本發明屬于肥料領域，具體涉及一種紅豆杉復合微生物有機肥料及其制備方法和用途。
背景技術：
紅豆杉是新型抗癌天然藥物紫杉醇(Taxol)的主要來源之一。紫杉醇是美國化學家Wall等(1971)首先從太平洋紫衫(Taxus brevifolia)樹皮中提取的具有五甲基十五碳烯骨架的二萜類化合物。它是世界上公認的廣譜、高活性的抗癌藥物。由于國內外對紅豆杉提取物紫杉醇的迫切需要，是我國出現了前所未有的紅豆杉資源開發熱潮，各地天然紅豆杉資源遭到了嚴重的破壞，有的地方甚至瀕臨滅絕。因此，如何保護、開發和利用紅豆杉資源，實現紫杉醇產業的可持續發展，已成為亟需解決的重要課題；此外，紅豆杉中紫杉醇類有效物質的含量十分低，如何提高紅豆杉中的紫杉醇含量對于紅豆杉的開發的商業價值提升具有重要意義。
紅豆杉中更加主要種類曼地亞紅豆杉(Taxus madia)原產于美國、加拿大，是一種天然雜交品種，其母本為東北紅豆杉(T.cuspidata)，父本為歐洲紅豆杉(T.bauata)，在美國、加拿大生長發展已有近100年的歷史。我國20世紀90年代中期從加拿大引種而來。曼地亞紅豆杉植株各部分均含有紫杉醇，其含量是國內其他紅豆杉的8-10倍，枝葉含量達0.03％以上，根系部分可達0.06％。雖然其生長速度較其他紅豆杉快，但作為灌木，生長速度仍然較慢。人工栽培曼地亞紅豆杉，提高紫杉醇及其前體在植株體內的生物合成和積累是解決紫杉醇資源瓶頸的重要途徑。為實現曼地亞紅豆杉短周期藥用林的高產高效經營，施肥是一個重要的環節。目前，以微生物為基礎開發的各種微生物肥料已經在農林業生產中得到廣泛應用，該類肥料具有肥效高、本身無毒、不污染環境、成本低、節約能源等特點，是化學肥料的最有效的替代品。
叢枝菌根(Arbuscular Mycorrhizae，AM)真菌是土壤中最重要的成員之一。AM真菌顯著影響植物的初生代謝過程，它可以促進植物根系對磷、銅、鋅、鎘等礦質元素及養分的吸收，調節植物激素的合成和分配，改善植物的根際微生物環境并增強植物的抗病性，同時提高植株對環境脅迫的耐受力，從而全面改善宿主植物的生長狀況。近年來，許多研究已經觀察到AM真菌與植物次生代謝的相關性，AM真菌能夠直接或間接地影響植物的次生代謝過程。現有技術中鮮有針對紅豆杉進行的菌根生物技術的研究。
此外，目前對于紅豆杉植物的藥物有效成分提取的方法的研究已成為抗癌藥物開發領域的熱點，現有技術中大多是針對提高紅豆杉植物的有效成分利用率進行的研發，如專利“從紅豆杉中高效快速提取紫杉醇、三尖杉寧堿和10-DABⅢ的方法”(CN105669602A)對紅豆杉植物中的有效成分紫杉醇、三尖杉寧堿和10-DABⅢ的提取率均達到98％以上。而紅豆杉植物經過提取后的殘渣大部分被作為廢棄物浪費掉，這不利于紅豆杉植物的綠色循環開發。
技術實現要素：
針對現有技術中的缺陷，本發明提供一種能夠提高紅豆杉植物紫杉醇含量的紅豆杉復合微生物有機肥料。
為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：
本發明提供的一種紅豆杉復合微生物有機肥料包括如下重量份組份：含紅豆杉提取殘渣的有機肥料80-90份、復合微生物菌劑10-20份。
本發明通過對紅豆杉提取殘渣進行廢物利用，再復合微生物菌劑而制得的紅豆杉復合微生物有機肥料能夠促進紅豆杉的根系發育，并且能夠大大提高紅豆杉植物中的紫杉醇含量。
進一步優選的，上述紅豆杉復合微生物有機肥料包括如下重量份組份：含紅豆杉提取殘渣的有機肥料82-88份、復合微生物菌劑12-18份。
更進一步優選的，上述紅豆杉復合微生物有機肥料包括如下重量份組份：含紅豆杉提取殘渣的有機肥料85份、復合微生物菌劑15份。
進一步的，上述紅豆杉復合微生物有機肥料中，所述有機肥料包括如下重量份組份：牲畜糞便60-75份、紅豆杉提取殘渣20-30份、草炭5-15份、酵素菌1-5份。所述牲畜糞便為雞、鴨、牛、羊、豬、鵝等常見牲畜的糞便。
進一步的，上述紅豆杉復合微生物有機肥料中，所述復合微生物菌劑包括如下兩種組份：分離自曼地亞紅豆杉植株組織中或者根際土壤中的幼套球囊霉(Glomus etunicatum)和枯草芽胞桿菌(Bacillus s-ubtilis)。從紅豆杉根際篩選優良AM真菌，利用菌根生物技術來促進紅豆杉生長的及次生代謝產物紫杉醇和前體的積累，這將有助于曼地亞紅豆杉的人工馴化栽培以及市場和患者對紫杉醇藥物的需求。
本發明所提供的復合微生物菌劑配合有機肥料對紫杉醇的生長具有如下具體的有益效果：1.分泌抑制生長環境中的有害菌的滋生繁殖，有效預防重茬病害及線蟲的侵染，增強植物的抗病免疫力，最大限度地阻斷土壤土傳病害；2.強力促進增根、生根、壯根，毛細根數增加，吸水、吸肥能力強，莖粗、壯苗、移栽緩苗快等功能；3.改善土壤團粒結構，改良土壤，提高土壤蓄水、蓄能和地溫，緩解重茬障礙；4.固氮、解磷、解鉀作用，平衡土壤的酸堿度，改良土壤結構，提高化肥利用率，促進作物生長，成熟，提高產品品質和產量；5.產生的過氧化氫酶及其它酵素和酶等外分泌物對作物生長均表現出不同程度的促進作用。
進一步優選的，上述紅豆杉復合微生物有機肥料中，所述幼套球囊霉和枯草芽胞桿菌的配比是1mL：1g。
上述紅豆杉復合微生物有機肥料的制備方法包括步驟：將牲畜糞便、紅豆杉提取殘渣、草炭三個組份按照配比混合后加入酵素菌發酵制得有機肥料；
將幼套球囊霉的孢子進行培養制得幼套球囊霉；
將枯草芽胞桿菌菌種經過培養基發酵制得枯草芽胞桿菌；
將制得的有機肥料、幼套球囊霉和枯草芽胞桿菌混合即得產品。
所述牲畜糞便、紅豆杉提取殘渣、草炭混合物的含水量在加入酵素菌前優選的控制在10-15％。
進一步的，上述紅豆杉復合微生物有機肥料的制備方法中，所述幼套球囊霉按如下方法制備：將幼套球囊霉的孢子用白三葉草為載體富集培養，培養基質為滅過菌的土和沙混合物，培養2月后，去掉地上部分，制成幼套球囊霉；所述土和沙質量比為2：1。
進一步的，上述紅豆杉復合微生物有機肥料的制備方法中，所述枯草芽胞桿菌為LB培養基發酵24h后的培養液。
上述紅豆杉復合微生物有機肥料的用途在于提高紅豆杉的紫杉醇含量。
綜上所述，本發明提供的復合微生物有機肥料能明顯促進曼地亞紅豆杉苗的生長發育，尤其是提高植物體內的紫杉醇的積累，對于紅豆杉抗癌藥物的開發具有十分積極的作用；同時，本發明對紅豆杉植物經有效成分提取后的殘渣進行了二次利用，十分利于紅豆杉植物的循環利用。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。需要說明的是，本發明所記載的實施例僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
實施例二至四中的使用的紅豆杉提取殘渣是將紅豆杉枝葉按照專利CN105669602A中實施例所記載的方法進行有效成分提取后的剩余固體殘渣。使用前紅豆杉提取廢渣經過風干除去其中殘留的有機試劑。
實施例一
復合微生物菌劑的制備
(1)把AM真菌幼套球囊菌的孢子用30％H2O2消毒10min，然后無菌水漂洗3次，把孢子用白三葉草為載體富集培養，培養基質為滅過菌的土和沙的混合物，土和沙的質量比為2：1，培養2月后，去掉地上部分，制成含有孢子、菌絲和侵染跟段的混合物作為AM真菌菌劑；
(2)將枯草芽孢桿菌活化，用接種環挑取少量菌體接種于含5mL LB培養基，LB培養基的具體成分為蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、蒸餾水1000mL、pH 7.2～7.4，121℃滅菌30min。20mL培養瓶中，37℃，200r/min振蕩過夜培養，作為種子液，按1％轉接于含150mL LB培養基500mL三角瓶中，37℃，200r/min振蕩培養24h后作為菌劑。
將制得的幼套球囊菌的AM真菌菌劑和枯草芽孢桿菌菌劑按照1mL：1g的比例混合即得復合微生物菌劑。
實施例二
復合微生物有機肥料的制備
牲畜糞便為雞糞和豬糞按2：3的比例混合。將60kg牲畜糞便、30kg紅豆杉殘渣、10kg草炭按混合，含水量15％。混勻后加入酵素菌，發酵10天，即制成有機肥。
將85kg有機肥料，實施例一制備所得的復合微生物菌劑15kg份混合均勻即制得復合微生物有機肥料。
實施例三
復合微生物有機肥料的制備
牲畜糞便為牛糞和豬糞按1：1的比例混合。將75kg牲畜糞便、25kg紅豆杉殘渣、5kg草炭按混合，含水量控制在11％。混勻后加入酵素菌，發酵10天，即制成有機肥。
將80kg有機肥料，實施例一制備所得的復合微生物菌劑20kg份混合均勻即制得復合微生物有機肥料。
實施例四
復合微生物有機肥料的制備
牲畜糞便為豬糞。將65kg牲畜糞便、20kg紅豆杉殘渣、15kg草炭按混合，含水量控制在12％。混勻后加入酵素菌，發酵10天，即制成有機肥。
將90kg有機肥料，實施例一制備所得的復合微生物菌劑10kg份混合均勻即制得復合微生物有機肥料。
實施例五
復合微生物有機肥料的田間試驗
將實施例二制備的復合微生物有機肥料施用于曼地亞紅豆杉苗種植田內，作為基肥，每畝用量為50kg，種植上紅豆杉扦插苗。不施肥和施用等量無機復合肥(包括氮肥、鉀肥、磷肥等)作為對照。
曼地亞紅豆杉假植苗1年后生長情況如表1所示。從表1中可看出，施肥有利于曼地亞紅豆杉苗的生長，施用復合微生物有機肥效果更明顯。其中施用復合微生物有機肥，曼地亞紅豆杉假植苗的根重和枝葉重相對于不施肥分別增長了141％、121％，相對于施用無機肥分別增長了48％、72％。
表1復合微生物有機肥對曼地亞紅豆杉苗生長的影響
注：P<0.05，同列不同行小寫字母不相同代表差異顯著。
實施例六
假植苗紫杉醇含量的檢測
對實施例五中的紅豆杉假植苗在種植1年后，分別將不同處理的根、莖、葉于35℃下烘干磨碎成粉狀物備用。分別稱取30g粉狀物置于500mL燒杯中，加入300mL甲醇，常溫下超聲萃取1小時，抽濾；再加入100mL甲醇，常溫下超聲萃取1小時，抽濾。將兩次濾液合并，通過高效液相色譜儀定量檢測其中紫杉醇的含量。
曼地亞紅豆杉假植苗生長1年后紫杉醇含量情況如表2所示。從表2中可看出，施肥有利于曼地亞紅豆杉苗中紫杉醇的積累，施用復合微生物有機肥效果更明顯。其中施用復合微生物有機肥，曼地亞紅豆杉假植苗的根中和枝葉中紫杉醇的含量相對于不施肥分別增長了192％、46％，相對于施用無機肥分別增長了153％、17％。
表2復合微生物有機肥對曼地亞紅豆杉苗紫杉醇積累的影響
注：P<0.05，同列不同行小寫字母不相同代表差異顯著。