專(zhuān)利名稱(chēng)：T2r味覺(jué)受體及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及最近鑒定的哺乳動(dòng)物化學(xué)感受G蛋白耦聯(lián)受體、這些受體的家族和編碼這些受體的基因和cDNA。本發(fā)明尤其涉及最近鑒定的在味覺(jué)信號(hào)發(fā)生上活躍的哺乳動(dòng)物化學(xué)感受G蛋白耦聯(lián)受體、這些受體的家族、編碼這些受體的基因和cDNA，并涉及在分析、發(fā)現(xiàn)味覺(jué)調(diào)節(jié)子時(shí)這類(lèi)受體、基因和cDNA的使用方法。
背景技術(shù)：
味覺(jué)系統(tǒng)提供了關(guān)于外界化學(xué)組分的感受信息。味覺(jué)轉(zhuǎn)換是動(dòng)物化學(xué)觸發(fā)的感受中最復(fù)雜的形式之一，整個(gè)動(dòng)物界，從后生動(dòng)物(metazoans)到最復(fù)雜的脊椎動(dòng)物都普遍存在。通常認(rèn)為哺乳動(dòng)物有五種基本味覺(jué)形式甜、苦、酸、咸和鮮(umami，谷氨酸鈉的味道)。
每種不同的味覺(jué)形式被認(rèn)為是由截然不同的傳導(dǎo)途徑來(lái)介導(dǎo)的。這些途徑被認(rèn)為是由受體介導(dǎo)，例如代謝趨向性(metabotropic)受體或變力(inotropic)受體，這些受體表達(dá)于味覺(jué)受體細(xì)胞亞類(lèi)(subsets)中。例如，一些受體被認(rèn)為是由G蛋白耦聯(lián)受體介導(dǎo)的，而其它味覺(jué)被認(rèn)為是由通道蛋白介導(dǎo)的(例如參見(jiàn)，Kawamura等，鮮味入門(mén)一種基本味道(Introduction to UmamiA Basic Taste)(1987)；Kinnamon等，生理學(xué)年度綜述(Ann.Rev.Physiol.)，54715-31(1992)；Lindemann，生理學(xué)綜述(Physiol.Rev.)，76718-66(1996)；Stewart等，美國(guó)生理學(xué)雜志(Am.J.Physiol.)，2721-26(1997))。
在哺乳動(dòng)物中，味覺(jué)受體細(xì)胞被組裝成味蕾，這些味蕾?gòu)V泛分布在舌上皮細(xì)胞的不同乳頭中。輪廓乳頭位于舌的最后部，包含成百上千個(gè)味蕾。與此相對(duì)照的是，位于舌后側(cè)面的葉狀乳頭含有幾十到幾百個(gè)味蕾。此外，位于舌前部的菌狀乳頭，僅有一個(gè)或幾個(gè)味蕾。
根據(jù)不同種類(lèi)，每個(gè)味蕾含有50-150個(gè)細(xì)胞，包括前體細(xì)胞、支持細(xì)胞和味覺(jué)受體細(xì)胞。例如參見(jiàn)，Lindemann，生理學(xué)綜述(Physiol.Rev.)，76718-66(1996)。受體細(xì)胞基部布滿(mǎn)傳入神經(jīng)末梢，通過(guò)腦干和丘腦的突觸，這些神經(jīng)末梢將信息傳遞給大腦皮層的味覺(jué)中樞。闡明味覺(jué)細(xì)胞信號(hào)發(fā)生和信息處理的機(jī)制對(duì)于理解味覺(jué)的功能、調(diào)節(jié)和感知是非常重要的。
大量動(dòng)物生理學(xué)研究表明味覺(jué)受體細(xì)胞可能對(duì)不同化學(xué)刺激選擇性地產(chǎn)生反應(yīng)(例如參見(jiàn)，Akabas et al.，Sc ience，2421047-50(1988)；gilbertson et al.，J.Gen.Physiol.，100803-24(1992)；Bernhardtet al.，J.Physiol.，490325-36(1996)；Cummings et al.，J.Neurophysiol.，751256-63(1996))。特別是，表達(dá)這些受體的細(xì)胞在暴露在特定化學(xué)刺激下，通過(guò)去極化產(chǎn)生動(dòng)作電位從而引發(fā)味覺(jué)感受。通常認(rèn)為動(dòng)作電位在嘗覺(jué)傳入神經(jīng)元突觸處觸發(fā)了神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而啟動(dòng)了神經(jīng)途徑上的信號(hào)發(fā)生，由此介導(dǎo)味覺(jué)感知(例如參見(jiàn)，Roper，神經(jīng)科學(xué)年度綜述(Ann.Rev.Neurosci.)，12329-53(1989))。雖然如此，目前對(duì)于味覺(jué)感受由何種方式引發(fā)仍了解甚少(例如參見(jiàn)，Margolskee，BioEssays，15645-50(1993)；Avenet等J.MembraneBiol.，1121-8(1989))。
如上所述，味覺(jué)受體特異性地識(shí)別能夠引發(fā)特定味覺(jué)感受的分子。這些分子在此處也被稱(chēng)作“味覺(jué)元(tastant)”。許多味覺(jué)受體屬于7-跨膜受體超家族(Hoon等，細(xì)胞(Cell)96451(1999)；Adler等，細(xì)胞100693(2000))，同樣也被認(rèn)為是G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)。G蛋白耦聯(lián)受體控制許多生理功能，如內(nèi)分泌功能、外分泌功能、心率、脂解作用、糖代謝和跨膜信號(hào)發(fā)生。許多這類(lèi)受體的生物化學(xué)分析和分子克隆已經(jīng)揭示了關(guān)于這些受體功能的許多基本原理。
例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,691,188描述了如何在配體(ligand)與GPCR結(jié)合后，這個(gè)受體可能發(fā)生構(gòu)象改變，從而導(dǎo)致G蛋白激活。G蛋白包含三個(gè)亞基一個(gè)與脒基核苷酸結(jié)合的α亞基，一個(gè)β亞基和一個(gè)γ亞基。G蛋白在兩種形式中循環(huán)，取決于GDP和GTP是否結(jié)合到α亞基上。GDP結(jié)合上之后，G蛋白以異三體(heterotrimer)形式存在即Gαβγ復(fù)合物。當(dāng)GTP結(jié)合后，α亞基從異三體上解離，剩下Gβγ復(fù)合物。當(dāng)Gαβγ復(fù)合物在細(xì)胞膜上與激活的G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合時(shí)，GTP交換結(jié)合GDP的速度加快，結(jié)合的Gα亞基從Gαβγ復(fù)合物中解離的速度亦隨之加快。游離Gα亞基和Gβγ復(fù)合物因此能夠傳遞一個(gè)信號(hào)到多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑下游環(huán)節(jié)。這些事件形成不同細(xì)胞信號(hào)現(xiàn)象多樣性的基礎(chǔ)，包括例如味覺(jué)和/或嗅覺(jué)被認(rèn)為是神經(jīng)學(xué)感受感知的信號(hào)現(xiàn)象。
眾多的人類(lèi)和其它真核化學(xué)感受受體全部或部分序列現(xiàn)在都已清楚。(例如參見(jiàn)，Pilpel，Y和Lancet，D，蛋白質(zhì)科學(xué)(Protein Science)，8969-977(1999)；Mombaerts，P.，神經(jīng)科學(xué)年度綜述，22487-50(1999)；EP0867508A2，US 5874243，WO 92/17585，WO 95/18140，WO 97/17444，WO 99/67282)。盡管人們對(duì)于味覺(jué)細(xì)胞功能的精神物理學(xué)和生理學(xué)了解很多，但對(duì)于介導(dǎo)感受信號(hào)反應(yīng)的分子和途徑缺乏了解。新型味覺(jué)受體和味覺(jué)信號(hào)發(fā)生分子的鑒定和分離能夠產(chǎn)生化學(xué)和遺傳調(diào)節(jié)味覺(jué)傳導(dǎo)途徑的新方法。例如，如果有受體和通道蛋白，就能夠篩選味覺(jué)活性的高親和力激動(dòng)劑、拮抗劑、反向激動(dòng)劑和調(diào)節(jié)劑。這些味覺(jué)調(diào)節(jié)化合物在藥品和食品工業(yè)十分有益，它們可以改進(jìn)多種消費(fèi)品的味道，或阻斷一些令人不快的味道，如某些產(chǎn)品的苦味。
發(fā)明概述本發(fā)明部分強(qiáng)調(diào)更好理解化學(xué)感受受體和化學(xué)刺激之間相互作用的必要性。因此，本發(fā)明提供新型味覺(jué)受體和使用這些受體的方法以及編碼該類(lèi)受體的基因和cDNA等等，來(lái)鑒定能用于調(diào)節(jié)味覺(jué)傳導(dǎo)的分子。
本發(fā)明尤其涉及一種最近發(fā)現(xiàn)的G蛋白耦聯(lián)受體家族，和編碼這些受體的基因和cDNA。這些受體被認(rèn)為主要參與苦味味覺(jué)傳導(dǎo)，但同樣也可能參與從其它味覺(jué)形式的信號(hào)轉(zhuǎn)換。
本發(fā)明提供了哺乳動(dòng)物包括人類(lèi)中味覺(jué)感知的描述方法和/或預(yù)知味覺(jué)感知的方法。優(yōu)選地，這些方法可以通過(guò)使用這些受體和使用編碼此處所述受體的基因來(lái)完成。
為此，本發(fā)明的一個(gè)目的就是提供一種哺乳動(dòng)物G蛋白受體新家族，在此稱(chēng)為T(mén)2R，T2R在味覺(jué)感知中具有活性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供能夠保留味覺(jué)元結(jié)合活性的這些T2R的片段和變體(variants)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼這種T2R及其片段或變體的核酸序列或分子。
本發(fā)明的另一個(gè)目的仍是提供表達(dá)載體，其中包含編碼這種T2R或其片段或變體的核酸序列，這些序列可操作性地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或參與正向或負(fù)向基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的其它序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的仍是提供功能性表達(dá)至少一種T2R或其片段或變體的人類(lèi)或非人類(lèi)細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)目的仍是提供T2R融合蛋白質(zhì)或多肽，包含至少一種這種T2R中的至少一個(gè)片段。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種分離的編碼T2R多肽的核酸分子，該分子包含一個(gè)核酸序列，其與選自下列的核酸序列至少50％，優(yōu)選75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19和23和其保守性修飾的變體序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種分離的核酸分子，該分子包含一個(gè)核酸序列，其編碼一條多肽，其氨基酸序列與選自下列的氨基酸序列至少35％到50％，優(yōu)選60％、75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，24和其保守性修飾的變體序列，其中該片段長(zhǎng)度至少是20，優(yōu)選40，60，80，100，150，200或250個(gè)氨基酸。任選地，片段可以是能結(jié)合抗-T2R抗體的抗原性片段。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供分離的多肽，其包含所述片段的變體，其中最多在10，優(yōu)選5，4，3，2或1個(gè)氨基酸殘基處存在變異。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供這些T2R的激動(dòng)劑拮抗劑，或其片段或變體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供哺乳動(dòng)物包括人類(lèi)中味覺(jué)感知的展示方法和/或預(yù)知味覺(jué)感知的方法。優(yōu)選地，這些方法可以通過(guò)使用此處所述的T2R受體或其片段或變體，和使用編碼該T2R的基因或其片段或變體來(lái)完成。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)特定味覺(jué)感知的新型分子或分子組合。這些分子或組合可以由以下方法得到對(duì)于已知分子或分子組合確定其在哺乳動(dòng)物中的味覺(jué)感知值；對(duì)于一種或多種未知分子或分子組合確定其在哺乳動(dòng)物中的味覺(jué)感知值；比較一種或多種未知組合物和一種或多種已知組合物在哺乳動(dòng)物中的味覺(jué)感知值；選擇能夠引發(fā)哺乳動(dòng)物特定味覺(jué)感知的分子或分子組合；和合并兩種或多種未知分子或分子組合形成分子或分子組合，其能夠引發(fā)一種特定的哺乳動(dòng)物味覺(jué)感知。合并步驟產(chǎn)生單獨(dú)分子或分子組合，其能夠引發(fā)特定的哺乳動(dòng)物味覺(jué)感知。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供篩選一種或多種化合物以鑒定是否存在哺乳動(dòng)物可察覺(jué)的味道的方法，包括把上述所指的一種或多種化合物與至少一種公開(kāi)的T2R、其片段或變體接觸的步驟，其中優(yōu)選地哺乳動(dòng)物是人。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種刺激味覺(jué)的方法，包括以下步驟對(duì)于此處所述多數(shù)T2R中的每一個(gè)，或其變體的片段，優(yōu)選地人類(lèi)T2R來(lái)說(shuō)，確定T2R與味覺(jué)元相互作用程度；合并多個(gè)化合物，其中每個(gè)化合物都有與一種或多種T2R預(yù)先確定的相互作用，以達(dá)到一起提供模仿味覺(jué)模式的受體-刺激樣式。通過(guò)在此描述的任何一個(gè)結(jié)合或報(bào)告試驗(yàn)可以確定味覺(jué)元與T2R的作用。多數(shù)化合物然后可以合并形成混合物。需要的話(huà)，多數(shù)化合物中的一種或多種可以共價(jià)結(jié)合。結(jié)合后的化合物基本上刺激至少50％、60％、70％、75％、80％或90％或全部可以實(shí)質(zhì)上由味覺(jué)元刺激的受體。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供一種方法，其中針對(duì)多數(shù)T2R、或其片段或變體，對(duì)多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化合物進(jìn)行測(cè)試，以確定每一個(gè)T2R和每一標(biāo)準(zhǔn)化合物的相互作用程度，由此產(chǎn)生每一標(biāo)準(zhǔn)化合物的受體刺激模式。這些受體刺激模式可以存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)存儲(chǔ)介質(zhì)上的相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中。本方法還可以包括提供一個(gè)味覺(jué)的所希望的受體刺激模式；將所希望的受體刺激模式與相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)比較；并確定能夠與所希望的受體刺激模式最密切相匹配的一種或多種標(biāo)準(zhǔn)化合物組合。本方法還進(jìn)一步包括將標(biāo)準(zhǔn)化合物組合成一種或多種已經(jīng)確定的組合物來(lái)刺激味覺(jué)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供展示哺乳動(dòng)物對(duì)特定物質(zhì)的味覺(jué)感知的方法，包括以下步驟提供X1到Xn值代表該脊椎動(dòng)物n個(gè)T2R中每一個(gè)的刺激量，其中n大于或等于4，n大于或等于12；n大于或等于24，或n大于或等于40；從該值中產(chǎn)生味覺(jué)感知的定量表示法。T2R可能是一個(gè)在此公開(kāi)的味覺(jué)受體，或其片段或變體，表示法可能包含一個(gè)點(diǎn)或n維空間的體積，可能包含一個(gè)圖或一個(gè)譜，或可能包含一個(gè)定量表示法矩陣。同樣，提供的步驟可能包括將多數(shù)重組產(chǎn)生的T2R、或其片段或變體與試驗(yàn)組合物接觸，并定量測(cè)量該組合物與該受體的作用。
本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)目的是提供一種預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物味覺(jué)感知的方法(該感知是由一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生未知的味覺(jué)感知)，包括以下步驟提供X1到Xn值代表該脊椎動(dòng)物n個(gè)T2R中每一個(gè)的刺激量，其中n大于或等于4，n大于或等于12；n大于或等于24，或n大于或等于40；對(duì)于一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生已知的味覺(jué)感知；并針對(duì)在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生已知味覺(jué)感知的一種或多種分子或分子組合，從該值中產(chǎn)生哺乳動(dòng)物味覺(jué)感知的定量表示法，提供X1到Xn值代表該脊椎動(dòng)物n個(gè)T2R中每一個(gè)的刺激量，其中n大于或等于4，n大于或等于12；n大于或等于24，或n大于或等于40；對(duì)于一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生未知的味覺(jué)感知；針對(duì)在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生未知味覺(jué)感知的一種或多種分子或分子組合，從該值中產(chǎn)生一個(gè)哺乳動(dòng)物味覺(jué)感知的定量表示法，通過(guò)比較哺乳動(dòng)物對(duì)一種或多種分子或分子組合產(chǎn)生未知味覺(jué)感知的定量表示法和哺乳動(dòng)物對(duì)一種或多種分子或分子組合產(chǎn)生已知味覺(jué)感知的定量表示法，預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物的味覺(jué)感知，該味覺(jué)感知是由一種或多種分子或分子組合產(chǎn)生的未知味覺(jué)感知。本方法使用的T2R可能包括在此公開(kāi)的味覺(jué)受體、或其片段或變體。
發(fā)明詳述本發(fā)明因此提供分離的編碼味覺(jué)細(xì)胞特異性G蛋白耦聯(lián)受體(“GPCR”)核酸分子，和它們編碼的多肽。這些核酸分子和它們編碼的多肽是味覺(jué)細(xì)胞特異性GPCR T2R家族成員。更進(jìn)一步地，最近鑒定的編碼候選苦味味覺(jué)受體的T2R基因家族(數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)為AF227129-AF227149和AF240765-AF240768)促進(jìn)了在公共核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找和鑒定相關(guān)基因。本發(fā)明涉及最近鑒定的這個(gè)家族的成員。有關(guān)T2R家族更詳盡的信息可參閱Adler等，Cell，100693-702(2000)和Chandrashekar等，Cell，100703-11(2000)，在此全文引用以上兩者以供參考。
本發(fā)明的編碼T2R蛋白和多肽的核酸可以按照WO 00/35374公開(kāi)的方法，從多種來(lái)源經(jīng)遺傳工程化、擴(kuò)增、合成、和/或重組表達(dá)方法分離，該專(zhuān)利在此全文引用用以供參考。
本發(fā)明尤其提供編碼味覺(jué)細(xì)胞特異性G蛋白耦聯(lián)受體新家族的核酸。這些核酸和編碼受體在此處被稱(chēng)為味覺(jué)細(xì)胞特異性G蛋白耦聯(lián)受體(“GPCR”)的“T2R”家族成員。通常認(rèn)為味覺(jué)細(xì)胞特異性GPCR是味覺(jué)傳導(dǎo)途徑的組分，特別是苦味味覺(jué)傳導(dǎo)途徑的組分，參與物質(zhì)的味覺(jué)檢測(cè)，如苦味物質(zhì)、6-正-丙基硫代尿嘧啶(PROP)、八乙酸蔗糖酯(soa)、十一乙酸蜜三糖酯(rua)、denatonium、甘氨酸銅(copper glycinate)和奎寧。但是，T2R可能還與其它味覺(jué)形式有關(guān)。
此外，通常認(rèn)為T(mén)2R家族成員可能與其它T2R家族成員、其它味覺(jué)細(xì)胞特異性GPCR或其組合結(jié)合發(fā)揮作用，由此影響化學(xué)感受的味覺(jué)傳導(dǎo)。例如，一般認(rèn)為T(mén)2R家族成員在相同味覺(jué)受體細(xì)胞型中可能共同表達(dá)，共表達(dá)的受體可能物理上相互作用，形成異二聚體(heterodimeric)味覺(jué)受體。或者，共同表達(dá)的受體均有可能單獨(dú)與同一類(lèi)型配體結(jié)合，而它們的組合結(jié)合可能會(huì)導(dǎo)致一種特異感知的味覺(jué)。
本發(fā)明也提供篩選這些味覺(jué)細(xì)胞特異性GPCR調(diào)節(jié)子的方法，如活化子(activator)、抑制子(inhibitor)、刺激子(stimulator)、增強(qiáng)子、激動(dòng)劑和拮抗劑等。這些味覺(jué)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)子對(duì)于味覺(jué)信號(hào)發(fā)生途徑的藥理和遺傳調(diào)節(jié)等十分有用。這些篩選方法可用于鑒定味覺(jué)細(xì)胞活性的高親和力激動(dòng)劑和拮抗劑。這些調(diào)節(jié)化合物然后能用于食品和藥物工業(yè)來(lái)定制味道，例如降低或掩蓋食品和藥品的苦味。
因此，本發(fā)明提供味道調(diào)節(jié)的驗(yàn)定法，其中T2R家族成員作為調(diào)節(jié)子對(duì)味覺(jué)傳導(dǎo)影響的直接或間接報(bào)告分子。例如GPCR可用于例如在體內(nèi)、體外和離體(ex vivo)測(cè)量配體結(jié)合、離子濃度、膜電位、電流、離子流量、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)傳導(dǎo)、受體配體相互作用、第二信使?jié)舛鹊茸兓脑囼?yàn)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，T2R家族成員可以通過(guò)與第二報(bào)告分子如綠色熒光蛋白質(zhì)結(jié)合而作為間接報(bào)告子(reporter)(例如參見(jiàn)，Mistili&Spector，Nature Biotechnology，15961-964(1997))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，T2R家族成員在細(xì)胞中重組表達(dá)，可以通過(guò)測(cè)量Ca2+水平和其它細(xì)胞內(nèi)信息如cAMP、cGMP或IP3的變化來(lái)分析GPCR活性對(duì)味覺(jué)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，T2R多肽在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，與促進(jìn)質(zhì)膜運(yùn)輸(trafficking)或成熟并定向通過(guò)分泌途徑的異源序列一起表達(dá)為嵌合受體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該異源序列是視紫紅質(zhì)序列，例如視紫紅質(zhì)N端片段。這種嵌合T2R受體可以在任何真核細(xì)胞如HEK-293細(xì)胞中表達(dá)。優(yōu)選地，這些細(xì)胞包含功能性G蛋白，例如Gα15，該蛋白能夠使嵌合受體與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)發(fā)生途徑耦聯(lián)或與信號(hào)蛋白如磷脂酶C耦聯(lián)。可以用任何標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)這些細(xì)胞中的嵌合受體的活化，例如通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中FURA-2依賴(lài)的熒光來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣的變化。如果宿主細(xì)胞不表達(dá)合適的G蛋白，它們可以用編碼混棲G蛋白的基因(例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朥S 60/243,770中所描述的)轉(zhuǎn)染。該專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)诖巳囊米鳛閰⒖肌?br> 分析味覺(jué)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)子的方法包括體外配體結(jié)合試驗(yàn)，其中使用T2R多肽，其部分，如細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)或其組合、或包含T2R家族成員一種或多種T2R家族成員結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白；卵母細(xì)胞、原代細(xì)胞或組織培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)T2R基因，或表達(dá)T2R片斷或融合蛋白，例如視紫紅質(zhì)融合蛋白；T2R家族成員磷酸化和去磷酸化；結(jié)合到GPCR上的G蛋白；拘捕素(arrestin)結(jié)合；內(nèi)部化(internalization)；配體結(jié)合試驗(yàn)；電壓、膜電位和電阻變化；離子流量試驗(yàn)；細(xì)胞內(nèi)第二信使如cGMP、cAMP和三磷酸肌醇的變化；細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的變化；神經(jīng)遞質(zhì)釋放。
此外，本發(fā)明提供檢測(cè)T2R核酸和蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，用來(lái)進(jìn)行味覺(jué)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)和味覺(jué)受體細(xì)胞的特異性鑒定的研究。T2R家族成員也提供親子和法醫(yī)鑒定有益的核酸探針。T2R基因也可作為用以鑒定味覺(jué)受體細(xì)胞，如葉狀、菌狀、輪廓、geschmackstreifen和會(huì)厭味覺(jué)受體細(xì)胞，特別是苦味味覺(jué)感受的味(轉(zhuǎn))導(dǎo)素(gustducin)表達(dá)細(xì)胞的有用的核酸探針。而且，該核酸和它們編碼的多肽可用作仔細(xì)研究味覺(jué)誘導(dǎo)的行為的探針。
T2R多肽也可用于制備鑒定味覺(jué)受體細(xì)胞的單克隆和多克隆抗體。可以使用如下技術(shù)如mRNA反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增、總RNA或多聚A+RNA的提取、Nothern印跡、點(diǎn)印跡、原位雜交、RNA酶保護(hù)、S1酶切、探明DNA微芯片陣列、Western印跡等進(jìn)行味覺(jué)受體細(xì)胞的鑒定。
T2R基因和其編碼的多肽包括相關(guān)的味覺(jué)細(xì)胞特異性G蛋白耦聯(lián)受體家族。在基因組內(nèi)，這些基因以單獨(dú)形式存在或位于幾個(gè)基因簇(cluster)中的一個(gè)之內(nèi)。位于人類(lèi)基因組區(qū)域12p13的一個(gè)基因簇包含至少24個(gè)基因，而位于7q33的另一基因簇包含至少7個(gè)基因。總之，從不同生物體內(nèi)共鑒定了60多種截然不同的T2R家族成員，包括幾個(gè)推定的假基因(pseudogenes)。據(jù)估計(jì)人類(lèi)基因組可能包括大約40種不同的T2R基因，編碼大約30種功能性人類(lèi)受體。
已經(jīng)把一些T2R基因和原先定位的參與苦味味覺(jué)控制的位點(diǎn)聯(lián)系起來(lái)。例如，人類(lèi)T2R1位于人5p15間隔，其中已經(jīng)精確定位了一個(gè)能夠影響品嘗PROP物質(zhì)的能力的基因座(參閱Reed等，Am.J.Hum.Genet.，641478-80(1999))。另外，位于人類(lèi)基因組區(qū)域12p13的基因簇，與小鼠6號(hào)染色體的一個(gè)區(qū)域相關(guān)，已證實(shí)其含有很多苦味味覺(jué)基因，通常認(rèn)為這些基因影響如八乙酸蔗糖酯、十一乙酸蜜三糖酯、放線(xiàn)(菌)酮和奎寧的味覺(jué)感受或感知(例如參見(jiàn)，Lush等，Genet.Res.，6167-74(1995))。這些聯(lián)系顯示T2R基因參與不同物質(zhì)特別是苦味物質(zhì)的味覺(jué)檢測(cè)。另外，小鼠T2R5對(duì)放線(xiàn)(菌)酮具有特異性感受，因此人們假設(shè)mT2R5基因的突變可產(chǎn)生放線(xiàn)(菌)酮-非-感受的表型。同樣，人類(lèi)T2R4和小鼠T2R8能夠?qū)enatonium和PROP特異性反應(yīng)。
從功能上講，T2R基因包含7種相關(guān)的跨膜G蛋白耦聯(lián)受體的家族，其被認(rèn)為參與味覺(jué)傳導(dǎo)，可能與G蛋白相互作用以介導(dǎo)味覺(jué)信號(hào)傳導(dǎo)(例如參見(jiàn)，F(xiàn)ong，Cell Signal，8217(1996)；Baldwin，Curr.Opin.CellBiol.，6180(1994))。特別是認(rèn)為T(mén)2R以配體特異的方式與G蛋白味(轉(zhuǎn))導(dǎo)素相互作用。
從結(jié)構(gòu)上來(lái)說(shuō)，T2R家族成員核苷酸序列可能編碼相關(guān)多肽家族，所述多肽包含一個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、7個(gè)跨膜域和一個(gè)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域域。來(lái)自其它物種的相關(guān)T2R家族基因與SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19和23，或其保守性修飾變體中至少有50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，可選地100、200、500或更多核苷酸長(zhǎng)度的區(qū)域，至少有20-30％核苷酸序列相同；或編碼多肽與SEQ ID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20和24，或其保守性修飾變體中的至少約25個(gè)氨基酸，任選地50到100個(gè)氨基酸的區(qū)域，至少大約30-40％氨基酸序列相同。已知T2R基因選擇性表達(dá)于舌、上顎上皮、葉狀乳頭、geschmackstreifen和會(huì)厭味覺(jué)受體細(xì)胞亞類(lèi)。與此相反，研究表明T2R基因較少表達(dá)于菌狀乳頭。而且，已知T2R基因在味(轉(zhuǎn))導(dǎo)素-陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)選擇性表達(dá)。
已經(jīng)鑒定了T2R家族成員特征性的幾個(gè)共有氨基酸序列或結(jié)構(gòu)域。具體而言，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)T2R家族成員通常包含與T2R跨膜區(qū)I、T2R跨膜區(qū)II、T2R跨膜區(qū)III、T2R跨膜區(qū)IV、T2R跨膜區(qū)V和T2R跨膜區(qū)VII至少大約有50％，可選地55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，或更高的一致性的序列。通過(guò)同一性、特異雜交或擴(kuò)增、或與針對(duì)結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的抗體的特異結(jié)合，這些保守的結(jié)構(gòu)域因而可用于鑒定T2R家族的成員。這些T2R跨膜區(qū)具有下列氨基酸序列T2R家族共有序列1
E(F/A)(I/V/L)(V/L)G(I/V)(L/V)GN(G/T)FI(V/A)LVNC(IM)DW(SEQ ID NO25)T2R家族共有序列2(D/G)(F/L)(I/L)L(T/I)(G/A/S)LAISRI(C/G/F)L(SEQ ID NO26)T2R家族共有序列3NH(L/F)(S/T/N)(L/I/V)W(F/L)(A/T)T(C/S/N)L(S/N/G)(I/V)(SEQ ID NO27)T2R家族共有序列4FY(F/C)LKIA(N/S)FS(H/N)(P/S)(L/I/V)FL(W/Y)LK(SEQ ID NO28)T2R家族共有序列5LLI(I/F/V)SLW(K/R)H(S/T)(K/R)(Q/K)(M/I)(Q/K)(SEQ ID NO29)T2R家族共有序列6HS(F/L)(I/V)LI(L/M)(G/S/T)N(P/S/N)KL(K/R)(Q/R)(SEQ IDNO30)人類(lèi)T2R核苷酸和氨基酸序列的特異區(qū)可用于鑒定人類(lèi)或其它物種的多態(tài)變體或等位基因或同源體(homologs)。這些鑒定可以體外進(jìn)行，例如在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件或PCR(例如，使用編碼T2R的上述共有序列的引物)和測(cè)序，或通過(guò)在一個(gè)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中使用這些序列信息用以和其它核苷酸序列進(jìn)行比較。一般來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)比較大約25個(gè)氨基酸或更多，如50-100個(gè)氨基酸的序列來(lái)鑒定T2R家族成員的多態(tài)變體或等位基因。氨基酸相同性大約30-40％，可選地50-60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％，或95-99％或更高通常表明蛋白質(zhì)是T2R家族成員的多態(tài)變體，或等位基因，或是同源體或直向進(jìn)化同源物(ortholog)。序列相同性可由下面公開(kāi)的方法計(jì)算。如果額外存在至少一處與原先鑒定的T2R家族共有序列完全等同或至少有75％的相同性的保守序列，幾乎可以肯定又一陽(yáng)性T2R基因?qū)儆赥2R家族。序列比較由下述任何一種序列比較算法實(shí)現(xiàn)。特異性結(jié)合T2R多肽或其中保守區(qū)的抗體也可用于鑒定T2R蛋白的等位基因、種間同源體和多態(tài)變體。
通過(guò)檢驗(yàn)推定的T2R多肽的味覺(jué)細(xì)胞的特異性表達(dá)可以確認(rèn)多態(tài)變體，或等位基因，和相關(guān)T2R同源體或直向進(jìn)化同源物。通常，具有在此公開(kāi)的氨基酸序列的T2R多肽可作為與推定的T2R多肽比較的陽(yáng)性對(duì)照，以證明T2R家族成員的等位基因或同源體的鑒定。這類(lèi)同源體或等位基因同樣具有G蛋白耦聯(lián)受體的7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。
T2R家族成員的核苷酸和氨基酸序列信息還可以用來(lái)在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中構(gòu)建味覺(jué)細(xì)胞特異性多肽模型。這些模型然后可用于鑒定可激活或抑制T2R受體蛋白的化合物。這些調(diào)節(jié)T2R家族成員活性的化合物可用于研究T2R基因和多肽在味覺(jué)傳導(dǎo)中的作用。
T2R家族成員的分離提供了分析味覺(jué)傳導(dǎo)抑制子和活化子的方法。使用測(cè)量如配體結(jié)合；磷酸化和去磷酸化；G蛋白結(jié)合；G蛋白激活；調(diào)節(jié)分子結(jié)合；電壓、膜電位和電導(dǎo)變化；離子流量；細(xì)胞內(nèi)第二信使如cAMP、cGMP和IP3；和細(xì)胞內(nèi)鈣水平等的的體內(nèi)(基于動(dòng)物的試驗(yàn))和體外測(cè)定法，可以利用生物活性的T2R蛋白質(zhì)測(cè)試作為味覺(jué)傳導(dǎo)子(transducer)，特別是苦味味覺(jué)傳導(dǎo)子的T2R抑制子和激活劑。使用T2R家族成員鑒定的這些活化子和抑制子可用于味覺(jué)傳導(dǎo)的進(jìn)一步研究和鑒定特異性味覺(jué)激動(dòng)劑和拮抗劑。這些活化子和抑制子作為藥品和食品調(diào)味劑十分有益，例如可以降低食品或藥品中的苦味。
本發(fā)明同樣提供分析方法，特別是高通量分析方法，用來(lái)鑒定與T2R多肽相互作用和/或調(diào)節(jié)T2R多肽的分子。在眾多方法中，可使用T2R家族成員的獨(dú)特部分，例如細(xì)胞外、跨膜、或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或區(qū)。在眾多的實(shí)施方案中，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)或其組合可以結(jié)合固體基質(zhì)，并用來(lái)例如分離配體、激動(dòng)劑、反向激動(dòng)劑、拮抗劑、或任何其它能夠結(jié)合到T2R多肽和/或調(diào)節(jié)T2R多肽細(xì)胞外域或跨膜區(qū)活性的分子。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，T2R多肽的區(qū)域，例如細(xì)胞外、跨膜或細(xì)胞內(nèi)區(qū)域，與異源多肽融合，由此形成嵌合多肽，如具有GPCR活性的嵌合多肽。這些嵌合多肽十分有用，例如可用于鑒定T2R多肽的配體、激動(dòng)劑、反向激動(dòng)劑、拮抗劑或其它調(diào)節(jié)子的試驗(yàn)中。另外，這些嵌合多肽還可用于產(chǎn)生具有新的配體結(jié)合專(zhuān)一性、調(diào)節(jié)模式、信號(hào)傳導(dǎo)途徑或其它此類(lèi)性質(zhì)的新型味覺(jué)受體，或用于產(chǎn)生具有新的配體結(jié)合專(zhuān)一性、調(diào)節(jié)模式、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等的組合特性的新型味覺(jué)受體。同樣T2R核酸和T2R多肽的表達(dá)可用于產(chǎn)生舌部拓?fù)鋱D，該圖可潛在地用于研究舌味覺(jué)受體細(xì)胞和腦部味覺(jué)感受神經(jīng)元之間的關(guān)系。特別是檢測(cè)T2R的方法可潛在地用于鑒定對(duì)苦味物質(zhì)敏感的味覺(jué)細(xì)胞。編碼人T2R基因的染色體定位同樣可潛在地用于鑒定由T2R家族成員引起或與T2R家族成員相關(guān)的疾病、突變和性狀。
總體上講，本發(fā)明提供分離的T2R家族成員核酸分子和它們編碼的味覺(jué)受體。本發(fā)明不但還包括核酸和具有特定氨基酸序列的多肽序列，而且還包括片段，特別是，例如40，60，80，100，150，200，或250個(gè)核苷酸，或更多核苷酸的片段，以及例如10，20，30，50，70，100，或150個(gè)氨基酸，或更多氨基酸的蛋白質(zhì)片段。
預(yù)想的各種保守性突變和替換都在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，利用已知的包括PCR、基因克隆、cDNA定位突變、宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染和體外轉(zhuǎn)錄重組基因技術(shù)方法進(jìn)行氨基酸替換都將在本領(lǐng)域技術(shù)人員的水平之內(nèi)。由此可以篩選到功能活性的變體。
更加特別的是，此處公開(kāi)的核酸序列的特異性區(qū)域和它們編碼的多肽，可能用于鑒定序列的多態(tài)變體、種間同源體和等位基因。該鑒定可以體外如在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下，進(jìn)行PCR和測(cè)序，或使用在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中的序列信息與其它核酸序列比較。在單一物種種群內(nèi)T2R基因的不同等位基因?qū)τ诖_定種群成員間等位基因序列差異是否與味覺(jué)感知差異有關(guān)也十分有益。
本發(fā)明的核酸分子通常是無(wú)內(nèi)含子(intronless)型，并編碼通常具有大約300個(gè)殘基長(zhǎng)的推定的T2R蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)疏水作圖分析預(yù)測(cè)，其包含7個(gè)跨膜區(qū)，表明它們屬于G蛋白耦聯(lián)受體(7TM)超家族。除了總體結(jié)構(gòu)相似性之外，此處鑒定的每一個(gè)T2R都具有T2R家族成員的特征性序列標(biāo)志。特別是所有序列包含與上述鑒定的T2R家族共有序列非常相近的匹配。結(jié)合所有上述提到鑒定的基因和編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，明顯提示它們代表T2R受體家族的新成員。
同樣可以推測(cè)T2R受體和它們的基因可單獨(dú)或與其它類(lèi)型味覺(jué)受體組合，用于開(kāi)發(fā)檢測(cè)系統(tǒng)和試驗(yàn)方法，用于化學(xué)鑒定被這些受體特異性識(shí)別的不同類(lèi)型的分子，以及用于診斷和研究目的。
本發(fā)明的核酸序列和實(shí)施本發(fā)明中使用的其它核酸，不管是RNA、cDNA、基因組DNA、載體、病毒或其雜合子(hybrids)，可以從多種來(lái)源中分離、經(jīng)遺傳工程化、擴(kuò)增、和/或重組表達(dá)。可以使用任何重組表達(dá)系統(tǒng)，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞，還包括如細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)或植物系統(tǒng)。
A.T2R多肽的鑒定本發(fā)明T2R蛋白和多肽的氨基酸序列可以通過(guò)編碼核酸序列的推定翻譯得到鑒定。這些多種多樣的氨基酸序列和編碼核酸序列可以按照許多方法互相比較或與其它序列比較。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，此處公開(kāi)的假基因可用于在本領(lǐng)域已知的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定功能性等位基因或相關(guān)基因。
例如在序列比較中，通常一條序列作為參考序列，與另外的試驗(yàn)序列進(jìn)行比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將試驗(yàn)和參考序列輸入計(jì)算機(jī)，必要時(shí)指定亞序列坐標(biāo)，并指定序列算法程序參數(shù)。可以使用默認(rèn)程序參數(shù)，如下面就BLASTN和BLASTP程序所述，或指定替代參數(shù)。序列比較算法然后根據(jù)程序參數(shù)計(jì)算試驗(yàn)序列相對(duì)于參考序列的百分比序列相同性。
此處所用的“比較窗口”包括參考任何毗鄰位置數(shù)的區(qū)段，(選自20到600，通常大約50到大約200，更經(jīng)常是大約100到大約150)，其中經(jīng)過(guò)兩個(gè)序列優(yōu)化比對(duì)后，可以將序列與相同號(hào)碼的鄰近位置的參考序列比較。比對(duì)序列以進(jìn)行比較的方法在本領(lǐng)域已經(jīng)廣為人知。可以例如通過(guò)使用Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源性算法，通過(guò)Needleman&Wunsch，J Mol.Biol.48443(1970)的同源性比對(duì)算法，使用Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444(1988)相似性搜尋方法，通過(guò)這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施方案GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，和TFASTA in Wisconsin Genetics SoftwarePackage，Genetics Computer Group，575 Science，Dr.，Madison，WI)，或使用手工比對(duì)和肉眼觀察(例如參見(jiàn)，Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等.，eds.1995增刊))的方法進(jìn)行比較序列的優(yōu)化比對(duì)。
適于確定序列同一性和序列相似性百分比的算法優(yōu)選的實(shí)施例是BLAST和BLAST2.0算法，其分別由Altschul等，Nuc.Acids Res.253389-3402(1977)和Altschul等，J Mol.Biol.，215403-410(1990)描述。執(zhí)行BLAST分析的軟件已經(jīng)可以從國(guó)家生物工程信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開(kāi)得到。該算法包括首先通過(guò)確定查詢(xún)序列W長(zhǎng)度中的短字來(lái)確定高分序列對(duì)(HSPs)，當(dāng)與數(shù)據(jù)庫(kù)中一個(gè)序列的相同長(zhǎng)度的字比對(duì)時(shí)，其或是匹配或是符合一些陽(yáng)性值閾值分?jǐn)?shù)T。T此處是指鄰近字分?jǐn)?shù)閾值(Altschul等，Nuc.Acids Res.253389-3402(1977)和Altschul等，J Mol.Biol.，215403-410(1990))。這些初始的鄰近字值(word hit)作為種子，以啟動(dòng)搜索尋找包含它們的更長(zhǎng)的HSPs。沿著序列向兩邊延伸該字值，直到累積比對(duì)分?jǐn)?shù)能被增加。對(duì)于核苷酸序列，用參數(shù)M(一對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)勵(lì)分?jǐn)?shù)；總是＞0)和N(錯(cuò)配殘基的懲罰分?jǐn)?shù)；總是＜0)來(lái)計(jì)算累積分?jǐn)?shù)。對(duì)于氨基酸序列，使用計(jì)分矩陣來(lái)計(jì)算累積分?jǐn)?shù)。字值向每個(gè)方向的延伸當(dāng)出現(xiàn)下列情形即停止累積比對(duì)分?jǐn)?shù)X量從其最大獲得值下降；由于一種或多種負(fù)分?jǐn)?shù)殘基比對(duì)結(jié)果導(dǎo)致累積分?jǐn)?shù)變?yōu)?或以下；或到達(dá)了序列任一末端。BLAST算法參數(shù)W，T和X決定比對(duì)的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的默認(rèn)值為字長(zhǎng)(W)為11，預(yù)期值(E)為10，M＝5，N＝-4和兩條鏈的比較。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默認(rèn)值為字長(zhǎng)為3，預(yù)期值(E)為10，和BLOSUM62計(jì)分矩陣(參見(jiàn)Henikoff&Henikoff，PNAS，8910915(1989))中比對(duì)(B)為50，預(yù)期值(E)為10，M＝5，N＝-4和兩條鏈的比較。
另一個(gè)有益的算法實(shí)施例是PILEUP。PILEUP從一組相關(guān)序列中產(chǎn)生多重序列比對(duì)結(jié)果，它使用漸進(jìn)的、配對(duì)比對(duì)方式來(lái)顯示關(guān)系和序列同一性百分比。它也能畫(huà)出一個(gè)所謂的“樹(shù)”或“樹(shù)狀圖”來(lái)顯示聚類(lèi)關(guān)系用以產(chǎn)生比對(duì)(例如參見(jiàn)圖2)。PILEUP使用一個(gè)簡(jiǎn)化了的Feng&Doolittle的漸進(jìn)式比對(duì)方法，J Mol.Evol.35351-360(1987)。該方法與Higgins&Sharp，CABIOS 5151-153(1989)描述的方法相似。該程序可以比對(duì)多達(dá)300條序列，每條的最大允許長(zhǎng)度為5000個(gè)核苷酸或氨基酸。多重比對(duì)程序由兩條最相似序列的配對(duì)比對(duì)開(kāi)始，產(chǎn)生兩條比對(duì)序列的簇(cluster)。該簇然后與下一個(gè)最相關(guān)序列或比對(duì)序列的簇比對(duì)。通過(guò)兩條單獨(dú)序列配對(duì)比對(duì)的簡(jiǎn)單延伸，兩個(gè)簇序列就被比對(duì)了。通過(guò)一系列漸進(jìn)式、配對(duì)比對(duì)，完成最后的比對(duì)。通常指定序列比較區(qū)的特異序列和它們的氨基酸或核苷酸坐標(biāo)及程序參數(shù)后，運(yùn)行程序。使用PILEUP，將參考序列與其它試驗(yàn)序列比較，使用如下參數(shù)來(lái)確定百分序列同一關(guān)系默認(rèn)缺口加權(quán)(3.00)，默認(rèn)缺口長(zhǎng)度加權(quán)(0.10)和末端缺口加權(quán)。PILEUP可以從GCG序列分析軟件包中獲得，例如版本7.0(Devereaux等，Nuc.Acids Res.12387-395(1984))。使用BLASTP算法將這些蛋白質(zhì)序列與公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)中所有已知的蛋白質(zhì)比較，顯示它們與T2R家族成員有很高的同源性，每一個(gè)T2R家族序列與至少一種已知的該家族成員有至少大約50％，和優(yōu)選地至少55％、至少60％、至少65％，和最優(yōu)選地70％的氨基酸同一性。
B.定義除非另有所指，此處使用的下列術(shù)語(yǔ)各自具有描述給它們的意義。
“味覺(jué)細(xì)胞”包括神經(jīng)上皮細(xì)胞，其成組后形成舌的味蕾，例如葉狀、菌狀和輪廓細(xì)胞(例如參見(jiàn)，Roper等，Ann.Rev.Neurosci.12329-353(1989))。味覺(jué)細(xì)胞同樣也見(jiàn)于上顎和其它組織，如食管和胃。
“T2R”指G蛋白耦聯(lián)受體家族中的一種或多種成員，這些受體在舌和上顎上皮的味覺(jué)細(xì)胞中選擇性表達(dá)，如葉狀、geschmackstreifen、會(huì)厭、菌狀和輪廓細(xì)胞，以及食管和胃細(xì)胞中表達(dá)(例如參見(jiàn)，Adler等，Cell，100693-702(2000))。該家族同樣也被稱(chēng)作“SF家族”(例如參見(jiàn)，PCT/US00/24821，在此全文引用以作參考)。這些味覺(jué)細(xì)胞可以被鑒定，因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)特異性分子如味(轉(zhuǎn))導(dǎo)素，味覺(jué)細(xì)胞特異性G蛋白，或其它味覺(jué)特異性分子(McLaughin等，Nature，357563-69(1992))。味覺(jué)受體細(xì)胞也可以通過(guò)形態(tài)學(xué)(例如參見(jiàn)，Roper，如前)來(lái)鑒定。T2R家族成員具有作為味覺(jué)傳導(dǎo)受體的能力。T2R家族成員也被稱(chēng)作“GR”家族，對(duì)于嘗覺(jué)(gustatory)受體，或稱(chēng)“SF”家族。
“T2R”核酸編碼擁有7個(gè)跨膜區(qū)的GPCR家族，其具有“G蛋白耦聯(lián)受體活性”，例如在一些酶如磷脂酶C和腺苷酸環(huán)化酶的刺激下，它們可以響應(yīng)外界刺激而與G蛋白結(jié)合并促進(jìn)產(chǎn)生第二信使如IP3、cAMP、cGMP和Ca2+(關(guān)于GPCR結(jié)構(gòu)和功能的描述，參見(jiàn)例如，F(xiàn)ong，如前，和Baldwin，如前)。這些核酸編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)于味覺(jué)細(xì)胞，特別是與苦味味覺(jué)元反應(yīng)的表達(dá)味(轉(zhuǎn))導(dǎo)素的味覺(jué)細(xì)胞。一個(gè)單獨(dú)的味覺(jué)細(xì)胞可能包括多種截然不同的T2R多肽。
術(shù)語(yǔ)“T2R”家族因此包括具有以下特征的多態(tài)變體、等位基因、突變體和同源體(1)與SEQ ID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24在一個(gè)大約25個(gè)氨基酸，可選地50-100個(gè)氨基酸的窗口上相比，具有大約30-40％氨基酸序列同一性，更加特異地大約40，50，60，70，75，80，85，90，95，96，97，98，或99％的氨基酸序列同一性；(2)特異性地結(jié)合針對(duì)某個(gè)免疫原(包含選自SEQ ID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24，和其保守性修飾的變體的氨基酸序列)產(chǎn)生的抗體；(3)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可以特異性地與選自SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19和23，和其保守性修飾的變體的序列進(jìn)行雜交(大小至少大約100，可選地至少大約500-1000個(gè)核苷酸)；(4)包括與選自SEQ ID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的氨基酸序列至少有大約40％同一性的序列；或(5)能被引物擴(kuò)增，該引物在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下可以與編碼SEQ ID NOS25-30的簡(jiǎn)并引物的相同序列進(jìn)行雜交。
如上所述，雖然T2R基因在蛋白質(zhì)和DNA水平表現(xiàn)出實(shí)質(zhì)的序列差異，但所有迄今分離的T2R基因均包含一定的共有序列，特別是與先前鑒定的T2R共有序列(SEQ ID NOS25-30)等同或具有或至少有70-75％同一性的區(qū)域。
從拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上來(lái)說(shuō)，某些化學(xué)感受GPCR具有“N端結(jié)構(gòu)域”、“細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域”、包含7個(gè)跨膜區(qū)和相關(guān)胞漿和細(xì)胞外環(huán)的“跨膜結(jié)構(gòu)域”，“胞漿區(qū)”和“C端結(jié)構(gòu)域”(例如參見(jiàn)，Hoon等，Cell，96541-551(1999)；Buck&Axel，Cell，65175-187(1991))。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以從結(jié)構(gòu)上鑒定這些區(qū)域，例如鑒定親水和疏水結(jié)構(gòu)域的序列分析程序(參見(jiàn)例如，Stryer，Biochemistry，(3rded.1988)；另見(jiàn)任何一款基于因特網(wǎng)的序列分析程序，例如可以在dot.imgen.bcm.tmc.edu上可以找到的程序)。這些區(qū)域?qū)τ谥苽淝逗系鞍缀捅景l(fā)明的體外試驗(yàn)，例如配體結(jié)合試驗(yàn)十分有用。
“細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域”因而指從細(xì)胞膜向外突出并暴露到細(xì)胞外一邊的T2R多肽的結(jié)構(gòu)域。這些區(qū)域一般包括暴露到細(xì)胞外一邊的“N端結(jié)構(gòu)域”，以及暴露到細(xì)胞外一邊的跨膜結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞外環(huán)，即跨膜區(qū)2和3之間、跨膜區(qū)4和5之間、跨膜區(qū)6和7之間的細(xì)胞外環(huán)。“N端結(jié)構(gòu)域”區(qū)起始于N末端并延伸至靠近跨膜區(qū)起始部位。這些細(xì)胞外區(qū)對(duì)于體外可溶性和固相配體結(jié)合試驗(yàn)十分有益。另外，下面描述的跨膜區(qū)還可以與細(xì)胞外區(qū)組合或單獨(dú)地參與配體結(jié)合，因而對(duì)于體外配體結(jié)合試驗(yàn)也十分有用。
“跨膜結(jié)構(gòu)域”包括7個(gè)“跨膜區(qū)”，是指位于胞漿膜內(nèi)的T2R多肽的結(jié)構(gòu)域，并同樣可能包括相關(guān)胞漿(細(xì)胞內(nèi))和細(xì)胞外環(huán)，同樣被稱(chēng)作跨膜“區(qū)”(regions)。使用由Kyte&Doolittle，J.Mol.Biol.，157105-32(1982)，或Stryer(如前)描述的標(biāo)準(zhǔn)方法，可以對(duì)7個(gè)跨膜區(qū)和細(xì)胞外和胞漿環(huán)進(jìn)行鑒定。
“胞漿結(jié)構(gòu)域”是指朝向細(xì)胞內(nèi)部的T2R的結(jié)構(gòu)域，例如“C端結(jié)構(gòu)域”和跨膜結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞內(nèi)環(huán)，例如跨膜區(qū)1和2之間、跨膜區(qū)3和4之間、跨膜區(qū)5和6之間的細(xì)胞內(nèi)環(huán)。“C端結(jié)構(gòu)域”是指跨越最后跨膜結(jié)構(gòu)域末端和蛋白質(zhì)的C末端的區(qū)域，它通常位于細(xì)胞胞漿內(nèi)。
術(shù)語(yǔ)“7-跨膜受體”指屬于跨膜蛋白超家族的多肽，它擁有7個(gè)結(jié)構(gòu)域，橫穿胞漿膜7次(因此，這7個(gè)區(qū)被稱(chēng)作跨膜”或“TM”結(jié)構(gòu)域TM I至TM VII)。嗅覺(jué)家族和某些味覺(jué)受體均屬于這個(gè)超家族。7-跨膜受體多肽具有相似和特征性的一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，下面將會(huì)詳細(xì)介紹。
術(shù)語(yǔ)“配體結(jié)合區(qū)”是指從化學(xué)感受受體衍生出的序列，或從味覺(jué)受體衍生出的序列，其基本上引入了跨膜結(jié)構(gòu)域II到VII(TM II到VII)。該區(qū)可以結(jié)合配體，特別是味覺(jué)元。
術(shù)語(yǔ)“胞漿膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域”或簡(jiǎn)稱(chēng)“轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域”指與示例轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域(5’-MNGTEGPNFYVPFSNKTGVV；SEQID NO31)功能相當(dāng)?shù)亩嚯慕Y(jié)構(gòu)域。這些多肽結(jié)構(gòu)域，當(dāng)摻入到多肽編碼序列的氨基端時(shí)能夠有效地把雜合(“融合”)蛋白“伴隨(chaperone)”或“轉(zhuǎn)位”至胞漿膜。這個(gè)特定的“轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域”最初是從人視紫紅質(zhì)受體多肽(一種7跨膜受體)的氨基端衍生出來(lái)。另外一個(gè)轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域是從牛視紫紅質(zhì)中衍生出來(lái)，對(duì)于協(xié)助轉(zhuǎn)位作用十分有益。視紫紅質(zhì)衍生序列在將7-跨膜融合蛋白轉(zhuǎn)位至胞漿膜非常有效。
“功能等價(jià)”是指在相似條件下，結(jié)構(gòu)域?qū)⑿路g的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位至胞漿膜的能力和效率與示例序列SEQ ID NO31一樣有效；用此處描述的方法可以測(cè)量和比較相對(duì)效率(用定量方式)。屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)常規(guī)篩選它們?cè)诩?xì)胞(哺乳動(dòng)物、蟾蜍等)中將新合成多肽轉(zhuǎn)位至胞漿膜的效率與20個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的轉(zhuǎn)位域SEQ ID NO31一樣的方式進(jìn)行鑒定。
在測(cè)試能夠調(diào)節(jié)T2R家族成員介導(dǎo)的味覺(jué)傳導(dǎo)化合物的試驗(yàn)中，短語(yǔ)“功能性效果”包括確定任何一個(gè)間接或直接受受體影響的參數(shù)，例如功能性、物理和化學(xué)效果。它包括體內(nèi)、體外和離體(ex vivo)時(shí)配體結(jié)合，離子流量、膜電位、電流、轉(zhuǎn)錄、G蛋白結(jié)合、GPCR磷酸化或去磷酸化、信號(hào)傳導(dǎo)、受體配體作用、第二信使?jié)舛?如cAMP、cGMP、IP3，或細(xì)胞內(nèi)Ca2+)等指標(biāo)的變化，還包括其它生理學(xué)效果例如神經(jīng)遞質(zhì)或激素釋放的增加或減少等。
“確定功能性效果”是指檢驗(yàn)增加或減少間接或直接受T2R家族成員影響的參數(shù)的化合物，例如功能性、物理和化學(xué)效果。這些功能性效果可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何手段進(jìn)行測(cè)量，例如光譜特征(例如熒光、吸收、折射率)、流體動(dòng)力學(xué)(如形狀)，色譜的或溶解性、膜片鉗試驗(yàn)(patch clamping)、電壓敏感性染色、全細(xì)胞電流、放射性同位素流出、可誘導(dǎo)標(biāo)志物、卵母細(xì)胞T2R基因表達(dá)的變化；組織培養(yǎng)細(xì)胞的T2R表達(dá)；T2R基因的轉(zhuǎn)錄激活；配體結(jié)合試驗(yàn)；電壓，膜電位和電導(dǎo)變化；離子流量試驗(yàn)；細(xì)胞內(nèi)第二信使如cAMP、cGMP和三磷酸肌醇(IP3)的變化；細(xì)胞內(nèi)鈣水平的變化和神經(jīng)遞質(zhì)釋放等。
T2R基因或蛋白質(zhì)的“抑制子”、“活化子”和“調(diào)節(jié)子”可交替使用，是指利用體內(nèi)、體外味覺(jué)傳導(dǎo)試驗(yàn)鑒定的抑制性、激活性和調(diào)節(jié)性的分子，例如配體、激動(dòng)劑、拮抗劑和它們的同源體和模擬物(mimetics)。例如抑制子是指例如結(jié)合后能夠部分或完全阻斷刺激、降低、防止、延遲激活、負(fù)向調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)或使之失活、脫敏的化合物，如拮抗劑。活化子是指例如結(jié)合后能夠刺激、增加、打開(kāi)、激活、促進(jìn)、增強(qiáng)活化、正向調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)或使之增敏的化合物，如激動(dòng)劑。調(diào)節(jié)子包括例如能夠改變受體與以下物質(zhì)作用的化合物能夠結(jié)合活化子或抑制子的細(xì)胞外蛋白質(zhì)(例如ebnerin和其它疏水載體家族成員)；G蛋白；激酶(例如參與受體去激活和脫敏的視紫紅質(zhì)激酶和β腎上腺素能受體激酶類(lèi)似物)；和同樣能夠使受體去活化和脫敏的拘捕素(arrestin)。調(diào)節(jié)子包括遺傳修飾的T2R家族成員，例如活性改變的成員，以及天然產(chǎn)生的和合成的配體、拮抗劑、激動(dòng)劑、小分子化合物等。
這些抑制子和活化子的試驗(yàn)包括，例如，在細(xì)胞或細(xì)胞膜內(nèi)表達(dá)T2R家庭成員，在有或無(wú)味覺(jué)元如苦味味覺(jué)元的情況下，應(yīng)用推定的調(diào)節(jié)子化合物，然后確定對(duì)上述味覺(jué)傳導(dǎo)的功能性影響。包含T2R家族成員的樣品或試驗(yàn)經(jīng)過(guò)潛在的活化子、抑制子或調(diào)節(jié)子處理后，與不用抑制子、活化子或調(diào)節(jié)子的對(duì)照樣品比較，以試驗(yàn)調(diào)節(jié)的程度。對(duì)照樣品(未經(jīng)調(diào)節(jié)子處理)指定為100％的相對(duì)T2R活性值。當(dāng)T2R活性值相對(duì)于對(duì)照大約有80％活性，可選地50％或25-0％時(shí)，就判定獲得了對(duì)T2R的抑制。當(dāng)T2R活性值相對(duì)于對(duì)照有110％活性，可選地150％、可選地200-500％或1000-3000％時(shí)，就判定獲得了T2R的活化。
此處所用術(shù)語(yǔ)“純化的”、“基本純化的”和“分離的”是指不含其它不同化合物的狀態(tài)(這些不同化合物與本發(fā)明化合物在自然狀態(tài)下是結(jié)合在一起的)。優(yōu)選地，以給定樣品的重量計(jì)，“純化的”、“基本純化的”和“分離的”是指該組合物占樣品的0.5％、1％、5％、10％或20％，最優(yōu)選地至少50％或75％的質(zhì)量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些術(shù)語(yǔ)用來(lái)指(以重量計(jì))至少占指定樣品95％的質(zhì)量的本發(fā)明化合物。當(dāng)涉及核酸或蛋白質(zhì)時(shí)，此處所用術(shù)語(yǔ)“純化的”、“基本純化的”和“分離的”核酸和蛋白質(zhì)是指不同于哺乳動(dòng)物體、特別是人體內(nèi)天然的純化狀態(tài)或濃度的一種純化狀態(tài)或濃度。大于哺乳動(dòng)物體特別是人體內(nèi)天然的純化狀態(tài)或濃度任何程度的純化或濃度，包括(1)從其它相關(guān)結(jié)構(gòu)或化合物中純化出來(lái)了或(2)與哺乳動(dòng)物體、特別是人體內(nèi)非正常相關(guān)的結(jié)構(gòu)和化合物結(jié)合，均屬于“分離的”定義范疇。此處描述的核酸或蛋白質(zhì)或核酸或蛋白質(zhì)種類(lèi)可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法和過(guò)程分離，或與自然狀態(tài)下無(wú)關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)和化合物相連。
當(dāng)涉及核酸或多肽時(shí)，此處所用術(shù)語(yǔ)“分離的”是指一種純化狀態(tài)或濃度，其不同于哺乳動(dòng)物體、特別是人體內(nèi)天然產(chǎn)生的狀態(tài)或濃度。大于哺乳動(dòng)物體、特別是人體內(nèi)天然產(chǎn)生的狀態(tài)或濃度任何程度的純化或濃度，包括(1)從其它天然產(chǎn)生的相關(guān)結(jié)構(gòu)或化合物中純化出來(lái)，或(2)與機(jī)體內(nèi)無(wú)正常關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)和化合物相結(jié)合均屬于此處所用“分離的”定義范疇。此處描述的核酸或多肽可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法和過(guò)程分離，或與自然下無(wú)正常關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)和化合物結(jié)合。
此處所用術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增”是指如下詳述的為產(chǎn)生或檢測(cè)重組子或天然表達(dá)的核酸的任何合適的擴(kuò)增方法學(xué)的應(yīng)用。例如，本發(fā)明提供方法和試劑(例如，特異性寡核苷酸引物對(duì))，用于體內(nèi)或體外擴(kuò)增(例如，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)PCR)本發(fā)明天然表達(dá)的(例如，基因組或mRNA)或重組(例如，cDNA)核酸(例如，本發(fā)明的味覺(jué)元結(jié)合序列)。
術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”是指用來(lái)在任何細(xì)胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中、體內(nèi)或體外、組成性或誘導(dǎo)表達(dá)本發(fā)明的核酸序列的任何重組表達(dá)系統(tǒng)。該術(shù)語(yǔ)包括線(xiàn)性或環(huán)狀表達(dá)系統(tǒng)。該術(shù)語(yǔ)包括游離狀態(tài)或已整合至宿主細(xì)胞基因組中的表達(dá)系統(tǒng)。該表達(dá)系統(tǒng)可具有自我復(fù)制或不具有自我復(fù)制(即在細(xì)胞內(nèi)引發(fā)短暫的表達(dá))的能力。本術(shù)語(yǔ)包括僅含有重組核酸轉(zhuǎn)錄所需的的最小元件的重組表達(dá)“盒。”術(shù)語(yǔ)“文庫(kù)”指一種含有不同核酸或多肽分子的混合制劑，例如重組產(chǎn)生的感受區(qū)文庫(kù)，特別是由簡(jiǎn)并引物對(duì)擴(kuò)增核酸產(chǎn)生的味覺(jué)受體配體結(jié)合區(qū)文庫(kù)，或分離的含有擴(kuò)增的配體結(jié)合區(qū)的載體集合，或每個(gè)細(xì)胞都隨機(jī)轉(zhuǎn)染了至少一個(gè)編碼味覺(jué)受體的載體的細(xì)胞混合物。
術(shù)語(yǔ)“核酸”或“核酸序列”指或者是單鏈或者是雙鏈形式的脫氧核糖核酸或核糖核酸寡核苷酸。該術(shù)語(yǔ)包括核酸，即含有天然核苷酸已知類(lèi)似物的寡核苷酸。該術(shù)語(yǔ)還包括有合成主鏈的核酸樣結(jié)構(gòu)。
除非另有所指，特定的核酸序列也暗指其保守性修飾的變體(例如，簡(jiǎn)并密碼子替換)和互補(bǔ)序列，以及清楚指出的序列。特別是，簡(jiǎn)并密碼子替換可以通過(guò)產(chǎn)生其中一個(gè)或多個(gè)待定密碼子的第三位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基替代的序列來(lái)實(shí)現(xiàn)(Batzer等，Nucleic Acid Res.，195081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.，2602605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes，891-98(1994))。術(shù)語(yǔ)核酸可與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸(polynucleotide)交替使用。
術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”此處可交替使用，是指氨基酸殘基多聚物。本術(shù)語(yǔ)適用于序列中一種或多種氨基酸殘基是相應(yīng)天然產(chǎn)生氨基酸的人工化學(xué)類(lèi)似物的氨基酸多聚物，以及天然產(chǎn)生的氨基酸多聚物和非天然產(chǎn)生的氨基酸多聚物。
此處描述的“轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域”、“配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”和嵌合受體組分也包括具有與示例序列基本一致的結(jié)構(gòu)和活性的“類(lèi)似物(analogs)”或“保守性變體”和“模擬物(mimetics)”(“肽模擬物”)。因此，術(shù)語(yǔ)“保守性變體”或“類(lèi)似物”或“摸擬物”指具有修飾過(guò)氨基酸序列的多肽，這類(lèi)修飾基本上不影響多肽的(保守性變體的)在此描述的結(jié)構(gòu)和/或活性。這包括氨基酸序列的保守性修飾變異，即替換、增加或缺失對(duì)于蛋白質(zhì)活性無(wú)關(guān)緊要的氨基酸殘基，或使用相同屬性的殘基進(jìn)行氨基酸替換(例如酸性、堿性、正電、負(fù)電、極性或非極性等)，以至于替換關(guān)鍵的氨基酸也基本上不影響結(jié)構(gòu)和/或活性。
更具體而言，“保守性修飾的變體”對(duì)氨基酸和核酸序列都適用。至于特定核酸序列，保守性修飾變體是指編碼同樣或基本同樣氨基酸序列的核酸，或當(dāng)核酸并不編碼氨基酸序列時(shí)，是指與它基本相同的序列。由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性，大量功能性相同的核酸分子編碼任意特定的蛋白質(zhì)。
例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼丙氨酸。因此，在由密碼子決定的丙氨酸每一個(gè)位置，密碼子可以改變?yōu)橛伤龅娜魏尾桓淖兙幋a多肽的密碼子。
這些核酸變異是“沉默變異”，是一種保守性修飾的變異。此處的每一條編碼多肽的核酸序列也描述了該核酸的每一個(gè)可能的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以判斷核酸中的每個(gè)密碼子(除了通常情況下是甲硫氨酸的唯一密碼子的AUG，和通常情況下是色氨酸的唯一密碼子的TGG之外)都可以被修飾而產(chǎn)生功能完全相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每一個(gè)沉默變異隱含在每個(gè)描述的序列中。
能夠提供功能相似的氨基酸保守性替換表在本領(lǐng)域眾所周知。例如，一個(gè)選擇保守性替換的示例性指南包括(原始?xì)埢浜笫鞘纠鎿Q)ala/gly或ser；arg/lys；asn/gln或his；asp/glu；cys/ser；gln/asn；gly/asp；gly/ala或pro；his/asn或gln；ile/leu或val；leu/ile或val；lys/arg或gln或glu；met/leu或tyr或ile；phe/met或leu或tyr；ser/thr；thr/ser；trp/tyr；tyr/trp或phe；val/ile或leu。另一示例指南使用下列六組，每組包含保守性互相替換的氨基酸1)丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴(lài)氨酸(I)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；(參見(jiàn)例如，Creighton，Proteins，W.H.Freeman和Company(1984)；Schultz和Schimer，Principles of Protein Structure，Springer-Vrlag(1979))。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解上述確定的替換并不是唯一的可能保守性替換。例如，出于某種原因，人們可能將所有帶電的氨基酸互為保守性替換體，不管它們是正電還是負(fù)電。另外，在編碼序列中的個(gè)別替換、缺失或增加從而導(dǎo)致變化、增加或缺失單一氨基酸或小部分氨基酸同樣也被認(rèn)為是“保守性修飾變異。”術(shù)語(yǔ)“模擬物”和“肽模擬物”指合成的化學(xué)化合物，它具有本發(fā)明多肽的基本上同樣結(jié)構(gòu)和/或功能特征，例如轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、配體結(jié)合區(qū)或嵌合受體。模擬物既可以是完全由化學(xué)合成的非天然氨基酸類(lèi)似物組成，或是部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸類(lèi)似物的嵌合分子。該模擬物同樣可以具有任意量的天然氨基酸保守性替換，只要這種替換也同樣基本上不改變類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)和/或活性即可。
與本發(fā)明中屬于保守性變體的多肽一樣，可利用常規(guī)試驗(yàn)確定模擬物是否屬于本發(fā)明的范圍，即它的結(jié)構(gòu)和/或活性基本上沒(méi)有被改變。多肽模擬物組合物可包括任何非天然結(jié)構(gòu)組分的組合，其通常來(lái)源于三個(gè)結(jié)構(gòu)基團(tuán)a)非天然酰胺鍵(“肽鍵”)的殘基連接基團(tuán)；b)非天然殘基替代天然產(chǎn)生的氨基酸殘基；或c)可誘導(dǎo)二級(jí)結(jié)構(gòu)模仿的殘基，即能夠誘導(dǎo)或穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)例如β轉(zhuǎn)角、γ轉(zhuǎn)角、β折疊片和α螺旋構(gòu)象等的殘基。當(dāng)多肽的所有殘基或一些殘基是通過(guò)化學(xué)手段而非天然肽鍵加入的時(shí)，該多肽就可以被鑒定為模擬物。單獨(dú)的肽模擬物殘基可以通過(guò)肽鍵、其它的化學(xué)鍵或耦聯(lián)手段連接，諸如戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯、雙功能馬來(lái)酰亞胺、N，N’-雙環(huán)己基碳二酰亞胺(DCC)或N，N’-二異丙基碳二酰亞胺(DIC)。可以成為傳統(tǒng)酰胺鍵(“肽鍵”)的替代物連接基團(tuán)包括，例如酮亞甲基(例如-C(＝O)-CH2-替換成-C(＝O)-NH-)、氨甲基(CH2-NH)、乙烯基、烯烴基(CH＝CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑、噻唑、retroamide、硫代酰胺或酯(參見(jiàn)例如，Spatola，Chemistry andBiochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins，Vol.7，pp267-357，Marcell Dekker，Peptide Backbone Modifications，NY(1983))。包含所有或部分非天然殘基替代天然產(chǎn)生殘基的多肽也可以被鑒定為模擬物；非天然殘基在科學(xué)和專(zhuān)利文獻(xiàn)中有詳盡描述。
“標(biāo)記”或“可檢測(cè)的部分”是可以被光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué)手段檢測(cè)到的組分。例如有用標(biāo)記包含32P、熒光素、電子致密試劑、酶(例如通常用于ELISA)、生物素、地高辛、或半抗原和可被檢測(cè)(例如通過(guò)在肽中摻入放射標(biāo)記)或用來(lái)檢測(cè)可特異性與肽反應(yīng)的抗體的蛋白質(zhì)。
“標(biāo)記的核酸探針或寡核苷酸”是指一個(gè)或者是通過(guò)接頭或是通過(guò)化學(xué)鍵而共價(jià)結(jié)合，或者是通過(guò)離子、范德華力、靜電、或氫鍵等非共價(jià)結(jié)合而結(jié)合了標(biāo)記的核酸或寡核苷酸，這樣通過(guò)檢測(cè)探針上結(jié)合的標(biāo)記就可以檢測(cè)探針的存在。
此處所用的“核酸探針或寡核苷酸”被定義為能通過(guò)一種或多種形式的化學(xué)鍵結(jié)合到互補(bǔ)序列的靶核酸上的核酸(一般是通過(guò)氫鍵形式的互補(bǔ)堿基配對(duì)來(lái)實(shí)現(xiàn))。此處所指的探針可以包括天然的(即A、G、C或T)或修飾堿基(7-脫氮鳥(niǎo)苷酸，次黃嘌呤等)。另外，探針中的堿基可以由非磷酸二酯鍵的連鍵連接，只要它不影響雜交即可。因此，例如，探針可以是其組成堿基由肽鍵連接而非磷酸二酯鍵連接的肽核酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，探針可以結(jié)合不完全與之互補(bǔ)的靶序列。探針任選地被直接標(biāo)記上同位素、發(fā)色物質(zhì)、熒光物質(zhì)、色原體，或被間接標(biāo)記上如可被鏈霉親和素復(fù)合物結(jié)合的生物素。通過(guò)分析探針的有無(wú)，人們可以檢測(cè)選擇序列或亞序列的有無(wú)。
當(dāng)針對(duì)核酸的一部分使用術(shù)語(yǔ)“異源的”時(shí)，是指該核酸包含兩個(gè)或更多在天然狀態(tài)下互相沒(méi)有相同的關(guān)系的亞序列。例如，核酸通常是重組產(chǎn)生的，具有兩個(gè)或更多非相關(guān)基因序列重組在一起形成一個(gè)新的功能性核酸分子，例如，一個(gè)來(lái)源的啟動(dòng)子和另一個(gè)來(lái)源的編碼區(qū)。同樣，異源蛋白質(zhì)指該蛋白包含兩個(gè)或多個(gè)天然狀態(tài)下不以相同相互關(guān)系存在的亞序列(例如，融合蛋白質(zhì))。
“啟動(dòng)子”是核酸序列陣列，其能指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄。此處所用的啟動(dòng)子包括在轉(zhuǎn)錄起始位置附近的必要的核酸序列，例如在聚合酶II型啟動(dòng)子的情況下是TATA元件。啟動(dòng)子可選地包括遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或阻遏子元件，其可能位于離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)多達(dá)幾千個(gè)堿基對(duì)的地方。“組成性”啟動(dòng)子是在大多數(shù)環(huán)境和發(fā)育條件下都具有活性的啟動(dòng)子。“可誘導(dǎo)”啟動(dòng)子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下具有活性的啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“可操作性連接”是指核酸表達(dá)調(diào)控序列(例如啟動(dòng)子，或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)排列)和另一核酸序列之間的功能性連接，其中表達(dá)調(diào)控序列指導(dǎo)對(duì)應(yīng)于第二序列的核酸轉(zhuǎn)錄。
此處所用的“重組”是指合成或其它體外操作的多核苷酸(例如，“重組多核苷酸”)，以及使用重組多核苷酸在細(xì)胞或其它生物系統(tǒng)中產(chǎn)生基因產(chǎn)物的方法，或指由重組多核苷酸編碼的多肽(“重組蛋白質(zhì)”)。“重組手段”也包括將來(lái)源不同、具有不同編碼區(qū)或結(jié)構(gòu)域或啟動(dòng)子序列的核酸連接至一個(gè)表達(dá)盒或載體中用來(lái)表達(dá)，例如可誘導(dǎo)的或組成性表達(dá)包含本發(fā)明轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和使用本發(fā)明的引物擴(kuò)增的核酸序列的融合蛋白。
短語(yǔ)“選擇性(或特異性)與……雜交”指在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下，分子僅與特定的存在于復(fù)合混合物中(例如，總細(xì)胞或文庫(kù)DNA或RNA)的核苷酸序列結(jié)合、形成雙螺旋或雜交。
短語(yǔ)“嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”指在這樣的條件下，探針僅與通常存在于核酸復(fù)合混合物中的靶序列雜交，而不與其它序列雜交。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴(lài)性的并且在不同情況下會(huì)有所不同。長(zhǎng)序列在高溫下才具有雜交特異性。有關(guān)核酸雜交更詳盡的指南參見(jiàn)Tijssen，Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicProbes，“Overview of Principles of Hybridization and theStrategy of Nucleic Acid Assays”(1993)。通常，在特定的離子強(qiáng)度pH下，選擇的嚴(yán)謹(jǐn)條件比特定序列的熱溶解點(diǎn)(thermal melting point，Tm)低大約5-10℃。Tm是指達(dá)到平衡后(靶序列過(guò)剩，在Tm下，平衡條件下50％的探針被飽和)與靶序列互補(bǔ)的探針中有50％與靶序列發(fā)生雜交時(shí)的溫度(在確定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)。嚴(yán)謹(jǐn)條件意味著其鹽濃度小于大約1.0M鈉離子，通常大約0.01至1.0M鈉離子(或其它鹽)濃度(pH7.0至8.3)，對(duì)于短探針(例如10至50個(gè)核苷酸)溫度至少大約30℃、對(duì)于長(zhǎng)探針(例如大于50個(gè)核苷酸)溫度至少大約60℃。加入一些破壞穩(wěn)定的試劑如甲酰胺也可以形成嚴(yán)謹(jǐn)條件。為了選擇性或特異性的雜交，陽(yáng)性信號(hào)至少是背景值的兩倍，可選地10倍于背景值。示例嚴(yán)謹(jǐn)條件如下50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，42℃溫育，或者5×SSC和1％SDS，65℃溫育，使用0.2×SSC和0.1％SDS在65℃下漂洗。這類(lèi)雜交和漂洗步驟可以進(jìn)行例如1，2，5，10，15，30，60分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。
如果核酸編碼的多肽是基本相關(guān)的話(huà)，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下互不雜交的核酸仍是基本上相關(guān)的。例如，利用遺傳密碼允許下的最大密碼子簡(jiǎn)并性產(chǎn)生核酸拷貝時(shí)就會(huì)發(fā)生這種情況。在這些情況下，核酸通常在中等嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下雜交。示例的“中等嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”包括在具有40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS緩沖液中，37℃下的雜交，使用1×SSC在45℃漂洗。這類(lèi)雜交和漂洗步驟可以進(jìn)行例如1，2，5，10，15，30，60分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。陽(yáng)性雜交至少是背景值的兩倍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該很容易認(rèn)識(shí)到其它雜交和漂洗條件可以用以提供相似嚴(yán)謹(jǐn)程度的條件。
“抗體”指包含免疫球蛋白基因或其片段的框架區(qū)域的多肽，其可以特異性地與抗原結(jié)合和識(shí)別。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、Δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及無(wú)數(shù)免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈被歸類(lèi)為κ或λ。重鏈歸類(lèi)為γ、μ、α、Δ和ε，它們因此分別確定了免疫球蛋白種類(lèi)，即IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
示例的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單位包括四聚體(tetramer)。每個(gè)四聚體由兩對(duì)相同的多肽鏈組成，每個(gè)多肽鏈對(duì)具有一條“輕”鏈(大約25kDa)和一條“重”鏈(大約50-70kDa)。每條鏈的N末端確定了一個(gè)大約100至110或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)，主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。術(shù)語(yǔ)可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指的就是這些輕鏈和重鏈。
“嵌合抗體”是指抗體分子，其中(a)恒定區(qū)或其部分被改變、替換或交換，以至于抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))與類(lèi)別、效應(yīng)物功能和/或種類(lèi)不同或被改變的恒定區(qū)相連，或與能夠賦予嵌合抗體新的特性的完全不同的分子(如酶、毒素、激素、生長(zhǎng)因子和藥物等)相連接；或(b)可變區(qū)或其部分被改變、替換或交換成具有不同或改變了抗原特異性的可變區(qū)。
“抗T2R抗體”是一種可以特異性結(jié)合T2R基因、cDNA或其亞序列編碼的多肽的抗體或抗體片段。
術(shù)語(yǔ)“免疫試驗(yàn)”是使用抗體特異性結(jié)合抗原的試驗(yàn)。免疫試驗(yàn)的特征是使用特定抗體的特異性結(jié)合特性來(lái)分離、定向和/或量化抗原。
當(dāng)涉及到蛋白質(zhì)或肽時(shí)，短語(yǔ)與抗體“特異性(或選擇性)結(jié)合”或“特異性(或選擇性)與……發(fā)生免疫反應(yīng)”是指結(jié)合反應(yīng)，其可以在異源蛋白質(zhì)和其它生物物質(zhì)群中確定目的蛋白質(zhì)的存在。因此，在指定的免疫試驗(yàn)條件下，指定抗體與特定蛋白質(zhì)的結(jié)合至少是背景值的兩倍，并且基本上不與樣品中存在的其它蛋白質(zhì)發(fā)生明顯的結(jié)合。這些條件下與抗體的特異性結(jié)合可能要求針對(duì)其對(duì)某個(gè)特定蛋白質(zhì)的特異性進(jìn)行了選擇的抗體。
例如，可選擇針對(duì)特定物種如大鼠、小鼠、或人T2R家族成員產(chǎn)生的多克隆抗體以獲得那些僅與T2R多肽或其免疫原成分而不與其它蛋白質(zhì)(T2R多肽直向進(jìn)化同源物或多態(tài)變體和等位基因除外)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的多克隆抗體。這種選擇過(guò)程可以通過(guò)去除與其它物種T2R分子或其它T2R分子有交叉反應(yīng)的抗體來(lái)完成。也可以選擇僅識(shí)別T2R GPCR家族成員而非其它GPCR家族的抗體。有多種免疫試驗(yàn)形式可以用于選擇特異性地與特定蛋白質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體。例如，固相ELISA免疫試驗(yàn)一般用來(lái)選擇特異性與特定蛋白質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體(例如參見(jiàn)，Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，(1988)，其中有關(guān)可用于確定特異性免疫反應(yīng)的免疫試驗(yàn)形式和條件的描述)。通常，特異性或選擇性反應(yīng)至少是背景值或噪聲的兩倍，更優(yōu)選地大于背景10至100倍。
短語(yǔ)“與……選擇性結(jié)合”指核酸與上述其它核酸“選擇性雜交”的能力，或抗體與上述蛋白質(zhì)“選擇性結(jié)合”的能力。
術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”指目的是在任何細(xì)胞，包括原核、酵母、真菌、植物、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，體內(nèi)或體外組成性或誘導(dǎo)表達(dá)本發(fā)明的核酸序列的任何重組表達(dá)系統(tǒng)。該術(shù)語(yǔ)包括線(xiàn)性或環(huán)狀表達(dá)系統(tǒng)。該術(shù)語(yǔ)包括游離狀態(tài)或已整合至宿主細(xì)胞基因組中的表達(dá)系統(tǒng)。表達(dá)系統(tǒng)具有自我復(fù)制或不具有自我復(fù)制的能力，即在細(xì)胞內(nèi)引發(fā)短暫的表達(dá)。該術(shù)語(yǔ)包括重組表達(dá)“盒”，其僅包括重組核酸轉(zhuǎn)錄所需的最小元件。
“宿主細(xì)胞”是指包含表達(dá)載體和支持表達(dá)載體復(fù)制或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞如大腸桿菌，或真核細(xì)胞如酵母、昆蟲(chóng)、兩棲動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如CHO、Hela和HEK-293及其它，例如培養(yǎng)的細(xì)胞、外植體(explants)和體內(nèi)細(xì)胞等。
C.T2R的分離和表達(dá)本發(fā)明T2R或其片段或變體的分離和表達(dá)可通過(guò)使用基于本申請(qǐng)公開(kāi)的T2R核酸序列構(gòu)建的探針或引物的已知克隆方法來(lái)實(shí)施。使用此處公開(kāi)的序列和已知的基于計(jì)算機(jī)的搜索技術(shù)，如BLAST序列搜索技術(shù)，同樣可以從人或其它物種基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出相關(guān)的T2R序列。在特定的實(shí)施方案中，此處公開(kāi)的假基因可用于鑒定功能性等位基因或相關(guān)基因。
然后可以使用表達(dá)載體感染或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞用來(lái)功能性表達(dá)這些序列。可以在體內(nèi)或體外制備和表達(dá)這些基因和載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道，通過(guò)調(diào)節(jié)本發(fā)明載體內(nèi)基因和核酸(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等)的表達(dá)或活性，可以得到改變和控制核酸表達(dá)的理想表型。可以使用描述成可用于增加或降低表達(dá)或活性的任何已知的方法。本發(fā)明的實(shí)踐可以與本領(lǐng)域任何已知的方法或方案相結(jié)合，這些方法或方案在科學(xué)和專(zhuān)利文獻(xiàn)中有詳盡描述。
另外，這些核酸分子可用已知的化學(xué)合成方法體外合成。例如以下描述的方法，Carruthers，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47411-418(1982)；Adams，Am.Chem.Soc.105661(1983)；Belousov，Nucleic Acids Res.253440-3444(1997)；Frenkel，F(xiàn)ree Radic.Biol.Med.19373-380(1995)；Blomers，Biochemistry 337886-7896(1994)；Narang，Meth.Enzymol.6890(1979)；Brown，Meth.Enzymol.68109(1979)；Beaucage，Tetra.Lett.221859(1981)；U.S.PatentNo.4,458,066。然后或者通過(guò)合成互補(bǔ)鏈，并在適合條件下使之退火，或通過(guò)用合適的引物序列及用DNA聚合酶加入互補(bǔ)鏈的方法可以獲得雙鏈DNA片段。
核酸操作技術(shù)，例如產(chǎn)生序列突變、亞克隆、探針標(biāo)記、測(cè)序、雜交等技術(shù)，在科學(xué)和專(zhuān)利文獻(xiàn)中有詳盡描述。參見(jiàn)例如，Sambrook，ed.，Molecular Cloninga Laboratory Manual(2nd ed.)，Vols.1-3，ColdSpring Harbor laboratory(1989)；Ausubel，ed.，Current Protocolsin Molecular Biology，Jon Wiley&Sons，Inc.，New York(1997)；Tijssen，ed.，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiologyHybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Theoryand Nucleic Acid Preparation，Elsevier，N.Y.(1993)。
核酸、載體、衣殼(capsids)、多肽等可以通過(guò)任何一個(gè)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法來(lái)分析和定量。這些方法包括如分析生物化學(xué)方法例如核磁共振(NMR)、光譜、放射、電泳、毛細(xì)管電泳、高效液相色譜(HPLC)、薄層層析(TLC)和超濾層析等，多種免疫學(xué)方法例如流體或凝膠沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散、免疫電泳、放射免疫試驗(yàn)(RIAs)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISAs)、免疫熒光試驗(yàn)、Southern分析、Northern分析、點(diǎn)印跡分析、凝膠電泳(例如SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、其它核酸或靶物質(zhì)或信號(hào)放大方法、放射標(biāo)記、液體閃爍計(jì)數(shù)和親和層析等。
寡核苷酸探針可以用來(lái)擴(kuò)增編碼T2R配體結(jié)合區(qū)域的核酸片段。此處描述的核酸同樣可以利用擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行克隆或定量測(cè)量。擴(kuò)增方法是本領(lǐng)域眾所周知的方法，包括例如聚合酶鏈反應(yīng)、PCR(Innis ed.，PCRProtocols，a Guide to Methods and Applications，Academic Press，N.Y.(1990)；Innis ed.，PCR Strategies，Academic Press，Inc.，N.Y.(1995)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)參見(jiàn)例如(Wu，Genomics 4560(1989)；Landegren，Sciencee 2411077，(1988)；Barringer，Gene 89117(1990))；轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(Kwoh，PNAS，861173(1989))；自我維持序列復(fù)制(Guatelli，PANS，871874(1990))；Q-β復(fù)制酶擴(kuò)增(Smith，J.Clin.Microbiol.351477-1491(1997))；自動(dòng)Q-β復(fù)制酶擴(kuò)增試驗(yàn)(Burg，Mol.Cell.Probes 10257-271(1996))和其它RNA聚合酶介導(dǎo)的技術(shù)(例如NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)等，同樣參見(jiàn)，Berger，Methods Enzymol.152307-16(1987)；Sambrook；Ausubel；U.S.Patent NOs.4,683,195和4,683,202；Sooknanan，Biotechnology13563-64(1995)。
一旦擴(kuò)增后，即按照本領(lǐng)域已知的方法，使用常規(guī)分子生物學(xué)方法，將核酸分子單獨(dú)或以文庫(kù)形式按照所需克隆到任意一個(gè)載體上；體外擴(kuò)增核酸的克隆方法參見(jiàn)如U.S.Pat.No.5,426,039的描述。為了協(xié)助擴(kuò)增序列的克隆，可以將限制性酶切位點(diǎn)“內(nèi)置”(built into)到PCR引物對(duì)中。例如Pst I和Bsp E1位點(diǎn)被設(shè)計(jì)到本發(fā)明的示例引物對(duì)中。這些獨(dú)特的限制性位點(diǎn)的序列能使得連接時(shí)相對(duì)于它們所剪接入的7-膜受體“供體”編碼序列而言讀框一致(配體結(jié)合區(qū)編碼序列位于7-膜多肽內(nèi)部，因此，如果想在限制酶切位點(diǎn)的下游翻譯構(gòu)建體(construct)，應(yīng)該避免出框的結(jié)果；如果插入的配體結(jié)合區(qū)基本上包含大部分跨膜V II區(qū)，這就不是必要的)。引物可以設(shè)計(jì)成保留有“供體”7-膜受體的原始序列。或者，引物可以編碼保守性替換的(例如疏水性殘基換成疏水性殘基，參見(jiàn)下面的討論)或功能上無(wú)影響的替換(例如，不干擾胞漿膜插入、不導(dǎo)致肽酶引起的裂解、不導(dǎo)致受體非正常折疊等)的氨基酸殘基。
引物對(duì)可以設(shè)計(jì)成選擇性擴(kuò)增T2R蛋白的配體結(jié)合區(qū)域。對(duì)于不同配體這些區(qū)域可能變化很大。因此，對(duì)一種配體可能是最小的結(jié)合區(qū)域，對(duì)于另一個(gè)潛在配體來(lái)說(shuō)可能具有很大的局限性。因此，需要擴(kuò)增不同大小、包含不同結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的配體結(jié)合區(qū)域；例如，7-跨膜T2R的跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域II至VII，III至VII，III至VI或II至VI，或其變體(例如，只是特定結(jié)構(gòu)域的亞序列，混合結(jié)構(gòu)域的順序等)。
由于許多7-膜T2R蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)和序列是已知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地選擇結(jié)構(gòu)域側(cè)翼和內(nèi)部結(jié)構(gòu)域序列作為模型序列來(lái)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并擴(kuò)增引物對(duì)。例如，使用引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增可以產(chǎn)生編碼結(jié)構(gòu)域區(qū)II至VII的核酸序列。為了擴(kuò)增包含跨膜結(jié)構(gòu)域I(TM I)序列的核酸序列，可以從編碼上面描述的T2R家族共有序列1的氨基酸序列的核酸中設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。這樣的簡(jiǎn)并引物可用于產(chǎn)生摻入了TM I至TM III，TM I至TM IV，TM I至TM V，TM I至TM VI或TM I至TM VII的結(jié)合區(qū)域。基于此處所提供的T2R家族其它共有序列可以設(shè)計(jì)其它的簡(jiǎn)并引物。這樣的簡(jiǎn)并引物可用于產(chǎn)生摻入TM III至TM IV，TM III至TM V，TM III至TM VI或TM III至TM VII的結(jié)合區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物的范例在本領(lǐng)域已眾所周知。例如，共義-簡(jiǎn)并雜合寡核苷酸引物(CODEHOP)策略計(jì)算機(jī)程序可以由http//blocks.fhcrc.org/codehop.html處獲得，引物可直接連接到Blockmaker多序列比對(duì)地址進(jìn)行雜合引物預(yù)測(cè)，其由一套相關(guān)蛋白質(zhì)序列開(kāi)始，如已知的味覺(jué)受體配體結(jié)合區(qū)域(例如參見(jiàn)，Rose，NucleicAcids Res.261628-1635(1998)；Singh，Biotechniques 24318-319(1998))。
合成寡核苷酸引物對(duì)的手段在本領(lǐng)域已眾所周知。可以使用“天然”堿基對(duì)或合成堿基對(duì)。例如，使用人工核苷酸堿基能夠提供操作引物序列、產(chǎn)生更加復(fù)雜的擴(kuò)增產(chǎn)物復(fù)合混合物的多樣途徑。人工核苷酸堿基多種家族通過(guò)內(nèi)部鍵旋轉(zhuǎn)，能夠采取多種氫鍵取向，從而提供簡(jiǎn)并分子識(shí)別的手段。這些類(lèi)似物摻入PCR引物的單一位點(diǎn)將導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物復(fù)雜文庫(kù)的產(chǎn)生。例如參見(jiàn)，Hoops，Nucleic Acids Res.254866-4871(1997)。非極性分子同樣可以用來(lái)模仿天然DNA堿基的形狀。腺嘌呤的非氫鍵形狀模擬物可以對(duì)胸腺嘧啶非極性形狀的模擬物有效和選擇性地復(fù)制(例如參見(jiàn)，Morales，Nat.Struct.Bioo.5950-954(1998))。例如兩個(gè)簡(jiǎn)并堿基可以是嘧啶堿基6H，8H-3，4-二羥基嘧啶并[4，5-c][1，2]嗪-7-酮或嘌呤堿基N6-甲氧基-2，6-二氨基嘌呤(例如參見(jiàn)，Hill，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 954258-4263(1998))。本發(fā)明簡(jiǎn)并引物的范例是摻入核堿基類(lèi)似物5’-二甲氧三苯甲基-N-苯甲酰基-2’-脫氧胞嘧啶和3’-[(2-氰乙基)-(N，N-二異丙基)]亞磷酰胺(參見(jiàn)如下所述序列中的“P”)。這種嘧啶類(lèi)似物與嘌呤，包括A和G殘基形成氫鍵。
此處公開(kāi)的味覺(jué)受體基本上是等同的多態(tài)變體、等位基因和種間同源體，可以使用下述的核酸探針?lè)蛛x。或者，通過(guò)檢測(cè)與針對(duì)T2R多肽產(chǎn)生的抗血清或純化抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的表達(dá)同源體(該表達(dá)的同源體同樣可以識(shí)別和選擇性結(jié)合到T2R同源體上)，表達(dá)文庫(kù)可以用于克隆T2R多肽和其多態(tài)變體、等位基因和種間同源體。
編碼味覺(jué)受體的配體結(jié)合區(qū)域的核酸可以使用適當(dāng)引物對(duì)(匹配或簡(jiǎn)并引物)擴(kuò)增(如PCR)適當(dāng)核酸序列得到。擴(kuò)增的核酸可以是來(lái)自任何細(xì)胞或組織的基因組DNA或味覺(jué)受體表達(dá)細(xì)胞衍生出來(lái)的mRNA或cDNA。
在一個(gè)實(shí)施例中，可以構(gòu)建出包含有編碼融合了轉(zhuǎn)位序列的T2R的核酸的雜合蛋白質(zhì)編碼序列。同樣可以提供包含轉(zhuǎn)位基元(motif)和其它化學(xué)感受受體，特別是味覺(jué)受體家族的味覺(jué)元結(jié)合區(qū)的雜合T2R。這些核酸序列可以被可操作地連接至轉(zhuǎn)錄或翻譯控制元件中，例如轉(zhuǎn)錄和翻譯起始序列、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、聚腺苷酸化序列、和其它對(duì)DNA轉(zhuǎn)錄成RNA有用的序列等。在重組表達(dá)盒、載體和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物構(gòu)建過(guò)程中，可以利用啟動(dòng)子片段指導(dǎo)在所有目的細(xì)胞或組織中表達(dá)目的核酸。
在另外一個(gè)實(shí)施例中，融合蛋白可能包括C末端或N末端轉(zhuǎn)位序列。此外，融合蛋白可以包括額外的元件，如用于蛋白質(zhì)檢測(cè)、純化或其它應(yīng)用的元件。促進(jìn)檢測(cè)和純化的結(jié)構(gòu)域包括，如金屬鰲合肽如聚組氨酸列串、組氨酸色氨酸組件或其它可以在固定金屬上純化的結(jié)構(gòu)域等；麥芽糖結(jié)合蛋白；可以在固定的免疫球蛋白上進(jìn)行純化的蛋白A結(jié)構(gòu)域；或FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)中使用的結(jié)構(gòu)域(Immunex Corp，SeattleWA)。
在轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域(為了有效的胞漿膜表達(dá))和新翻譯的多肽其余部分之間，包含一個(gè)可裂解連接物序列如Xa因子(例如參見(jiàn)，Ottavi，Biochimie 80289-293(1998))、枯草桿菌素(subtilisin)蛋白酶識(shí)別基元(例如參見(jiàn)，Polyak，Protein Eng.10615-619(1997))、腸激酶(Invitrogen，San Diego，CA)等對(duì)促進(jìn)純化可能有利。例如，一個(gè)構(gòu)建體可以包括一條多肽編碼核酸序列(與6個(gè)組氨酸殘基連接，后跟一個(gè)是腸激酶裂解位點(diǎn)的硫氧還蛋白，(例如參見(jiàn)，Williams，Biochemistry341787-1797(1995))，和一個(gè)C末端轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域。組氨酸殘基可促進(jìn)檢測(cè)和純化，而腸激酶裂解位點(diǎn)提供了從剩余融合蛋白中純化目的蛋白的手段。有關(guān)編碼融合蛋白的載體技術(shù)和融合蛋白應(yīng)用的技術(shù)科學(xué)和專(zhuān)利文獻(xiàn)中已有詳細(xì)描述，例如參見(jiàn)，Kroll，DNA Cell.Biol.12441-53(1993)。
包含配體結(jié)合區(qū)編碼序列的表達(dá)載體(不管是單獨(dú)表達(dá)載體還是表達(dá)載體文庫(kù))可以引入細(xì)胞的基因組或胞漿或細(xì)胞核，通過(guò)科學(xué)和專(zhuān)利文獻(xiàn)中描述的多種多樣的常規(guī)方法表達(dá)目的序列。例如參見(jiàn)，Roberts，Nature 328731(1987)；Berger如前；Schneider，Protein Expr.Purif.643510(1995)；Sambrook；Tijssen；Ausubel生物試劑和試驗(yàn)器材廠家提供的產(chǎn)品信息手冊(cè)也會(huì)提供有關(guān)生物學(xué)方法的信息。載體可以從天然狀態(tài)分離，從諸如ATCC或GenBank文庫(kù)獲得，或通過(guò)合成或重組方法制備。
核酸可以在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定或短暫表達(dá)(例如游離體表達(dá)系統(tǒng))的表達(dá)盒、載體或病毒中表達(dá)。選擇標(biāo)志物可以摻入到表達(dá)盒和載體中，從而賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞和序列以可選擇的表型。例如，選擇標(biāo)記物可以編碼游離體維持和復(fù)制，所以就不必整合至宿主基因組了。例如，標(biāo)志物可能編碼抗生素抗性(例如氯霉素、卡那霉素、G418、博來(lái)霉素、潮霉素)或除草劑抗性(例如chlorosulfuron或Basta)，以選擇轉(zhuǎn)化了目的DNA序列的細(xì)胞(例如參見(jiàn)，Blondelet-Rouault，Gene 190315-317(1997)；Aubrecht，J.Pharmacol.Exp.Ther.281992-997(1997))。賦予新霉素或潮霉素這類(lèi)底物的抗性的可選擇標(biāo)志物基因僅能用于組織培養(yǎng)，而化學(xué)抗性基因可以作為體內(nèi)或體外的選擇性標(biāo)記物。
嵌合核酸序列可以編碼在任何7跨膜多肽內(nèi)部的T2R配體結(jié)合區(qū)。因?yàn)?跨膜受體多肽具有相似的一級(jí)序列及二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)域(例如細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、TM結(jié)構(gòu)域、胞漿結(jié)構(gòu)域等)可以很容易地通過(guò)序列分析鑒定。例如，同源性模建、傅立葉分析和螺旋周期檢測(cè)可用于鑒定有7跨膜受體序列的7個(gè)結(jié)構(gòu)域。快速傅立葉轉(zhuǎn)換(FFT)算法可用于評(píng)估代表被分析序列疏水性和可變性概況的顯性周期。周期檢測(cè)增強(qiáng)和α螺旋周期指數(shù)可由如Donnelly，Protein Sci.255-70(1993)的方法完成。其它算法和模建算法在本領(lǐng)域已眾所周知(例如參見(jiàn)，Peitsch，Receptors，Channels 4；161-164(1996)；kyte&Doolittle，J.Md.Bio.，157105-132(1982)；Cronet，Protein Eng.659-64(1993)；http//bioinfo.weizman.ac.il/)。
本發(fā)明不但包括具有指定核酸和氨基酸序列的核酸分子和多肽，還同樣包括其片段，特別是如40、60、80、100、150、200或250個(gè)核苷酸、或更多核苷酸的片段，以及如10、20、30、50、70、100或150個(gè)氨基酸、或更多氨基酸的多肽片段。可選地，核酸片段可編碼能夠與針對(duì)T2R家族成員產(chǎn)生的抗體結(jié)合的抗原性多肽。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)片段可選地是能夠與針對(duì)T2R家族成員產(chǎn)生的抗體結(jié)合的抗原性片段。
本發(fā)明另外還包括嵌合蛋白，其包含此處公開(kāi)的至少一種T2R多肽中的至少10、20、30、50、70、100或150個(gè)氨基酸或更多序列，并耦聯(lián)至額外的氨基酸序列(該序列代表另一個(gè)GPCR、優(yōu)選地7跨膜超家族成員的全部或部分)。這些嵌合子可直接從本發(fā)明受體和另一個(gè)GPCR獲得，或組合兩種或多種本發(fā)明受體獲得。在一個(gè)實(shí)施例中，嵌合子的一部分對(duì)應(yīng)于本發(fā)明T2R多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域，或是從該跨膜結(jié)構(gòu)域衍生出來(lái)。在另外一個(gè)實(shí)施例中，嵌合子的一部分對(duì)應(yīng)于此處描述的T2R多肽的一個(gè)或多個(gè)跨膜區(qū)，或是從中衍生出來(lái)，而嵌合子剩余部分來(lái)自另一個(gè)GPCR。嵌合受體在本領(lǐng)域眾所周知，制備嵌合受體的技術(shù)和用于摻入的G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)構(gòu)域和片段的選擇及界定也是本領(lǐng)域眾所周知。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)可容易用于這種嵌合受體的制備。使用這種嵌合受體可以提供例如一種在此特別描述的受體的味覺(jué)選擇性特征，并與另一個(gè)受體的信號(hào)傳導(dǎo)特征相耦聯(lián)，如現(xiàn)有技術(shù)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中已知的一種受體。
例如，象配體結(jié)合區(qū)域、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞漿結(jié)構(gòu)域、N端結(jié)構(gòu)域、C端結(jié)構(gòu)域或其任意組合的區(qū)域，可以共價(jià)地連接至異源蛋白質(zhì)上。如T2R跨膜區(qū)可連接至異源GPCR跨膜結(jié)構(gòu)域，或異源GPCR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可連接至T2R跨膜區(qū)。其它可選異源蛋白質(zhì)包括，如綠色熒光蛋白、β-gal、谷氨酸受體和視紫紅質(zhì)N末端等。
表達(dá)本發(fā)明的T2R、片段或變體的宿主細(xì)胞也處在本發(fā)明范圍之內(nèi)。為了獲得克隆的基因或核酸(例如編碼本發(fā)明的T2R、片段或變體的cDNA)的高水平表達(dá)，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常是將目的核酸序列亞克隆至含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子、并且對(duì)于編碼蛋白質(zhì)的核酸分子來(lái)說(shuō)，還有翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的表達(dá)載體中。適合的細(xì)菌啟動(dòng)子本領(lǐng)域眾所周知，例如參見(jiàn)Sambrook等的描述。但是，細(xì)菌或真核表達(dá)系統(tǒng)都可以使用。
可以使用任何已知將外源核苷酸序列引入宿主細(xì)胞的方法。這些方法包括使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染、polybrene、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體、微注射、胞漿載體、病毒載體和其它任何已知的將克隆基因組DNA、cDNA、合成DNA或其它外源遺傳物質(zhì)引入宿主細(xì)胞的方法(例如參見(jiàn)，Sambrook等)。只要保證特定遺傳工程方法能夠成功地將至少一條核酸分子引入能表達(dá)目的T2R、片段或變體的宿主細(xì)胞即可。
將表達(dá)載體引入到細(xì)胞中后，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在適合目的受體、片段或變體表達(dá)的條件下培養(yǎng)，然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)物中回收。此類(lèi)技術(shù)的實(shí)施例本領(lǐng)域眾所周知。例如參見(jiàn)WO 00/06593，此處以與本公開(kāi)內(nèi)容具有一致性的方式引用。
D.T2R的免疫檢測(cè)除了使用核酸雜交技術(shù)檢測(cè)T2R基因和基因表達(dá)以外，同樣可以使用免疫試驗(yàn)檢測(cè)T2R，例如鑒定味覺(jué)受體細(xì)胞和T2R家族成員的變體。免疫試驗(yàn)可用以定性或定量分析T2R。此技術(shù)應(yīng)用的總體概述參見(jiàn)Harlow&Lane，AntibodiesA Laboratory Manual(1988)。
1.針對(duì)T2R家族成員的抗體產(chǎn)生可以與T2R家族成員特異性反應(yīng)的單克隆抗體和多克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(例如參見(jiàn)，Coligan，CurrentProtocols in Immunology(1991)；Harlow&Lane，如前；Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice(2d ed.1986)；andKohler&Milstein，Nature，256495-497(1975))。此類(lèi)技術(shù)包括通過(guò)從噬菌體或類(lèi)似載體的重組抗體文庫(kù)中選擇抗體來(lái)制備相應(yīng)抗體，以及通過(guò)免疫家兔或小鼠來(lái)制備單克隆抗體和多克隆抗體(例如參見(jiàn)，Huse等，Science，2461275-1281(1989)；Ward等，Nature，341544-546(1989))。
許多包含T2R的免疫原可用于產(chǎn)生與T2R家族成員特異性反應(yīng)的抗體。例如，重組T2R蛋白，或其抗原性片段，可用此處描述的方法分離。合適的抗原性區(qū)域包括，例如用于鑒定T2R家族成員的上述公開(kāi)的共有序列。重組蛋白質(zhì)可以使用上面描述的方法在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)，和使用本領(lǐng)域已知的方法純化。重組蛋白質(zhì)是優(yōu)選的免疫原，用于產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體。或者，從此處公開(kāi)的序列衍生出的合成肽，與載體蛋白綴合后可用作免疫原。天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)也可以純凈的或非純凈形式使用。產(chǎn)物然后被注射進(jìn)能夠產(chǎn)生抗體的動(dòng)物。可得到單克隆或多克隆抗體，用于后續(xù)測(cè)量蛋白質(zhì)的免疫試驗(yàn)。
更具體而言，產(chǎn)生多克隆抗體的方法本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知。例如，使用標(biāo)準(zhǔn)佐劑例如弗氏佐劑和標(biāo)準(zhǔn)免疫程序，用T2R多肽免疫近交系小鼠(例如BALB/C小鼠)或家兔。然后可通過(guò)采血和確定與T2R的反應(yīng)滴度來(lái)監(jiān)測(cè)動(dòng)物對(duì)免疫原制備物的免疫反應(yīng)。當(dāng)獲得合適的針對(duì)免疫原的抗體高滴度后，可采集動(dòng)物血液并制備抗血清。如果需要，可以通過(guò)抗血清進(jìn)一步分級(jí)分離來(lái)富集與T2R多肽反應(yīng)的抗體(參見(jiàn)Harlow&Lane，如前)。
可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種技術(shù)得到單克隆抗體。簡(jiǎn)單地講，通常經(jīng)過(guò)與骨髓瘤融合，使目的抗原免疫的動(dòng)物脾細(xì)胞永生化(參見(jiàn)kohler&Milstein，Eur.J.Immunol.，6511-519(1976))。永生化的另一個(gè)方法包括使用E-B病毒(Epstein BarrVirus)、癌基因、反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化、或本領(lǐng)域已知的其它方法。對(duì)由單個(gè)永生化細(xì)胞形成的克隆篩選，選出能夠產(chǎn)生針對(duì)抗原具有所需特異性和親和性的抗體的克隆。通過(guò)多種技術(shù)可以提高這些細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體的產(chǎn)量，包括注射到脊椎動(dòng)物宿主的腹膜腔內(nèi)。或者，按照Huse等，Science，2461275-1281(1989)概述的一般方法，通過(guò)篩選人B細(xì)胞的核酸文庫(kù)，可以分離編碼單克隆抗體或其結(jié)合片段的核酸序列。
通常收集單克隆抗體和多克隆血清并在免疫試驗(yàn)中用免疫原蛋白滴定，例如固相免疫試驗(yàn)，其中免疫原固定在固相支持物上。通常，選擇具有104或更高滴度的多克隆抗血清，并使用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合免疫試驗(yàn)，測(cè)試它們與非T2R蛋白質(zhì)、或甚至其它T2R家族成員、或其它生物體的其它相關(guān)蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)。特異性多克隆抗血清和單克隆抗體一般結(jié)合的Kd會(huì)至少大約0.1mM，更經(jīng)常地至少大約1pM，可選地至少大約0.1pM或更好，并且可選地0.01pM或更好。
一旦得到T2R家族成員特異性抗體，各T2R蛋白質(zhì)可用一系列免疫試驗(yàn)方法來(lái)檢測(cè)。有關(guān)免疫學(xué)和免疫試驗(yàn)程序的綜述，參見(jiàn)Stites&Terreds.，Basic and Clinical Immunology(7thed.1991)。而且，本發(fā)明的免疫試驗(yàn)可以由幾種形式來(lái)完成，這些形式在Maggio，ed.，EnzymeImmunoassay(1980)和Harlow&Lane(如前)中詳述。
2.免疫學(xué)結(jié)合試驗(yàn)T2R蛋白質(zhì)可用任何一個(gè)已知的免疫學(xué)結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)和/或定量(例如參見(jiàn)US Patents 4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168)。對(duì)于一般性免疫試驗(yàn)的綜述，參見(jiàn)細(xì)胞生物學(xué)方法抗體在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用(Methods in Cell biologyAntibodies in Cell Biology，volume 37，Asai，ed.1993)；基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)(Basic and ClinicalImmunology，Stiters&Terr，eds.，7thed.1991)。免疫學(xué)結(jié)合試驗(yàn)(或免疫試驗(yàn))通常使用能夠特異性與所選蛋白質(zhì)或抗原(本專(zhuān)利申請(qǐng)中是T2R家族成員或其抗原性亞序列)結(jié)合的抗體。抗體(例如抗-T2R)可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種手段和如上所述的各種方法產(chǎn)生。
免疫試驗(yàn)也經(jīng)常使用標(biāo)記物，其可特異性地結(jié)合和標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物。標(biāo)記物本身可能是包含抗體/抗原復(fù)合物的一個(gè)部分。因此，標(biāo)記物可以是標(biāo)記的T2R多肽或標(biāo)記的抗-T2R抗體。或者，標(biāo)記物可以是一個(gè)第三部分，如第二抗體，其能夠特異性地結(jié)合抗體/T2R復(fù)合物(第二抗體通常特異性結(jié)合產(chǎn)生第一抗體的物種的抗體)。其它能夠特異結(jié)合免疫球蛋白恒定區(qū)的蛋白質(zhì)，如蛋白A或蛋白G同樣可用作標(biāo)記物。這些蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與許多物種的免疫球蛋白恒定區(qū)強(qiáng)烈的非免疫原性反應(yīng)活性(例如參見(jiàn)，Kronval等，J.Immunol.，1111401-1406(1973)；Akerstrom等，J.Immunol.，1352589-2542(1985))。可用可檢測(cè)部分修飾標(biāo)記物，如生物素，其可與另外的分子特異結(jié)合，如鏈霉親和素。多種可檢測(cè)部分為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
貫穿整個(gè)試驗(yàn)，每結(jié)合一個(gè)試劑都需要孵育和/或漂洗步驟。孵育步驟從5秒鐘到幾個(gè)小時(shí)，可選地從大約5分鐘到大約24小時(shí)。但是，孵育時(shí)間將取決于試驗(yàn)形式、抗原、溶液體積、濃度等。一般情況下試驗(yàn)在室溫下進(jìn)行，盡管它們可以在一個(gè)溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，如10℃到40℃。
a.非競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)形式檢測(cè)樣品中T2R蛋白質(zhì)的免疫試驗(yàn)既可以是競(jìng)爭(zhēng)性的也可以是非競(jìng)爭(zhēng)性的。非競(jìng)爭(zhēng)性免疫試驗(yàn)是其中的抗原量被直接測(cè)定。例如在一個(gè)優(yōu)選的“夾心”(sandwich)試驗(yàn)中，抗-T2R抗體可直接結(jié)合在其固定的固相支持物上。這些固定化抗體然后可捕獲試驗(yàn)樣品中的任何T2R蛋白質(zhì)。T2R蛋白質(zhì)因此被固定，然后結(jié)合標(biāo)記物，例如帶有標(biāo)記的第二T2R抗體。或者，該第二抗體可能沒(méi)有標(biāo)記，但是它可以結(jié)合標(biāo)記了的第三抗體，該第三抗體對(duì)產(chǎn)生第二抗體的物種的抗體具有特異性。該第二抗體或第三抗體通常用可檢測(cè)部分修飾，例如生物素，其可和另外的分子特異性結(jié)合，如鏈霉親和素，以提供可檢測(cè)部分。
b.競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)形式在競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)中，通過(guò)測(cè)量用樣品中存在的未知的T2R蛋白質(zhì)從抗-T2R抗體中去除(競(jìng)爭(zhēng)去除)已知的外加的(外源的)T2R蛋白質(zhì)的量，間接測(cè)量樣品中存在的T2R蛋白質(zhì)的量。在一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)中，將已知量的T2R蛋白質(zhì)加入到樣品中，樣品然后與能特異結(jié)合T2R的抗體接觸。與抗體結(jié)合的外源T2R蛋白質(zhì)的量與樣品中T2R蛋白質(zhì)濃度成反比。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體被固定在一個(gè)固相底物上。與抗體結(jié)合的T2R蛋白質(zhì)的量可以通過(guò)測(cè)量T2R/抗體復(fù)合物中T2R蛋白質(zhì)的量，或通過(guò)測(cè)量剩余未形成復(fù)合物的蛋白質(zhì)的量來(lái)確定。通過(guò)提供標(biāo)記的T2R分子可以檢測(cè)T2R蛋白質(zhì)的量。
半抗原抑制試驗(yàn)是另一種優(yōu)選的競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)。在這個(gè)試驗(yàn)中已知T2R蛋白質(zhì)固定在固相底物上。將已知量的抗T2R抗體加入到樣品中，樣品然后與固定的T2R接觸。抗-T2R抗體結(jié)合到已知的固定化T2R蛋白質(zhì)的量與樣品中存在的T2R蛋白質(zhì)的量成反比。同樣，固定化抗體的量可以通過(guò)檢測(cè)抗體固定化部分或溶液中剩余抗體部分來(lái)檢測(cè)。抗體被標(biāo)記時(shí)可直接檢測(cè)，或隨后加入一個(gè)如上所述的特異結(jié)合抗體的標(biāo)記部分進(jìn)行間接檢測(cè)。
c.交叉反應(yīng)測(cè)定競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合形式的免疫試驗(yàn)也可用來(lái)測(cè)定交叉反應(yīng)。例如，由在此公開(kāi)的核酸序列至少部分編碼的蛋白質(zhì)可以固定在固相支持物上。蛋白質(zhì)(例如T2R多肽和其同源物)加入到試驗(yàn)體系中，與固定的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗血清。將加入蛋白質(zhì)的與固定蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗血清的競(jìng)爭(zhēng)能力，與在此公開(kāi)的核酸序列編碼的T2R多肽與自己競(jìng)爭(zhēng)的能力相比較。使用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算法計(jì)算上述蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)百分比。與每一個(gè)上述加入蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)小于10％的抗血清被選擇出來(lái)并合并在一起。通過(guò)加入特定蛋白質(zhì)，例如遠(yuǎn)源同源物進(jìn)行免疫吸收，交叉反應(yīng)抗體可任選地從合并抗血清中去除。另外，含有可用于鑒定T2R家族成員的代表共有序列的氨基酸序列的肽，可用于測(cè)定交叉反應(yīng)性。
免疫吸收的和合并的抗血清然后用于進(jìn)行如上所述的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合免疫試驗(yàn)，用以第二蛋白質(zhì)(該蛋白質(zhì)被認(rèn)為可能是T2R家族成員的等位基因或多態(tài)變體)和免疫原蛋白質(zhì)(即由在此公開(kāi)的核酸序列編碼的T2R多肽)的比較。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)比較，該兩種蛋白質(zhì)都要在一個(gè)寬范圍濃度內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，確定抑制抗血清與固定的蛋白質(zhì)50％結(jié)合需要的每一種蛋白質(zhì)的量。如果抑制50％結(jié)合需要的第二蛋白質(zhì)量小于在此公開(kāi)核酸序列編碼的蛋白質(zhì)抑制50％結(jié)合需要的量10倍，那么該第二蛋白質(zhì)就被認(rèn)為能夠特異性地結(jié)合由T2R免疫原產(chǎn)生的多克隆抗體。
針對(duì)T2R共有序列的抗體也可用于制備僅與T2R家族的GPCR特異性結(jié)合，而不與其它家族的GPCR結(jié)合的抗體。例如，特異性結(jié)合特定T2R家族成員的多克隆抗體可以通過(guò)使用其它T2R家族成員扣除交叉反應(yīng)性抗體來(lái)制備。物種特異性多克隆抗體可以通過(guò)類(lèi)似途徑獲得。例如人T2R1特異性抗體的制備，可以通過(guò)扣除例如與大鼠T2R1或小鼠T2R1直向進(jìn)化同源物序列交叉反應(yīng)的抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)。
d.其它試驗(yàn)形式Western印跡(免疫印跡)分析可用于檢測(cè)和定量樣品中存在的T2R蛋白質(zhì)。該技術(shù)一般包括通過(guò)基于分子量的凝膠電泳分離樣品蛋白質(zhì)、將分離開(kāi)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到合適的固相支持物上(例如硝酸纖維素膜、尼龍膜或衍生尼龍膜)、將樣品與特異結(jié)合T2R蛋白質(zhì)的抗體孵育。抗-T2R多肽抗體然后特異性與固相支持物上的T2R多肽結(jié)合。這些抗體可能直接被標(biāo)記，或隨后被特異結(jié)合抗-T2R抗體的標(biāo)記抗體所檢測(cè)(例如標(biāo)記的綿羊抗小鼠抗體)。
另外，試驗(yàn)形式包括脂質(zhì)體免疫試驗(yàn)(LIA)，其利用設(shè)計(jì)成結(jié)合特定分子(如抗體)，并釋放出封裝好的試劑或標(biāo)志物的脂質(zhì)體。釋放出的試劑然后可利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢測(cè)(參見(jiàn)Monroe等，Amer.Clin.Prod.Rev.，534-41(1986))。
e.非特異結(jié)合的降低本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，免疫試驗(yàn)中經(jīng)常希望降低非特異性的結(jié)合。特別是當(dāng)試驗(yàn)涉及固定在固相基質(zhì)上的抗原或抗體時(shí)，希望降低非特異結(jié)合到固相基質(zhì)上的量。降低非特異結(jié)合的手段本領(lǐng)域眾所周知。一般來(lái)講，該技術(shù)涉及使用蛋白質(zhì)性質(zhì)的組分來(lái)包被基質(zhì)。特別是象牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、明膠這樣的組分被廣泛應(yīng)用，最優(yōu)選的方案是使用奶粉。
f.標(biāo)記物(labels)試驗(yàn)中使用的特定標(biāo)記物或可檢測(cè)基團(tuán)不是本發(fā)明的關(guān)鍵因素，只要它不顯著影響試驗(yàn)中抗體的特異性結(jié)合即可。可檢測(cè)基團(tuán)可以是任何具有可檢測(cè)的物理或化學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)。這類(lèi)可檢測(cè)標(biāo)記在免疫試驗(yàn)領(lǐng)域發(fā)展完善，并且通常情況下，這些方法中有用的大多數(shù)標(biāo)記物都可以應(yīng)用于本發(fā)明。因此，標(biāo)記物是指任何能用光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)的、光學(xué)的或化學(xué)的手段檢測(cè)到的組分。本發(fā)明有用的標(biāo)記物包括磁珠(如DYNABEADSTM)、熒光染料(如異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅(Texas red)、羅丹明等)、放射標(biāo)記物(如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶和其它通常用于ELISA的酶)、和顯色標(biāo)記物如膠體金或彩色玻璃或塑料珠(如聚苯烯、聚丙烯、乳膠等)。
按照本領(lǐng)域已知的方法，標(biāo)記物可以直接或間接耦聯(lián)至試驗(yàn)中目的組分上。如上所述，根據(jù)所需要的靈敏度、與化合物綴合的難易度、所需穩(wěn)定性、現(xiàn)有儀器、和廢物處理?xiàng)l款，可以使用各種各樣的標(biāo)記物。
非放射標(biāo)記物通常使用間接法標(biāo)記。一般來(lái)講，配基分子(如生物素)共價(jià)結(jié)合至分子上。該配基然后結(jié)合另外一個(gè)分子(如鏈霉親和素)，該分子本身可被檢測(cè)或共價(jià)連接至一個(gè)信號(hào)系統(tǒng)如可檢測(cè)酶、熒光化合物、或化學(xué)發(fā)光化合物上。配基和它們的靶標(biāo)可以與識(shí)別T2R蛋白的抗體、或識(shí)別抗-T2R的二抗以任意適當(dāng)?shù)慕M合使用。
分子也可以直接綴合至信號(hào)產(chǎn)生化合物上，例如與酶或熒光團(tuán)綴合。作為標(biāo)記物的目的酶主要是水解酶，特別是磷酸酶、酯酶和糖苷酶、或氧化酶(oxidotase)，特別是過(guò)氧化物酶。熒光化合物包括熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹磺酰化合物、傘形酮等。化學(xué)發(fā)光化合物包括螢光素(luciferin)，和2，3-二氫吩嗪二酮類(lèi)(2，3-dihydrophthalazinediones)，例如魯米諾。可能使用的多種標(biāo)記或信號(hào)發(fā)生系統(tǒng)參見(jiàn)U.S.Patent No.4,391,904的綜述。
檢測(cè)標(biāo)記物的方法本領(lǐng)域眾所周知。因此，例如當(dāng)標(biāo)記物是放射標(biāo)記物時(shí)，檢測(cè)手段包括閃爍計(jì)數(shù)器或感光膜放射自顯影。當(dāng)標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物時(shí)，可以通過(guò)合適波長(zhǎng)的光激發(fā)熒光團(tuán)并檢測(cè)產(chǎn)生的熒光。熒光可以肉眼觀察，通過(guò)感光膜，或通過(guò)電子檢測(cè)器如電荷耦聯(lián)裝置(CCDs)或光電倍增器等檢測(cè)。類(lèi)似地，在提供酶的合適底物后，可以通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物來(lái)檢測(cè)酶標(biāo)記物。最后，簡(jiǎn)單的顯色標(biāo)記物可以通過(guò)簡(jiǎn)單觀察與標(biāo)記物相關(guān)的顏色來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，在一系列試紙條(dipstick)試驗(yàn)中，綴合的金通常顯示粉紅色，而各種綴合的小珠顯示各自小珠本身的顏色。
一些試驗(yàn)形式不需要使用標(biāo)記的組分。例如，凝集試驗(yàn)可用于檢測(cè)靶抗體存在與否。在該試驗(yàn)中，抗原包被顆粒與包含靶抗體的樣品發(fā)生凝集。在該形式中，參與組分均無(wú)需標(biāo)記，通過(guò)肉眼簡(jiǎn)單觀測(cè)就能判定靶抗體的有無(wú)。
E.味覺(jué)調(diào)節(jié)子的檢測(cè)確定一種試驗(yàn)化合物是否能夠在體內(nèi)和體外特異性結(jié)合本發(fā)明的T2R多肽的方法和組合物如下所述。可以監(jiān)測(cè)細(xì)胞生理學(xué)的許多指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)配體結(jié)合自然產(chǎn)生的或嵌合的T2R的效果。這些試驗(yàn)可以在表達(dá)T2R多肽的完整細(xì)胞上進(jìn)行，在通透化的細(xì)胞上進(jìn)行，或在通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生的膜成分上進(jìn)行。
味覺(jué)受體結(jié)合味覺(jué)元并引發(fā)化學(xué)刺激轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。激活的或抑制的G蛋白繼而改變靶標(biāo)酶、通道、或其它效應(yīng)蛋白質(zhì)的性質(zhì)。一些例子如通過(guò)視覺(jué)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)素而引起cGMP磷酸二酯酶的活化、由刺激性G蛋白引起的腺苷酸環(huán)化酶、由Gq或其它同類(lèi)G蛋白引起的磷脂酶C的激活化、和由Gi和其它G蛋白引起的不同通道的調(diào)節(jié)等。下游結(jié)果也能檢驗(yàn)，如由磷脂酶C引發(fā)二酯酰甘油和IP3的產(chǎn)生，繼而也可以檢驗(yàn)由IP3引發(fā)的鈣遷移。
試驗(yàn)中的T2R蛋白或多肽通常從具有SEQ ID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的序列，或其片段或保守性修飾變體序列的多肽中選擇出來(lái)。
或者，試驗(yàn)中的T2R蛋白或多肽可以從真核宿主細(xì)胞衍生而來(lái)，其包含具有與SEQ ID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24，或其保守性修飾變體相同的氨基酸序列的氨基酸亞序列。一般來(lái)講，氨基酸序列的相同性至少30％，優(yōu)選地30-40％，更具體地50-60、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。可選地，試驗(yàn)中的T2R蛋白或多肽可以包含T2R多肽的區(qū)域，如細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)、胞漿結(jié)構(gòu)域、配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域等。可選地，T2R多肽或其一部分，可以共價(jià)連接至異源蛋白質(zhì)，以產(chǎn)生可用于此處描述的試驗(yàn)的嵌合蛋白質(zhì)。
可以使用如上所述的T2R蛋白質(zhì)或多肽，不管是重組的還是天然產(chǎn)生的，來(lái)測(cè)試T2R活性的調(diào)節(jié)子。可以分離、在細(xì)胞中表達(dá)、在由細(xì)胞衍生出的膜上表達(dá)、在動(dòng)物或組織中表達(dá)重組的或者是天然產(chǎn)生的T2R蛋白和多肽。例如，舌切片、從舌上分離下來(lái)的細(xì)胞、轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或膜都可以使用。可以使用此處描述的體內(nèi)或體外試驗(yàn)中的一種來(lái)測(cè)試調(diào)節(jié)作用。
1.體外結(jié)合試驗(yàn)使用T2R多肽或嵌合分子，例如共價(jià)連接至異源信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的T2R的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)或其組合；或共價(jià)結(jié)合至T2R蛋白或多肽的跨膜和/或胞漿結(jié)構(gòu)域的異源細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和/或跨膜區(qū)，利用可溶性的或固相反應(yīng)，可以在體外檢驗(yàn)味覺(jué)傳導(dǎo)。此外，可以利用T2R多肽配體結(jié)合區(qū)，在體外可溶或固相反應(yīng)中以試驗(yàn)其配體結(jié)合。在多數(shù)實(shí)施方案中，嵌合受體可以被制成包含T2R多肽的全部或一部分，以及促進(jìn)T2R定位到膜上的序列，諸如視紫紅質(zhì)，如視紫紅質(zhì)蛋白的N端片段。
T2R蛋白質(zhì)、配體結(jié)合區(qū)或嵌合蛋白質(zhì)與配體的結(jié)合，可以在溶液、雙層膜(附著到固相上)、脂單層、或囊泡中檢測(cè)。調(diào)節(jié)子的結(jié)合可以利用如光譜特征(例如熒光、吸收、折射指數(shù))變化、流體力學(xué)(如形狀)、層析或溶解性進(jìn)行測(cè)試。
T2R-G蛋白的相互作用也能被檢驗(yàn)。例如，G蛋白與T2R多肽的結(jié)合，或它從多肽上的釋放都能被檢驗(yàn)。在沒(méi)有GTP的情況下，活化子(activator)將導(dǎo)致G蛋白(全部三個(gè)亞基)和T2R的緊密復(fù)合物的形成。該復(fù)合物可用上述的多種方法檢測(cè)。這種試驗(yàn)修飾后可用于尋找抑制子(inhibitors)，例如在沒(méi)有GTP的情況下，將活化子加入G蛋白和T2R的緊密復(fù)合物中，然后通過(guò)觀察T2R-G蛋白復(fù)合物的解離從而篩選抑制子。在GTP存在的情況下中，G蛋白α亞基從其它兩個(gè)G蛋白亞基的釋放可作為活化標(biāo)準(zhǔn)。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用GTPγS試驗(yàn)。如上所述，在GPCR的活化下，G蛋白復(fù)合物的Gα亞基被刺激，將結(jié)合的GDP交換成為GTP。配體介導(dǎo)的G蛋白交換活性的刺激可以通過(guò)在生物化學(xué)試驗(yàn)測(cè)量，其中測(cè)定在推測(cè)配體存在情況下加入的放射標(biāo)記GTPγ35S與G蛋白的結(jié)合。一般情況下，含有目的化學(xué)感受受體的膜與G蛋白復(fù)合物相混合。將潛在抑制子和/或活化子和GTPγS加入到試驗(yàn)中，測(cè)量GTPγS與G蛋白的結(jié)合。可以通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)或其它本領(lǐng)域已知的手段(包括閃爍接近試驗(yàn)(scintillation proximity assay，SPA))測(cè)量結(jié)合作用。在另一種試驗(yàn)形式中，可使用熒光標(biāo)記的GTPγS。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，T2R-味(轉(zhuǎn))導(dǎo)素相互作用可作為T(mén)2R受體活化的函數(shù)檢測(cè)。例如，小鼠T2R5與味(轉(zhuǎn))導(dǎo)素顯示出強(qiáng)烈的放線(xiàn)(菌)酮依賴(lài)性耦聯(lián)。T2R受體與味(轉(zhuǎn))導(dǎo)素的這種配體依賴(lài)耦聯(lián)可作為標(biāo)志物用來(lái)鑒定T2R家族任何成員的調(diào)節(jié)物(modifier)。
2.熒光偏振試驗(yàn)在另一實(shí)施方案中，基于熒光偏振(“FP”)的試驗(yàn)可用于檢測(cè)和監(jiān)測(cè)配體結(jié)合。熒光偏振試驗(yàn)是測(cè)量平衡結(jié)合、核酸雜交、和酶活性的實(shí)驗(yàn)室通用技術(shù)。熒光偏振試驗(yàn)是均一性的，因?yàn)樗恍枰蛛x步驟如離心、過(guò)濾、層析、沉淀或電泳等。這些試驗(yàn)在溶液中直接實(shí)時(shí)進(jìn)行，不需要一個(gè)固定化階段。偏振值可重復(fù)測(cè)量，在加入試劑后測(cè)量速度非常快，所以不會(huì)破壞樣品。一般情況下，本技術(shù)可用于測(cè)量低至匹摩爾(picomolar)到微摩爾(micromolar)水平熒光基團(tuán)(fluorophore)的偏振值。本節(jié)描述了怎樣簡(jiǎn)單定量地將熒光偏振應(yīng)用于測(cè)量本發(fā)明T2R多肽配體的結(jié)合。
當(dāng)熒光標(biāo)記分子被平面偏振光激發(fā)，就發(fā)出具有一定偏振程度的光，偏振程度與其分子旋轉(zhuǎn)成反比。大的熒光標(biāo)記分子在激發(fā)態(tài)(對(duì)于熒光素來(lái)說(shuō)為4納秒)保持一定程度的穩(wěn)定性，在激發(fā)和發(fā)射之間光的偏振保持一定程度的恒定。小的熒光標(biāo)記分子在激發(fā)態(tài)快速旋轉(zhuǎn)，在激發(fā)和發(fā)射之間光的偏振變化顯著。因此，小分子偏振值較低而大分子偏振值較高。例如，一個(gè)單鏈熒光素標(biāo)記的寡核苷酸具有相對(duì)較低的偏振值，但當(dāng)它與互補(bǔ)鏈雜交后就具有較高的偏振值。當(dāng)使用FP來(lái)檢測(cè)和監(jiān)測(cè)可能激活或抑制本發(fā)明化學(xué)感受受體的味覺(jué)元結(jié)合作用時(shí)，可以使用熒光標(biāo)記的味覺(jué)元或自發(fā)熒光味覺(jué)元。
熒光偏振(P)被定義為P=IntΠ-Int⊥IntΠ+Int⊥]]>其中∏是與激發(fā)光平面平行的發(fā)射光強(qiáng)度，⊥是與激發(fā)光平面垂直的發(fā)射光強(qiáng)度。P，作為一個(gè)光強(qiáng)度的比值，是一個(gè)沒(méi)有單位的數(shù)字。例如，Beacon和Beacon2000TM系統(tǒng)可以與這些試驗(yàn)結(jié)合使用。這類(lèi)系統(tǒng)通常用毫偏振單位來(lái)表達(dá)偏振值(1偏振單位＝1000mP單位)。
分子旋轉(zhuǎn)和尺寸之間的關(guān)系由Perrin方程式描述。概括地講，Perrin方程式認(rèn)為偏振與旋轉(zhuǎn)弛豫(rotational relaxation)時(shí)間成正比關(guān)系，該時(shí)間是一個(gè)分子旋轉(zhuǎn)過(guò)大約68.5°角所需要的時(shí)間。旋轉(zhuǎn)弛豫時(shí)間按下列方程式與粘度(η)、絕對(duì)溫度(T)、分子體積(V)、和氣體常數(shù)(R)有關(guān) 旋轉(zhuǎn)弛豫時(shí)間對(duì)于小分子如熒光素非常小(≈1納秒)，對(duì)于大分子如免疫球蛋白非常大(≈100納秒)。如果粘度和溫度保持恒定，旋轉(zhuǎn)弛豫時(shí)間，也即偏振，與分子體積直接相關(guān)。分子體積的變化可能是由于與其它分子的相互作用、解離、聚合、降解、雜交或熒光標(biāo)記分子的構(gòu)象變化等引起。例如，熒光偏振已被用于測(cè)量大分子熒光素標(biāo)記的聚合物的酶促裂解，如用蛋白酶、DNA酶和RNA酶引起的裂解。它也同樣被用于測(cè)量蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用、抗體/抗原結(jié)合、和DNA/蛋白質(zhì)結(jié)合的平衡結(jié)合作用。
3.固相和可溶性高通量試驗(yàn)在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用T2R多肽，或表達(dá)T2R多肽的細(xì)胞或組織的可溶性試驗(yàn)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明以高通量形式提供了基于固相的體外試驗(yàn)，其中T2R多肽、或表達(dá)T2R多肽的細(xì)胞或組織附著在固相底物上。
在本發(fā)明的高通量試驗(yàn)中，在一天內(nèi)篩選多達(dá)幾千個(gè)不同的調(diào)節(jié)子或配體是可能的。特別是微孔板的每一個(gè)孔都可以用于進(jìn)行針對(duì)選擇的潛在調(diào)節(jié)子的單獨(dú)的試驗(yàn)，或者如果是觀察濃度或孵育時(shí)間效果，每5-10個(gè)孔可以測(cè)試一個(gè)調(diào)節(jié)子。因此，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)微孔板可以試驗(yàn)大約100個(gè)(例如96個(gè))調(diào)節(jié)子。如果使用1536孔板，那么一個(gè)板可以輕松分析1000到大約1500個(gè)不同化合物。也可以在每個(gè)平板孔中分析多種化合物。另外每天都可以分析幾個(gè)不同的微孔板，使每天分析大約6,000-20,000種化合物成為可能；最近又發(fā)展了試劑操作的微流體方法。
目的分子可以直接或間接通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)鍵如經(jīng)由一個(gè)標(biāo)記物(tag)結(jié)合到固態(tài)組分上。標(biāo)記物可以是任何的各種各樣的組分。一般來(lái)講，將可結(jié)合標(biāo)記物的分子(標(biāo)記物結(jié)合物)固定在一個(gè)固相支持物上，通過(guò)標(biāo)記物和標(biāo)記物結(jié)合物的相互作用，標(biāo)記了的目的分子(如味覺(jué)傳導(dǎo)目的分子)就固定在了固相支持物上。
根據(jù)文獻(xiàn)描述的已知分子相互作用，可以使用許多標(biāo)記物和標(biāo)記物結(jié)合物。例如，當(dāng)一個(gè)標(biāo)記物具有一個(gè)天然結(jié)合物，例如生物素、蛋白A、或蛋白G，它就可以與適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物結(jié)合物(親和素、鏈霉親和素、中性親和素、免疫球蛋白的Fc區(qū)等)結(jié)合使用。針對(duì)具有天然結(jié)合物的分子如生物素的抗體也可被廣泛應(yīng)用，并是合適的標(biāo)記物結(jié)合物(參見(jiàn)，SigmaImmunochemicals 1998 Catalogue，Sigma，St.Louis MO)。
類(lèi)似地，任何半抗原或抗原性化合物都可與適當(dāng)抗體結(jié)合形成標(biāo)記物/標(biāo)記物結(jié)合物對(duì)。幾千種特異性抗體都已商業(yè)化并且文獻(xiàn)中還描述了許多其它的抗體。例如，在一個(gè)常見(jiàn)方法中，標(biāo)記物是第一抗體，標(biāo)記物結(jié)合物是特異識(shí)別第一抗體的第二抗體。除了抗體-抗原相互作用外，受體-配體相互作用也可以作為合適的標(biāo)記物和標(biāo)記物結(jié)合物對(duì)。例如，細(xì)胞膜受體激動(dòng)劑和拮抗劑(例如，細(xì)胞受體-配體相互作用如轉(zhuǎn)鐵蛋白、c-盒、病毒受體配體、細(xì)胞因子受體、趨化因子受體、白介素受體、免疫球蛋白受體和抗體、鈣粘著蛋白家族、整聯(lián)蛋白家族、選擇蛋白(selectin)家族等，例如參見(jiàn)，Pogott&Power，The Adhesion MoleculeFacts Book I(1993))。類(lèi)似地，毒素和毒液(venoms)、病毒表位、激素(例如鴉片、類(lèi)固醇等)、細(xì)胞內(nèi)受體(例如，介導(dǎo)各種小配體作用的物質(zhì)，包括類(lèi)固醇、甲狀腺激素、類(lèi)維生素A和維生素D，和肽)、藥物、凝集素、糖、核酸(線(xiàn)性和環(huán)狀聚合物構(gòu)型)、寡糖、蛋白質(zhì)、磷脂和抗體等都可以與不同細(xì)胞受體相互作用。
合成聚合物如聚氨基甲酸酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲類(lèi)、聚酰胺、聚乙烯亞胺、聚芳撐硫化物、聚硅氧烷、聚酰亞胺、聚乙酸酯(polyacetates)同樣可以形成合適的標(biāo)記物或標(biāo)記物結(jié)合物。許多其它的標(biāo)記物/標(biāo)記物結(jié)合物對(duì)同樣對(duì)于在此描述的試驗(yàn)系統(tǒng)十分有益，在瀏覽本公開(kāi)專(zhuān)利時(shí)這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
一般接頭如肽、聚醚等同樣可以作為標(biāo)記物，并且包括多肽序列，例如大約5到200個(gè)氨基酸的聚甘氨酸序列。這類(lèi)彈性接頭對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。例如，聚(乙二醇)接頭可以從ShearwaterPolymers，Inc.Huntsville，Alabama得到。這些接頭可選地具有酰胺鍵、巰基鍵或異功能鍵等。
標(biāo)記物結(jié)合物可以使用現(xiàn)有的各種方法固定到固相底物上。通常固相底物的全部或部分暴露于化學(xué)試劑(將能與標(biāo)記物結(jié)合物的一部分發(fā)生反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)固定到表面)中以完成其衍生或功能化。例如，適合附著在長(zhǎng)鏈部分上的基團(tuán)可包括胺、羥基、硫醇和羧基基團(tuán)。氨基烷基硅烷(aminoalkylsilanes)和羥烷基硅烷(hydroxyalkylsilanes)可用于一系列表面的功能化，例如玻璃表面。構(gòu)建此類(lèi)固相生物聚合膜陣列的方法文獻(xiàn)中均有詳細(xì)描述。例如參見(jiàn)，Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，852149-2154(1963)(描述了固相如肽的合成)；Geysen等，J.Immun.Meth.，102259-274(1987)(描述了在針上固相組分的合成)；Frank&Doring，Tetrahedron，446031-6040(1988)(描述了在纖維素盤(pán)上合成多種肽序列)；Fodor等，Science，251767-777(1991)；Sheldon等，Clinical Chemistry，39(4)718-719(1993)；和Kozal等，NatureMedicine，2(7)753-759(1996)(均描述了固定在固相支持物上的生物聚合物排列)。固定標(biāo)記物結(jié)合物到底物上的非化學(xué)方法包括其它常用方法，如加熱、UV輻射交聯(lián)等。
4.基于計(jì)算機(jī)的試驗(yàn)另外一種測(cè)定調(diào)節(jié)T2R多肽活性的化合物的試驗(yàn)涉及計(jì)算機(jī)輔助化合物設(shè)計(jì)，其中計(jì)算機(jī)系統(tǒng)在氨基酸序列編碼的結(jié)構(gòu)信息基礎(chǔ)上，用于產(chǎn)生T2R多肽的三維結(jié)構(gòu)。輸入的氨基酸序列與計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中預(yù)先建立的算法直接并積極相互作用，產(chǎn)生出蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)模型。然后檢驗(yàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型，來(lái)確定具有結(jié)合例如配體的能力的結(jié)構(gòu)區(qū)域。這些區(qū)域然后用于鑒定可結(jié)合該蛋白質(zhì)的配體。
通過(guò)輸入至少有10個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)氨基酸序列或相應(yīng)的編碼T2R多肽的核酸序列到計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中，產(chǎn)生蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型。編碼T2R多肽的核酸序列，或其氨基酸序列，可以是此處公開(kāi)的任何序列和其保守性修飾的變體。
氨基酸序列代表了蛋白質(zhì)的一級(jí)序列或亞序列，其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。將至少10個(gè)殘基的氨基酸序列(或編碼10個(gè)氨基酸的核苷酸序列)通過(guò)鍵盤(pán)、計(jì)算機(jī)可讀的底物(包括但并不局限于，電子存儲(chǔ)介質(zhì)(如磁盤(pán)、磁帶、盒帶(cartridges)、和芯片)、光學(xué)介質(zhì)(如CD ROM))、由因特網(wǎng)和RAM發(fā)布的信息輸入到計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中。然后通過(guò)氨基酸序列與計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的相互作用，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知軟件，產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型。
氨基酸序列代表了一級(jí)結(jié)構(gòu)，其編碼形成目的蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)必要的信息。本軟件根據(jù)一級(jí)序列編碼的某些參數(shù)來(lái)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)模型。這些參數(shù)被稱(chēng)為“能量參數(shù)”，主要包括靜電電勢(shì)、疏水電勢(shì)、溶劑可接近性表面、和氫鍵形成。二級(jí)能量參數(shù)包括范德華電勢(shì)。生物分子形成以一種累積形式使該能量參數(shù)值最小化的結(jié)構(gòu)。計(jì)算機(jī)程序然后使用這些由一級(jí)結(jié)構(gòu)或氨基酸序列編碼的參數(shù)值來(lái)產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)模型。
在二級(jí)結(jié)構(gòu)能量參數(shù)的基礎(chǔ)上，形成由二級(jí)結(jié)構(gòu)編碼的蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。用戶(hù)此時(shí)可以輸入另外的變量，如該蛋白質(zhì)是膜結(jié)合的或是可溶性的、在機(jī)體內(nèi)的定位、它的細(xì)胞內(nèi)定位如胞漿、表面或細(xì)胞核等。這些變量以及二級(jí)結(jié)構(gòu)能量參數(shù)用來(lái)產(chǎn)生三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。在三級(jí)結(jié)構(gòu)模建中，計(jì)算機(jī)程序?qū)⒍?jí)結(jié)構(gòu)疏水面和類(lèi)似物匹配，以及將二級(jí)結(jié)構(gòu)親水面和類(lèi)似物匹配。
一旦產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)，計(jì)算機(jī)就會(huì)鑒定出潛在的配體結(jié)合區(qū)域。通過(guò)輸入如上所述的氨基酸或核苷酸序列或化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式，可產(chǎn)生潛在配體的三維結(jié)構(gòu)。然后將潛在配體的三維結(jié)構(gòu)與T2R多肽的三維結(jié)構(gòu)相比較，從而鑒定結(jié)合該蛋白質(zhì)的配體。通過(guò)能量參數(shù)確定蛋白質(zhì)和配體間的結(jié)合親和性，由此可以確定哪些配體具有增加的與該蛋白質(zhì)結(jié)合的概率。
計(jì)算機(jī)系統(tǒng)同樣可用于篩選T2R基因的突變、多態(tài)變體、等位基因、和種間同源體。這類(lèi)突變可能與疾病狀態(tài)或遺傳性狀相關(guān)。如上所述，基因芯片(GeneChipTM)和相關(guān)技術(shù)同樣可用于篩選突變、多態(tài)變體、等位基因、和種間同源體。一旦變體被鑒定，可以用診斷試驗(yàn)確定具有突變的基因的患者。突變T2R基因的鑒定涉及接收T2R基因或其保守性修飾變體的第一核酸或氨基酸序列的輸入。序列用如上所述的方法輸入計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。該第一核酸或氨基酸序列然后與同第一序列基本相同的第二核酸或氨基酸序列比較。第二序列用如上所述的方法輸入計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。一旦比較了第一和第二序列，就能確定兩序列中核苷酸或氨基酸的差異。這些序列能夠代表不同的T2R基因中的等位基因差異、與疾病狀態(tài)和遺傳性狀相關(guān)的突變。
5.基于細(xì)胞的結(jié)合試驗(yàn)在優(yōu)選的實(shí)施方案中，T2R蛋白或多肽在真核細(xì)胞中表達(dá)為嵌合受體，其帶有異源的、能夠促進(jìn)其成熟和定向通過(guò)分泌途徑的伴侶序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該異源序列是視紫紅質(zhì)序列，如視紫紅質(zhì)的N端片段。這類(lèi)嵌合T2R蛋白質(zhì)可在任何真核細(xì)胞中表達(dá)，如HEK-293細(xì)胞。優(yōu)選地，這些細(xì)胞包含功能性G蛋白，例如Gα15，其可以耦聯(lián)嵌合受體至細(xì)胞內(nèi)信號(hào)發(fā)生途徑上，或耦聯(lián)至信號(hào)發(fā)生蛋白如磷脂酶C上。細(xì)胞內(nèi)這類(lèi)嵌合受體的活化可以用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)，如通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的FURA-2依賴(lài)性熒光來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣的變化。
激活的GPCR受體變成激酶的底物，激酶能夠使受體C端尾部磷酸化(也可能是其它位置)。因此，激活子能促進(jìn)32P從γ標(biāo)記的GTP到受體的轉(zhuǎn)移，其可用閃爍計(jì)數(shù)器分析。C端尾部磷酸化能促進(jìn)捕獲素(arrestin)樣蛋白的結(jié)合，從而干擾G蛋白的結(jié)合。激酶/捕獲素途徑在許多GPCR的脫敏中起著重要的作用。例如，調(diào)節(jié)味覺(jué)受體保持活性的持續(xù)期的化合物可用于延長(zhǎng)目的味道或去除一個(gè)不愉快的味道。GPCR信號(hào)傳導(dǎo)和分析信號(hào)傳導(dǎo)的方法的一般性綜述參見(jiàn)，Methods in Enzymology，vols.237 and 238(1994)and volume 96(1983)；Bourne等，Nature，10349117-27(1991)；Bourne等，Nature，348125-32(1990)；Pitcher等，Annu.Rev.Biochem.，67653-92(1998)。
通過(guò)比較由推定的調(diào)節(jié)子處理過(guò)的T2R多肽的反應(yīng)和未處理過(guò)的對(duì)照樣品的反應(yīng)從而分析T2R調(diào)節(jié)作用。這類(lèi)推定的T2R調(diào)節(jié)子可包括抑制或活化T2R多肽活性的味覺(jué)元。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)照樣品(未用活化子或抑制子處理)的T2R相對(duì)活性值被指定為100。當(dāng)T2R活性值相對(duì)于對(duì)照為大約90％，可選地50％或25-0％時(shí)，就獲得對(duì)T2R多肽的抑制。當(dāng)T2R活性值相對(duì)于對(duì)照為110％，可選地150％、200-500％或1000-2000％時(shí)，就獲得對(duì)T2R多肽的活化。
離子流量變化可通過(guò)確定表達(dá)T2R多肽的細(xì)胞或膜的離子偏振(即電勢(shì))變化來(lái)評(píng)價(jià)。確定細(xì)胞偏振變化的一個(gè)手段就是用電壓-鉗(voltage-clamp)和補(bǔ)丁-鉗(patch-clamp)技術(shù)(例如參見(jiàn)，“細(xì)胞附著”模式、“內(nèi)-外”模式、和“全細(xì)胞”模式，如Ackerman等，New Engl.JMed.，3361575-1595(1997)))測(cè)量電流變化(從而檢測(cè)偏振的變化)。全細(xì)胞電流可用已知的標(biāo)準(zhǔn)方法很方便地測(cè)量到。其它已知的試驗(yàn)包括放射標(biāo)記的離子流量試驗(yàn)和使用電壓敏感性染料的熒光試驗(yàn)(例如參見(jiàn)，Vestergarrd-Bogind等，J.Membrane Biol.，8867-75(1988)；Gonzales&Tsien，Chem.Biol.，4269-277(1997)；Daniel等，J.Pharmacol.Meth.，25185-193(1991)；Holevinsky等，J.MembraneBiol.，13759-70(1994))。一般來(lái)講，待測(cè)試化合物的存在濃度為從1pM到100mM。
待測(cè)試化合物對(duì)于T2R多肽功能的效果可以通過(guò)檢驗(yàn)如上所述的任何一個(gè)參數(shù)來(lái)測(cè)量。任何影響GPCR活性的適當(dāng)?shù)纳韺W(xué)變化都可用于評(píng)價(jià)一個(gè)待測(cè)試化合物對(duì)本發(fā)明T2R多肽的影響。當(dāng)使用完整細(xì)胞或動(dòng)物確定功能結(jié)果時(shí)，同樣可測(cè)量一系列效果如遞質(zhì)釋放、激素釋放、已知和未鑒定遺傳標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄變化(例如Northern印跡)、細(xì)胞代謝變化如細(xì)胞生長(zhǎng)或pH變化、和細(xì)胞內(nèi)第二信使如Ca2+、IP3、cGMP或cAMP的變化等。
優(yōu)選的分析GPCR的試驗(yàn)包括載有離子或電壓敏感性染料，能夠報(bào)告受體活性的細(xì)胞。確定這類(lèi)受體活性的試驗(yàn)同樣可使用其它G蛋白耦聯(lián)受體已知的激動(dòng)劑和拮抗劑作為陰性或陽(yáng)性對(duì)照，來(lái)評(píng)價(jià)待測(cè)化合物的活性。在鑒定調(diào)節(jié)活性化合物(例如激動(dòng)劑、拮抗劑)的試驗(yàn)中，胞漿內(nèi)離子水平或膜電位的變化可以分別使用離子敏感或膜電位熒光指示劑來(lái)監(jiān)測(cè)。可能使用到的離子敏感指示劑和電壓探頭在Molecular Probes1997 Catalot中有描述。對(duì)于GPCR，混棲G蛋白如Gα15和Gα16可用于選擇實(shí)驗(yàn)(Wilkie等，PNAS，8810049-10053(1991))。這類(lèi)混棲G蛋白允許廣泛的受體分子的耦聯(lián)。
受體活化通常啟動(dòng)隨后的細(xì)胞內(nèi)事件，如第二信使如IP3的增加，其能夠釋放細(xì)胞內(nèi)鈣離子庫(kù)存。一些GPCR的活化通過(guò)磷脂酶C介導(dǎo)的磷脂酰肌醇水解作用刺激三磷酸肌醇(IP3)的形成(Berridge&Irvine，Nature，312315-21(1984))。IP3繼而刺激細(xì)胞內(nèi)鈣離子庫(kù)存的釋放。因此胞漿鈣離子水平變化，或第二信使如IP3水平的變化可用于評(píng)價(jià)GPCR的功能。表達(dá)這類(lèi)GPCR的細(xì)胞可能會(huì)因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)庫(kù)存釋放和通過(guò)離子通道活化而表現(xiàn)出胞漿鈣離子水平增加，在這種情況下盡管不是十分必要但也應(yīng)盡量在沒(méi)有鈣離子的緩沖液中進(jìn)行該試驗(yàn)，可選地在溶液中加入一種鰲合劑如EGTA，用來(lái)區(qū)分由內(nèi)部庫(kù)存鈣釋放引起的熒光反應(yīng)。
其它試驗(yàn)可包括確定受體活性，其活化后，通過(guò)活化或抑制酶如腺苷酸環(huán)化酶導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸如cAMP或cGMP水平的變化。環(huán)核苷酸門(mén)控離子通道如錐狀光受體細(xì)胞通道和嗅覺(jué)神經(jīng)元通道，在結(jié)合cAMP或cGMP而活化下，對(duì)陽(yáng)離子具有通透性(例如參見(jiàn)，Altenhofen等，PNAS，889868-9872(1991)and Dhallan等，Nature，347184-187(1990))。在受體活化導(dǎo)致環(huán)核苷酸水平降低的情況下，可優(yōu)選在加入受體激活化合物到試驗(yàn)細(xì)胞之前，將細(xì)胞暴露在能夠增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸水平的試劑如毛喉素中。用于這種類(lèi)型的試驗(yàn)中的細(xì)胞可通過(guò)用編碼環(huán)核苷酸門(mén)控離子通道、GPCR磷酸酶的DNA和編碼受體(例如某些谷氨酸受體、蕈毒堿性乙酰膽堿受體、多巴胺受體、五羥色胺受體等)的DNA共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞而制備，其在活化后將引起胞漿內(nèi)環(huán)核苷酸水平的變化。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)在異源細(xì)胞(具有將受體連接至磷脂酶C信號(hào)傳導(dǎo)途徑上的混棲G蛋白)中表達(dá)T2R基因，測(cè)量T2R多肽的活性(參見(jiàn)Offermanns&Simon，J.Biol.Chem.，27015175-15180(1995))。可選地該細(xì)胞系是HEK-293(其在天然狀態(tài)下不表達(dá)T2R基因)，混棲G蛋白是Gα15(Offermanns&Simon，如前)。通過(guò)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平(其通過(guò)吸收與T2R多肽結(jié)合的分子，響應(yīng)于T2R信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)作用而變化)的變化來(lái)分析味覺(jué)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)。Ca2+水平的變化可選地由熒光Ca2+指示劑染料和熒光成像技術(shù)來(lái)測(cè)量。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用免疫試驗(yàn)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)的cAMP或cGMP的變化。Offermanns&Simon，J.Biol.Chem.，27015175-15180(1995)描述的方法可以用于確定cAMP水平。同樣，F(xiàn)elley-Bosco等，Am.J.Resp.Cell and Mol.Biol.，11159-164(1994)描述的方法可以用于確定cGMP水平。此外，測(cè)量cAMP和/或cGMP的試驗(yàn)試劑盒見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,115,538，在此引用作為參考。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以按照U.S.Patent 5,436,128分析磷脂酰肌醇(PI)水解，在此引用作為參考。簡(jiǎn)單地講，該試驗(yàn)涉及用3H-肌醇標(biāo)記細(xì)胞48小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。標(biāo)記后的細(xì)胞用待測(cè)化合物處理1小時(shí)。處理后的細(xì)胞裂解并用氯仿-甲醇-水抽提，其后通過(guò)離子交換層析分離磷酸肌醇，用閃爍計(jì)數(shù)定量。計(jì)算存在激動(dòng)劑時(shí)的cpm和存在緩沖液對(duì)照時(shí)的cpm的比率，確定刺激作用倍數(shù)。類(lèi)似地，計(jì)算存在拮抗劑時(shí)的cpm和存在緩沖液對(duì)照(可能含有或不含有激動(dòng)劑)時(shí)的cpm的比率，可以確定抑制作用倍數(shù)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可測(cè)量轉(zhuǎn)錄水平用于評(píng)價(jià)待測(cè)化合物對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)的影響。可將包含T2R多肽的宿主細(xì)胞與待測(cè)化合物接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間以實(shí)現(xiàn)任何相互作用，然后測(cè)量目的蛋白的基因表達(dá)水平。實(shí)現(xiàn)這些相互作用的時(shí)間可以憑經(jīng)驗(yàn)確定，例如執(zhí)行一個(gè)時(shí)間進(jìn)程并且測(cè)量轉(zhuǎn)錄水平作為時(shí)間的函數(shù)。轉(zhuǎn)錄量可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的方法測(cè)量。例如，目的蛋白mRNA的表達(dá)可以通過(guò)Northern印跡檢測(cè)或利用免疫試驗(yàn)鑒定其多肽產(chǎn)物來(lái)檢測(cè)。或者，可使用利用報(bào)告基因的基于轉(zhuǎn)錄的試驗(yàn)，參見(jiàn)U.S.Patent 5,436,128的描述，在此引用作為參考。報(bào)告基因可以是，例如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、螢光素酶、3’-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶。此外，經(jīng)過(guò)附著在第二報(bào)告子如綠色熒光蛋白后，目的蛋白可以間接用作報(bào)告子(例如參見(jiàn)，Mistili&Spector，NatureBiotechnology，15961-964(1994))。
然后將轉(zhuǎn)錄量與在缺少待測(cè)化合物時(shí)相同細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄量相比較，或者與缺少T2R多肽的基本相同細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄量相比較。基本相同的細(xì)胞可以從用于制備重組細(xì)胞的相同細(xì)胞衍生而來(lái)，但是未被引進(jìn)異源DNA修飾。轉(zhuǎn)錄量的任何差異意味著待測(cè)化合物在一定程度上改變了目的T2R多肽的活性。
6.表達(dá)味覺(jué)受體的轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物表達(dá)一種或多種本發(fā)明T2R多肽的非人類(lèi)動(dòng)物同樣可用于試驗(yàn)。這種表達(dá)可用于確定試驗(yàn)化合物在體內(nèi)是否可以特異性地結(jié)合至哺乳動(dòng)物T2R多肽，具體方法是將用編碼T2R多肽或其配體結(jié)合區(qū)域的核酸穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的非人類(lèi)動(dòng)物與待測(cè)化合物接觸，并確定該動(dòng)物是否通過(guò)特異性結(jié)合多肽而對(duì)待測(cè)化合物起反應(yīng)。
使用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染或感染過(guò)的動(dòng)物對(duì)于鑒定和鑒別可結(jié)合特異性或一組受體的味覺(jué)元/配體的試驗(yàn)特別有用。這類(lèi)經(jīng)載體感染、能表達(dá)人類(lèi)化學(xué)感受受體序列的動(dòng)物，可用于體內(nèi)篩選味覺(jué)元和分析味覺(jué)元對(duì)細(xì)胞生理學(xué)(如對(duì)味覺(jué)神經(jīng)元)、對(duì)CNS或行為的影響。
單獨(dú)或作為文庫(kù)形式感染/表達(dá)核酸和載體的手段本領(lǐng)域眾所周知。各種各樣個(gè)體細(xì)胞、器官、或整個(gè)動(dòng)物的參數(shù)可用多種手段來(lái)測(cè)量。通過(guò)用感染劑如腺病毒表達(dá)載體投遞，可在動(dòng)物味覺(jué)組織中表達(dá)例如本發(fā)明的T2R序列。
內(nèi)源性化學(xué)感受受體基因可保持有功能，并且野生型(天然的)活性仍然存在。在其它情況下，當(dāng)需要所有的化學(xué)感受受體活性都是由引入的異源雜合受體引起時(shí)，優(yōu)選使用敲除品系(knockout line)。構(gòu)建非人類(lèi)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，特別是轉(zhuǎn)基因小鼠，和產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞的重組構(gòu)建體的選擇和制備的方法本領(lǐng)域眾所周知。
構(gòu)建“敲除”細(xì)胞和動(dòng)物基于的前提是，通過(guò)將干擾待抑制基因的一部分DNA序列的新DNA序列引入到基因組中，可以降低或完全消除哺乳動(dòng)物細(xì)胞中特定基因的表達(dá)水平。同樣，“基因誘捕插入”(gene trapinsertion)，可用于破壞宿主基因，小鼠胚胎干細(xì)胞(ES)可用于產(chǎn)生敲除的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如參見(jiàn)，Holzschu，Transgenic Res.697-106(1997))。異源序列的插入通常由互補(bǔ)核酸序列間的同源重組實(shí)現(xiàn)。異源序列是待修飾靶基因的一部分，例如外顯子、內(nèi)含子或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，或任何可影響靶基因表達(dá)水平的基因組序列；或其組合。多能胚胎干細(xì)胞中經(jīng)過(guò)同源重組的基因打靶可以允許對(duì)目的基因組序列進(jìn)行精確修飾。任何技術(shù)都可用于產(chǎn)生、篩選、繁殖敲除動(dòng)物，例如參見(jiàn)Bijvoet，Hum.Mol.Genet.753-62(1998)；Moreadith，J.Mol.Med.75208-216(1997)；Tojo，Cytotechnology 19161-165(1995)；Mudgett，MethodsMol.Biol.48167-184(1995)；Longo，Transgenic Res.6321-328(1997)；U.S.Patents NOs.5,616,491；5,464,764；5,631,153；5,487,992；5,627,059；5,272,071；WO 91/09955；WO 93/09222；WO96/29411；WO 95/31560；WO 91/12650。
本發(fā)明的核酸同樣可作為產(chǎn)生“敲除”人細(xì)胞及其后代的試劑。類(lèi)似地，本發(fā)明的核酸同樣可作為產(chǎn)生小鼠“敲入(knock-ins)”的試劑。人或大鼠T2R基因序列可以替換小鼠基因組中的直向進(jìn)化同源T2R。通過(guò)這個(gè)途徑，可產(chǎn)生表達(dá)人或大鼠T2R的小鼠。該小鼠然后可用于分析人或大鼠T2R的功能，和鑒定這類(lèi)T2R的配體。
F.調(diào)節(jié)子作為T(mén)2R家族成員調(diào)節(jié)子測(cè)試的化合物可以是任何小的化學(xué)化合物，或生物學(xué)實(shí)體如蛋白質(zhì)、糖、核酸或脂。或者，調(diào)節(jié)子可以是T2R家族成員的遺傳變體。一般情況下，試驗(yàn)化合物可以是小的化學(xué)分子和肽。基本上任何化學(xué)化合物都可以作為本發(fā)明試驗(yàn)中的潛在調(diào)節(jié)子或配體，盡管在大多數(shù)情況下化合物溶解于水或有機(jī)溶劑(特別是基于DMSO的)中。通過(guò)自動(dòng)化試驗(yàn)步驟，及從任何方便的來(lái)源中提供化合物用于試驗(yàn)，這些試驗(yàn)可用于篩選大的化學(xué)文庫(kù)，這些試驗(yàn)通常是平行方式進(jìn)行(例如在機(jī)器試驗(yàn)中在微量滴定板上以微量滴定方式進(jìn)行)。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到有很多化學(xué)化合物供應(yīng)商，包括Sigma(St.Louis，MO)，Aldrich(St.Louis，MO)，Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，F(xiàn)luka Chemika-BiochemicaAnalytika(Buchs，Switzerland)等。
在一個(gè)實(shí)施方案中，高通量篩選方法涉及提供包含大量潛在治療性化合物(潛在調(diào)節(jié)子或配體化合物)的組合化學(xué)或肽文庫(kù)。然后在一種或多種上述試驗(yàn)中篩選這類(lèi)“組合化學(xué)文庫(kù)”或“配體文庫(kù)”，來(lái)鑒定這些顯示所需特征性活性的文庫(kù)成員(特別是化學(xué)種類(lèi)或亞類(lèi))。因此鑒定的化合物可以作為常規(guī)的“引導(dǎo)化合物(lead compounds)”或本身就可作為潛在或真正的消費(fèi)品。
組合化學(xué)文庫(kù)是不同化學(xué)化合物(由化學(xué)合成或生物合成產(chǎn)生的)的集合，通過(guò)大量化學(xué)“構(gòu)造部件(building blocks)”如試劑組合而成。例如，線(xiàn)性組合化學(xué)文庫(kù)如多肽文庫(kù)是由一系列化學(xué)構(gòu)造部件(氨基酸)用各種可能方式以指定化合物長(zhǎng)度(即多肽化合物中氨基酸的數(shù)目)組合而形成。通過(guò)這種化學(xué)構(gòu)造部件的組合混合可以合成出數(shù)百萬(wàn)個(gè)化學(xué)化合物。
組合化學(xué)文庫(kù)的制備和篩選本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知。這類(lèi)組合化學(xué)文庫(kù)包括肽文庫(kù)，但并不局限于肽文庫(kù)(例如參見(jiàn)，U.S.Patent5,010,175，F(xiàn)urka，Int.J.Pept.Prot.Res.，37487-493(1991)andHoughton等，Nature，35484-88(1991))。同樣可以用其它產(chǎn)生化學(xué)多樣文庫(kù)的化學(xué)物質(zhì)。這些化學(xué)物質(zhì)包括，但并不局限于類(lèi)肽(例如WO91/19735)、編碼的肽(例如WO 93/20242)、隨機(jī)生物寡聚物(PCT例如WO 92/00091)、苯并二氮雜(例如U.S.Pat.No.5,288,514)、乙內(nèi)酰脲和苯并二氮雜以及二肽的異聚物(diversomers)(Hubbs等，PNAS906906-6913(1993))、聯(lián)乙烯(vinylogous)多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.，1146568(1992))、具有葡萄糖支架的非肽性肽模仿物(nonpeptidal petidomimetics)(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.，1149217-9218(1992))、類(lèi)似的有機(jī)合成小分子化合物文庫(kù)(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.，1162661(1994))、寡氨基甲酸酯(oligocarbamates)(Cho等，Science，2611303(1993))、肽基膦酸酯(Campbell等，J.Org.Chem.，59658(1994))、核酸文庫(kù)(Ausubel，Berger and Sambrook，均如前)、肽核酸文庫(kù)(U.S.Patent 5,539,083)、抗體文庫(kù)(Vaughn等，Nature Biotechnology，14(3)309-314(1996)and PCT/US96/10278)、糖類(lèi)文庫(kù)(Liang等，Science，2741520-1522(1996)and U.S.Patent 5,593853)，有機(jī)小分子文庫(kù)(苯并二氮雜，Baum，C&EN，Jan 18，page 33(1993)；噻唑烷酮(thiazolidinones)和metathiazanones，U.S.Patent 5,549,974；pynrolidines，U.S.Patents 5,525,735和5,519,134；嗎啉代化合物，U.S.Patent5,506,337；苯并二氮雜，5,288,514等)。
制備組合文庫(kù)的裝置已經(jīng)商品化(例如參見(jiàn)，357 MPS，390 MPS(Advanced Chem Tech，Loui svilleKY)，Symphony(Rainin，Woburn，MA)，433A(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，9050 Plus(Millipore，Bedford，MA))。另外，許多組合文庫(kù)本身也已經(jīng)商品化(例如參見(jiàn)，ComGenex，Princeton，NJ；Tripos，Inc.，St.Louis，MO；3DPharmaceuticals，Exton，PA；Martek BioSciences；Columbia，MD等)。
本發(fā)明的一個(gè)方面是，T2R調(diào)節(jié)子可用于任何食用產(chǎn)品、糖果、藥物組合物或其成分中，從而以所需的方式調(diào)節(jié)產(chǎn)品、組合物或成分的味道。例如，可以加入能夠增強(qiáng)苦味感覺(jué)的T2R調(diào)節(jié)子以增加產(chǎn)品或組合物的苦味，而可加入能阻斷苦味感覺(jué)的T2R調(diào)節(jié)子以改善產(chǎn)品與組合物的味道。
G.描述和預(yù)測(cè)味覺(jué)感受的方法本發(fā)明同樣優(yōu)選地提供在哺乳動(dòng)物特別是人類(lèi)中描述味覺(jué)感知和/或預(yù)測(cè)味覺(jué)感知的方法。優(yōu)選地，這些方法可以通過(guò)使用在此公開(kāi)的這些受體和使用此處公開(kāi)的編碼該T2R多肽的基因來(lái)完成。
本發(fā)明還包括一種篩選一種或多種化合物以檢測(cè)是否存在可被哺乳動(dòng)物察覺(jué)到的味道的方法，包括把上述所指的一種或多種化合物與公開(kāi)的受體接觸，優(yōu)選地其中哺乳動(dòng)物是人。本發(fā)明同樣可以包括展示哺乳動(dòng)物對(duì)特定味道的味覺(jué)感知的方法，包括以下步驟提供代表該脊椎動(dòng)物n種味覺(jué)受體中每一種的定量刺激的X1到Xn值，其中n大于或等于4；從這些值中產(chǎn)生出一個(gè)味覺(jué)感知的定量描述。味覺(jué)受體可以是此處公開(kāi)的味覺(jué)受體，描述可能包含一個(gè)點(diǎn)或n維空間的一個(gè)體積，可能包含一個(gè)圖或一個(gè)譜，還可能包含一個(gè)定量描述矩陣。同樣，提供的步驟可能包括將多數(shù)重組產(chǎn)生的味覺(jué)受體與待測(cè)組合物接觸，定量測(cè)量該組合物與該受體的作用。
本發(fā)明同樣涵蓋預(yù)測(cè)在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生未知的味覺(jué)感知的一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生的味覺(jué)感知的方法，包括以下步驟對(duì)于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生已知味覺(jué)感知的一種或多種分子或分子組合，提供X1到Xn值代表該脊椎動(dòng)物n個(gè)味覺(jué)受體中每一個(gè)的刺激量，其中n大于或等于4；對(duì)于一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生已知的味覺(jué)感知，從該值中產(chǎn)生出一個(gè)味覺(jué)感知的定量描述，對(duì)于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生未知味覺(jué)感知的一種或多種分子或分子組合，提供X1到Xn值代表該脊椎動(dòng)物n個(gè)味覺(jué)受體中每一個(gè)的刺激量，其中n大于或等于4；對(duì)于一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生未知的味覺(jué)感知，從該值中產(chǎn)生出一個(gè)味覺(jué)感知的定量描述，預(yù)測(cè)一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生的未知味覺(jué)感知，方法是將在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生未知味覺(jué)感知的一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中引起的定量的描述與在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生已知味覺(jué)感知的一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中引起的定量的描述相比較。本方法中所用味覺(jué)受體可以包括此處公開(kāi)的味覺(jué)受體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)確定如上所述的已知分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中的味覺(jué)感知值；確定如上所述的一種或多種未知分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中的味覺(jué)感知值；將一種或多種未知組合物在哺乳動(dòng)物中的味覺(jué)感知值和一種或多種已知組合物在哺乳動(dòng)物中的味覺(jué)感知值相比較；選擇能夠引發(fā)哺乳動(dòng)物特定味覺(jué)感知的分子或分子組合；并合并兩個(gè)或更多未知分子或分子組合以形成能夠引發(fā)哺乳動(dòng)物中預(yù)定味覺(jué)感知的分子或分子組合，從而獲得在哺乳動(dòng)物中引發(fā)預(yù)定味覺(jué)感知的新型分子或分子組合。合并步驟產(chǎn)生能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)特定味覺(jué)感知的單種分子或分子組合。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是提供刺激味覺(jué)的方法，包括以下步驟對(duì)于克隆的味覺(jué)受體群，優(yōu)選的是人類(lèi)受體群中的每一個(gè)，確定受體與味覺(jué)元的相互作用程度；合并各自具有與一種或多種所述受體預(yù)先確定的相互作用的化合物群，其用量是在一起能提供模擬味覺(jué)元作用圖的受體-刺激作用圖。通過(guò)在此描述的任何一種結(jié)合或報(bào)告子試驗(yàn)可以確定味覺(jué)元與味覺(jué)受體的相互作用。該多數(shù)化合物然后可以合并以形成一種混合物。如果需要，該多數(shù)化合物中的一種或多種可以共價(jià)結(jié)合。組合后的化合物基本上刺激至少75％、80％或90％的基本上由味覺(jué)元刺激的受體。
在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，針對(duì)多數(shù)味覺(jué)受體測(cè)試多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化合物，來(lái)確定每一個(gè)受體和每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化合物的相互作用程度，因此針對(duì)每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化合物產(chǎn)生受體刺激圖。然后這些受體刺激圖可以存儲(chǔ)在存在于數(shù)據(jù)存儲(chǔ)介質(zhì)上的相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中。本方法可進(jìn)一步包括提供味覺(jué)的所需受體刺激圖；比較所需受體刺激圖與相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)；確定與所需的受體刺激圖最密切匹配的一種或多種標(biāo)準(zhǔn)化合物組合。本方法還可進(jìn)一步包括將標(biāo)準(zhǔn)化合物組合成一種或多種已經(jīng)確定的組合形式來(lái)刺激味覺(jué)。
H.試劑盒T2R基因和它們的同源體是鑒定味覺(jué)受體細(xì)胞、法醫(yī)學(xué)和親子鑒定、檢驗(yàn)味覺(jué)傳導(dǎo)的有利工具。能夠特異性與T2R核酸雜交的T2R家族成員特異性試劑，如T2R探針和引物，以及能夠特異性結(jié)合T2R蛋白質(zhì)的T2R特異性試劑，例如T2R抗體，可以用于檢驗(yàn)味覺(jué)細(xì)胞表達(dá)和味覺(jué)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)。
確定樣品中T2R家族成員DNA和RNA是否存在的核酸試驗(yàn)包括本領(lǐng)域眾所周知的許多技術(shù)，例如Southern分析、Northern分析、點(diǎn)印跡、RNA酶保護(hù)、S1分析、擴(kuò)增技術(shù)如PCR、和原位雜交。例如在原位雜交中，靶核酸從它的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中釋放出來(lái)，以便能在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行雜交，同時(shí)保持細(xì)胞形態(tài)，利于隨后的解釋和分析。以下文章提供了原位雜交的概況Singer等，Biotechniques，4230-250(1986)；Haase等，Methodsin Virology，vol.VII，189-226(1984)；和Names等，eds.，NucleicAcid HybridizationA Practical Approach(1987)。另外，T2R蛋白質(zhì)可以使用如上描述的各種免疫試驗(yàn)技術(shù)來(lái)檢測(cè)。測(cè)試樣品通常同時(shí)與陽(yáng)性對(duì)照(例如，表達(dá)重組T2R蛋白質(zhì)的樣品)和陰性對(duì)照比較。
本發(fā)明同樣提供了篩選T2R家族成員調(diào)節(jié)子的試劑盒。這些試劑盒可以從現(xiàn)成材料和試劑中制備。例如，這些試劑盒可以包含以下材料中的任何一種或多種T2R核酸或蛋白質(zhì)、反應(yīng)試管、測(cè)試T2R活性的指南等。可選地，試劑盒包含功能性T2R多肽。按照本發(fā)明可以制備多種試劑盒和組分，這取決于試劑盒的特定用戶(hù)和用戶(hù)的特殊需求。
實(shí)施例下面的實(shí)施例概括了本發(fā)明中的分離的核酸分子，和與核酸分子概念性翻譯相應(yīng)的多肽序列。此處提供的蛋白質(zhì)序列中，單字母X或Xaa指二十種常見(jiàn)氨基酸殘基中的任意一種。此處提供的DNA序列中，單字母N或n代表四種常見(jiàn)核苷酸堿基A、T、C、G中的任意一種。
hT2R51全長(zhǎng)cDNA(BAC AC011654)(SEQ ID NO1)ATGTTGACTCTAACTCGCATCCGCACTGTGTCCTATGAAGTCAGGAGTACATTTCTGTTCATTTCAGTCCTGGAGTTTGCAGTGGGGTTTCTGACCAATGCCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCAGGCACTGAGCAACAGTGATTGTGTGCTGCTGTGTCTCAGCATCAGCCGGCTTTTCCTGCATGGACTGCTGTTCCTGAGTGCTATCCAGCTTACCCACTTCCAGAAGTTGAGTGAACCACTGAACCACAGCTACCAAGCCATCATCATGCTATGGATGATTGCAAACCAAGCCAACCTCTGGCTTGCTGCCTGCCTCAGCCTGCTTTACTGCTCCAAGCTCATCCGTTTCTCTCACACCTTCCTGATCTGCTTGGCAAGCTGGGTCTCCAGGAAGATCTCCCAGATGCTCCTGGGTATTATTCTTTGCTCCTGCATCTGCACTGTCCTCTGTGTTTGGTGCTTTTTTAGCAGACCTCACTTCACAGTCACAACTGTGCTATTCATGAATAACAATACAAGGCTCAACTGGCAGATTAAAGATCTCAATTTATTTTATTCCTTTCTCTTCTGCTATCTGTGGTCTGTGCCTCCTTTCCTATTGTTTCTGGTTTCTTCTGGGATGCTGACTGTCTCCCTGGGAAGGCACATGAGGACAATGAAGGTCTATACCAGAAACTCTCGTGACCCCAGCCTGGAGGCCCACATTAAAGCCCTCAAGTCTCTTGTCTCCTTTTTCTGCTTCTTTGTGATATCATCCTGTGTTGCCTTCATCTCTGTGCCCCTACTGATTCTGTGGCGCGACAAAATAGGGGTGATGGTTTGTGTTGGGATAATGGCAGCTTGTCCCTCTGGGCATGCAGCCATCCTGATCTCAGGCAATGCCAAGTTGAGGAGAGCTGTGATGACCATTCTGCTCTGGGCTCAGAGCAGCCTGAAGGTAAGAGCCGACCACAAGGCAGATTCCCGGACACTGTGCTGA(SEQ ID NO1)hT2R51概念性翻譯(BAC AC011654)(SEQ ID NO2)MLTLTRIRTVSYEVRSTFLFISVLEFAVGFLTNAFVFLVNFWDVVKRQALSNSDCVLLCLSISRLFLHGLLFLSAIQLTHFQKLSEPLNHSYQAIIMLWMIANQANLWLAACLSLLYCSKLIRFSHTFLICLASWVSRKISQMLLGIILCSCICTVLCVWCFFSRPHFTVTTVLFMNNNTRLNWQIKDLNLFYSFLFCYLWSVPPFLLFLVSSGMLTVSLGRHMRTMKVYTRNSRDPSLEAHIKALKSLVSFFCFFVISSCVAFISVPLLILWRDKIGVMVCVGIMAACPSGHAAILISGNAKLRRAVMTILLWAQSSLKVRADHKADSRTLC(SEQ ID NO2)hT2R54全長(zhǎng)cDNA(BAC AC024156)(SEQ ID NO3)ATGACTAAACTCTGCGATCCTGCAGAAAGTGAATTGTCGCCATTTCTCATCACCTTAATTTTAGCAGTTTTACTTGCTGAATACCTCATTGGTATCATTGCAAATGGTTTCATCATGGCTATACATGCAGCTGAATGGGTTCAAAATAAGGCAGTTTCCACAAGTGGCAGGATCCTGGTTTTCCTGAGTGTATCCAGAATAGCTCTCCAAAGCCTCATGATGTTAGAAATTACCATCAGCTCAACCTCCCTAAGTTTTTATTCTGAAGACGCTGTATATTATGCATTCAAAATAAGTTTTATATTCTTAAATTTTTGTAGCCTGTGGTTTGCTGCCTGGCTCAGTTTCTTCTACTTTGTGAAGATTGCCAATTTCTCCTACCCCCTTTTCCTCAAACTGAGGTGGAGAATTACTGGATTGATACCCTGGCTTCTGTGGCTGTCCGTGTTTATTTCCTTCAGTCACAGCATGTTCTGCATCAACATCTGCACTGTGTATTGTAACAATTCTTTCCCTATCCACTCCTCCAACTCCACTAAGAAAACATACTTGTCTGAGATCAATGTGGTCGGTCTGGCTTTTTTCTTTAACCTGGGGATTGTGACTCCTCTGATCATGTTCATCCTGACAGCCACCCTGCTGATCCTCTCTCTCAAGAGACACACCCTACACATGGGAAGCAATGCCACAGGGTCCAACGACCCCAGCATGGAGGCTCACATGGGGGCCATCAAAGCTATCAGCTACTTTCTCATTCTCTACATTTTCAATGCAGTTGCTCTGTTTATCTACCTGTCCAACATGTTTGACATCAACAGTCTGTGGAATAATTTGTGCCAGATCATCATGGCTGCCTACCCTGCCAGCCACTCAATTCTACTGATTCAAGATAACCCTGGGCTGAGAAGAGCCTGGAAGCGGCTTCAGCTTCGACTTCATCTTTACCCAAAAGAGTGGACTCTGTGA(SEQ ID NO3)hT2R54概念性翻譯(BAC AC024156)(SEQ ID NO4)MTKLCDPAESELSPFLITLILAVLLAEYLIGIIANGFIMAIHAAEWVQNKAVSTSGRILVFLSVSRIALQSLMMLEITISSTSLSFYSEDAVYYAFKISFIFLNFCSLWFAAWLSFFYFVKIANFSYPLFLKLRWRITGLIPWLLWLSVFISFSHSMFCINICTVYCNNSFPIHSSNSTKKTYLSEINVVGLAFFFNLGIVTPLIMFILTATLLILSLKRHTLHMGSNATGSNDPSMEAHMGAIKAISYFLILYIFNAVALFIYLSNMFDINSLWNNLCQIIMAAYPASHSILLIQDNPGLRRAWKRLQLRLHLYPKEWTL(SEQ IDNO4)hT2R55全長(zhǎng)cDNA(BAC AC024156)(SEQ ID NO5)ATGGCAACGGTGAACACAGATGCCACAGATAAAGACATATCCAAGTTCAAGGTCACCTTCACTTTGGTGGTCTCCGGAATAGAGTGCATCACTGGCATCCTTGGGAGTGGCTTCATCACGGCCATCTATGGGGCTGAGTGGGCCAGGGGCAAAACACTCCCCACTGGTGACCGCATTATGTTGATGCTGAGCTTTTCCAGGCTCTTGCTACAGATTTGGATGATGCTGGAGAACATTTTCAGTCTGCTATTCCGAATTGTTTATAACCAAAACTCAGTGTATATCCTCTTCAAAGTCATCACTGTCTTTCTGAACCATTCCAATCTCTGGTTTGCTGCCTGGCTCAAAGTCTTCTATTGTCTTAGAATTGCAAACTTCAATCATCCTTTGTTCTTCCTGATGAAGAGGAAAATCATAGTGCTGATGCCTTGGCTTCTCAGGCTGTCAGTGTTGGTTTCCTTAAGCTTCAGCTTTCCTCTCTCGAGAGATGTCTTCAATGTGTATGTGAATAGCTCCATTCCTATCCCCTCCTCCAACTCCACGGAGAAGAAGTACTTCTCTGAGACCAATATGGTCAACCTGGTATTTTTCTATAACATGGGGATCTTCGTTCCTCTGATCATGTTCATCCTGGCAGCCACCCTGCTGATCCTCTCTCTCAAGAGACACACCCTACACATGGGAAGCAATGCCACAGGGTCCAGGGACCCCAGCATGAAGGCTCACATAGGGGCCATCAAAGCCACCAGCTACTTTCTCATCCTCTACATTTTCAATGCAATTGCTCTATTTCTTTCCACGTCCAACATCTTTGACACTTACAGTTCCTGGAATATTTTGTGCAAGATCATCATGGCTGCCTACCCTGCCGGCCACTCAGTACAACTGATCTTGGGCAACCCTGGGCTGAGAAGAGCCTGGAAGCGGTTTCAGCACCAAGTTCCTCTTTACCTAAAAGGGCAGACTCTGTGA(SEQ IDNO5)hT2R55概念性翻譯(BAC AC024156)(SEQ ID NO6)MATVNTDATDKDISKFKVTFTLVVSGIECITGILGSGFITAIYGAEWARGKTLPTGDRIMLMLSFSRLLLQIWMMLENIFSLLFRIVYNQNSVYILFKVITVFLNHSNLWFAAWLKVFYCLRIANFNHPLFFLMKRKIIVLMPWLLRLSVLVSLSFSFPLSRDVFNVYVNSSIPIPSSNSTEKKYFSETNMVNLVFFYNMGIFVPLIMFILAATLLILSLKRHTLHMGSNATGSRDPSMKAHIGAIKATSYFLILYIFNAIALFLSTSNIFDTYSSWNILCKIIMAAYPAGHSVQLILGNPGLRRAWKRFQHQVPLYLKGQTL(SEQ ID NO6)hT2R61全長(zhǎng)cDNA(BAC AC018630)(SEQ ID NO7)ATGATAACTTTTCTACCCATCATTTTTTCCAGTCTGGTAGTGGTTACATTTGTTATTGGAAATTTTGCTAATGGCTTCATAGCACTGGTAAATTCCATTGAGTGGTTCAAGAGACAAAAGATCTCCTTTGCTGACCAAATTCTCACTGCTCTGGCGGTCTCCAGAGTTGGTTTGCTCTGGGTATTATTATTAAACTGGTATTCAACTGTGTTGAATCCAGCTTTTAATAGTGTAGAAGTAAGAACTACTGCTTATAATATCTGGGCAGTGATCAACCATTTCAGCAACTGGCTTGCTACTACCCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACTTTATTTTTCTTCACTTAAAGAGGAGAGTTAAGAGTGTCATTCTGGTGATGTTGTTGGGGCCTTTGCTATTTTTGGCTTGTCATCTTTTTGTGATAAACATGAATGAGATTGTGCGGACAAAAGAATTTGAAGGAAACATGACTTGGAAGATCAAATTGAAGAGTGCAATGTACTTTTCAAATATGACTGTAACCATGGTAGCAAACTTAGTACCCTTCACTCTGACCCTACTATCTTTTATGCTGTTAATCTGTTCTTTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGTAAAGGATCTCAAGATCCCAGCACCAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGATCTCCTTCCTCTTGTTATGTGCCATTTACTTTCTGTCCATAATGATATCAGTTTGGAGTTTTGGAAGTCTGGAAAACAAACCTGTCTTCATGTTCTGCAAAGCTATTAGATTCAGCTATCCTTCAATCCACCCATTCATCCTGATTTGGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGACTTTTCTTTCAGTTTTTTGGCAAATGAGGTACTGGGTGAAAGGAGAGAAGACTTCATCTCCATAG(SEQ ID NO7)hT2R61概念性翻譯(BAC AC018630)(SEQ ID NO8)MITFLPIIFSSLVVVTFVIGNFANGFLALVNSIEWFKRQKISFADQILTALAVSRVGLLWVLLLNWYSTVLNPAFNSVEVRTTAYNIWAVINHFSNWLATTLSIFYLLKIANFSNFIFLHLKRRVKSVILVMLLGPLLFLACHLFVINMNEIVRTKEFEGNMTWKIKLKSAMYFSNMTVTMVANLVPFTLTLLSFMLLICSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSTKVHIKALQTVISFLLLCAIYFLSIMISVWSFGSLENKPVFMFCKALRFSYPSIHPFILIWGNKKLKQTFLSVFWQMRYWVKGEKTSSP(SEQ ID NO8)hT2R63全長(zhǎng)cDNA(BAC AC0 18630)(SEQ ID NO9)ATGATGAGTTTTCTACACATTGTTTTTTCCATTCTAGTAGTGGTTGCATTTATTCTTGGAAATTTTGCCAATGGCTTTATAGCACTGATAAATTTCATTGCCTGGGTCAAGAGACAAAAGATCTCCTCAGCTGATCAAATTATTGCTGCTCTGGCAGTCTCCAGAGTTGGTTTGCTCTGGGTAATATTATTACATTGGTATTCAACTGTGTTGAATCCAACTTCATCTAATTTAAAAGTAATAATTTTTATTTCTAATGCCTGGGCAGTAACCAATCATTTCAGCATCTGGCTTGCTACTAGCCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATCGTCAATTTCTCCAGACTTATTTTTCATCACTTAAAAAGGAAGGCTAAGAGTGTAGTTCTGGTGATAGTGTTGGGGTCTTTGTTCTTTTTGGTTTGTCACCTTGTGATGAAACACACGTATATAAATGTGTGGACAGAAGAATGTGAAGGAAACGTAACTTGGAAGATCAAACTGAGGAATGCAATGCACCTTTCCAACTTGACTGTAGCCATGCTAGCAAACTTGATACCATTCACTCTGACCCTGATATCTTTTCTGCTGTTAATCTACTCTCTGTGTAAACATCTGAAGAAGATGCAGCTCCATGGCAAAGGATCTCAAGATCCCAGCACCAAGATCCACATAAAAGCTCTGCAAACTGTGACCTCCTTCCTCATATTACTTGCCATTTACTTTCTGTGTCTAATCATATCGTTTTGGAATTTTAAGATGCGACCAAAAGAAATTGTCTTAATGCTTTGCCAAGCTTTTGGAATCATATATCCATCATTCCACTCATTCATTCTGATTTGGGGGAACAAGACGCTAAAGCAGACCTTTCTTTCAGTTTTGTGGCAGGTGACTTGCTGGGCAAAAGGACAGAACCAGTCAACTCCATAG(SEQ ID NO9)hT2R63概念性翻譯(BAC AC018630)(SEQ ID NO10)MMSFLHIVFSILVVVAFILGNFANGFIALINFIAWVKRQKISSADQIIAALAVSRVGLLWVILLHWYSTVLNPTSSNLKVIIFISNAWAVTNHFSIWLATSLSIFYLLKIVNFSRLIFHHLKRKAKSVVLVIVLGSLFFLVCHLVMKHTYINVWTEECEGNVTWKIKLRNAMHLSNLTVAMLANLIPFTLTLISFLLLIYSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSTKIHIKALQTVTSFLILLAIYFLCLIISFWNFKMRPKEIVLMLCQAFGIIYPSFHSFILIWGNKTLKQTFLSVLWQVTCWAKGQNQSTP(SEQ ID NO10)hT2R64全長(zhǎng)cDNA(BAC AC018630)(SEQ ID NO11)ATGACAACTTTTATACCCATCATTTTTTCCAGTGTGGTAGTGGTTCTATTTGTTATTGGAAATTTTGCTAATGGCTTCATAGCATTGGTAAATTCCATTGAGCGGGTCAAGAGACAAAAGATCTCTTTTGCTGACCAGATTCTCACTGCTCTGGCGGTCTCCAGAGTTGGTTTGCTCTGGGTATTATTATTAAATTGGTATTCAACTGTGTTTAATCCAGCTTTTTATAGTGTAGAAGTAAGAACTACTGCTTATAATGTCTGGGCAGTAACCGGCCATTTCAGCAACTGGCTTGCTACTAGCCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTTTCTTCACTTAAAGAGGAGAGTTAAGAGTGTCATTCTGGTGATGCTGTTGGGGCCTTTACTATTTTTGGCTTGTCAACTTTTTGTGATAAACATGAAAGAGATTGTACGGACAAAAGAATATGAAGGAAACTTGACTTGGAAGATCAAATTGAGGAGTGCAGTGTACCTTTCAGATGCGACTGTAACCACGCTAGGAAACTTAGTGCCCTTCACTCTGACCCTGCTATGTTTTTTGCTGTTAATCTGTTCTCTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGTAAAGGATCTCAAGATCCCAGCACCAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGATCTTTTTCCTCTTGTTATGTGCCGTTTACTTTCTGTCCATAATGATATCAGTTTGGAGTTTTGGGAGTCTGGAAAACAAACCTGTCTTCATGTTCTGCAAAGCTATTAGATTCAGCTATCCTTCAATCCACCCATTCATCCTGATTTGGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGACTTTTCTTTCAGTTTTGCGGCAAGTGAGGTACTGGGTGAAAGGAGAGAAGCCTTCATCTCCATAG(SEQ ID NO11)hT2R64概念性翻譯(BAC AC018630)(SEQ ID NO12)MTTFIPIIFSSVVVVLFVIGNFANGFIALVNSIERVKRQKISFADQILTALAVSRVGLLWVLLLNWYSTVFNPAFYSVEVRTTAYNVWAVTGHFSNWLATSLSIFYLLKIANFSNLIFLHLKRRVKSVILVMLLGPLLFLACQLFVINMKEIVRTKEYEGNLTWKIKLRSAVYLSDATVTTLGNLVPFTLTLLCFLLLICSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSTKVHIKALQTVIFFLLLCAVYFLSIMISVWSFGSLENKPVFMFCKAIRFSYPSIHPFILIWGNKKLKQTFLSVLRQVRYWVKGEKPSSP(SEQ ID NO12)hT2R65全長(zhǎng)cDNA(BAC AC018630)(SEQ ID NO13)ATGATGTGTTTTCTGCTCATCATTTCATCAATTCTGGTAGTGTTTGCATTTGTTCTTGGAAATGTTGCCAATGGCTTCATAGCCCTAGTAAATGTCATTGACTGGGTTAACACACGAAAGATCTCCTCAGCTGAGCAAATTCTCACTGCTCTGGTGGTCTCCAGAATTGGTTTACTCTGGGTCATGTTATTCCTTTGGTATGCAACTGTGTTTAATTCTGCTTTATATGGTTTAGAAGTAAGAATTGTTGCTTCTAATGCCTGGGCTGTAACGAACCATTTCAGCATGTGGCTTGCTGCTAGCCTCAGCATATTTTGTTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTCTCTCCACCTAAAGAAGAGAATTAAGAGTGTTGTTCTGGTGATACTGTTGGGGCCCTTGGTATTTCTGATTTGTAATCTTGCTGTGATAACCATGGATGAGAGAGTGTGGACAAAAGAATATGAAGGAAATGTGACTTGGAAGATCAAATTGAGGAATGCAATACACCTTTCAAGCTTGACTGTAACTACTCTAGCAAACCTCATACCCTTTACTCTGAGCCTAATATGTTTTCTGCTGTTAATCTGTTCTCTTTGTAAACATCTCAAGAAGATGCGGCTCCATAGCAAAGGATCTCAAGATCCCAGCACCAAGGTCCATATAAAAGCTTTGCAAACTGTGACCTCCTTCCTCATGTTATTTGCCATTTACTTTCTGTGTATAATCACATCAACTTGGAATCTTAGGACACAGCAGAGCAAACTTGTACTCCTGCTTTGCCAAACTGTTGCAATCATGTATCCTTCATTCCACTCATTCATCCTGATTATGGGAAGTAGGAAGCTAAAACAGACCTTTCTTTCAGTTTTGTGGCAGATGACACGCTGA(SEQ ID NO13)hT2R65概念性翻譯(BAC AC018630)(SEQ ID NO14)MMCFLLIISSILVVFAFVLGNVANGFIALVNVIDWVNTRKISSAEQILTALVVSRIGLLWVMLFLWYATVFNSALYGLEVRIVASNAWAVTNHFSMWLAASLSIFCLLKIANFSNLISLHLKKRIKSVVLVILLGPLVFLICNLAVITMDERVWTKEYEGNVTWKIKLRNAIHLSSLTVTTLANLIPFTLSLICFLLLICSLCKHLKKMRLHSKGSQDPSTKVHIKALQTVTSFLMLFAIYFLCIITSTWNLRTQQSKLVLLLCQTVAIMYPSFHSFILIMGSRKLKQTFLSVLWQMTR(SEQ ID NO14)hT2R67全長(zhǎng)cDNA(BAC AC018630)(SEQ ID NO15)ATGATAACTTTTCTATACATTTTTTTTTCAATTCTAATAATGGTTTTATTTGTTCTCGGAAACTTTGCCAATGGCTTCATAGCACTGGTAAATTTCATTGACTGGGTGAAGAGAAAAAAGATCTCCTCAGCTGACCAAATTCTCACTGCTCTGGCGGTCTCCAGAATTGGTTTGCTCTGGGCATTATTATTAAATTGGTATTTAACTGTGTTGAATCCAGCTTTTTATAGTGTAGAATTAAGAATTACTTCTTATAATGCCTGGGTTGTAACCAACCATTTCAGCATGTGGCTTGCTGCTAACCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTCTTTTTCTTCATTTAAAGAGGAGAGTTAGGAGTGTCATTCTGGTGATACTGTTGGGGACTTTGATATTTTTGGTTTGTCATCTTCTTGTGGCAAACATGGATGAGAGTATGTGGGCAGAAGAATATGAAGGAAACATGACTGGGAAGATGAAATTGAGGAATACAGTACATCTTTCATATTTGACTGTAACTACCCTATGGAGCTTCATACCCTTTACTCTGTCCCTGATATCTTTTCTGATGCTAATCTGTTCTCTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGAGAAGGATCGCAAGATCTCAGCACCAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTCTGATCTCCTTCCTCTTGTTATGTGCCATTTTCTTTCTATTCCTAATCGTTTCGGTTTGGAGTCCTAGGAGGCTGCGGAATGACCCGGTTGTCATGGTTAGCAAGGCTGTTGGAAACATATATCTTGCATTCGACTCATTCATCCTAATTTGGAGAACCAAGAAGCTAAAACACACCTTTCTTTTGATTTTGTGTCAGATTAGGTGCTGA(SEQ ID NO15)hT2R67概念性翻譯(BAC AC018630)(SEQ ID NO16)MITFLYIFFSILIMVLFVLGNFANGFIALVNFIDWVKRKKISSAKQILTALAVSRIGLLWALLLNWYLTVLNPAFYSVELRITSYNAWVVTNHFSMWLAANLSIFYLLKIANFSNLLFLHLKRRVRSVILVILLGTLIFLVCHLLVANMDESMWAEEYEGNMTGKMKLRNTVHLSYLTVTTLWSFIPFTLSLISFLMLICSLCKHLKKMQLHGEGSQDLSTKVHIKALQTLISFLLLCAIFFLFLIVSVWSPRRLRNDPVVMVSKAVGNIYLAFDSFILIWRTKKLKHTFLLILCQIRC(SEQ ID NO16)hT2R71全長(zhǎng)cDNA(BAC AC073264)(SEQ ID NO17)ATGCAAGCAGCACTGACGGCCTTCTTCGTGTTGCTCTTTAGCCTGCTGAGTCTTCTGGGGATTGCAGCGAATGGCTTCATTGTGCTGGTGCTGGGCAGGGAGTGGCTGCGATATGGCAGGTTGCTGCCCTTGGATATGATCCTCATTAGCTTGGGTGCCTCCCGCTTCTGCCTGCAGTTGGTTGGGACGGTGCACAACTTCTACTACTCTGCCCAGAAGGTCGAGTACTCTGGGGGTCTCGGCCGACAGTTCTTCCATCTACACTGGCACTTCCTGAACTCAGCCACCTTCTGGTTTTGCAGCTGGCTCAGTGTCCTGTTCTGTGTGAAGATTGCTAACATCACACACTCCACCTTCCTGTGGCTGAAGTGGAGGTTCCCAGGGTGGGTGCCCTGGCTCCTGTTGGGCTCTGTCCTGATCTCCTTCATCATAACCCTGCTGTTTTTTTGGGTGAACTACCCTGTATATCAAGAATTTTTAATTAGAAAATTTTCTGGGAACATGACCTACAAGTGGAATACAAGGATAGAAACATACTATTTCCCATCCCTGAAACTGGTCATCTGGTCAATTCCTTTTTCTGTTTTTCTGGTCTCAATTATGCTGTTAATTAATTCTCTGAGGAGGCATACTCAGAGAATGCAGCACAACGGGCACAGCCTGCAGGACCCCAGCACCCAGGCTCACACCAGAGCTCTGAAGTCCCTCATCTCCTTCCTCATTCTTTATGCTCTGTCCTTTCTGTCCCTGATCATTGATGCCGCAAAATTTATCTCCATGCAGAACGACTTTTACTGGCCATGGCAAATTGCAGTCTACCTGTGCATATCTGTCCATCCCTTCATCCTCATCTTCAGCAACCTCAAGCTTCGAAGCGTGTTCTCGCAGCTCCTGTTGTTGGCAAGGGGCTTCTGGGTGGCCTAG(SEQ ID NO17)hT2R71概念性翻譯(BAC AC073264)(SEQ ID NO18)MQAALTAFFVLLFSLLSLLGIAANGFIVLVLGREWLRYGRLLPLDMILISLGASRFCLQLVGTVHNFYYSAQKVEYSGGLGRQFFHLHWHFLNSATFWFCSWLSVLFCVKIANITHSTFLWLKWRFPGWVPWLLLGSVLISFIITLLFFWVNYPVYQEFLIRKFSGNMTYKWNTRIETYYFPSLKLVIWSIPFSVFLVSIMLLINSLRRHTQRMQHNGHSLQDPSTQAHTRALKSLISFLILYALSFLSLLIDAAKFISMQNDFYWPWQLAVYLCISVHPFILIFSNLKLRSVFSQLLLLARGFWVA(SEQ ID NO18)hT2R75全長(zhǎng)cDNA(SEQ ID NO19)ATGATAACTTTTCTGCCCATCATTTTTTCCATTCTAATAGTGGTTACATTTGTGATTGGAAATTTTGCTAATGGCTTCATAGCATTGGTAAATTCCATTGAGTGGTTCAAGAGACAAAAGATCTCTTTTGCTGACCAAATTCTCACTGCTCTGGCAGTCTCCAGAGTTGGTTTACTCTGGGTATTAGTATTAAATTGGTATGCAACTGAGTTGAATCCAGCTTTTAACAGTATAGAAGTAAGAATTACTGCTTACAATGTCTGGGCAGTAATCAACCATTTCAGCAACTGGCTTGCTACTAGCCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTTTCTTCACTTAAAGAGGAGAGTTAAGAGTGTTGTTCTGGTGATACTATTGGGGCCTTTGCTATTTTTGGTTTGTCATCTTTTTGTGATAAACATGAATCAGATTATATGGACAAAAGAATATGAAGGAAACATGACTTGGAAGATCAAACTGAGGAGTGCAATGTACCTTTCAAATACAACGGTAACCATCCTAGCAAACTTAGTTCCCTTCACTCTGACCCTGATATCTTTTCTGCTGTTAATCTGTTCTCTGTGTAAACATCTCAAAAAGATGCAGCTCCATGGCAAAGGATCTCAAGATCCCAGCATGAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGACCTCCTTCCTCTTGTTATGTGCCATTTACTTTCTGTCCATAATCATGTCAGTTTGGAGTTTTGAGAGTCTGGAAAACAAACCTGTCTTCATGTTCTGCGAAGCTATTGCATTCAGCTATCCTTCAACCCACCCATTCATCCTGATTTGGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGACTTTTCTTTCAGTTTTGTGGCATGTGAGGTACTGGGTGAAAGGAGAGAAGCCTTCATCTTCATAG (SEQ ID NO19)hT2R75概念性翻譯(SEQ ID NO20)MITFLPIIFSILIVVTFVIGNFANGFIALVNSIEWFKRQKISFADQILTALAVSRVGLLWVLVLNWYATELNPAFNSIEVRITAYNVWAVINHFSNWLATSLSIFYLLKIANFSNLIFLHLKRRVKSVVLVILLGPLLFLVCHLFVINMNQIIWTKEYEGNMTWKIKLRSAMYLSNTTVTILNLVPFTLTLISFLLLICSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSMKVHIKALQTVTSFLLLCAIYFLSIIMSVWSFESLENKPVFMFCEAIAFSYPSTHPFILIWGNKKLKQTFLSVLWHVRYWVKGEKPSSS(SEQ ID NO20)hT2R59假基團(tuán)(BAC AC018630)(SEQ ID NO21)ATGGTATATTTTCTGCTCATCATTTTATCAATTCTGGTAGTGTTTGCATTTGTTCTTGGAAATTTTTCCAATGGCTTCATAGCTCTAGTAAATGTCATTGACTGGGTTAAGACACGAAAGATCTCCTCAGCTGACCAAATCCTCACTGCTCTGGTGGTCTCCAGAATTGGTTTACTCTGGGTCATATTATTACATTGGTATGCAAATGTGTTTAATTCAGCTTTATATAGTTCAGAAGTAGGAGCTGTTGCTTCTAATATCTCAGCAATAATCAACCATTTCAGCATCTGGCTTGCTGCTAGCCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTTTCTCCACCTAAAGAAGAGAATTAGGAGTGTTGTTCTGGTGATACTGTTGGGTCCCTTGGTATTTTTGATTTGTAATCTTGCTGTGATAACCATGGATGACAGTGTGTGGACAAAAGAATATGAAGGAAATGTGACTTGGAAGATCAAATTGAGGAATGCAATACACCTTTCAAACTTGACTGTAAGCACACTAGCAAACCTCATACCCTTCATTCTGACCCTAATATGTTTTCTGCTGTTAATCTGTTCTCTGCATAAACATCTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGCAAAGGATCTCAAGATCTCAGCACCAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGATCTCCTTCCTCATGTTATATGCCATTTACTTTCTGTATCTAATCACATTAACCTGGAATCTTTGAACACAGCAGAACAAACTTGTATTCCTGCTTTGCCAAACTCTTGGAATCATGTATCCTTCATTCCACTCATTCTTCCTGATTATGGGAAGCAGGAAACTAAAACAGACGTTTCTTTCAGTTTTATGTCAGGTCACATGCTTAGTGAAAGGACAGCAACCCTCAACTCCATAG(SEQ ID NO21)hT2R69假基因(BAC AC018630)(SEQ ID NO22)ATGATATGTTTTCTGCTCATCATTTTATCAATTCTGGTAGTGTTTGCATTTGTTCTTGGAAATGTTGCCAATGGCTTCATAGCTCTAGTAGGTGTCCTTGAGTGGGTTAAGACACAAAAGATCTCATCAGCTGACCAAATTTCTCACTGCTCTGGTGGTGTCCAGAGTTGGTTTACTCTGGGTCATATTATTACATTGGTATGCAACTGTGTTTAATTTGGCTTCACATAGATTAGAAGTAAGAATTTTTGGTTCTAATGTCTCAGCAATAACCAAGCATTTCAGCATCTGGGTGTTACTAGCCTCAGCATATTTCATTTGCTCAAGACTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTTTCTCCACCTAAAGAAAAGGATTAAGAATGTTGGTTTGGTGATGCTGTTGGGGCCCTTGGTATTTTTCATTTGTAATCTTGCTCTGATAACCACGGGTGAGAGTGTGTGGACAAAAGAATATGAAGGAAATTTGTCTTGGATGATCAAATTGAGGAATGCAATACAGCTTTCAAACTTGACTGTAACCATGCCAGCAAACGTCACACCCTGCACTCTGACACTAATATCTTTTCTGCTGTTAATCTATTCTCCATGTAAACATGTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGCAAAGGATCTCAACATCTCAGCACCAAGGTGCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGATCTCCTTCCTTATGTTATTTGCCATTTACTTTCTGTGTCTAATCACATCAACTTGGAATCCTAGGACTCAGCAGAGCAAACTTGTATTCCTGCTTTACCAAACTCTTGGATTCATGTATCTTTTGTTCCACTCATTCATCCTGACTATGGGAAGTAGGAAGCCAAAACAGACCTTTCTTTCAGCTTTGTGA(SEQ ID NO22)mT2R33全長(zhǎng)cDNA(BAC AC020619)(SEQ ID NO23)ATGACCTCCCCTTTCCCAGCTATTTATCACATGGTCATCATGACAGCAGAGTTTCTCATCGGGACTACAGTGAATGGATTCCTTATCATTGTGAACTGCTATGACTTGTTCAAGAGCCGAACGTTCCTGATCCTGCAGACCCTCTTGATGTGCACAGGGCTGTCCAGACTCGGTCTGCAGATAATGCTCATGACCCAAAGCTTCTTCTCTGTGTTCTTTCCATACTCTTATGAGGAAAATATTTATAGTTCAGATATAATGTTCGTCTGGATGTTCTTCAGCTCGATTGGCCTCTGGTTTGCCACATGTCTCTCTGTCTTTTACTGCCTCAAGATTTCAGGCTTCACTCCACCCTGGTTTCTTTGGCTGAAATTCAGAATTTCAAAGCTCATATTTTGGCTGCTTCTGGGCAGCTTGCTGGCCTCTCTGGGCACTGCAACTGTGTGCATCGAGGTAGGTTTCCCTTTAATTGAGGATGGCTATGTCCTGAGAAACGCAGGACTAAATGATAGTAATGCCAAGCTAGTGAGAAATAATGACTTGCTCCTCATCAACCTGATCCTCCTGCTTCCCCTGTCTGTGTTTGTGATGTGCACCTCTATGTTATTTGTTTCTCTTTACAAGCACATGCACTGGATGCAAAGCGAATCTCACAAGCTGTCAAGTGCCAGAACCGAAGCTCATATAAATGCATTAAAGACAGTGACAACATTCTTTTGTTTCTTTGTTTCTTACTTTGCTGCCTTCATGGCAAATATGACATTTAGAATTCCATACAGAAGTCATCAGTTCTTCGTGGTGAAGGAAATCATGGCAGCATATCCCGCCGGCCACTCTGTCATAATCGTCTTGAGTAACTCTAAGTTCAAAGACTTATTCAGGAGAATGATCTGTCTACAGAAGGAAGAGTGA(SEQ IDNO23)mT2R33概念性翻譯(BAC AC020619)(SEQ ID NO24)MTSPFPAIYHMVTMTAEFLIGTTVNGFLIIVNCYDLFKSRTFLILQTLLMCTGLSRLGLQIMLMTQSFFSVFFPYSYEENIYSSDIMFVWMFFSSIGLWFATCLSVFYCLKISGFTPPWFLWLKFRISKLIFWLLLGSLLASLGTATVCIEVGFPLIEDGYVLRNAGLNDSNAKLVRNNDLLLINLILLLPLSVFVMCTSMLFVSLYKHMHWMQSESHKLSSARTEAHINALKTVTTFFCFFVSYFAAFMANMTFRIPYRSHQFFVVKEIMAAYPAGHSVIIVLSNSKFKDLFRRMICLQKEE(SEQ ID NO24)雖然前面詳盡的敘述已經(jīng)描述了本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施方案，但必需認(rèn)識(shí)到以上的描述只是對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明，而不是限定。本發(fā)明僅由下面的權(quán)利要求來(lái)限定。
權(quán)利要求
1.分離的核酸分子，其選自(i)分離的核酸分子，其包含選自SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，和23的核苷酸序列，或含有至少75個(gè)核苷酸的其片段；(ii)分離的cDNA或由其轉(zhuǎn)錄出的不溶性RNA，其編碼包含選自SEQID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的氨基酸序列的多肽，或其編碼所述肽的至少25個(gè)連續(xù)氨基酸的片段；(iii)分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，和23的核酸序列，或其包含其至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有至少20-30％的序列相同性；(iv)分離核酸分子，其編碼與具有選自SEQ ID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的氨基酸序列的多肽在氨基酸水平上具有至少40％的序列相同性的多肽，或編碼至少其50個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的分離的核酸分子；(v)編碼味覺(jué)受體或其片段的分離的核酸分子，其在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下，能夠與選自SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，和23的核酸序列特異地雜交；以及(vi)(i)或(ii)中的分離的核酸分子的變體，其在編碼區(qū)包含至少一處替換、缺失或加入突變。
2.權(quán)利要求1中的分離的核酸分子，其選自SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，和23，或含有其至少75個(gè)連續(xù)核苷酸的片段。
3.權(quán)利要求1中的分離的核酸分子，其編碼具有選自SEQ IDNOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的氨基酸序列的多肽，或其編碼所述多肽的至少25個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的片段。
4.分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，和23的核酸序列，或其包含任何所述序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有至少30％的序列相同性。
5.分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，和23的核酸序列，或其包含任何所述序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有至少40-60％的序列相同性。
6.分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，和23的核酸序列，或其包含任何所述序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有至少70％的序列相同性。
7.分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，和23的核酸序列，或其包含任何所述序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有至少80％的序列相同性。
8.分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，和23的核酸序列，或其包含任何所述序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有至少90％的序列相同性。
9.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其編碼與具有選自SEQ IDNOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的氨基酸序列的多肽或其包含其中至少40個(gè)連續(xù)氨基酸的片段有至少95％序列相同性的多肽。
10.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其編碼與具有選自SEQ IDNOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的氨基酸序列的多肽或其包含其中至少40個(gè)連續(xù)氨基酸的片段有至少96％序列相同性的多肽。
11.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其編碼與具有選自SEQ IDNOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的氨基酸序列的多肽或其包含其中至少40個(gè)連續(xù)氨基酸的片段有至少97％序列相同性的多肽。
12.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其編碼與具有選自SEQ IDNOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的氨基酸序列的多肽或其包含其中至少40個(gè)連續(xù)氨基酸的片段有至少98％序列相同性的多肽。
13.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其編碼與具有選自SEQ IDNOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的氨基酸序列的多肽或其包含其中至少40個(gè)連續(xù)氨基酸的片段有至少99％序列相同性的多肽。
14.分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，和23的核酸序列具有至少20-30％的序列相同性，或與包含所述核酸序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有至少30％的序列相同性；并且進(jìn)一步包含至少一種編碼與選自SEQ ID NOS25，26，27，28，29，和30的共有序列具有至少70％相同性的多肽的序列。
15.分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，和23的核酸序列具有至少40-60％的序列相同性，或與包含所述核酸序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有至少40-60％的序列相同性；并且進(jìn)一步包含至少一種編碼與選自SEQ IDNOS25，26，27，28，29，和30的共有序列具有至少70％相同性的多肽的序列。
16.分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，和23的核酸序列具有至少70％的序列相同性，或與包含所述核酸序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有至少70％的序列相同性；并且進(jìn)一步包含至少一種編碼與選自SEQ ID NOS25，26，27，28，29，和30的共有序列具有至少70％相同性的多肽的序列。
17.分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，和23的核酸序列具有至少80％的序列相同性，或與包含所述核酸序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有至少90％的序列相同性；并且進(jìn)一步包含至少一種編碼與選自SEQ ID NOS25，26，27，28，29，和30的共有序列具有至少70％相同性的多肽的序列。
18.分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，和23的核酸序列具有至少85％的序列相同性，或與包含所述核酸序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有至少85％的序列相同性；并且進(jìn)一步包含至少一種編碼與選自SEQ ID NOS25，26，27，28，29，和30的共有序列具有至少70％相同性的多肽的序列。
19.分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，和23的核酸序列具有至少90％的序列相同性，或與包含所述核酸序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有至少90％的序列相同性；并且進(jìn)一步包含至少一種編碼與選自SEQ ID NOS25，26，27，28，29，和30的共有序列具有至少70％相同性的多肽的序列。
20.分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，和23的核酸序列具有至少95％的序列相同性，或與包含所述核酸序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有至少95％的序列相同性；并且進(jìn)一步包含至少一種編碼與選自SEQ ID NOS25，26，27，28，29，和30的共有序列具有至少70％相同性的多肽的序列。
21.分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，和23的核酸序列具有大約95-99％的序列相同性，或與包含所述核酸序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有大約95-99％的序列相同性；并且進(jìn)一步包含至少一種編碼與選自SEQ IDNOS25，26，27，28，29，和30的共有序列具有至少70％相同性的多肽的序列。
22.編碼功能性味覺(jué)受體的分離的核酸分子，其包含至少100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的部分，所述的部分與選自SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，和23的核酸序列的至少具有100個(gè)連續(xù)核苷酸的部分具有至少40％的序列相同性。
23.權(quán)利要求22的核酸分子，其是嵌合核酸分子，其中所述的嵌合核酸分子是通過(guò)組合至少兩種不同的G蛋白耦聯(lián)受體的部分而產(chǎn)生的。
24.權(quán)利要求23的嵌合核酸分子，其中所述的兩種不同的G蛋白耦聯(lián)受體是味覺(jué)受體。
25.權(quán)利要求23的嵌合核酸分子，其中所述的嵌合核酸分子包含至少200個(gè)與所述核酸序列之一的一部分有至少40％相同性的連續(xù)核苷酸。
26.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其直接或間接附著到編碼可檢測(cè)多肽的核酸序列上。
27.權(quán)利要求26的核酸分子，其中所述的可檢測(cè)多肽是綠色熒光蛋白，或其片段或變體。
28.分離的核酸分子，其編碼與選自SEQ ID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的多肽或其包含所述多肽的至少40個(gè)連續(xù)氨基酸的片段具有大約30-40％序列相同性的多肽，所述多肽直接或間接附著在可以協(xié)助所述的多肽在細(xì)胞表面的表達(dá)和/或轉(zhuǎn)位的序列上。
29.分離的核酸分子，其編碼與選自SEQ ID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的多肽或其包含所述多肽的至少40個(gè)連續(xù)氨基酸的片段具有大約50％序列相同性的多肽，所述多肽直接或間接附著在可以協(xié)助所述的多肽在細(xì)胞表面的表達(dá)和/或轉(zhuǎn)位的序列上。
30.分離的核酸分子，其編碼與選自SEQ ID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的多肽或其包含所述多肽的至少40個(gè)連續(xù)氨基酸的片段具有大約60％序列相同性的多肽，所述多肽直接或間接附著在可以協(xié)助所述的多肽在細(xì)胞表面的表達(dá)和/或轉(zhuǎn)位的序列上。
31.分離的核酸分子，其編碼與選自SEQ ID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的多肽或其包含所述多肽的至少40個(gè)連續(xù)氨基酸的片段具有至少70％序列相同性的多肽，所述多肽直接或間接附著在可以協(xié)助所述的多肽在細(xì)胞表面的表達(dá)和/或轉(zhuǎn)位的序列上。
32.分離的核酸分子，其編碼與選自SEQ ID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的多肽或其包含所述多肽的至少40個(gè)連續(xù)氨基酸的片段具有至少80％序列相同性的多肽，所述多肽直接或間接附著在可以協(xié)助所述的多肽在細(xì)胞表面的表達(dá)和/或轉(zhuǎn)位的序列上。
33.分離的核酸分子，其編碼與選自SEQ ID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的多肽或其包含所述多肽的至少40個(gè)連續(xù)氨基酸的片段具有至少90％序列相同性的多肽，所述多肽直接或間接附著在可以協(xié)助所述的多肽在細(xì)胞表面的表達(dá)和/或轉(zhuǎn)位的序列上。
34.分離的核酸分子，其編碼與選自SEQ ID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的多肽或其包含所述多肽的至少40個(gè)連續(xù)氨基酸的片段具有至少95％序列相同性的多肽，所述多肽直接或間接附著在可以協(xié)助所述的多肽在細(xì)胞表面的表達(dá)和/或轉(zhuǎn)位的序列上。
35.分離的核酸分子，其編碼與選自SEQ ID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的多肽或其包含所述多肽的至少40個(gè)連續(xù)氨基酸的片段具有大約95-99％序列相同性的多肽，所述多肽直接或間接附著在可以協(xié)助所述的多肽在細(xì)胞表面的表達(dá)和/或轉(zhuǎn)位的序列上的片段。
36.權(quán)利要求1中的分離的核酸分子，其可操作性地連接至組成性啟動(dòng)子上。
37.權(quán)利要求1中的分離的核酸分子，其可操作性地連接至可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子上。
38.權(quán)利要求1中的分離的核酸分子，其直接或間接附著到編碼伴侶蛋白或其片段的核酸序列上。
39.分離的核酸分子，其包含編碼具有選自SEQ ID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的氨基酸序列的多肽中至少60個(gè)連續(xù)氨基酸的片段的核苷酸序列。
40.權(quán)利要求39中的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼至少100個(gè)氨基酸。
41.權(quán)利要求39中的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼至少150個(gè)氨基酸。
42.權(quán)利要求39中的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼至少200個(gè)氨基酸。
43.權(quán)利要求39中的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼至少250個(gè)氨基酸。
44.權(quán)利要求39中的分離的核酸分子，其中所述多肽是T2R多肽。
45.權(quán)利要求39中的分離的核酸分子，其中所述的片段特異性結(jié)合選自6-正丙基硫代尿嘧啶、八醋酸蔗糖酯、十一醋酸蜜三糖酯、denatonium、甘氨酸銅和奎寧的配體。
46.權(quán)利要求1中的分離的核酸分子，其包含選自SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，和23的核苷酸序列。
47.包含權(quán)利要求1中的核酸序列的表達(dá)載體。
48.權(quán)利要求47中的表達(dá)載體，其為哺乳動(dòng)物、酵母、細(xì)菌或昆蟲(chóng)表達(dá)載體。
49.用權(quán)利要求1中的至少一種核酸序列轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
50.權(quán)利要求49中的細(xì)胞，其中細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
51.權(quán)利要求50中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中的細(xì)胞是人細(xì)胞。
52.權(quán)利要求49中的細(xì)胞，其中的細(xì)胞是酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞。
53.權(quán)利要求50中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其選自味覺(jué)細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞。
54.固相，其包含至少一種權(quán)利要求1中的分離的核酸序列。
55.固相，其附著在包含至少一種權(quán)利要求1的序列的不同核酸序列的陣列上。
56.權(quán)利要求54的固相，其包含至少4種不同的編碼功能性味覺(jué)受體或其片段或變體的核酸序列的陣列。
57.權(quán)利要求54的包含核酸陣列的固相，其包含至少10種不同的編碼功能性味覺(jué)受體的核酸序列。
58.權(quán)利要求54包含核酸陣列的固相，其包含至少50種不同的編碼功能性味覺(jué)受體或其片段或變體的核酸序列。
59.權(quán)利要求54包含核酸陣列的固相，其包含至少100種不同的編碼功能性味覺(jué)受體或其片段或變體的核酸序列。
60.分離的多肽或融合蛋白，其選自(i)包含選自SEQ ID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的氨基酸序列的多肽；(ii)包含與選自SEQ ID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的氨基酸序列有至少50％序列相同性的多肽；(iii)包含與至少40個(gè)氨基酸長(zhǎng)的(i)中多肽的片段具有至少75％序列相同性的氨基酸序列的多肽；(iv)嵌合多肽，其包含至少40個(gè)氨基酸長(zhǎng)的(i)或(ii)中多肽的一部分，和至少另外一種G蛋白耦聯(lián)受體的一部分；以及(v)(i)中的多肽的變體，其與所述的多肽不同之處在于至少有一處替換、增加或缺失修飾。
61.權(quán)利要求60中的分離的多肽，其中該多肽與具有選自SEQ IDNOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的序列的多肽或其至少200個(gè)氨基酸的片段具有至少60％序列相同性。
62.權(quán)利要求60中的分離的多肽，其中該多肽與具有選自SEQ IDNOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的序列的多肽或其至少200個(gè)氨基酸的片段具有至少65％序列相同性。
63.權(quán)利要求60中的分離的多肽，其中該多肽與具有選自SEQ IDNOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的序列的多肽或其至少200個(gè)氨基酸的片段具有至少75％序列相同性。
64.權(quán)利要求60中的分離的多肽，其中該多肽與具有選自SEQ IDNOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的序列的多肽或其至少200個(gè)氨基酸的片段具有至少75％序列相同性。
65.權(quán)利要求60中的分離的多肽，其中該多肽與具有選自SEQ IDNOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的序列的多肽或其至少200個(gè)氨基酸的片段具有至少80％序列相同性。
66.權(quán)利要求60中的分離的多肽，其中該多肽與具有選自SEQ IDNOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的序列的多肽或其至少200個(gè)氨基酸的片段具有至少90％序列相同性。
67.權(quán)利要求60(v)中的變體，其包含至少5處保守性氨基酸替換。
68.權(quán)利要求60(v)中的變體，其包含至多5處保守性氨基酸替換。
69.權(quán)利要求60(v)中的變體，其包含5-7處保守性替換修飾。
70.權(quán)利要求60(v)中的變體，其包含3-4處保守性替換修飾。
71.權(quán)利要求60(v)中的變體，其包含1或2處保守性替換修飾。
72.固相，其直接或間接固定了至少一種權(quán)利要求60的分離的多肽，或在細(xì)胞表面表達(dá)所述多肽的細(xì)胞。
73.權(quán)利要求72中的固相，其包含固定化的至少4種不同的權(quán)利要求60中的多肽或在細(xì)胞表面表達(dá)所述多肽的細(xì)胞。
74.權(quán)利要求72中的固相，其包含固定化的至少16種不同的權(quán)利要求60中的多肽或在細(xì)胞表面表達(dá)所述多肽的細(xì)胞。
75.權(quán)利要求72中的固相，其包含固定化的至少25種不同的權(quán)利要求48中的多肽或在細(xì)胞表面表達(dá)所述多肽的細(xì)胞。
76.檢測(cè)味覺(jué)受體基因表達(dá)的方法，其包括(a)將至少一種樣品與權(quán)利要求1中的核酸分子雜交，以及(b)通過(guò)陽(yáng)性雜交信號(hào)檢測(cè)味覺(jué)受體基因的表達(dá)。
77.篩選文庫(kù)的方法，其包括(a)將文庫(kù)與權(quán)利要求1中的核酸分子雜交以及(b)通過(guò)陽(yáng)性雜交信號(hào)在文庫(kù)中檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)味覺(jué)受體克隆。
78.包含權(quán)利要求1中的核酸分子的重組多核苷酸，其直接或間接附著在異源核酸分子上。
79.包含權(quán)利要求1中的核酸分子的表達(dá)載體，其中該核酸分子可操作性地連接至驅(qū)動(dòng)其表達(dá)的異源核酸分子上。
80.轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其包括被引入到宿主細(xì)胞或其后代的權(quán)利要求78中的重組多核苷酸。
81.轉(zhuǎn)基因的非人類(lèi)生物體，其包括被引入到非人類(lèi)宿主生物體的細(xì)胞或其后代中的權(quán)利要求78中的重組多核苷酸。
82.制備重組多核苷酸的方法，其包括將權(quán)利要求1中的核酸分子連接至異源核酸上。
83.權(quán)利要求82中的方法，其中所述的異源核酸包含翻譯的和/或轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)。
84.制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，其包括將權(quán)利要求78中的重組多核苷酸引入到宿主細(xì)胞，或繁殖已經(jīng)引入重組多核苷酸的宿主細(xì)胞。
85.檢測(cè)推定的配體與味覺(jué)受體特異性結(jié)合的方法，其包括(a)將推定的配體與已經(jīng)引入了權(quán)利要求79的表達(dá)載體的細(xì)胞接觸，其中味覺(jué)受體因而由所述的細(xì)胞表達(dá)，和(b)直接或間接檢測(cè)推定的配體和味覺(jué)受體之間的特異性結(jié)合。
86.制備轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)生物體的方法，其包括將權(quán)利要求78中的重組多核苷酸引入到宿主非人類(lèi)生物體細(xì)胞，或繁殖已經(jīng)引入了重組多核苷酸的宿主非人類(lèi)生物體。
87.分離的多肽分子，其包括具有選自SEQ ID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的氨基酸序列的多肽的至少60個(gè)連續(xù)氨基酸的片段。
88.權(quán)利要求87中分離的多肽分子，其中所述的片段包含至少100個(gè)氨基酸。
89.權(quán)利要求87中分離的多肽分子，其中所述的片段包含至少150個(gè)氨基酸。
90.權(quán)利要求87中分離的多肽分子，其中所述的片段包含至少200個(gè)氨基酸。
91.權(quán)利要求87中分離的多肽分子，其中所述的片段包含至少250個(gè)氨基酸。
92.權(quán)利要求87中分離的多肽分子，其中所述的片段是T2R多肽。
93.權(quán)利要求87中分離的多肽分子，其中所述的片段特異性結(jié)合與苦味物質(zhì)相關(guān)聯(lián)的味覺(jué)元，所述的苦味物質(zhì)選自6-正丙基硫代尿嘧啶、八醋酸蔗糖酯、十一醋酸蜜三糖酯、denatonium、甘氨酸銅和奎寧。
94.包含權(quán)利要求87的多肽和異源肽結(jié)構(gòu)域的重組多肽。
95.權(quán)利要求94的重組多肽，其中所述的異源肽結(jié)構(gòu)域包括G蛋白耦聯(lián)受體的跨膜區(qū)。
96.權(quán)利要求94的重組多肽，其包括具有味覺(jué)受體配體結(jié)合區(qū)的7跨膜受體，其中所述的味覺(jué)受體配體結(jié)合區(qū)是至少兩種不同味覺(jué)受體的嵌合體。
97.檢測(cè)配體和味覺(jué)受體特異性結(jié)合的方法，其包括(a)將配體與權(quán)利要求87的多肽接觸，和(b)直接或間接檢測(cè)配體和味覺(jué)受體之間的特異性結(jié)合。
98.抗體或抗體片段，其特異性結(jié)合具有選自SEQ ID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的氨基酸序列的多肽。
99.檢測(cè)權(quán)利要求98的抗體和味覺(jué)受體特異性結(jié)合的方法，其包括(a)將抗體與可能含有味覺(jué)受體的樣品接觸，和(b)檢測(cè)兩者之間的特異性結(jié)合。
100.權(quán)利要求99的方法，其中通過(guò)抗體與樣品中細(xì)胞的特異性結(jié)合，將該細(xì)胞鑒定為味覺(jué)細(xì)胞。
101.從化學(xué)化合物文庫(kù)中篩選參與味覺(jué)感受的化合物的方法，其包括將所述的文庫(kù)中的化合物與至少一種權(quán)利要求87中的多肽接觸，并鑒定特異性結(jié)合至少一種所述多肽的化合物。
102.權(quán)利要求101的方法，其中所述的文庫(kù)是組合化學(xué)文庫(kù)。
103.權(quán)利要求101的方法，其中所述的文庫(kù)是肽文庫(kù)。
104.權(quán)利要求101的方法，其中所述的文庫(kù)是肽、編碼肽、苯(并)二氮雜、變構(gòu)體(diversomer)、乙烯類(lèi)(vinylogous)多肽、非肽類(lèi)肽模擬物(peptidominetic)、或小分子有機(jī)化合物文庫(kù)。
105.權(quán)利要求101的方法，其中所述的文庫(kù)是化合物的隨機(jī)組合。
106.權(quán)利要求101的方法，其中所述的化合物是通過(guò)高通量篩選法篩選。
107.權(quán)利要求101的方法，其中所述的篩選法是由能夠表達(dá)至少一種所述多肽的動(dòng)物細(xì)胞或組織來(lái)完成。
108.細(xì)胞或非人類(lèi)動(dòng)物試驗(yàn)，用于鑒定與T2R多肽相互作用的分子，包括獲得表達(dá)至少一種功能性T2R多肽或包含功能性T2R多肽的嵌合多肽，以及可選地表達(dá)至少一種功能性G蛋白的細(xì)胞或非人類(lèi)動(dòng)物；將所述的細(xì)胞或非人類(lèi)動(dòng)物與欲篩選是否具有調(diào)節(jié)T2R多肽的能力的分子接觸；并檢測(cè)是否有調(diào)節(jié)作用發(fā)生。
109.權(quán)利要求108的方法，其中調(diào)節(jié)作用基于細(xì)胞內(nèi)鈣水平的變化來(lái)檢測(cè)。
110.權(quán)利要求108的方法，其中調(diào)節(jié)作用通過(guò)測(cè)量32P從γ標(biāo)記的GTP到T2R多肽的轉(zhuǎn)移來(lái)檢測(cè)。
111.權(quán)利要求108的方法，其中調(diào)節(jié)作用基于與已知的能夠調(diào)節(jié)特定T2R多肽的對(duì)照化合物進(jìn)行比較來(lái)確定。
112.權(quán)利要求108的方法，其中G蛋白是Gα15或Gα16或其它混棲G蛋白。
113.權(quán)利要求108的方法，其中調(diào)節(jié)作用由檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸水平是否發(fā)生變化來(lái)確定。
114.權(quán)利要求108的方法，其中調(diào)節(jié)作用基于將細(xì)胞與篩選的化合物接觸后，預(yù)定的靶蛋白的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)確定。
115.權(quán)利要求108的方法，其中所述的篩選的化合物基于T2R多肽或其片段的氨基酸序列的預(yù)測(cè)或?qū)嶋H的三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助化合物設(shè)計(jì)而合成。
116.權(quán)利要求108的方法，其中調(diào)節(jié)T2R多肽的化合物是基于它們是否能與T2R多肽特異性結(jié)合來(lái)鑒定。
117.權(quán)利要求108的方法，其中調(diào)節(jié)作用指T2R多肽功能的抑制。
118.權(quán)利要求108的方法，其中調(diào)節(jié)作用指T2R多肽功能的增強(qiáng)。
119.用于描述一種或多種哺乳動(dòng)物中的一種或多種味覺(jué)感知的方法，其包括提供X1到Xn值代表所述哺乳動(dòng)物的n個(gè)味覺(jué)受體中每一個(gè)的刺激量；和從所述的值中產(chǎn)生味覺(jué)感知的定量表示法，其中至少一種所述的味覺(jué)受體是味覺(jué)受體多肽，其具有與選自SEQ ID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的序列有至少約75％相同性的序列。
120.權(quán)利要求119的方法，其中所述的描述包含點(diǎn)或n維空間的體積。
121.權(quán)利要求119的方法，其中所述的描述包含圖或圖譜。
122.權(quán)利要求119的方法，其中所述的描述包含定量描述矩陣。
123.權(quán)利要求119的方法，其中所述的提供步驟包括將多個(gè)重組產(chǎn)生的味覺(jué)受體與試驗(yàn)組合物接觸，并定量測(cè)量所述的組合物與所述的受體的相互作用。
124.預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物中由一種或多種分子或分子組合產(chǎn)生的味覺(jué)感知的方法，包括針對(duì)在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生已知味覺(jué)感知的一種或多種分子或分子組合，提供X1到Xn值，代表所述的哺乳動(dòng)物n個(gè)味覺(jué)受體中每一個(gè)的刺激量，針對(duì)在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生已知味覺(jué)感知的一種或多種分子或分子組合，從所述的值中產(chǎn)生哺乳動(dòng)物味覺(jué)感知的定量表示法；針對(duì)在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生未知味覺(jué)感知的一種或多種分子或分子組合，提供X1到Xn值，代表所述的哺乳動(dòng)物n個(gè)味覺(jué)受體中每一個(gè)的刺激量；針對(duì)在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生未知味覺(jué)感知的所述一種或多種分子或分子組合，從所述的值中產(chǎn)生哺乳動(dòng)物味覺(jué)感知的定量表示法；和通過(guò)將由在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生未知味覺(jué)感知的一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生的味覺(jué)感知的定量表示法和由在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生已知味覺(jué)感知的所述一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中的味覺(jué)感知的定量表示法，預(yù)測(cè)由在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生未知味覺(jué)感知的一種或多種分子或分子組合在哺乳動(dòng)物中所產(chǎn)生的味覺(jué)感知，其中至少一種所述的味覺(jué)受體是味覺(jué)受體多肽，其具有與選自SEQID NOS2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，和24的序列至少75％相同性的序列。
125.分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS21和22的核酸序列具有至少20-30％的序列相同性，或其與包含所述的核酸序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有至少30％的序列相同性；并且其進(jìn)一步包括至少一種編碼與選自SEQ ID NOS25，26，27，28，29，和30的共有序列具有至少70％相同性的多肽的序列。
126.分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS21和22的核酸序列具有至少40-60％的序列相同性，或其與包含所述的核酸序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有至少40-60％的序列相同性；并且其進(jìn)一步包括至少一種編碼與選自SEQ ID NOS25，26，27，28，29，和30的共有序列具有至少70％相同性的多肽的序列。
127.分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS21和22的核酸序列具有至少70％的序列相同性，或其與包含所述的核酸序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有至少70％的序列相同性；并且其進(jìn)一步包括至少一種編碼與選自SEQ ID NOS25，26，27，28，29，和30的共有序列具有至少70％相同性的多肽的序列。
128.分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS21和22的核酸序列具有至少80％的序列相同性，或其與包含所述的核酸序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有至少90％的序列相同性；并且其進(jìn)一步包括至少一種編碼與選自SEQ ID NOS25，26，27，28，29，和30的共有序列具有至少70％相同性的多肽的序列。
129.分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS21和22的核酸序列具有至少85％的序列相同性，或其與包含所述的核酸序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有至少85％的序列相同性；并且其進(jìn)一步包括至少一種編碼與選自SEQ ID NOS25，26，27，28，29，和30的共有序列具有至少70％相同性的多肽的序列。
130.分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS21和22的核酸序列具有至少90％的序列相同性，或其與包含所述的核酸序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有至少90％的序列相同性；并且其進(jìn)一步包括至少一種編碼與選自SEQ ID NOS25，26，27，28，29，和30的共有序列具有至少70％相同性的多肽的序列。
131.分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS21和22的核酸序列具有至少95％的序列相同性，或其與包含所述的核酸序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有至少95％的序列相同性；并且其進(jìn)一步包括至少一種編碼與選自SEQ ID NOS25，26，27，28，29，和30的共有序列具有至少70％相同性的多肽的序列。
132.分離的核酸分子，其與選自SEQ ID NOS21和22的核酸序列具有大約95-99％的序列相同性，或其與包含所述的核酸序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段具有大約95-99％的序列相同性；并且其進(jìn)一步包括至少一種編碼與選自SEQ ID NOS25，26，27，28，29，和30的共有序列具有至少70％相同性的多肽的序列。
133.分離的核酸分子，其具有選自SEQ ID NOS21和22的核酸序列，或其包含所述的核酸序列的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；并且其進(jìn)一步包括至少一種編碼與選自SEQ ID NOS25，26，27，28，29，和30的共有序列具有至少70％相同性的多肽的序列。
134.篩選文庫(kù)的方法，其包括(a)將文庫(kù)與權(quán)利要求125的分離的核酸分子雜交和(b)通過(guò)陽(yáng)性雜交信號(hào)在文庫(kù)中檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)味覺(jué)受體克隆。
135.檢測(cè)G蛋白耦聯(lián)受體多肽基因在細(xì)胞中表達(dá)的方法，其包括將所述的細(xì)胞和在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與權(quán)利要求125的分離的核酸分子雜交的核酸分子接觸；并為了檢測(cè)所述的G蛋白耦聯(lián)受體多肽基因的表達(dá)而檢測(cè)雜交。
136.從哺乳動(dòng)物基因組中篩選味覺(jué)信號(hào)發(fā)生中有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽的編碼序列的方法，包括(i)將所述的哺乳動(dòng)物基因組與至少一種基本由編碼選自SEQ IDNOS25，26，27，28，29，和30的共有序列的核酸序列組成的簡(jiǎn)并引物，或至少一種由權(quán)利要求125的分離的核酸分子衍生而來(lái)的簡(jiǎn)并引物接觸；(ii)在聚合酶、游離核苷酸和輔因子存在下，擴(kuò)增包含至少一種引物序列的所述基因組序列；并(iii)檢測(cè)擴(kuò)增的包含G蛋白耦聯(lián)受體多肽基因的序列的存在。
137.生物化學(xué)試驗(yàn)，用于鑒定對(duì)在味覺(jué)信號(hào)發(fā)生中有活性的G蛋白耦聯(lián)受體有結(jié)合特異性的味覺(jué)元配體，包括(i)將一種或多種權(quán)利要求87的多肽與G蛋白和GTPγS制備物，以及一種或多種推定的味覺(jué)元配體或包含一種或多種推定的味覺(jué)元配體的組合物接觸；并且(ii)通過(guò)測(cè)量GTPγS與G蛋白的結(jié)合，檢測(cè)對(duì)在所述的味覺(jué)信號(hào)發(fā)生中有活性的G蛋白耦聯(lián)受體具有結(jié)合特異性的味覺(jué)元配體的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明描述了新鑒定的哺乳動(dòng)物味覺(jué)細(xì)胞特異性G蛋白耦聯(lián)受體及編碼這些受體的基因。尤其描述了被認(rèn)為參與苦味味覺(jué)感受的T2R G蛋白耦聯(lián)受體及編碼相同受體的基因，以及分離這些基因和分離和表達(dá)這些受體的方法。本發(fā)明同時(shí)描述了表征哺乳動(dòng)物特定味覺(jué)元的味覺(jué)感知的方法，以及產(chǎn)生能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)預(yù)定味覺(jué)感知的新分子或分子組合的方法，和刺激一種或多種味覺(jué)的方法。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1434921SQ01809145
公開(kāi)日2003年8月6日 申請(qǐng)日期2001年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月7日
發(fā)明者J·E·阿德勒 申請(qǐng)人:塞諾米克斯公司