專利名稱：含鈷夾心雜多酸及其合成方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及夾心雜多酸及其合成方法和應用。
背景技術：
結直腸癌是世界上第三大高發內臟惡性腫瘤及由于治療抗性引起癌相關死亡的主要原因之一。患者接受的主要治療方法即為姑息性外科手術及化學藥物治療。化療方法已經成為一種臨床腫瘤治療最重要的方法。臨床實踐和實驗研究階段的化療藥物主要包括合成化合物和天然產物提取物或植物化學物，但首選并且效果明顯的仍是合成化合物，如 2000年，結直腸惡性腫瘤臨床主要應用的化療藥物是5-氟脲嘧啶結合甲酰四氫葉酸。為了進一步增加結直腸惡性腫瘤患者的存活率，急待高效化療合成藥物的研發。國內外學者對多金屬氧酸鹽抗結直腸腫瘤進行了探索，如1992年，Na[IMo6024]作為抗結直腸癌藥物在日本應用于是臨床，但多金屬氧酸鹽作為結直腸腫瘤化療藥物的尚未開展，尤其是基于過渡金屬鈷的多金屬氧酸鹽在抗結直腸腫瘤中的研究未見報道。

發明內容
本發明的目的是提供含鈷夾心雜多酸及其合成方法和應用。本發明的含鈷夾心雜多酸的分子式為H6[Bi2W2tlCo2 (OH2)6O7tlNa4 (OH2)14] (C3H4N2) 2。本發明的含鈷夾心雜多酸的合成方法按以下步驟進行一、在磁力攪拌下，將 4mmol 5mmol的Na2WO4溶解在80mL 120mL的去離子水中，并加熱至80°C 120°C，然后逐滴加入濃度為6mol/L的鹽酸調節pH至5. 0 7. 0，得到溶液A ；二、將0. 3mmol 0. 8mmol 的Bi (NO3) 3溶解在IOmL濃度為6mol/L的鹽酸中，得到Bi (NO3) 3溶液，再將Bi (NO3) 3溶液、 0. 5mmol Immol的CoCl2和0. 8mmol 1. 2mmol的咪唑同時加入到步驟一得到的溶液A 中混合均勻，在攪拌條件下，加熱至80°C 120°C并保持Ih 2h，然后冷卻至室溫，過濾后， 將濾液靜止5 10天，析出晶體，得到含鈷夾心雜多酸。本發明的含鈷夾心雜多酸作為抗人結直腸癌化療藥物的應用。本發明所合成的含鈷夾心雜多酸H6 [Bi2W2tlCo2 (OH2)6O7tlNa4 (OH2)14] (C3H4N2)2 是一種活性修飾的多金屬氧酸鹽，它對人結直腸癌腫瘤細胞具有較強抑制作用與誘導人結直腸腫瘤細胞凋亡的的作用。本發明的含鈷夾心雜多酸的結構屬于Krebs-型夾心化合物，其中兩個[B-β -BiW9O33]9-通過兩個共用頂點的WO6八面體和兩個Co11O3(H2O)3八面體構成 Krebs-型結構，與多陰離子配位的兩個Na+分別與另外的Na+相連。兩個[Bi2W2tlCo2]片段通過兩個Na+形成一維鏈狀結構。在多聚的一維鏈中，兩個配位的橋連Na+離子為八面體配位， 每個鈉離子由四個水和兩個來自于毗鄰的[Co2 (H2O) 6 (WO2) 2 (B- β -Biff9O33) 2] 1(1_陰離子中的 μ 2-0原子配位，每個橋連鈉離子分別通過三個水分子與另外的一個通過六個水配位的Na+ 離子相連，額外的鈉離子起到穩定結構和平衡電荷的作用。每兩個多酸分子通過兩個鈉橋形成無限擴展的ID鏈狀結構。獨立的有機咪唑分子位于兩個鈉橋與多陰離子形成的孔中。本發明的含鈷夾心雜多酸通過多酸的氧化還原性使人結直腸癌細胞發生細胞凋亡。本發明合成的 H6 [Bi2W20Co2 (OH2 ) 6070Na4 (OH2) 14] (C3H4N2) 2 采用噻唑藍(MTT)方法檢測了該化合物對人結腸癌HT-29腫瘤細胞的生長抑制作用，其半數抑制濃度IC5tl = 0. llmmol/L，24h。Hoechst 33342和Α0/ΕΒ等熒光染色法檢測出本實施方式中含鈷夾心雜多酸H6 [Bi2W2tlCo2 (OH2)6O7tlNa4 (OH2)14] (C3H4N2) 2對人結腸腫瘤細胞株具有凋亡誘導作用。 采用單細胞凝膠電泳實驗(慧星實驗)和凋亡細胞的瓊脂糖凝膠電泳(DNAladder)實驗方法檢測出本發明的含鈷夾心雜多酸H6[Bi2W2tlCo2 (OH2)6O7tlNa4(OH2)14] (C3H4N2)2對腫瘤細胞株體外實驗存在的DNA損傷，如彗星施尾及DNA Ladder中出現的不同分子量的DNA 片斷。采用透射電鏡和掃描電鏡形態學觀察，獲得了本實施方式中所得含鈷夾心雜多酸 H6[Bi2W20Co2 (OH2) 6070Na4 (OH2) 14] (C3H4N2) 2誘導細胞凋亡的超微結構，采用流式細胞技術檢測出IC5tl下細胞凋亡接近半數。本發明的含鈷夾心雜多酸可用作抗人結直腸癌化療藥物。


圖1是試驗一制備的含鈷夾心雜多酸的分子模型；圖2是試驗一制備的含鈷夾心雜多酸的紅外吸收光譜圖；圖3是試驗一制備的含鈷夾心雜多酸和5-氟脲嘧啶的藥物濃度與腫瘤細胞活性的關系曲線圖；其中a表示本試驗一制備的含鈷夾心雜多酸的濃度與腫瘤細胞活性的關系曲線，b表示5-氟尿嘧啶的濃度與腫瘤細胞活性的關系曲線；圖4是試驗一制備的含鈷夾心雜多酸作用24h后的人結腸癌腫瘤細胞倒置顯微鏡下(X200)細胞形態圖；圖5是試驗一中作為空白對照的人結腸癌腫瘤細胞倒置顯微鏡下(X200)細胞形態圖； 圖6是0. 2mmol/L試驗一制備的含鈷夾心雜多酸作用24h后的人結腸癌腫瘤細胞熒光顯微鏡下(X200)細胞形態圖；圖7是試驗一中作為空白對照的人結腸癌腫瘤細胞熒光顯微鏡下(X200)細胞形態圖。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式的含鈷夾心雜多酸的分子式為IUBi2W2。(^ (CHi)6O7^a4(CHi)14] 艦)2。本實施方式中的H6[Bi2W2tlCo2(OH2)6O7tlNa4(OH2)14] (C3H4N2)2 為粉紅色粉未狀晶體。 本實施方式的 H6 [Bi2W2tlCo2 (OH2)6O7tlNa4 (OH2)14] (C3H4N2) 2 采用噻唑藍(MTT)方法檢測了該化合物對人結腸癌HT-29腫瘤細胞的生長抑制作用，其半數抑制濃度IC5tl = 0. Ilmmol/ L，24h。Hoechst 33342和Α0/ΕΒ等熒光染色法檢測出本實施方式中含鈷夾心雜多酸 H6[Bi2W2tlCo2 (OH2)6O7tlNa4(OH2)14] (C3H4N2)2對人結腸腫瘤細胞株具有凋亡誘導作用。采用單細胞凝膠電泳實驗(慧星實驗)和凋亡細胞的瓊脂糖凝膠電泳(DNAladder)實驗方法檢測出本發明的含鈷夾心雜多酸H6 [Bi2W2tlCo2 (OH2)6O7tlNa4 (OH2)14] (C3H4N2) 2對腫瘤細胞株體外實驗存在的DNA損傷情況，如彗星施尾及DNA Ladder中出現的不同分子量的DNA 片斷。采用透射電鏡和掃描電鏡形態學觀察，獲得了本實施方式中所得含鈷夾心雜多酸 H6[Bi2W20Co2 (OH2) 6070Na4 (OH2) 14] (C3H4N2) 2誘導細胞凋亡的超微結構，采用流式細胞技術檢測出IC5tl下細胞凋亡接近半數。
具體實施方式
二 本實施方式的含鈷夾心雜多酸的合成方法按以下步驟進行 一、在磁力攪拌下，將4mmol 5mmol的Na2WO4溶解在80mL 120mL的去離子水中，并加
4熱至80°C 120°C，然后逐滴加入濃度為6mol/L的鹽酸調節pH至5. 0 7. 0，得到溶液A ； 二、將0. 3mmol 0. 8mmol的Bi (NO3)3溶解在IOmL濃度為6mol/L的鹽酸中，得到Bi (NO3)3 溶液，再將Bi (NO3)3溶液、0. 5mmol Immol的CoCl2和0. 8mmol 1. 2mmol的咪唑同時加入到步驟一得到的溶液A中混合均勻，在攪拌條件下，加熱至80°C 120°C并保持Ih 2h， 然后冷卻至室溫，過濾后，濾液靜止5 10天，析出晶體，得到含鈷夾心雜多酸。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
二不同的是步驟一中將4. 2mmol
4.8mmol的Na2WO4溶解在90mL IlOmL的去離子水中，并加熱至90°C 110°C。其它步驟及參數與具體實施方式
二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
二或三不同的是步驟一調節PH至
5.5 6. 5。其它步驟及參數與具體實施方式
二或三相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
二至四之一不同的是步驟二中將 0. 4mmol 0. 7mmol的Bi (NO3) 3溶解在IOmL濃度為6mol/L的鹽酸中，得到Bi (NO3) 3溶液， 再將Bi (NO3)3溶液、0. 6mmol 0. 9mmol的CoCl2和0. 9mmol 1. Immol的咪唑同時加入到步驟一得到的溶液A中混合均勻。其它步驟及參數與具體實施方式
二至四之一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
二至五之一不同的是步驟二中加熱溫度為90°C 110°C，保持時間為1. 2h 1. Sh0其它步驟及參數與具體實施方式
二至五之一相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
二至六之一不同的是步驟二中靜止時間為6 8天。其它步驟及參數與具體實施方式
二至六之一相同。
具體實施方式
八本實施方式的含鈷夾心雜多酸作為抗人結直腸癌化療藥物的應用。本實施方式的H6 [Bi2W20Co2 (OH2 ) 6070Na4 (OH2) 14] (C3H4N2) 2 采用噻唑藍(MTT)方法檢測了該化合物對人結腸癌HT-29腫瘤細胞的生長抑制作用，其半數抑制濃度IC5tl = 0. llmmol/L，24h。Hoechst 33342和Α0/ΕΒ等熒光染色法檢測出本實施方式中含鈷夾心雜多酸H6 [Bi2W2tlCo2 (OH2)6O7tlNa4 (OH2)14] (C3H4N2) 2對人結腸腫瘤細胞株具有凋亡誘導作用。 采用單細胞凝膠電泳實驗(慧星實驗)和凋亡細胞的瓊脂糖凝膠電泳(DNAladder)實驗方法檢測出本發明的含鈷夾心雜多酸H6 [Bi2W2tlCo2 (OH2)6O7tlNa4 (OH2)14] (C3H4N2) 2對腫瘤細胞株體外實驗存在的DNA損傷情況，如彗星施尾及DNA Ladder中出現的不同分子量的DNA 片斷。采用透射電鏡和掃描電鏡形態學觀察，獲得了本實施方式中所得含鈷夾心雜多酸 H6[Bi2W20Co2 (OH2) 6070Na4 (OH2) 14] (C3H4N2) 2誘導細胞凋亡的超微結構，采用流式細胞技術檢測出IC5tl下細胞凋亡接近半數。本發明采用以下試驗驗證本發明的有益效果試驗一本試驗的含鈷夾心雜多酸的合成方法按以下步驟進行一、在磁力攪拌下，將4. 7mmol的Na2WO4溶解在IOOmL的去離子水中，并加熱至100°C，然后逐滴加入6mol/ L的HCl調節pH至6. 0，獲得溶液A ；二、將0. 5mmol的Bi (NO3) 3溶解在IOmL濃度為6mol/ L的鹽酸中，得到Bi (NO3) 3溶液，再將Bi (NO3) 3溶液、0. 7mmol的CoCl2Ummol的固體咪唑同時加入到溶液A中混合均勻，然后加熱至IOCTC并保持1. 5h，然后自然冷卻至室溫，常壓過濾后，將濾液冷卻后靜止8天，析出晶體，得到含鈷夾心雜多酸。本試驗一得到的含鈷夾心雜多酸的分子式為H6 [Bi2W20Co2 (OH2) 6070Na4 (OH2) 14](C3H4N2)2，為一種為粉紅色粉未狀晶體。通過單晶X-射線衍射分析處理后可知本試驗一制備的含鈷夾心雜多酸 H6 [Bi2W2tlCo2 (OH2)6O7tlNa4 (OH2)14] (C3H4N2)2 屬于 Krebs-型夾心化合物，其中兩個 [B- β -BiW9O33] 9_通過兩個共用頂點的WO6八面體和兩個Co11O3(H2O) 3八面體構成Krebs-型結構，與多陰離子配位的兩個Na+分別與另外的Na+相連。兩個[Bi2W2tlCo2]片段通過兩個 Na+形成一維鏈狀結構。在多聚的一維鏈中，兩個配位的橋連Na+離子為八面體配位，每個鈉離子由四個水和兩個來自于毗鄰的[Co2 (H2O) 6 (WO2) 2 (B- β -Biff9O33) 2] &陰離子中的μ 2_0 原子配位，每個橋連鈉離子分別通過三個水分子與另外的一個通過六個水配位的Na+離子相連，額外的鈉離子起到穩定結構和平衡電荷的作用。每兩個多酸分子通過兩個鈉橋形成無限擴展的ID鏈狀結構。獨立的有機咪唑分子位于兩個鈉橋與多陰離子形成的孔中。該結構如附圖1所示。本試驗一制備的含鈷夾心雜多酸的紅外吸收光譜圖如圖2所示，從圖2可以看出 944 (s)，819 (s)，632 (s) cm—1 譜帶歸屬為多酸骨架的振動峰，1621 (m)，1434 (w)，1061 (m) cm—1 譜帶歸屬為咪唑的振動峰，3386 (s)，3146 (m)，2967 (w) cm—1譜帶歸屬為N-H和O-H的振動峰。 從而證明含鈷夾心雜多酸的分子式為H6[Bi2W20Co2 (OH2) 6070Na4(OH2) 14] (C3H4N2)2。按質量百分比將的青鏈霉素、的谷氨酰胺和10%的胎牛血清加入到 RPMI-1640完全培養液中，得到培養基，將本試驗制備的不同劑量的含鈷夾心雜多酸加入到培養基中，得到加藥培養基，再將人結腸癌細胞用加藥培養基于37°C、5% CO2培養箱中培養 24h后，用質量百分比為0. 25%的胰酶消化后，采用噻唑藍(MTT)法檢測本試驗一制備的含鈷夾心雜多酸對人結腸癌HT-29腫瘤細胞的體外增殖抑制作用，并以5-氟脲嘧啶作為對照，得到的藥物濃度與腫瘤細胞活性的關系曲線圖如圖3所示，其中a表示本試驗一合成的含鈷夾心雜多酸的濃度與腫瘤細胞活性的關系曲線，b表示5-氟尿嘧啶的濃度與腫瘤細胞活性的關系曲線，從圖3可以看出，對腫瘤細胞活性的抑制作用與藥物濃度之間存在的劑量依賴性，隨著含鈷夾心雜多酸給藥劑量的增加，細胞生長明顯受到抑制，并且含鈷夾心雜多酸對細胞的生長抑制明顯高于臨床用藥5-氟脲嘧啶對細胞的生長抑制。按質量百分比將的青鏈霉素、的谷氨酰胺和10%的胎牛血清加入到 RPMI-1640完全培養液中，得到培養基，將本試驗制備的含鈷夾心雜多酸0. 2mmol/L加入到培養基中，得到加藥培養基，再將人結腸癌細胞用加藥培養基于37°C、5% CO2培養箱中培養 24h后，用質量百分比為0. 25%的胰酶消化后，采用倒置顯微鏡對人結腸癌腫瘤細胞的生長狀況和形態學進行觀察，同時做空白對照，本試驗制備的含鈷夾心雜多酸作用24h后的人結腸癌腫瘤細胞倒置顯微鏡下(X200)細胞形態圖如圖4所示，作為空白對照的人結腸癌腫瘤細胞倒置顯微鏡下(X200)細胞形態圖如圖5所示，比較圖4和圖5，可知本試驗制備的含鈷夾心雜多酸作用后，人結腸癌HT-29腫瘤細胞發生細胞皺縮、變圓及細胞碎裂等形態學改變，表明含鈷夾心雜多酸對人結腸癌腫瘤細胞存在生長抑制作用，其半數抑制濃度 IC50 = 0. llmmol/L，24h。按質量百分比將的青鏈霉素、的谷氨酰胺和10%的胎牛血清加入到RPMI-1640完全培養液中，得到培養基，將本試驗制備的含鈷夾心雜多酸按濃度為 0. 2mmol/L加入到培養基中，得到加藥培養基，再將人結腸癌細胞用加藥培養基于37°C、 5% CO2培養箱中培養24h后，用質量百分比為0.25%的胰酶消化后，采用hoechst 33342熒光染色法觀察細胞形態，同時做空白對照，圖6為0. 2mmol/L本試驗制備的含鈷夾心雜多酸作用24h后的人結腸癌腫瘤細胞熒光顯微鏡下(X200)細胞形態圖，圖7為對照組的人結腸癌腫瘤細胞熒光顯微鏡下(X200)細胞形態圖，比較圖6和圖7可以看出對比對照組， HT-29細胞經含鈷夾心雜多酸作用后出現了染色質凝聚、核碎裂片斷及凋亡小體的形成等典型的細胞凋亡的形態學改變，由此可見，本試驗制備的含鈷夾心雜多酸對人結腸癌腫瘤細胞株具有凋亡誘導作用。按質量百分比將的青鏈霉素、的谷氨酰胺和10%的胎牛血清加入到RPMI-1640完全培養液中，得到培養基，將本試驗制備的含鈷夾心雜多酸按濃度為 0. 2mmol/L加入到培養基中，得到加藥培養基，再將人結腸癌細胞用加藥培養基于37°C、 5% CO2培養箱中培養24h后，用質量百分比為0. 25%的胰酶消化后，采用單細胞凝膠電泳 (慧星實驗)和凋亡細胞的瓊脂糖凝膠電泳(DNA ladder)兩種實驗方法檢測，結果顯示本試驗制備的含鈷夾心雜多酸作用后的彗星施尾及DNALadder中出現的不同分子量的DNA片斷，由此可知，本試驗制備的含鈷夾心雜多酸對腫瘤細胞株體外具有誘導DNA的損傷作用。按質量百分比將的青鏈霉素、的谷氨酰胺和10%的胎牛血清加入到RPMI-1640完全培養液中，得到培養基，將本試驗制備的含鈷夾心雜多酸按濃度為 0. 2mmol/L加入到培養基中，得到加藥培養基，再將人結腸癌細胞用加藥培養基于37°C、 5% CO2培養箱中培養24h后，用質量百分比為0. 25%的胰酶消化后，采用透射電鏡和掃描電鏡形態學觀察，發現本試驗制備的含鈷夾心雜多酸能夠誘導人結腸癌腫瘤細胞凋亡的超微結構，包括細胞膜起泡，微絨毛消失及分離的凋亡小體擴在的核膜，胞漿空泡及DNA碎裂等超微結構的改變。并采用流式細胞技術檢測了 IC5tl下細胞凋亡接近半數。在此基礎上采用Western blot法(蛋白免疫印跡)檢測了細胞凋亡執行器Caspase-3蛋白在不同藥物劑量下24h后的蛋白表達，結果表明Caspase-3蛋白被激活，并且含鈷夾心雜多酸劑量濃度的增加，蛋白表達增強并呈現裂分趨勢。
權利要求
1.含鈷夾心雜多酸，其特征在于含鈷夾心雜多酸的分子式為 H6 [Bi2W20Co2 (OH2) 6070Na4 (OH2) 14] (C3H4N2) 2。
2.如權利要求1所述的含鈷夾心雜多酸的合成方法，其特征在于含鈷夾心雜多酸的合成方法按以下步驟進行一、在磁力攪拌下，將4mmol 5mmol的Na2WO4溶解在80mL 120mL的去離子水中，并加熱至80°C 120°C，然后逐滴加入濃度為6mol/L的鹽酸調節pH 至5. O 7. 0，得到溶液A ；二、將0. 3讓ol 0. 8讓01的Bi (NO3) 3溶解在IOmL濃度為6mol/L 的鹽酸中，得到Bi (NO3) 3溶液，再將Bi (NO3) 3溶液、0. 5mmol Immol的CoCl2和0. 8mmol 1. 2mmol的咪唑同時加入到步驟一得到的溶液A中混合均勻，在攪拌條件下，加熱至80°C 120°C并保持Ih 2h，然后冷卻至室溫，過濾后，濾液靜止5 10天，析出晶體，得到含鈷夾心雜多酸。
3.根據權利要求2所述的含鈷夾心雜多酸的合成方法，其特征在于步驟一中將4.2謹ol 4. Siimol的Na2WO4溶解在90mL IlOmL的去離子水中，并加熱至90°C 110°C。
4.根據權利要求2或3的含鈷夾心雜多酸的合成方法，其特征在于步驟一中調節pH至5.5 6. 5o
5.根據權利要求2或3的含鈷夾心雜多酸的合成方法，其特征在于步驟二中將 0. 4mmol 0. 7mmol的Bi (NO3) 3溶解在IOmL濃度為6mol/L的鹽酸中，得到Bi (NO3) 3溶液， 再將Bi (NO3)3溶液、0. 6mmol 0. 9mmol的CoCl2和0. 9mmol 1. Immol的咪唑同時加入到步驟一得到的溶液A中混合均勻。
6.根據權利要求2或3的含鈷夾心雜多酸的合成方法，其特征在于步驟二中加熱溫度為90°C 110°C，保持時間為1. 2h 1. 8h。
7.根據權利要求2或3的含鈷夾心雜多酸的合成方法，其特征在于步驟二中靜止時間為6 8天。
8.如權利要求1所述的含鈷夾心雜多酸作為一種抗人結直腸癌化療藥物的應用，其特征在于含鈷夾心雜多酸作為抗人結直腸癌化療藥物的應用。
全文摘要
含鈷夾心雜多酸及其合成方法和應用，它涉及夾心雜多酸及其合成方法和應用。本發明提供了一種新的具有抗人結直腸癌的化療藥物及其合成方法。本發明的含鈷夾心雜多酸的分子式為H6[Bi2W20Co2(OH2)6O70Na4(OH2)14](C3H4N2)2。合成方法一、將Na2WO4溶于水中，加熱并調節pH，得到溶液A；二、將Bi(NO3)3、CoCl2和咪唑同時加入溶液A中混勻，加熱至80℃～120℃并保持1h～2h，經冷卻、過濾、靜止后得到含鈷夾心雜多酸。該化合物對腫瘤細胞具有生長抑制作用和凋亡誘導作用。可作為抗人結直腸癌化療藥物。
文檔編號C01G51/00GK102503892SQ20111033997
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月1日 優先權日2011年11月1日
發明者于凱, 初麗麗, 吳江, 周百斌, 山祁, 王春曉, 王路, 蘇占華 申請人:哈爾濱工業大學