專利名稱：人類17號染色體短臂1區(qū)3帶3亞帶區(qū)域內(nèi)人腫瘤相關(guān)基因和編碼蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼人腫瘤相關(guān)蛋白的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。
惡性腫瘤的死亡率在我國僅次于心、腦血管疾病名列第二。在惡性腫瘤中肝癌的死亡率列在肺癌、胃癌之后居第三位。目前對肝癌(除小肝癌外)缺乏有效的診治手段。人們普遍認(rèn)為癌的發(fā)生是一種多因子多步驟的復(fù)雜事件，是多種癌基因激活和抑癌基因失活的結(jié)果。其中抑癌基因可能更為關(guān)鍵。因此尋找腫瘤抑癌基因是目前研究的熱點之一。基因經(jīng)常通過一個等位基因的丟失(雜合子缺失，Loss ofHeterozygocity，LOH)而失去一種正常性狀，LOH頻發(fā)部位可能存在抑癌基因。
上海市腫瘤研究所癌基因及相關(guān)基因國家重點實驗室長期從事人肝癌基因的研究，早在1991年就發(fā)現(xiàn)肝癌的發(fā)生與p53失活有關(guān)，該基因不僅249編碼子突變，還有其它編碼子出現(xiàn)點突變(Li D.Z；Gu JR et al Carcinogenesis 14(2)169，1993)。p53位于人染色體17p13.1。
另外，對17p13.3區(qū)段內(nèi)的研究國外也有報導(dǎo)。Nishida等(Noashi Nishida et al.，Cancer Research 53368-372，1993)在17p上選10個多態(tài)性探針，研究人肝癌的17pLOH和p53基因突變之間的關(guān)系，他認(rèn)為肝癌的發(fā)生可能與17p13.3上未被證明的腫瘤抑制基因有關(guān)。Schultz等(David C.Schultz，et al.，Cancer Research 561997-2002 1996)，用等位基因丟失作圖和定點克隆方法證明了兩個新基因OVCA1和OVCA2，定位于17p13.3，這兩個新基因在正常的卵巢上皮細(xì)胞有表達(dá)，在卵巢瘤或卵巢瘤細(xì)胞株中表達(dá)減少或無表達(dá)。Wales等(Michele M.Wales et al.，NatureMedicine570-577，1995)，通過腫瘤組織DNA高度甲基化分析，在17p13.3區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個后選基因Hic-1，它是一個鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，在正常組織普遍表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)降低。
然而，上述報告存在以下不足之處1.沒有報導(dǎo)肝癌組織LOH頻率的最小范圍和位點。2.上述發(fā)現(xiàn)的后選基因與肝癌的關(guān)系未見報導(dǎo)。
由于癌癥是危害人類健康的主要疾病之一。為了有效地治療和預(yù)防腫瘤(如肝癌)，目前人們已越來越關(guān)注腫瘤的早期診斷和基因治療。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)研究新的癌癥相關(guān)的和/或具有抑癌功能的人蛋白及其激動劑/抑制劑。
本發(fā)明的目的是提供一種新的腫瘤相關(guān)蛋白-人HC6蛋白多肽以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的人HC6蛋白多肽，它包括具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該該多肽是具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少85％相同性(a)編碼如 1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼的多肽具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；更佳地，該多核苷酸具有選自下組的序列SEQ ID NO3中所示的編碼區(qū)序列(第128-532位)或全長序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備腫瘤相關(guān)HC6蛋白活性的多肽的制備方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有腫瘤相關(guān)HC6蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的腫瘤相關(guān)HC6蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的10-800個核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的腫瘤相關(guān)HC6蛋白多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。這些藥物組合物可治療癌癥以及細(xì)胞異常增殖等病癥。
在本發(fā)明的第七方面，提供了一種檢測肝細(xì)胞是否發(fā)生癌變或存在癌變易感性的方法，它包括步驟檢測肝細(xì)胞樣品中HC6轉(zhuǎn)錄本與正常的HC6轉(zhuǎn)錄本相比是否有變化，有變化就表示該肝細(xì)胞發(fā)生癌變或存在癌變易感性；或者檢測肝細(xì)胞樣品中HC6蛋白的活性與正常的HC6蛋白相比是否有變化，有變化就表示該肝細(xì)胞發(fā)生癌變或存在癌變易感性。較佳地，所述的變化是核苷酸的缺失、插入、或置換突變。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測肝癌的試劑盒，它包括(1)特異性擴(kuò)增人HC6基因的引物對，(2)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物與正常的HC6基因相比是否存在變化所需的試劑。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
在附圖中，

圖1和2是Southern雜交檢測HC6在肝癌組織中的LOH狀況，其中，基因組DNA以BamHI酶切；Q21、Q27、Q28、Q29、Q30、Z11、Z12、Z14為肝癌標(biāo)本。K肝癌組織；L癌旁組織。
圖3顯示了空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的結(jié)果。
圖4顯示了HC6轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的結(jié)果圖5顯示了HC6基因的多組織膜Northern雜交結(jié)果。
在肝癌的研究中，本發(fā)明人首先確定了肝癌組織在17p13.3范圍內(nèi)有高頻率LOH(60-100％)。最近，通過對肝癌全基因組掃描也證明17p13.3是LOH的最高區(qū)域。本發(fā)明人對人17號染色體短臂13.3位點的癌相關(guān)表達(dá)序列(EST)進(jìn)行了分離和全長克隆。用對應(yīng)于17p13.3區(qū)段內(nèi)926位點的噬菌體人工染色體(PAC)579號(P579)克隆，通過九倍鳥槍法(shotgun)測序得到其序列，應(yīng)用計算機(jī)分析在其中找到1個代表新基因的EST，通過RACE方法獲得全長核苷酸序列和編碼的氨基酸，命名為HC6。通過Northern、Southern雜交，證明它們與腫瘤相關(guān)，體外實驗證明它們可以抑制肝癌細(xì)胞7721的生長。因此，HC6基因可應(yīng)用于腫瘤的診斷、治療和預(yù)防。
在本發(fā)明中，術(shù)語“HC6蛋白”、“HC6多肽”、“腫瘤相關(guān)HC6蛋白”或“腫瘤相關(guān)蛋白HC6”可互換使用，都指具有人腫瘤相關(guān)蛋白HC6氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。該術(shù)語還包括含有或不含起始甲硫氨酸的腫瘤相關(guān)蛋白HC6。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的腫瘤相關(guān)HC6蛋白或多肽”，“分離的HC6蛋白或多肽”是指腫瘤相關(guān)HC6蛋白多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化HC6蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。HC6蛋白多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括腫瘤相關(guān)的人HC6蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然腫瘤相關(guān)人HC6蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人腫瘤相關(guān)蛋白HC6多肽”或“人NIP2AP蛋白多肽”可互換使用，都指具有人腫瘤相關(guān)蛋白HC6活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人腫瘤相關(guān)蛋白HC6相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人腫瘤相關(guān)蛋白HC6的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人腫瘤相關(guān)蛋白HC6 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人腫瘤相關(guān)蛋白HC6多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人腫瘤相關(guān)蛋白HC6多肽或其片段的融合蛋白(如包含SEQ ID NO2所示序列的融合蛋白)。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人腫瘤相關(guān)蛋白HC6多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人腫瘤相關(guān)蛋白HC6多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人腫瘤相關(guān)蛋白HC6或多肽的類似物。這些類似物與天然人腫瘤相關(guān)蛋白HC6多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人腫瘤相關(guān)蛋白HC6保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表A進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表 A
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO3所示的編碼區(qū)序列(第618-1445位)相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO3所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼HC6蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的DNA序列能用幾種方法獲得。例如，用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分離DNA。這些技術(shù)包括但不局限于1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源性核苷酸序列，和2)表達(dá)文庫的抗體篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的DNA片段。
編碼HC6蛋白的特異DNA片段序列產(chǎn)生也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學(xué)合成DNA序列以獲得所需多肽的雙鏈DNA。
上述提到的方法中，分離基因組DNA最不常用。當(dāng)需要的多肽產(chǎn)物的整個氨基酸序列已知時，DNA序列的直接化學(xué)合成是經(jīng)常選用的方法。如果所需的氨基酸的整個序列不清楚時，DNA序列的直接化學(xué)合成是不可能的，選用的方法是cDNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標(biāo)準(zhǔn)方法是從高表達(dá)該基因的供體細(xì)胞分離mRNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，形成質(zhì)粒或噬菌體cDNA文庫。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術(shù)，試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得(Qiagene)。而構(gòu)建cDNA文庫也是通常的方法(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory.New York，1989)。還可得到商業(yè)供應(yīng)的cDNA文庫，如Clontech公司的不同cDNA文庫。當(dāng)結(jié)合使用聚合酶反應(yīng)技術(shù)時，即使極少的表達(dá)產(chǎn)物也能克隆。
可用常規(guī)方法從這些cDNA文庫中篩選本發(fā)明的基因。這些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標(biāo)志基因的功能出現(xiàn)或喪失；(3)測定HC6蛋白的轉(zhuǎn)錄本的水平；(4)通過免疫學(xué)技術(shù)或測定生物學(xué)活性，來檢測基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物。上述方法可單用，也可多種方法聯(lián)合應(yīng)用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與本發(fā)明的多核苷酸的任何一部分同源，其長度至少15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸。此外，探針的長度通常在2kb之內(nèi)，較佳地為1kb之內(nèi)。此處所用的探針通常是在本發(fā)明的基因DNA序列信息的基礎(chǔ)上化學(xué)合成的DNA序列。本發(fā)明的基因本身或者片段當(dāng)然可以用作探針。DNA探針的標(biāo)記可用放射性同位素，熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等。
在第(4)種方法中，檢測HC6蛋白基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物可用免疫學(xué)技術(shù)如Western印跡法，放射免疫沉淀法，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。可用常規(guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本發(fā)明的基因，或者各種DNA片段等的核苷酸序列的測定可用常規(guī)方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger et al.PNAS，1977，745463-5467)。這類核苷酸序列測定也可用商業(yè)測序試劑盒等。為了獲得全長的cDNA序列，測序需反復(fù)進(jìn)行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或HC6蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的HC6蛋白多肽(Science，1984；2241431)。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼腫瘤相關(guān)人HC6蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，腫瘤相關(guān)的人HC6蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含HC6蛋白編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動物細(xì)胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。可舉的例子包括在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的100到270個堿基對的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。可供選擇的是用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可包被于細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外或在細(xì)胞膜上表達(dá)或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
本發(fā)明人研究已表明，在發(fā)生癌變的肝細(xì)胞中，HC6基因幾乎都存在突變，這些突變包括HC6編碼序列和非編碼序列的缺失、插入和置換突變，以及重排。這些變化可能導(dǎo)致在肝細(xì)胞中的HC6蛋白沒有活性或活性過低，并最終直接或間接地導(dǎo)致肝癌。
因此，本發(fā)明重組的人腫瘤相關(guān)HC6蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療HC6蛋白功能低下或喪失所致的疾病(如癌癥，尤其是肝癌)，和用于篩選促進(jìn)或?qū)笻C6蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。例如，抗體可用于激活或抑制HC6蛋白的功能。用表達(dá)的重組HC6蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激HC6蛋白功能的多肽分子。
本發(fā)明也提供了篩選藥物以鑒定提高(激動劑)或阻遏(拮抗劑)HC6蛋白的藥劑的方法。例如，能在藥物的存在下，將哺乳動物細(xì)胞或表達(dá)HC6蛋白的膜制劑與標(biāo)記的HC6蛋白一起培養(yǎng)。然后測定藥物提高或阻遏此相互作用的能力。
HC6蛋白的拮抗劑包括篩選出的抗體、化合物、受體缺失物和類似物等。HC6蛋白的拮抗劑可以與HC6蛋白結(jié)合并消除其功能，或是抑制HC6蛋白的產(chǎn)生，或是與多肽的活性位點結(jié)合使多肽不能發(fā)揮生物學(xué)功能。HC6蛋白的拮抗劑可用于治療用途。
在篩選作為拮抗劑的化合物時，可以將HC6蛋白加入生物分析測定中，通過測定化合物影響HC6蛋白和其受體之間的相互作用來確定化合物是否是拮抗劑。用上述篩選化合物的同樣方法，可以篩選出起拮抗劑作用的受體缺失物和類似物。
本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，例如，各種惡性腫瘤和細(xì)胞異常增殖等，尤其是用于肝癌的治療。
本發(fā)明的多肽，及其片段、衍生物、類似物或它們的細(xì)胞可以用來作為抗原以生產(chǎn)抗體。這些抗體可以是多克隆或單克隆抗體。多克隆抗體可以通過將此多肽直接注射動物的方法得到。制備單克隆抗體的技術(shù)包括雜交瘤技術(shù)，三瘤技術(shù)，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，EBV-雜交瘤技術(shù)等。
可以將本發(fā)明的多肽和拮抗劑與合適的藥物載體組合后使用。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩沖液、甘油以及它們的組合。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用于疾病治療。
本發(fā)明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的藥用組合物成分。與這些容器一起，可以有由制造、使用或銷售藥品或生物制品的政府管理機(jī)構(gòu)所給出的指示性提示，該提示反映出生產(chǎn)、使用或銷售的政府管理機(jī)構(gòu)許可其在人體上施用。此外，本發(fā)明的多肽可以與其它的治療化合物結(jié)合使用。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或皮內(nèi)的給藥途徑。HC6蛋白以有效地治療和/或預(yù)防具體的適應(yīng)癥的量來給藥。施用于患者的HC6蛋白的量和劑量范圍將取決于許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫(yī)生的判斷。
HC6蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的。基因治療技術(shù)可用于治療由于HC6蛋白的無表達(dá)或異常/無活性的HC6蛋白的表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計成表達(dá)變異的HC6蛋白，以抑制內(nèi)源性的HC6蛋白活性。例如，一種變異的HC6蛋白可以是縮短的、缺失了信號傳導(dǎo)功能域的HC6蛋白，雖可與下游的底物結(jié)合，但缺乏信號傳導(dǎo)活性。因此重組的基因治療載體可用于治療HC6蛋白表達(dá)或活性異常所致的疾病。來源于病毒的表達(dá)載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細(xì)小病毒等可用于將HC6蛋白基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶HC6蛋白基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(xiàn)(Sambrook，et al.)。另外重組HC6蛋白基因可包裝到脂質(zhì)體中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
抑制HC6蛋白mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機(jī)制是核酶分子與互補(bǔ)的靶RNA特異性雜交后進(jìn)行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進(jìn)行修飾，如增加兩側(cè)的序列長度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
本發(fā)明的多肽還可用作肽譜分析，例如，多肽可用物理的、化學(xué)或酶進(jìn)行特異性切割，并進(jìn)行一維或二維或三維的凝膠電泳分析。
本發(fā)明還提供了針對HC6蛋白抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限于)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段。
抗HC6蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的HC6蛋白。
與HC6蛋白結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標(biāo)記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標(biāo)記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細(xì)胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與HC6蛋白相關(guān)的疾病。給予適當(dāng)劑量的抗體可以刺激或阻斷HC6蛋白的產(chǎn)生或活性。
抗體也可用于設(shè)計針對體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如HC6蛋白高親和性的單克隆抗體可與細(xì)菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅HC6蛋白陽性的細(xì)胞。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用HC6蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
HC6蛋白單克隆抗體可用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)(Kohler and Milstein.Nature，1975，256495-497)。將人恒定區(qū)和非人源的可變區(qū)結(jié)合的嵌合抗體可用已有的技術(shù)生產(chǎn)(Morrison et al，PNAS，1985，816851)。而已有的生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(U.S.PatNo.4946778)也可用于生產(chǎn)抗HC6蛋白的單鏈抗體。
能與HC6蛋白結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫而獲得。篩選時，必須對HC6蛋白分子進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測HC6蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的HC6蛋白水平，可以用作解釋HC6蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷HC6蛋白起作用的疾病。
HC6蛋白的多聚核苷酸可用于HC6蛋白相關(guān)疾病(尤其肝癌)的診斷和治療。在診斷方面，HC6蛋白的多聚核苷酸可用于檢測HC6蛋白的表達(dá)與否，或檢測在疾病狀態(tài)下HC6蛋白的異常表達(dá)。而HC6蛋白DNA序列可用于對活檢標(biāo)本的雜交以判斷HC6蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用HC6蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測HC6蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測HC6蛋白基因的突變也可用于診斷HC6蛋白相關(guān)的疾病(尤其是肝癌)。HC6蛋白突變的形式包括與正常野生型HC6蛋白DNA序列(如SEQ ID NO1所示的正常序列)相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的HC6蛋白核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中的各種DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
此外，由于本發(fā)明的HC6蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與來源于其他物種的同族蛋白相比，預(yù)計在施用于人時將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內(nèi)的免疫原性更低或沒有)。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1.HC6原始表達(dá)序列的獲得對17p13.3區(qū)域內(nèi)最高LOH位點D17S926對應(yīng)的P579克隆，通過九倍鳥槍法測序得到其序列，其中有1個代表新基因的EST6。PCR實驗表明，HC6在正常肝組織中表達(dá)。
1. 17p13.3區(qū)域內(nèi)LOH共同缺失最小范圍(0.5-0.6Mb)的確定用17p13.3區(qū)段內(nèi)YNZ22.2多態(tài)性位點的序列為探針，發(fā)現(xiàn)30％以上的肝癌有LOH。后來又選用17p13.3區(qū)域內(nèi)14個多態(tài)性位點標(biāo)志，采用PCR方法對22例肝細(xì)胞肝癌樣品中雜合性丟失(LOH)進(jìn)行詳細(xì)研究，確定了肝癌在17p13.3區(qū)域內(nèi)LOH的共同缺失的最小范圍(0.5-0.6Mb)，缺失頻率高達(dá)60-100％。
2.HC6原始序列的獲得對應(yīng)于17p13.3中926位點的PAC579(P579)克隆(Genome System公司提供)人DNA的插入片段(100kb)，經(jīng)九倍鳥槍法測序已得到其序列(在基康格式完成)。生物信息學(xué)分析顯示其中包含1個代表新基因的表達(dá)序列(EST)，編號為EST6，登錄號分別是AA410701(上海市腫瘤研究所趙新泰博士提供)。
3.HC6在正常肝組織中表達(dá)根據(jù)PAC579克隆內(nèi)代表新基因的EST6，設(shè)計如下引物對正常人肝cDNA文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)EST6在正常肝cDNA文庫中表達(dá)。
EST6引物
實施例2HC6的多組織膜Northern雜交人多組織Northern雜交膜片(MTN)購自Clontech公司，在42℃預(yù)雜交3-4小時(預(yù)雜交液含有50％甲酰胺，0.05M Tris，1％SDS，5′Denhardt′s 0.1％焦磷酸鈉，100mg/ml變性的精子DNA)。EST6克隆經(jīng)NotI、HindIII酶切，回收插入片段，電泳定量。取25ng DNA，加入2.5μl隨機(jī)引物與適量水，使總體積達(dá)到13.5μl。煮沸5分鐘，離心將液體甩至管底，加入2.5μl反應(yīng)緩沖液，dATP、dTTP、dGTP各1μl，1μl Klenow酶，5ml32P-a-dCTP。輕彈混勻，稍加離心。37℃溫育20分鐘，加入2μl0.5M EDTA終止反應(yīng)。1ml注射器中塞入玻璃棉，加入TE飽和的Sephadex G-50。2000rpm5分鐘。重復(fù)一次，加G-50至刻度1ml附近。用100μl TE平衡三次。標(biāo)記反應(yīng)加75μl TE，上柱，離心回收。探針100℃5分鐘變性，放至冰上。然后加入預(yù)雜交液中42℃雜交12-16小時。取膜片用1′SSC-0.05％SDS溶液42℃洗2次，每次30分鐘，再用0.1′SSC-0.1％SDS42℃洗2次，每次30分鐘，最后X光片自顯影。
結(jié)果如圖5所示。HC6原始長度僅有約700個堿基，多組織膜Northern雜交顯示該基因全長約1.8kb。HC6基因在心、胎盤、肝、腎、胰臟、骨骼肌及肺中皆有表達(dá)，但腦中不表達(dá)。
實施例3HC6的Southern雜交人肝癌和癌旁組織DNA 10μg用BamH I內(nèi)切酶徹底酶切，然后按“分子克隆”一書的方法制成Southern膜片，其后預(yù)雜交、雜交、洗膜片等程序，同Northern雜交。
結(jié)果如圖1，2和表1所示。HC6在Z11，Q27，Q29癌旁組織(L)中有兩條帶，而在肝癌組織(K)中只有一條帶，說明有缺失。Q21，Q28的條帶在肝癌組織(K)和癌旁組織(L)中的條帶位置不同，說明肝癌組織中DNA有重排。
表1HC6基因在肝癌組織中的雜合性缺失(LOH)或DNA重排
*注Z12、Z21等為樣本的編號。
鑒于HC6在肝癌組織中的雜合性缺失和重排頻率較高(77％)，于是重新命名為腫瘤相關(guān)(肝癌相關(guān))新基因6(HC6)。
實施例4HC6全長cDNA克隆(1)所用主要試劑cDNA池(Marathon-Ready cDNAs，Clontech)，聚合酶系統(tǒng)(Advantage cDNA polymerase Mix，Clontech)TA克隆系統(tǒng)(TOPO TA cloning)。
(2)引物用于RACE(Rapid amplification of cDNA ends)反應(yīng)的基因特異引物應(yīng)符合下列條件(a)長度23-28nt；(b)GC含量50-70％；(c)Tm值大于65℃。
HC6的引物3′RACEHC6-1 CAACCGAAGAGAGTACGACAGAGCCTT
巢式HC6-N1 CCGAAGAGAGTACGACAGAGCCTT5′RACEHC6-2 TGGACACGCTGAGTCTGATATGTGGT巢式HC6-N2 AACATCGGTCTGGACAGAGAAAGTGC(3)RACE反應(yīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)可在12.5μl或25μl的反應(yīng)體積中進(jìn)行，按下列條件設(shè)置RACE反應(yīng)
PCR反應(yīng)條件94℃ 1分鐘 1循環(huán)94℃ 30秒 5循環(huán)72℃ 4分鐘94℃ 30秒 5循環(huán)70℃ 4分鐘94℃ 20秒 25循環(huán)68℃ 4分鐘RACE產(chǎn)物的亞克隆取回收的PCR產(chǎn)物0.5-2.5μl，加PCR-TOPO載體0.5μl混勻室溫放置5分鐘置冰上，再按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)菌轉(zhuǎn)化，涂板37℃生長12-16小時，蘭、白斑篩選。
(4)RACE產(chǎn)物的篩選鑒定在96孔板中，每孔加入含Amp抗性的LB30μl，對于每個RACE反應(yīng)，挑取10-20個白斑重組子至上述96孔板的LB中，用該菌液作模板，直接進(jìn)行PCR反應(yīng)，初步篩出候選陽性RACE克隆。對候選陽性克隆進(jìn)行小量液擴(kuò)，抽提質(zhì)粒DNA，內(nèi)切酶酶切，電泳分析，篩選出大片段RACE克隆，再進(jìn)行PCR鑒定。
(5)RACE產(chǎn)物的測序及序列分析對候選大片段陽性克隆進(jìn)行測序，依據(jù)RACE產(chǎn)物的長度和該基因的mRNA大小，確定是否已獲得該基因的全序列，全序列即包括完整的閱讀框架，在第一個起始編碼子ATG前面相同閱讀框架內(nèi)有終止編碼子。在閱讀框架的3′端有polyA序列。另外也含有相應(yīng)的5′端和3′端非編碼區(qū)。用RACE方法獲得HC6序列和相應(yīng)的編碼框架，結(jié)果如SEQ ID N01-3所示。
實施例5HC6的序列分析(1)HC6的核苷酸序列(SEQ ID NO1)長度1771bpTCAGCTCAGA CAGGTGGTTG TTGTTGATGA GGCATAATTT AGGTAGAATT TAAATGTGTT 60TTGACGGTTG TGTTTACTCA TACAACCACT ACTCAGAATA CAGACCATTT TCCCAGGAAG 120TTCCCTCATG CCCATCTCCA GTGAGTTGGC ACCTTCATCT CCCAGATCAG CTGCTATTCT 180GACTTCTGTC ACTGTAGGTG AGTTCGTTCT TGGACTTCAT ACAAATGGAG TCATTCAGTA 240TTTTCTTTCC TTTTGTGCCT GGCTGCTTTT ACTCACCATG GCTTTTTTTG TTTTTTGTTT 300TTTGTTTTTT TTGAGACGGA GTCTCGGTCT GTCACCCAGG CTGGAGTGCA GTGGTACAAT 360CTCTGCTCAC TGCAAGCTCC GCCTCCCGGG TTCACGCCAT TCTCCTGCCT CAGCCTACCG 420AGTAGCTGGG ACTACAGGCA CCTGCCACCT CGCCCGGCTA ATTTTTTGTA TTTTTAGTAG 480AGACGGGTTT CACCGTGTTA GCCAGGAAGG TCTCGATCTC CTGACCTTGT GATCCACCCA 540CCTTGGCCTC CCAAAGGGCT GGGATTACAG GTGTGAGCCA CCCCGCCCGG CCTACTCAAC 600ATGGTTTTGA GATTCCACCA TGTAATTGCA TATCACAGCT CTTTTTTTTT AATTGCTGAC 660TGATACTCAA TTTTATGAAT ATAACAATTT GCTCATTCAT TCTTATAATG GTGGACATTT 720GGTTTATTTC TAGATTTTTT AATCTATTAT AAGGAAGACT GCCATGAACA TTCTAGTGTA 780AATCTTCTTG TAGATAGATG TTTCATTTCT CTTGAGTAAA TACCTAGGAG TAGAACTGCT 840TTTACTGTAT AAGAAAGTGT CAAACAGTCA TCGAAAGTGA TCGGACCATC GTTTGTCCAC 900GAGAGGTCCA GTAGGTCTAC ATTCTCACCA ACACTTATTT TGCTTTTTGT GGGTTTTTTA 960GCTATTCTAG CACATGCGAA ATGGTTTCAT TGGTGCAATC AAGCGATCCT TCTGCCTCAG 1020CCACCACATA GCTAGGGCTG CAGCACTATG CCCAGCTGAT GTTTTTTATG TTTGTAGAGA 1080CAGATTCTCA CTGTGTTGCC CAGGCTGGCC TCCAGTGATC CTTCCAGCTC GGCCCCACAG 1140AGGTTTAATT TTTATTTCCC TGATGACTAA TGATATTGAG CACCTTCTCA TGTGCTTATT 1200AGCCATTTAC TTATTTTTGT GAATTTTATG TTCAAGTCTT TTGTCCATTC TTTAATAATT 1260TTTAATATTT CATGATGAAA ATTCCAAATA TGCACAACCG AAGAGAGTAC GACAGAGCCT 1320TACGTGACTC TTACCTTGAC TCTGTACTGT AGTTTTTCAT CATTCCTTCG TCACTTGCAA 1380ATTCAAGTAT TTTTCCCAGC CATTAATTGA GTTTTTGAAG ATGAGGAATT TTTTATTTTG 1440GTGAAGTCCA GCTTATGAAC TTTTTCTCTT ACATGTAGCA CTTTCTCTGT CCAGACCGAT 1500GTTATATCCT GAGAACCTCT TCACCTAGGA AACCTACCAC ATATCAGACT CAGCGTGTCC 1560ATAACTTATC TTACCTCAAA TCCATTCTTC TTCCAGTAAT ATTACATAAA GGCTACTTGG 1620GAGTGTAGAT TCTGGGAAAC CTGAATCTAT GTTCCCGGGC TGCAGTCTTC AAGCTTGGCC 1680CAGATGAACT CTCTATTTAT ACTAAAAATA TGTAAATAAA TAAAAATAAA AAGAAATAAA 1740TGCTACTATA TCGAAAAAAA AAAAAAAAAA A 1771(2)HC6的氨基酸序列(SEQ ID NO2)134個氨基酸MPISSELAPS SPRSAAILTS VTVGEFVLGL HTNGVIQYFL SFCAWLLLLT 50MAFFVFCFLF FLRRSLALSP RLECSGTISA HCKLRLPGSR HSPASAYRVA 100GTTGTCHLAR LIFCIFSRDG FHRVSQEGLD LLTL* 134(3)HC6的合并序列(SEQ ID NO3)起始密碼子128ATG； 終止密碼子532TGA蛋白分子量14.7KD蛋白長度134個氨基酸(不包括終止密碼子)1T CAG CTC AGA CAG GTG GTT GTT GTT GAT GAG GCA TAA TTT AGG TAG 4647 AAT TTA AAT GTG TTT TGA CGG TTG TGT TTA CTC ATA CAA CCA CTA CTC 9495 AGA ATA CAG ACC ATT TTC CCA GGA AGT TCC CTC ATG CCC ATC TCC AGT1421 M P I S S 5143 GAG TTG GCA CCT TCA TCT CCC AGA TCA GCT GCT ATT CTG ACT TCT GTC1906 E L A P S S P R S A A I L T S V 21191 ACT GTA GGT GAG TTC GTT CTT GGA CTT CAT ACA AAT GGA GTC ATT CAG23822 T V G E F V L G L H T N G V I Q 37239 TAT TTT CTT TCC TTT TGT GCC TGG CTG CTT TTA CTC ACC ATG GCT TTT28638 Y F L S F C A W L L L L T M A F 53287 TTT GTT TTT TGT TTT TTG TTT TTT TTG AGA CGG AGT CTC GCT CTG TCA33454 F V F C F L F F L R R S L A L S 69335 CCC AGG CTG GAG TGC AGT GGT ACA ATC TCT GCT CAC TGC AAG CTC CGC38270 P R L E C S G T I S A H C K L R 85383 CTC CCG GGT TCA CGC CAT TCT CCT GCC TCA GCC TAC CGA GTA GCT GGG43086 L P G S R H S P A S A Y R V A G 101431 ACT ACA GGC ACC TGC CAC CTC GCC CGG CTA ATT TTT TGT ATT TTT AGT478102 T T G T C H L A R L I F C I F S 117479 AGA GAC GGG TTT CAC CGT GTT AGC CAG GAA GGT CTC GAT CTC CTG ACC526118 R D G F H R V S Q E G L D L L T 133527 TTG TGA TCC ACC CAC CTT GGC CTC CCA AAG GGC TGG GAT TAC AGG TGT574134 L * 134575 GAG CCA CCC CGC CCG GCC TAC TCA ACA TGG TTT TGA GAT TCC ACC ATG622623 TAA TTG CAT ATC ACA GCT CTT TTT TTT TAA TTG CTG ACT GAT ACT CAA670671 TTT TAT GAA TAT AAC AAT TTG CTC ATT CAT TCT TAT AAT GGT GGA CAT718719 TTG GTT TAT TTC TAG ATT TTT TAA TCT ATT ATA AGG AAG ACT GCC ATG 766767 AAC ATT CTA GTG TAA ATC TTC TTG TAG ATA GAT GTT TCA TTT CTC TTG 814815 AGT AAA TAC CTA GGA GTA GAA CTG CTT TTA CTG TAT AAG AAA GTG TCA 862863 AAC AGT CAT CGA AAG TGA TCG GAC CAT CGT TTG TCC ACG AGA GGT CCA 910911 GTA GGT CTA CAT TCT CAC CAA CAC TTA TTT TGC TTT TTG TGG GTT TTT 958959 TAG CTA TTC TAG CAC ATG CGA AAT GGT TTC ATT GGT GCA ATC AAG CGA 10061007 TCC TTC TGC CTC AGC CAC CAC ATA GCT AGG GCT GCA GCA CTA TGC CCA 10541055 GCT GAT GTT TTT TAT GTT TGT AGA GAC AGA TTC TCA CTG TGT TGC CCA 11021103 GGC TGG CCT CCA GTG ATC CTT CCA GCT CGG CCC CAC AGA GGT TTA ATT 11501151 TTT ATT TCC CTG ATG ACT AAT GAT ATT GAG CAC CTT CTC ATG TGC TTA 11981199 TTA GCC ATT TAC TTA TTT TTG TGA ATT TTA TGT TCA AGT CTT TTG TCC 12461247 ATT CTT TAA TAA TTT TTA ATA TTT CAT GAT GAA AAT TCC AAA TAT GCA 12941295 CAA CCG AAG AGA GTA CGA CAG AGC CTT ACG TGA CTC TTA CCT TGA CTC 13421343 TGT ACT GTA GTT TTT CAT CAT TCC TTC GTC ACT TGC AAA TTC AAG TAT 13901391 TTT TCC CAG CCA TTA ATT GAG TTT TTG AAG ATG AGG AAT TTT TTA TTT 14381439 TGG TGA AGT CCA GCT TAT GAA CTT TTT CTC TTA CAT GTA GCA CTT TCT 14861487 CTG TCC AGA CCG ATG TTA TAT CCT GAG AAC CTC TTC ACC TAG GAA ACC 15341535 TAC CAC ATA TCA GAC TCA GCG TGT CCA TAA CTT ATC TTA CCT CAA ATC 15821583 CAT TCT TCT TCC AGT AAT ATT ACA TAA AGG CTA CTT GGG AGT GTA GAT 16301631 TCT GGG AAA CCT GAA TCT ATG TTC CCG GGC TGC AGT CTT CAA GCT TGG 16781679 CCC AGA TGA ACT CTC TAT TTA TAC TAA AAA TAT GTA AAT AAA TAA AAA 17261727 TAA AAA GAA ATA AAT GCT ACT ATA TCG AAA AAA AAA AAA AAA AAA 1771(4)同源比較同源比較結(jié)果顯示，HC6蛋白N端44(4-47)個氨基酸中有17個與酵母海藻糖磷脂酶相同(38％)。
實施例6HC6基因的cDNA導(dǎo)入肝癌細(xì)胞體外試驗在本實施例中，用脂質(zhì)體試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的體外實驗。
(1)細(xì)胞株原發(fā)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系7721。
(2)DNA來源于表達(dá)質(zhì)粒pCMV/script-HC6的DNA。
(3)脂質(zhì)體LIPOFECT AMINETMReagent Kit(BRL公司)(4)培養(yǎng)液無血清培液，簡稱SF-DMEM全培液(10％小牛血清)含G418的全培液T25培養(yǎng)瓶。
(5)DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物(DNA-liposome complex)的制備
lipofectin 50μl加50μl SF-DMEM混勻。DNA(20μg在20μl TE中)加80μlSF-DMEM混勻。將稀釋的DNA加入稀釋的lipofectin溶液中，混勻置室溫5-10分鐘。加1.3ml SF-DMEM進(jìn)入DNA-lipofectin復(fù)合物中，終體積為1.5ml。
(6)轉(zhuǎn)染細(xì)胞細(xì)胞長到80％滿度為好，實驗前換培液一次。加1.5mllipofectin試劑-DNA復(fù)合物入細(xì)胞表面，輕輕搖動，鋪均勻，37℃溫育1-3小時。加入1.5ml SF-DMEM混勻，37℃生長過夜。換培液37℃過夜，細(xì)胞長到70％滿度換含G418培液以后常規(guī)換液至克隆出現(xiàn)，數(shù)克隆數(shù)。
結(jié)果如圖3-4和表2所示。在圖3中，空表達(dá)載體(pCMV/script)轉(zhuǎn)染7721細(xì)胞有較多克隆形成，而在圖4中，含有HC6基因插入片段的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染7721細(xì)胞有少數(shù)克隆形成。這表明H56在體外對肝癌細(xì)胞生長有抑制作用。
結(jié)果如下表表2 HC6在體外對肝癌細(xì)胞生長的抑制作用
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ii)發(fā)明名稱人類17號染色體短臂1區(qū)3帶3亞帶區(qū)域內(nèi)人腫瘤相關(guān)基因和編碼蛋白(iii)序列數(shù)目3(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度1771堿基(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO1TCAGCTCAGA CAGGTGGTTG TTGTTGATGA GGCATAATTT AGGTAGAATT TAAATGTGTT60TTGACGGTTG TGTTTACTCA TACAACCACT ACTCAGAATA CAGACCATTT TCCCAGGAAG120TTCCCTCATG CCCATCTCCA GTGAGTTGGC ACCTTCATCT CCCAGATCAG CTGCTATTCT180GACTTCTGTC ACTGTAGGTG AGTTCGTTCT TGGACTTCAT ACAAATGGAG TCATTCAGTA240TTTTCTTTCC TTTTGTGCCT GGCTGCTTTT ACTCACCATG GCTTTTTTTG TTTTTTGTTT300TTTGTTTTTT TTGAGACGGA GTCTCGCTCT GTCACCCAGG CTGGAGTGCA GTGGTACAAT360CTCTGCTCAC TGCAAGCTCC GCCTCCCGGG TTCACGCCAT TCTCCTGCCT CAGCCTACCG420AGTAGCTGGG ACTACAGGCA CCTGCCACCT CGCCCGGCTA ATTTTTTGTA TTTTTAGTAG480AGACGGGTTT CACCGTGTTA GCCAGGAAGG TCTCGATCTC CTGACCTTGT GATCCACCCA540CCTTGGCCTC CCAAAGGGCT GGGATTACAG GTGTGAGCCA CCCCGCCCGG CCTACTCAAC600ATGGTTTTGA GATTCCACCA TGTAATTGCA TATCACAGCT CTTTTTTTTT AATTGCTGAC660TGATACTCAA TTTTATGAAT ATAACAATTT GCTCATTCAT TCTTATAATG GTGGACATTT720GGTTTATTTC TAGATTTTTT AATCTATTAT AAGGAAGACT GCCATGAACA TTCTAGTGTA780AATCTTCTTG TAGATAGATG TTTCATTTCT CTTGAGTAAA TACCTAGGAG TAGAACTGCT840TTTACTGTAT AAGAAAGTGT CAAACAGTCA TCGAAAGTGA TCGGACCATC GTTTGTCCAC900GAGAGGTCCA GTAGGTCTAC ATTCTCACCA ACACTTATTT TGCTTTTTGT GGGTTTTTTA960GCTATTCTAG CACATGCGAA ATGGTTTCAT TGGTGCAATC AAGCGATCCT TCTGCCTCAG1020CCACCACATA GCTAGGGCTG CAGCACTATG CCCAGCTGAT GTTTTTTATG TTTGTAGAGA1080CAGATTCTCA CTGTGTTGCC CAGGCTGGCC TCCAGTGATC CTTCCAGCTC GGCCCCACAG1140AGGTTTAATT TTTATTTCCC TGATGACTAA TGATATTGAG CACCTTCTCA TGTGCTTATT1200AGCCATTTAC TTATTTTTGT GAATTTTATG TTCAAGTCTT TTGTCCATTC TTTAATAATT1260TTTAATATTT CATGATGAAA ATTCCAAATA TGCACAACCG AAGAGAGTAC GACAGAGCCT1320TACGTGACTC TTACCTTGAC TCTGTACTGT AGTTTTTCAT CATTCCTTCG TCACTTGCAA1380ATTCAAGTAT TTTTCCCAGC CATTAATTGA GTTTTTGAAG ATGAGGAATT TTTTATTTTG1440GTGAAGTCCA GCTTATGAAC TTTTTCTCTT ACATGTAGCA CTTTCTCTGT CCAGACCGAT1500GTTATATCCT GAGAACCTCT TCACCTAGGA AACCTACCAC ATATCAGACT CAGCGTGTCC1560ATAACTTATC TTACCTCAAA TCCATTCTTC TTCCAGTAAT ATTACATAAA GGCTACTTGG1620GAGTGTAGAT TCTGGGAAAC CTGAATCTAT GTTCCCGGGC TGCAGTCTTC AAGCTTGGCC1680CAGATGAACT CTCTATTTAT ACTAAAAATA TGTAAATAAA TAAAAATAAA AAGAAATAAA1740TGCTACTATA TCGAAAAAAA AAAAAAAAAA A 1771(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度134個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO2MPISSELAPS SPRSAAILTS VTVGEFVLGL HTNGVIQYFL SFCAWLLLLT 50MAFFVFCFLF FLRRSLALSP RLECSGTISA HCKLRLPGSR HSPASAYRVA 100GTTGTCHLAR LIFCIFSRDG FHRVSQEGLD LLTL* 134(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度1771堿基(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO31T CAG CTC AGA CAG GTG GTT GTT GTT GAT GAG GCA TAA TTT AGG TAG 4647 AAT TTA AAT GTG TTT TGA CGG TTG TGT TTA CTC ATA CAA CCA CTA CTC 9495 AGA ATA CAG ACC ATT TTC CCA GGA AGT TCC CTC ATG CCC ATC TCC AGT 1421 M P I S S5143 GAG TTG GCA CCT TCA TCT CCC AGA TCA GCT GCT ATT CTG ACT TCT GTC 1906 E L A P S S P R S A A I L T S V21191 ACT GTA GGT GAG TTC GTT CTT GGA CTT CAT ACA AAT GGA GTC ATT CAG 23822 T V G E F V L G L H T N G V I Q37239 TAT TTT CTT TCC TTT TGT GCC TGG CTG CTT TTA CTC ACC ATG GCT TTT 28638 Y F L S F C A W L L L L T M A F 53287 TTT GTT TTT TGT TTT TTG TTT TTT TTG AGA CGG AGT CTC GCT CTG TCA 33454 F V F C F L F F L R R S L A L S 69335 CCC AGG CTG GAG TGC AGT GGT ACA ATC TCT GCT CAC TGC AAG CTC CGC 38270 P R L E C S G T I S A H C K L R 85383 CTC CCG GGT TCA CGC CAT TCT CCT GCC TCA GCC TAC CGA GTA GCT GGG 43086 L P G S R H S P A S A Y R V A G 101431 ACT ACA GGC ACC TGC CAC CTC GCC CGG CTA ATT TTT TGT ATT TTT AGT 478102 T T G T C H L A R L I F C I F S 117479 AGA GAC GGG TTT CAC CGT GTT AGC CAG GAA GGT CTC GAT CTC CTG ACC 526118 R D G F H R V S Q E G L D L L T 133527 TTG TGA TCC ACC CAC CTT GGC CTC CCA AAG GGC TGG GAT TAC AGG TGT 574134 L * 134575 GAG CCA CCC CGC CCG GCC TAC TCA ACA TGG TTT TGA GAT TCC ACC ATG 622623 TAA TTG CAT ATC ACA GCT CTT TTT TTT TAA TTG CTG ACT GAT ACT CAA 670671 TTT TAT GAA TAT AAC AAT TTG CTC ATT CAT TCT TAT AAT GGT GGA CAT 718719 TTG GTT TAT TTC TAG ATT TTT TAA TCT ATT ATA AGG AAG ACT GCC ATG 766767 AAC ATT CTA GTG TAA ATC TTC TTG TAG ATA GAT GTT TCA TTT CTC TTG 814815 AGT AAA TAC CTA GGA GTA GAA CTG CTT TTA CTG TAT AAG AAA GTG TCA 862863 AAC AGT CAT CGA AAG TGA TCG GAC CAT CGT TTG TCC ACG AGA GGT CCA 910911 GTA GGT CTA CAT TCT CAC CAA CAC TTA TTT TGC TTT TTG TGG GTT TTT 958959 TAG CTA TTC TAG CAC ATG CGA AAT GGT TTC ATT GGT GCA ATC AAG CGA10061007 TCC TTC TGC CTC AGC CAC CAC ATA GCT AGG GCT GCA GCA CTA TGC CCA10541055 GCT GAT GTT TTT TAT GTT TGT AGA GAC AGA TTC TCA CTG TGT TGC CCA11021103 GGC TGG CCT CCA GTG ATC CTT CCA GCT CGG CCC CAC AGA GGT TTA ATT11501151 TTT ATT TCC CTG ATG ACT AAT GAT ATT GAG CAC CTT CTC ATG TGC TTA11981199 TTA GCC ATT TAC TTA TTT TTG TGA ATT TTA TGT TCA AGT CTT TTG TCC12461247 ATT CTT TAA TAA TTT TTA ATA TTT CAT GAT GAA AAT TCC AAA TAT GCA12941295 CAA CCG AAG AGA GTA CGA CAG AGC CTT ACG TGA CTC TTA CCT TGA CTC13421343 TGT ACT GTA GTT TTT CAT CAT TCC TTC GTC ACT TGC AAA TTC AAG TAT13901391 TTT TCC CAG CCA TTA ATT GAG TTT TTG AAG ATG AGG AAT TTT TTA TTT14381439 TGG TGA AGT CCA GCT TAT GAA CTT TTT CTC TTA CAT GTA GCA CTT TCT14861487 CTG TCC AGA CCG ATG TTA TAT CCT GAG AAC CTC TTC ACC TAG GAA ACC15341535 TAC CAC ATA TCA GAC TCA GCG TGT CCA TAA CTT ATC TTA CCT CAA ATC15821583 CAT TCT TCT TCC AGT AAT ATT ACA TAA AGG CTA CTT GGG AGT GTA GAT16301631 TCT GGG AAA CCT GAA TCT ATG TTC CCG GGC TGC AGT CTT CAA GCT TGG16781679 CCC AGA TGA ACT CTC TAT TTA TAC TAA AAA TAT GTA AAT AAA TAA AAA17261727 TAA AAA GAA ATA AAT GCT ACT ATA TCG AAA AAA AAA AAA AAA AAA177權(quán)利要求
1.一種分離的人HC6蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少85％相同性(a)編碼如權(quán)利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼的多肽具有SEQID NO2所示的氨基酸序列，或者該多核苷酸具有選自下組的序列SEQ ID NO3中所示的編碼區(qū)序列或全長序列。
5.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
6.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它是選自下組的一種宿主細(xì)胞(a)用權(quán)利要求5所述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)用權(quán)利要求3所述的多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
7.一種制備具有人蛋白HC6活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人蛋白HC6活性的多肽。
8.一種能與權(quán)利要求1所述的人HC6蛋白特異性結(jié)合的抗體。
9.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
10.一種檢測肝細(xì)胞是否發(fā)生癌變或存在癌變易感性的方法，其特征在于，它包括步驟檢測肝細(xì)胞樣品中HC6轉(zhuǎn)錄本與正常的HC6轉(zhuǎn)錄本相比是否有變化，有變化就表示該肝細(xì)胞發(fā)生癌變或存在癌變易感性；或者檢測肝細(xì)胞樣品中HC6蛋白的活性與正常的HC6蛋白相比是否有變化，有變化就表示該肝細(xì)胞發(fā)生癌變或存在癌變易感性。
11.一種檢測肝癌的試劑盒，其特征在于，它包括(1)特異性擴(kuò)增人HC6基因的引物對，(2)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物與正常的HC6基因相比是否存在變化所需的試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的與腫瘤相關(guān)的人蛋白HC6,編碼此多肽的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生該多肽的方法。本發(fā)明還公開了此多肽用于診斷和治療諸如癌癥等疾病的方法。本發(fā)明還公開了抗此多肽的拮抗劑及其治療作用。本發(fā)明還公開了編碼這種與腫瘤相關(guān)的人蛋白的多核苷酸的用途。
文檔編號C07H21/00GK1343723SQ00125280
公開日2002年4月10日 申請日期2000年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月19日
發(fā)明者顧健人, 溫傳俊, 覃文新, 趙新泰, 萬大方 申請人:上海市腫瘤研究所