專利名稱：可誘導的無融合生殖的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物無性繁殖，也稱為無融合生殖。具體地，本發明描述了一種增加在植物世代中形成的無融合生殖種子的比率，即通過種子進行無性繁殖的概率的方法步驟。
背景技術：
無融合生殖是在某些多倍體非栽培植物物種中發現的一種受遺傳控制的植物繁殖方式，通過這種繁殖方式獲得的后代植物，其遺傳本質上與雌性親本植物一致。在WO 97/43427和WO 00/24914中，描述了通過在胚囊附近轉基因表達而增加無融合生殖種子比率的基因。這些基因編碼體細胞胚胎發生受體激酶(SERK)或與此激酶相互作用的蛋白質。
可區分兩種類型的無融合生殖，即配子體無融合生殖和非配子體無融合生殖。在配子體無融合生殖中，形成了多個典型缺乏反足核的胚囊，從而使在胚囊中不能進行大孢子發生。在非配子體無融合生殖，也稱為不定胚生殖中，體細胞胚直接從胚囊、子房壁或珠被細胞發育而來。來自周圍細胞的體細胞胚侵入到有性子房中，其中的一個體細胞胚競爭掉其它體細胞胚和有性胚，并利用已經形成了的胚乳。
無融合生殖使不分離的以種子繁殖的雜種成為可能。因此，將無融合生殖應用到栽培植物品種中，由于可以不需要自交及為穩定理想基因組合而進行的后代檢測，從而將會縮短并簡化育種程序。由于無融合生殖基因型無論雜合與否都不分離，因此，具有獨特基因組合的基因型可被用作栽培種。因而，基因或基因群可被“聚積及固定”在所需的基因型中。每一種來自有性生殖-無融合生殖雜交的優良無融合生殖基因型都有潛力成為栽培品種。將無融合生殖應用于栽培植物中，使植物育種者可培育具有株高、種子和飼料品質及成熟等特定穩定性狀的栽培種。在雜交種的商業生產中，育種者將不再受限于(1)質-核相互作用以產生雄性不育的母本，或(2)授粉者的育性恢復能力。幾乎所有雜交親和的種質都可以是生產無融合生殖雜種的潛在親本。
無融合生殖也將會簡化雜交種子的商業生產。具體來說，(1)不再需要對商業雜交種生產田進行物理上的隔離；(2)所有可利用的土地都可用于增產雜交種子，而不是成為授粉者和雄性不育系間的隔離空間；(3)不再需要保存親本品系種子原種。

發明內容
本發明公開了一種種子生產中的方法步驟，它能夠增加植物世代中形成或發育的無融合生殖種子的比率，在此植物世代中，通過轉基因途徑在胚囊附近表達了編碼體細胞胚胎發生受體激酶或與此種激酶相互作用的基因。根據本發明，在開花前以植物生長素處理上述植物。所增加的無融合生殖可被看作可誘導的無融合生殖，它在停用生長素后，又回復到幾乎正常的有性生殖。
按照本發明，生產種子的方法包括(a)在第一親本植物的胚囊附近轉基因表達編碼體細胞胚胎發生受體激酶或與此激酶相互作用的基因，(b)將步驟(a)中的第一親本植物與具遺傳多態性的第二親本植物雜交，并在開花期前給雜交后的植物施加生長素，(c)從獲自以生長素處理后的植物的種子培育F1后代植物，(d)將步驟c中得到的F1后代植物自交，以獲得F2后代植物，(e)選擇其核基因組標記圖譜(marker profile)與在步驟(d)中用于自交的F1后代植物核基因組標記圖譜一致的F2后代植物，和(f)任選地，通過一輪以上的自交增殖上述F2后代植物。
為了生產足量的核基因組標記圖譜一致的種子，可將通過上述方法獲得的無融合生殖植物進行重復多輪自交或雜交來增殖。為了進行后代分析，可在方法步驟(b)中方便地使用自交系。然而，此方法也能應用于有近交衰退的情況。
用在胚囊附近轉基因表達的基因的例子有胡蘿卜(Daucus carota)SERK基因(GENBANK登錄號為U93048)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)SERK基因(GENBANK登錄號為A67827)以及編碼與SERK基因產物發生物理性相互作用的蛋白質的基因，如GENBANK登錄號AX024556、AX024558、AX024560、AX024562、AX024564、AX024566、AX024568及AX024570所描述的擬南芥基因。這些基因所編碼的蛋白質的氨基酸序列選自WO 97/43427中的序列3和21及WO 00/24914中的序列2、4、6、8、10、12、14和16。也可利用可獲自其它植物種的功能相似、結構相關的基因。
為了實現轉基因在胚囊附近表達，必須將該基因可操作地連接到合適的可誘導的或受發育調節的啟動子。任選地，基因于極核與雄配子核融合前在雌配子體中表達。其中最有利的是基因在胚囊、子房壁、珠心或珠被的體細胞中表達。合適的啟動子的具體例子是胡蘿卜幾丁質酶DcEP3-1基因啟動子、擬南芥屬AtChitIV基因啟動子、擬南芥屬LTP-1基因啟動子、擬南芥屬bel-1基因啟動子、矮牽牛fbp-7基因啟動子、擬南芥屬ANT基因啟動子、擬南芥屬AtDMC1啟動子、蝴蝶蘭屬(Phalaenopsis)O126基因啟動子或SERK基因啟動子。
為了鑒定無融合生殖種子，用于最初雜交的親本植物的基因組相互間應該具有足夠的多態性。如果在最初雜交中使用了遺傳相似的植物，盡管也能產生無融合生殖種子，但鑒定由此雜交得到的無融合生殖種子幾乎是不可能的。與此相反，親本植物的遺傳多態性則使利用DNA指紋表征后代植物很容易進行，從而鑒定由無融合生殖產生的種子。如果親本植物包含至少5到10個，優選20個以上，更優選50到60個或更多獨立分離的座位，而這些座位在至少一個親本植物中或兩個親本植物間都表現出遺傳變異，那么，可以認為這些親本植物已具有足夠的多態性。
在親本植物最初雜交后，于開花前1到10天，優選開花前1到2天至少施用一次生長素。在開花前重復施用生長素例如2、3、4或5次同樣也是優選的。生長素可以選自2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、NAA(萘乙酸)及IAA(吲哚乙酸)等。特別合適的生長素是2，4-D。
無融合生殖可產生在遺傳上和最初雜交中的母本植物相同的植物。因此，在本發明中，可以認為，F2后代植物的核基因組與在最初雜交中，即上述方法的步驟(b)中所采用的母本植物的核基因組基本上是一致的。
本發明可應用于雙子葉植物和單子葉植物。在雙子葉植物中，優選擬南芥屬、大豆、棉花、甜菜、甘蔗、油菜(oilseed rape)、煙草和向日葵。特別優選的是大豆、棉花、煙草、甜菜和油菜。在單子葉植物中，優選玉米、甜玉米、小麥、大麥、高粱、黑麥、燕麥、草坪草和飼料草、谷子以及稻。特別優選的是玉米、小麥、高粱和稻。
采用具有足夠多態性的植物進行最初的雜交允許利用DNA指紋技術去鑒別各種后代植物，從而鑒定那些由無融合生殖得到的植物。在上述方法的一個特定的實施方案中，通過比較F2后代植物基因組指紋與在方法步驟(d)中用于自交產生F2后代植物的F1后代植物的基因組指紋，鑒別其核基因組基本上與以上步驟(d)中自交的F1后代植物核基因組一致的F2后代植物。利用一套分子標記，如限制性片段長度多態性(RFLPs)、隨機擴增多態性DNA(RAPD)、單核苷酸多態性(SNPs)、簡單序列長度多態性(SSLPs)、切割擴增多態性(CAPs)或擴增片段長度多態性(AFLPs)等，可以方便地進行基因組的指紋分析和比較。一些特定的擬南芥SSLPs的清單可以從例如擬南芥基因組中心URL http//genome.salk.edu/獲取。在URLhttp//genome.salk.edu/SSLP_info/SSLPsordered.html中可以找到一套擬南芥SSLPs和相應的寡核苷酸。
因此，本發明還包括區分有性生殖后代植物和無融合生殖后代植物的方法，該方法包括在后代和親本植物中表征至少5到10個，優選20個以上，更優選50到60個或更多獨立分離的分子標記座位的標記圖譜，并鑒別其標記圖譜與雌性親本植物標記圖譜一致的后代植物，其中標記對親本植物是多態的。
實施例實施例1AtLTP∷AtSERK1表達載體的構建將2.1kb AtSERK1全長cDNA作為SacI-KpnI片段克隆到包含CaMV35S啟動子的pRT105載體(Topfer等，Nucleic Acids Res.155890，1987)中。然后用HincII-SmaI消化，以從pRT105中除去CaMV35S啟動子，并以AtLTP1(Thoma等，Plant Physiol.10535，1994)啟動子片段取代。采用下列對側翼pRT105質粒DNA特異的、并包含SmaI限制位點的引物，對AtLTP1∷AtSERK1盒進行PCR擴增pRTFor5′-TCCCCCGGGGGAAGCTTGCATGCCTG-3′(SEQ ID NO1)和pRTRev5′-TCCCCCGGGGGACTGGATTTTGGTT-3′(SEQ ID NO2).
然后將PCR產物片段以SmaI酶切消化后轉移至雙元載體pMOG800(Mogen)中，用于植物轉化。通過使用AtSERK1特異引物SERK1 Rev5′-TAAGTTTGTCAGATTTCCAAGATTACTAGG-3′(SEQ ID NO3)測序，驗證該構建體，并通過電穿孔轉入根癌農桿菌AGL1菌株中(Lazo等，Biotechnology 5963，1991)。
實施例2AtLTP∷AtSERK1表達載體轉化擬南芥植物以Bechtold等(C.R.Acad.Sci.Paris，Sciences de la vie3161194，1993)所述的真空滲入法轉化擬南芥生態型WS植物。在10天內于補充有10％蔗糖和50mg/L卡那霉素的1/2 MS-鹽培養基(Murashige和Skoog，Duchefa Biochemie BV)上選擇T1種子。將卡那霉素抗性幼苗移栽到土壤中，以用于繁殖種子。
實施例3無融合生殖種子的生產a.材料與方法利用對AtLTP1∷AtSERK1構建體純合的轉基因T3擬南芥生態型WS植物，即轉化后的第三代轉基因植物作為雄性供體給擬南芥生態型Landsberg erecta(Ler)植物授粉。將開花前約1-2天的11至12期(Smyth等，The Plant Cell 2755，1990)F1植物花芽浸入到如Vivian-Smith等所述(Plant Physiol.121437，1999)的補充有0.04％(v/v)Triton X-100作為表面活性劑的2μM 2，4-D水溶液中。在兩天的期間內重復該處理2次，并使植物生長以產生F2種子。同時進行野生型Ler雌性植物和野生型WS雄性植物間的雜交作為對照，并獲取其F1植物。這些F1植物被稱為野生型F1植物，除了不以生長素處理外，用與轉基因F1植物同樣的方法對其進行分析。
待F2種子生長至幼苗后，從每株植物取一些蓮座葉按Ponce等(Mol.Gen.Genet.261408，1999)所述的方法提取DNA.利用Ponce等(見上)所述的熒光標記引物通過多重PCR同時擴增11個SSLP標記(見表1)，以進行簡單序列長度多態性(SSLP)分析。所采用的全部SSLP標記對WS和Ler生態型都具有多態性，這些標記均一分布于基因組中，且不連鎖，使得在F2后代能進行孟德爾分離。用三種不同的熒光染料之一標記每條正向引物，以運行于GS 36C-2400模式的ABI PRISMTM337 DNA測序儀分離PCR產物。然后運用GeneScan3.1和Genotyper軟件(Applied Biosystems)分析DNA片段。
表1所采用的SSLP標記(如Ponce等所述，Mol.Gen.Genet.261408，1999)

*該PCR產物大小與Ponce等測定的略有不同b.結果/解釋/討論我們采用基于遺傳學的方法在超量表達AtSERK1的植物的后代中進行無融合生殖的篩選。該方法的基礎是利用單一序列長度多態性(SSLP)標記。SSLPs是串聯重復的2到5個堿基對的DNA核心序列。重復區域兩側的DNA序列通常是保守的，由此可以選擇PCR引物以擴增居間的SSLP。串聯重復數目的變化將會導致PCR產物長度的不同。在擬南芥屬中已經發表了50條SSLP標記，這些SSLP通常被用作共顯性遺傳標記進行連鎖和基因型分型分析。SSLPs檢測的是高水平的等位基因變異，并且很容易利用PCR進行評價(19)。
所有轉基因和對照F1植物的SSLP圖譜都是一致的，通常擴增得到22個PCR產物。它們對應于Ler生態型中的11個SSLP等位基因及WS生態型中的11個SSLP等位基因，這些等位基因存在于所有雜合F1植物中。以上述同樣11個SSLP標記，對每個轉基因試驗所獲得的F2植物和野生型對照試驗的F2植物按基因型分類。將每株F2植物的SSLP圖譜與其相應的F1母本植物進行比較。結果見表2和表3。
表2野生型Ler與WS間雜交的SSLP分析

表3以2，4-D處理后野生型Ler與轉基因WS的SSLP分析

我們為在每個轉基因試驗和野生型對照中對11個SSLP標記為雜合的F2植物數目進行評定。在有性生殖群體中，對11個SSLP標記均為雜合的期望植物數為0.00048，這意味著每2048株植物的群體中出現1株植物。對于本試驗中評定的野生型植物數(459株)，期望值為0.2。在這個群體中，沒有檢測到對11個SSLP標記均為雜合的植物。即得到0.2的卡方(x2)值，表明對459株F2群體來說，與期望值的偏離是非顯著的。這些數據說明野生型擬南芥植物是通過有性生殖方式進行繁殖的。第15號轉基因雜交的結果顯示，對所用的超量表達AtLTP1∷AtSERK1的植物，卡方值是極顯著的(x2＝37)。在一個175株植物的F2群體中，我們鑒定到了2株對11個SSLP均為雜合的植物。這種情況偶然發生的概率是很低的(p＜0.0001)，由此我們推斷，這兩株植物起源于母本，它們是無融合生殖的后代。在另一個用與第15號雜交所用的轉基因系相比低水平表達SERK1蛋白質(以Western雜交分析檢測的)的轉基因系進行的轉基因雜交(雜交號為14)中，沒有檢測到對所選用的全部11個SSLP標記都為雜合的植物。
因為在所分析的轉基因植物中不存在非減數的配子，我們推斷沒有發生配子體類型的無融合生殖。這使得單性生殖之后在中心細胞受精(假受精)存在時雙單倍體化或者是不定胚生殖成為無融合生殖胚胎發生的可能方式。由于后代對所檢測的所有標記都是雜合的，由此可以排除假受精。這使得通常在受精前開始的不定胚生殖成為無融合生殖最可能的方式。
序列表<110>Syngenta Participations AG<120>可誘導的無融合生殖<130>S-60006A<140>
<141>
<150>EP 01108901.8<151>2001-04-10<160>25<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明pRTFor引物<400>1tcccccgggg gaagcttgca tgcctg 26<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明pRTRev引物<400>2tcccccgggg gactggattt tggtt 25<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明SERK 1 Rev引物<400>3taagtttgtc agatttccaa gattactagg 30
<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明AthACS標記引物1<400>4agaagtttag acaggtac 18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明AthACS標記引物2<400>5aaatgtgcaa ttgccttc 18<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明AthGENEA標記引物1<400>6gctacgcgtt gtcgtcgtg 19<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明AthGENEA標記引物2<400>7acataaccac aaataggggt g 21<210>8<211>21<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明nga111標記引物1<400>8ctccagttgg aagctaaagg g 21<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明nga111標記引物2<400>9tattttttag gacaaatggc g 21<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明nga1126標記引物1<400>10cgctacgctt ttcggtaaag 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明nga1126標記引物2<400>11tcagtgcttg aggaagatat 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明nga1145標記引物1<400>12ccttcacatc caaaacccac 20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明nga1145標記引物2<400>13gcacataccc acaaccagaa 20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明nga162標記引物1<400>14catgcaattt gcatctgagg 20<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明nga162標記引物2<400>15ctctgtcact cttttcctct gg 22<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明nga12標記引物1
<400>16aatgttgtcc tcccctcctc 20<210>17<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明nga12標記引物2<400>17cttgtagatc ttctgatgc 19<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明nga1111標記引物1<400>18gggttcggtt acaatcgtgt 20<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明nga1111標記引物2<400>19agttccagat tgagctttga gc 22<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明AthCTRI標記引物1<400>20
tatcaacaga aacgcaccga g 21<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明AthCTRI標記引物2<400>21ccacttgttt ctctctctag 20<210>22<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明AthPHYC標記引物1<400>22ctcagagaat tcccagaaaa atct24<210>23<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明AthPHYC標記引物2<400>23aaactcgaga gttttgtcta gatc24<210>24<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明MBK5標記引物1<400>24ctgtcagttg ttggtgaag 19
<210>25<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明MBK5標記引物2<400>25ctgtcagttg ttggtgaag 19
權利要求
1.一種增加在胚囊附近轉基因表達編碼體細胞胚胎發生受體激酶或與體細胞胚胎發生受體激酶相互作用的基因的植物世代中無融合生殖概率的方法步驟，其中在開花前向植物施用生長素。
2.一種生產種子的方法，包括(a)在第一親本植物的胚囊附近轉基因表達編碼體細胞胚胎發生受體激酶或與體細胞胚胎發生受體激酶相互作用的基因，(b)將步驟(a)中的第一親本植物與具遺傳多態性的第二親本植物雜交，并在開花期前給雜交后的植物施用生長素，(c)從用生長素處理過的植物的種子培育F1后代植物，(d)將步驟c中得到的F1后代植物自交，以獲得F2后代植物，(e)選擇其核基因組標記圖譜與在步驟(d)中自交的F1后代植物核基因組標記圖譜一致的F2后代植物，和(f)任選地，通過一輪以上的自交增殖上述F2后代植物。
3.權利要求1的方法步驟或權利要求2的方法，其中在開花前1至2天的期間內，施用生長素至少一次，優選兩次。
4.權利要求1的方法步驟或權利要求2的方法，其中生長素選自2，4-D、NAA及IAA。
5.權利要求4的方法步驟或方法，其中生長素為2，4-D。
6.權利要求1的方法步驟或權利要求2的方法，其中轉基因表達的基因編碼蛋白質，該蛋白質的氨基酸序列選自WO 97/43427中的序列3和21及WO 00/24914中的序列2、4、6、8、10、12、14和16。
7.權利要求1的方法步驟或權利要求2的方法，其中基因的表達受可誘導的或發育調節的啟動子的控制。
8.權利要求7的方法步驟或方法，其中基因在極核與雄配子核融合之前表達。
9.權利要求7的方法步驟或方法，其中基因在胚囊、子房壁、珠心或珠被的體細胞中表達。
10.權利要求7的方法步驟或方法，其中基因的表達受以下啟動子控制胡蘿卜幾丁質酶DcEP3-1基因啟動子、擬南芥屬AtChitIV基因啟動子、擬南芥屬LTP-1基因啟動子、擬南芥屬bel-1基因啟動子、矮牽牛fbp-7基因啟動子、擬南芥屬ANT基因啟動子、蝴蝶蘭屬O126基因啟動子或SERK基因啟動子。
12.權利要求2的方法，其中F2后代植物的標記圖譜與步驟(b)中所采用的雌性親本的標記圖譜是一致的。
13.權利要求2的方法，其中，通過比較F2后代植物的基因組指紋和步驟(d)中自交的F1后代植物的基因組指紋，鑒定其核基因組標記圖譜與步驟(d)中自交的F1后代植物的核基因組標記圖譜相一致的F2后代植物。
14.權利要求13的方法，其中使用一套分子標記對基因組進行DNA指紋分析和比較。
15.一種生產具有一致的核基因組標記圖譜的種子的方法，包括對權利要求2中獲得的植物或其后代植物進行重復循環的自交或雜交。
16.一種區分無融合生殖后代植物和有性生殖后代植物的方法，包括在后代和親本植物中表征至少5個分子標記的標記圖譜，并鑒定其標記圖譜與雌性親本植物標記圖譜一致的后代植物，其中標記對親本植物是多態的。
17.權利要求16的方法，其中分子標記選自限制性片段長度多態性、隨機擴增多態性DNA、單核苷酸多態性、簡單序列長度多態性、切割擴增多態性或擴增片段長度多態性。
全文摘要
本發明涉及植物無性繁殖，也稱為無融合生殖。本發明具體描述了一種種子生產的方法，包括(a)通過轉基因途徑在第一親本植物的胚囊附近表達編碼體細胞胚胎發生受體激酶或與這種激酶相互作用的基因，(b)將步驟(a)中的第一親本植物與具遺傳多態性的第二親本植物雜交，并在開花期前以生長素處理雜交后的植物，(c)從用生長素處理過的植物的種子培育F
文檔編號C07K14/415GK1501978SQ02807998
公開日2004年6月2日 申請日期2002年4月9日 優先權日2001年4月10日
發明者E·魯西諾瓦, S·C·德弗里斯, E 魯西諾瓦, 德弗里斯 申請人:辛根塔參與股份公司