專利名稱：二色桌片參中新的抗腫瘤化合物Intercedenside D～H的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，是從海洋動物二色桌片參中分離到的5種新的抗腫瘤化合物Intercedenside D、E、F、G、H。
背景技術：
二色桌片參(Mensamaria intercedens Lampert)是一種大量生長于福建沿海的海參綱動物，屬瓜參科桌片參屬。體形較小，體長不足10cm，直徑不足3cm，體壁薄。含有豐富的蛋白質、維生素A和維生素E，有較高的營養價值。文獻報道該動物還含有豐富的蛋白多糖、多糖和皂苷類物質(吳萍茹等，二色桌片參化學成分研究，中國海洋藥物，2000，19(1)17)。有關所含的皂苷類成分的化學結構及抗腫瘤活性迄今尚未見有過報道。

發明內容
本發明是從生長于中國福建海域的二色桌片參中提取分離到的一種新的皂苷類化合物，分別命名為Intercedenside D，Intercedenside E，Intercedenside F，Intercedenside G，Intercedenside H，它們的化學結構式通式如下
本發明化合物的制備方法如下(1)提取將新鮮二色桌片參洗凈、切碎，用5倍量(重量)95％乙醇浸泡提取7天，濾出提取液，再用85％的乙醇浸泡提取2次，每次7天。合并3次提取液，減壓回收乙醇，得到流浸膏。將流浸膏溶于水中過濾，將濾液通過大孔樹脂柱，依次用水和50％乙醇洗脫。收集50％乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，得到總皂苷提取物。
(2)分離上述總皂苷提取物進行硅膠柱層析，以二氯甲烷∶甲醇∶水(8～5∶1～4∶1)混合溶劑洗脫，薄層層析檢測，收集含有皂苷的流分，再經過ODS反相柱層析，以甲醇∶水(5～10∶5～0)梯度洗脫，收集不同濾液，薄層層析檢測，得到Intercedenside D～H純品。經多種現代光譜分析，特別是綜合應用多種先進的二維核磁共振波譜的解析，確定了這些化合物的化學結構和立體構型。
1.Intercedenside D為無色結晶性粉末，熔點214-216℃，分子式C55H83O27SNa；Liebermann-Burchard反應和α-萘酚反應陽性。電噴霧陽離子質譜ESI-MS+m/z1253[M+Na]+；電噴霧陰離子質譜ESI-MS-m/z1207[M-Na]-。IR(KBr)cm-13436(羥基)，1745(羰基)，1653(雙鍵)，1235，1068(硫酸酯基)。13C NMR與1H NMR數據見表1和表2。以15％HCl水解皂苷后得到組成皂苷糖鏈的單糖，將其制備成糖腈乙酸酯衍生物，進行氣相色譜-質譜聯用分析，經與標準糖的糖腈乙酸酯衍生物對照，確定Intercedenside D的糖鏈由木糖、葡萄糖、3-O-甲基葡萄糖組成，比例為2∶1∶1。
2.Intercedenside E為無色結晶性粉末，熔點242-244℃，分子式C54H81O26SNa；Liebermann-Burchard反應和α-萘酚反應陽性。電噴霧陽離子質譜ESI-MS+m/z1223[M+Na]+；電噴霧陰離子質譜ESI-MS-m/z1177[M-Na]-。IR(KBr)cm-13442(羥基)，1734(羰基)，1659(雙鍵)，1237，1071(硫酸酯基)。13C NMR與1H NMR數據見表3和表4。以15％HCl水解皂營后得到組成皂苷糖鏈的單糖，將其制備成糖腈乙酸酯衍生物，進行氣相色譜-質譜聯用分析，經與標準糖的糖腈乙酸酯衍生物對照，確定Intercedenside E的糖鏈由木糖、3-O-甲基葡萄糖組成，比例為3∶1。
3.Intercedenside F為無色結晶性粉末，熔點226-228℃，分子式C55H85O27SNa；Liebermann-Burchard反應和α-萘酚反應陽性。電噴霧陽離子質譜ESI-MS+m/z1255[M+Na]+；電噴霧陰離子質譜ESI-MS-m/z1209[M-Na]-。IR(KBr)cm-13437(羥基)，1731(羰基)，1660(雙鍵)，1241，1069(硫酸酯基)。13C NMR與1H NMR數據見表5和表6。以15％HCl水解皂苷后得到組成皂苷糖鏈的單糖，將其制備成糖腈乙酸酯衍生物，進行氣相色譜-質譜聯用分析，經與標準糖的糖腈乙酸酯衍生物對照，確定Intercedenside F的糖鏈由木糖、葡萄糖、3-O-甲基葡萄糖組成，比例為2∶1∶1。
4.Intercedenside G為無色結晶性粉末，熔點241.5-243.2℃，分子式C54H81O25SNa；Liebermann-Burchard反應和α-萘酚反應陽性。電噴霧陽離子質譜ESI-MS+m/z1207[M+Na]+；電噴霧陰離子質譜ESI-MS-m/z1161[M-Na]-。IR(KBr)cm-13443(羥基)，1729(羰基)，1665(雙鍵)，1242，1071(硫酸酯基)。13C NMR與1H NMR數據見表7和表8。以15％HCl水解皂苷后得到組成皂苷糖鏈的單糖，將其制備成糖腈乙酸酯衍生物，進行氣相色譜-質譜聯用分析，經與標準糖的糖腈乙酸酯衍生物對照，確定Intercedenside G的糖鏈由木糖、3-O-甲基葡萄糖組成，比例為3∶1。
5.Intercedenside H為無色結晶性粉末，熔點188-190℃，分子式C55H83O26SNa；Liebermann-Burchard反應和α-萘酚反應陽性。電噴霧陽離子質譜ESI-MS+m/z1237[M+Na]+；電噴霧陰離子質譜ESI-MS-m/z1191[M-Na]-。IR(KBr)cm-13437(羥基)，1732(羰基)，1671(雙鍵)，1245，1069(硫酸酯基)。13C NMR與1H NMR數據見表9和表10。以15％HCl水解皂苷后得到組成皂苷糖鏈的單糖，將其制備成糖腈乙酸酯衍生物，進行氣相色譜-質譜聯用分析，經與標準糖的糖腈乙酸酯衍生物對照，確定Intercedenside H的糖鏈由木糖、奎諾糖、3-O-甲基葡萄糖組成，比例為2∶1∶1。
表1.Intercedenside D苷元部分的13C NMR與1H NMR數據Position δCδH(m，Jin Hz) HMBC1 35.21.25(1H，m，α)，1.33(1H，m，β)2 26.71.82(1H，m，β)，1.97(1H，m，α)3 88.93.15(1H，dd，3.6，12) C1xyl14 39.15 47.80.84(1H，m) C4，30，316 22.81.86(2H，m)7 119.6 5.59(1H，bs)8 147.59 47.53.34(1H，d，9.6)10 35.711 22.31.49(1H，m)，1.77(1H，m)12 25.41.98(1H，m)，2.64(1H，m)13 58.014 48.415 43.31.69(1H，m)，2.53(1H，dd，α，4.8，8.4)16 82.86.07(1H，m)C17，CH3COO17 87.418 178.419 23.81.07(3H，s)C9，1020 86.021 26.51.74(3H，s)C17，20，2222 128.3 5.80(1H，d，12)C20，2423 121.0 6.08(1H，t，12)C20，2524 122.0 6.73(1H，d，12)C26，27，25 135.426 26.01.58(3H，s)C23，24，25，2727 17.21.57(3H，s)C23，24，25，2630 17.00.98(3H，s)C3，4，5，3131 28.41.10(3H，s)C3，4，5，3032 30.91.44(3H，s)C13，14CH3COO170.6CH3COO21.01.93(3H，s)
表2.Intercedenside D糖鏈部分的13C NMR與1H NMR數據Position δCδH(m，Jin Hz) HMBCxyl1(1→C-3)1104.7 4.66(1H，d，7.2) CC-3281.1 4.12(1H，m) C1glc374.9 4.25(1H，m) C2xyl1475.9 5.01(1H，m)563.8 3.72(1H，m)，4.75(1H，m)glc(1→2xyl1)1104.3 5.13(1H，d，7.2) C2xyl1275.6 3.88(1H，m)380.0 4.08(1H，m) C1xyl2471.8 4.04(1H，m)576.0 3.69(1H，m)660.7 4.26(1H，m)，4.31(1H，m)xyl2(1→3glc)1104.1 4.91(1H，d，7.8) C3glc273.2 3.86(1H，m)386.4 4.06(1H，m) C1Meglu468.6 3.93(1H，m)565.8 3.53(1H，t，10.8)，4.05(1H，m)Meglu(1→3xyl2)1104.4 5.15(1H，d，7.2) C3xyl2274.4 3.84(1H，m) C3 Meglu386.9 3.64(1H，m) C2，4 Meglu，OMe470.2 3.87(1H，m) COMe577.4 3.91(1H，m) C4 Meglu661.6 4.02(1H，m)，4.36(1H，m)OMe 60.4 3.78(3H，s) C3 Meglu
表3. Intercedenside E苷元部分13C NMR與1H NMR數據Position δCδH(m，Jin Hz)HMBC1 35.4 1.28(1H，m，α)，1.37(1H，m，β)2 26.6 1.83(1H，m，β)，1.97(1H，m，α)3 88.8 3.18(1H，dd，4.2，12) C1xyl14 39.25 47.9 0.90(1H，m)C4，30，316 22.9 1.89(2H，m)7 119.7 5.61(1H，bs)8 147.69 47.7 3.38(1H，d，14.4)10 35.911 22.4 1.45(1H，m)，1.79(1H，m)12 25.5 1.99(1H，m)，2.65(1H，m)13 58.214 48.615 43.4 1.70(1H，m)，2.55(1H，dd，α，4.8，8.4)16 82.8 6.09(1H，m)C17，CH3COO17 87.518 178.519 24.0 1.10(3H，s)C9，1020 86.221 26.8 1.75(3H，s)C17，20，2222 128.5 5.83(1H，d，12)C20，2423 121.1 6.10(1H，t，12)C20，2524 122.1 6.77(1H，d，12)C26，27，25 136.126 26.1 1.59(3H，s)C23，24，25，2727 17.3 1.58(3H，s)C23，24，25，2630 16.8 1.0(3H，s) C3，4，5，3131 28.3 1.15(3H，s)C3，4，5，3032 31.0 1.48(3H，s)C13，14CH3COO170.5CH3COO21.1 1.94(3H，s)
表4. Intercedenside E糖鏈部分的13C NMR與1H NMR數據Position δCδH(m，Jin Hz) HMBCxyl1(1→C-3)1 104.8 4.60(1H，d，7.2)CC-32 82.34.00(1H，m) C1xyl23 75.44.26(1H，m) C2xyl14 75.95.06(1H，m)5 64.13.71(1H，m)，4.79(1H，m)xyl2(1→2xyl1)1 105.7 5.02(1H，d，7.2)C2xyl12 74.73.88(1H，m)3 74.94.03(1H，m)4 77.04.11(1H，m) C1xyl35 64.23.50(1H，m)，4.34(1H，m)Xyl3(1→4xyl2)1 102.8 4.76(1H，d，7.2)C4xyl22 72.63.90(1H，m)3 86.44.09(1H，m) C1 Meglu4 68.83.97(1H，m)5 68.03.53(1H，m)，4.14(1H，m)Meglu(1→3xyl3)1 104.5 5.22(1H，d，7.8)C3xyl32 75.63.95(1H，m) C3 Meglu3 87.23.66(1H，m) C2，4 Meglu，OMe4 70.43.94(1H，m) COMe5 77.73.87(1H，m) C4 Meglu6 61.84.06(1H，m)，4.40(1H，m)OMe 60.63.79(3H，s) C3 Meglu
表5. Intercedenside F苷元部分的13C NMR與1H NMR數據PositionδCδH(m，Jin Hz) HMBC1 35.7 1.25(1H，m，α)，1.35(1H，m，β)2 26.8 1.80(1H，m，β)，1.94(1H，m，α)3 88.8 3.16(1H，m) C1xyl14 39.25 47.3 0.86(1H，m) C4，30，316 22.9 1.85(2H，m)7 119.45.64(1H，bs)8 147.89 47.1 3.37(1H，d，14.4)10 35.311 22.3 1.45(1H，m)，1.75(1H，m)12 25.8 1.92(1H，m)，2.60(1H，m)13 59.614 48.715 43.4 1.71(1H，m)，2.63(1H，dd，α，4.8，8.4)16 85.2 6.16(1H，m) C17，CH3COO17 87.218 178.419 23.9 1.04(3H，s)C9，1020 87.021 25.4 1.68(3H，s)C17，20，2222 37.4 2.03(1H，m)，2.50(1H，m) C20，2423 23.6 2.20(1H，m)，2.28(1H，m) C20，2524 124.55.04(1H，m)C26，27，25 131.626 25.3 1.55(3H，s)C23，24，25，2727 17.4 1.43(3H，s)C23，24，25，2630 17.1 0.98(3H，s)C3，4，5，3131 28.5 1.07(3H，s)C3，4，5，3032 30.4 1.45(3H，s)C13，14CH3COO 169.9CH3COO 20.8 1.95(3H，s)
表6. Intercedenside F糖鏈部分的13C NMR與1H NMR數據Position δCδH(m，Jin Hz) HMBCxyl1(1→C-3)1 104.8 4.65(1H，d，7.2) CC-32 81.44.13(1H，m) C1glc3 75.14.26(1H，m) C2xyl14 75.95.05(1H，m)5 63.93.72(1H，m)，4.76(1H，m)glc(1→2xyl1)1 104.5 5.14(1H，d，7.2) C2xyl12 75.83.95(1H，m)3 80.14.12(1H，m) C1xyl24 71.44.04(1H，m)5 76.13.69(1H，m)6 60.84.28(1H，m)，4.37(1H，m)xyl2(1→3glc)1 104.2 4.95(1H，d，7.8) C3glc2 73.33.90(1H，m)3 86.44.07(1H，m) C1Meglu4 68.63.93(1H，m)5 66.03.53(1H，m)，4.08(1H，m)Meglu(1→3xyl2)1 104.6 5.18(1H，d，7.2) C3xyl22 74.53.86(1H，m) C3 Meglu3 86.63.65(1H，m) C2，4Meglu，OMe4 70.33.92(1H，m) COMe5 77.63.88(1H，m) C4Meglu6 61.74.05(1H，m)，4.40(1H，m)OMe 60.53.78(3H，s) C3Meglu
表7. Intercedenside G苷元部分的13C NMR與1H NMR數據Position δCδH(m，Jin Hz) HMBC1 35.9 1.33(2H，m)2 26.7 1.80(1H，m，β)，1.99(1H，m，α)3 88.8 3.19(1H，m) C1xyl14 39.25 47.6 0.91(1H，dd，4.2，10.2) C4，30，316 23.0 1.95(2H，m)7 120.25.57(1H，bs)8 145.69 47.2 3.33(1H，bd，13.8)10 35.311 22.3 1.44(1H，m，α)，1.76(1H，m，β)12 30.6 2.09(1H，m)13 58.314 47.915 43.8 1.59(1H，dd，β，7.2，11.4)，2.42(1H，dd，α，7.8，12)16 72.7 5.91(1H，m) C17，CH3COO17 57.2 3.12(1H，d，8.4) C13，2118 179.519 23.7 1.09(3H，s) C9，1020 84.021 28.9 1.60(3H，s) C17，20，2222 131.75.69(1H，d，12) C20，2423 120.36.03(1H，t，12) C20，2524 121.06.42(1H，d，12) C26，2725 137.026 26.0 1.66(3H，s) C23，24，25，2727 17.5 1.61(3H，s) C23，24，25，2630 16.8 1.00(3H，s) C3，4，5，3131 28.2 1.16(3H，s) C3，4，5，3032 32.4 1.08(3H，s) C13，14CH3COO170.2CH3COO21.2 1.92(3H，s)
表8. Intercedenside G糖鏈部分的13C NMR與1H NMR數據Position δCδH(m，Jin Hz)HMBCxyl1(1→C-3)1 104.74.66(1H，d，7.2)CC-32 82.4 4.01(1H，m) C1xyl23 75.3 4.24(1H，m) C2xyl14 75.8 5.07(1H，m)5 64.1 3.73(1H，m)，4.79(1H，m)xyl2(1→2xyl1)1 105.85.01(1H，d，7.2)C2xyl12 74.7 3.89(1H，m)3 74.9 4.05(1H，m)4 77.0 4.13(1H，m) C1Xyl35 64.2 3.49(1H，m)，4.31(1H，m)xyl3(1→4xyl2)1 102.84.76(1H，d，7.8)C4xyl22 72.6 3.90(1H，m)3 86.2 4.09(1H，m) C1 Meglu4 68.8 3.97(1H，m)5 66.0 3.54(1H，m)，4.12(1H，m)Meglu(1→3xyl3)1 104.65.22(1H，d，7.8)C3xyl32 75.6 3.95(1H，m) C3 Meglu3 87.2 3.68(1H，m) C2，4 Meglu，OMe4 70.4 3.94(1H，m) COMe5 77.7 3.86(1H，m) C4 Meglu6 61.8 4.06(1H，m)，4.40(1H，m)OMe 60.5 3.78(3H，s) C3 Meglu
表9. Intercedenside H苷元部分的13C NMR與1H NMR數據Position δCδH(m，Jin Hz)1 35.3 1.26(1H，m，β)，1.34(1H，m，α)2 26.5 1.80(1H，m，β)，1.98(1H，m，α)3 88.3 3.20(1H，dd，4.2，12)4 39.55 47.9 0.93(1H，m)6 23.0 1.91(2H，m)7 120.15.62(1H，bs)8 147.99 47.5 3.37(1H，d，13.8)10 35.611 22.5 1.44(1H，m)，1.72(1H，m)12 25.7 1.98(1H，m)，2.65(1H，m)13 58.514 48.315 43.6 1.72(1H，β)，2.53(1H，dd，α，8.4，4.8)16 82.8 6.10(1H，m)17 87.618 179.019 24.1 1.12(3H，s)20 85.921 27.0 1.79(3H，s)22 128.65.77(1H，d，12)23 121.36.20(1H，t，12)24 122.56.69(1H，d，12)25 136.426 26.2 1.60(3H，s)27 17.7 1.57(3H，s)30 17.0 1.08(3H，s)31 28.3 1.15(3H，s)32 31.5 1.49(3H，s)CH3COO170.1CH3COO21.2 1.94(3H，s)
表10. Intercedenside H糖鏈部分的13C NMR與1H NMR數據Position δCδH(m，Jin Hz)xyl1(1→C-3)1 105.3 4.70(1H，d，7.2)2 83.2 3.97(1H，m)3 75.2 4.26(1H，m)4 75.8 5.10(1H，m)5 64.0 3.70(1H，m)，4.74(1H，m)qui(1→2xyl1)1 105.2 4.71(1H，d，6.6)2 76.1 3.91(1H，m)3 75.3 4.12(1H，m)4 86.0 3.59(1H，m)5 71.8 4.12(1H，m)6 18.0 1.64(3H，d，6.2)xyl2(1→4qui)1 105.0 4.84(1H，d，7.8)2 73.6 4.01(1H，m)3 87.2 4.18(1H，m)4 68.8 4.12(1H，m)5 66.6 3.56(1H，m)，4.27(1H，m)Meglu(1→3xyl2)1 105.6 5.32(1H，d，7.2)2 74.7 3.98(1H，m)3 88.0 3.63(1H，m)4 70.5 4.07(1H，m)5 78.1 3.94(1H，m)6 62.0 4.23(1H，m)，4.41(1H，m)OMe 60.8 3.84(3H，s)Xyl木糖；Glc葡萄糖；Qui奎諾糖；J偶合常數本發明化合物intercedenside D～H經體外抗腫瘤活性實驗，表明這些化合物有明顯的抑制腫瘤細胞生長的效果。實驗所用的細胞株為國際通用的腫瘤細胞株，即
A-549(肺癌)MCF-7(乳腺癌)IA-9(卵巢癌)CAKI-1(腎癌)U-87-MG(神經母細胞癌)PC-3(前列腺癌)KB(鼻咽癌)KB-VIN(鼻咽癌)SK-MEL-2(黑色素瘤)HCT-8(腸癌)實驗方法為國際通用的SRB法根據細胞生長速率，將處于對數生長期的腫瘤細胞以90μl/孔接種于96孔培養板，貼壁生長24小時再加藥10μl孔。每個濃度設3復孔。并設相應濃度的生理鹽水溶媒對照及無細胞調零孔。腫瘤細胞在37℃、5％CO2的條件下培養72小時，然后傾去培養液，用10％冷TCA固定細胞，4℃放置1小時后，用蒸餾水洗滌5次，空氣干燥。最后加入150μl/孔的Tris溶液，酶標儀520nm波長下測定OD值。實驗結果見表11。
表11. Intercedenside D～H對腫瘤細胞株的抑制作用(ED50，μg/ml)樣品A549 MCF-7IA9 CAKI-1 U-87-MG PC-3 KB KB-VIN SK-MEL-2 HCT-8Int.D1.82.42.4＞54.13.33.74.34.22.9Int.E1.41.41.71.62.11.71.92.01.61.1Int.F1.72.11.71.73.32.33.23.22.11.9Int.G1.62.01.93.83.32.03.33.92.41.8Int.H1.41.80.96 1.03.32.23.03.72.21.9ED50半數有效抑制濃度從表11可見，這五種化合物對10種腫瘤細胞株的半數有效抑制濃度(ED50)均小于4.3μg/ml，通常ED50＜10μg/ml濃度為有效。上述實驗結果表明，Intercedenside D～H對10種不同的腫瘤細胞株均顯示明顯的抑制作用。因而可用于制備抗腫瘤藥物。
本發明為研制新的抗腫瘤藥物提供了新的先導化合物，對開發利用中國的海洋藥用生物資源具有重要意義。
具體實施例方式實施例1Intercedenside D～H的分離制備選擇生長于中國福建海域的新鮮二色桌片參1000克，洗滌切碎后分別用5倍量(重量)95％、85％、85％的乙醇依次浸泡提取，每次浸泡7天。合并乙醇提取液，減壓回收乙醇，得流浸膏。將流浸膏溶于3倍量的水中，過濾，濾液通過D101大孔樹脂柱，依次用水和50％乙醇各5000ml洗脫。收集50％乙醇洗脫液，減壓回收溶劑至干，得到總皂苷4.6克。將總皂苷進行硅膠柱層析，以配比為7∶3∶1的二氯甲烷∶甲醇∶水混合溶劑(下層)約1500ml洗脫，收集含有皂苷的部分，再進行ODS反相柱層析，以甲醇∶水(9～7∶1～3)進行梯度洗脫，薄層層析檢測，得到intercedenside D～H純品，其得量分別為0.13克、0.15克、0.09克、0.23克、0.21克。
權利要求
1.抗腫瘤化合物Intercedenside D～H，其特征在于化學結構式如下
2.權利要求1所述抗腫瘤化合物Intercednside D～H的制備方法，其具體步驟如下(1)提取將新鮮二色桌片參洗凈、切碎，用5倍量(重量)95％乙醇浸泡提取7天，濾出提取液，再用85％的乙醇浸泡提取2次，每次7天，合并3次提取液，減壓回收乙醇，得到流浸膏，將流浸膏溶于水中，通過大孔樹脂柱，依次用水和50％乙醇洗脫，收集50％乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，得到總皂苷提取物；(2)分離將上述總皂苷提取物進行硅膠柱層析，以二氯甲烷∶甲醇∶水(8～5∶1～4∶1)混合溶劑洗脫，薄層層析檢測，收集含有皂苷的流分，再經過ODS反相柱層析，以甲醇∶水(5～10∶5～0)梯度洗脫，薄層層析檢測，分別得到Intercedenside D～H純品。
3.權利要求1所述抗腫瘤化合物Intercedenside D～H在制備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及醫藥技術領域，具體為從二色桌片參中分離的5種抗癌化合物Intercedenside D～H，分子式分別為C
文檔編號C07J71/00GK1528781SQ20031010804
公開日2004年9月15日 申請日期2003年10月21日 優先權日2003年10月21日
發明者易楊華, 鄒崢嶸, 吳久鴻, 吳厚銘 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學