專利名稱：人類重組可溶性腫瘤壞死因子受體－Ⅱ的制備方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體地說涉及一種用大腸桿菌高效表達rTNFR-II分泌型重組蛋白——一種人類重組可溶性腫瘤壞死因子受體-II(recombinant tumor necrosisfactor receptor-II，rTNFR-II)的制備方法。
背景技術：
重組可溶性受體類藥物的研發成功是近年來生物技術藥物發展的一個重大突破，治療的疾病包括癌癥、心血管疾病及自身免疫性疾病等。目前類風濕關節炎藥物治療包括激素和免疫抑制劑等，效果不甚滿意，而且藥物副作用較大(高等醫學院校內科學教材第五版，人民衛塵出版社，901-903)。上世紀八十年代初，在類風濕關節炎病人中，發現腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF)在血清中的含量遠超過正常人。在后來的小鼠類風濕關節炎動物模型中，也表明血清腫瘤壞死因子水平明顯增高。利用提取的TNFR-II中和體內過高TNF，治療患有類風濕關節炎的小鼠，療效明顯。后來臨床上也取得了令人滿意的效果。腫瘤壞死因子的可溶性受體的主要優點是屬于人體自身的成分，在治療中不易引起免疫應答的發生，因而安全性較好；目前使用真核CHO細胞生產rTNFR-II，生產工藝復雜且成本高，病人的藥費高達120,000元人民幣/年，我國絕大多病人無法支付如此高昂的藥費。大腸桿菌操作方便、遺傳背景清晰、成本低廉，成為工業化生產重組蛋白類藥物的理想工具。但使用常規的大腸桿菌表達技術表達rTNFR-II，以包涵體的形式表達而又無法體外復性。因此，如何能降低生產成本，生產出具用生物學活性的rTNFR-II是亟待解決的一個課題。

發明內容
本發明的目的是利用基因工程的原理，將TNFR-II胞外區的基因片段插入到分泌型表達載體pET-22b(+)中，利用pET系統分泌型高效表達技術，提供一種降低生產成本的人類重組可溶性腫瘤壞死因子受體-II的制備方法。
本發明的技術方案概述如下一種人類重組可溶性腫瘤壞死因子受體-II的制備方法，由如下步驟組成用SEQ ID No.1所述的核苷酸序列和SEQ ID No.2所述的氨基酸序列設計SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所述的核苷酸序列作為PCR引物，進行PCR擴增，獲得表達TNFR-II的基因片段；通過NcoI和XhoI雙酶切位點，將表達TNFR-II的基因片段克隆到原核表達載體pET-22b(+)中，構建表達載體pET-TNFR-II；將重組載體pET-TNFR-II經轉入大腸桿菌BL21(DE3)內獲得工程菌；誘導后的工程菌，經低溫離心，收集菌體，使用低溫低滲緩沖液抽提，再次低溫離心，取上清，經層析純化后，獲得一種人類重組可溶性腫瘤壞死因子受體-II。
所述抽提的方法為按100克菌體使用300ml的2mmol/L～20mmol/LpH為7.9Tris-HCl緩沖液，再加入1mmolEDTA，充分懸浮菌體，0℃～4℃放置30分鐘～60分鐘。
所述低溫離心步驟是指0℃～4℃，12000g離心10分鐘～30分鐘。
所述層析純化步驟使用鎳離子螯和親和柱。
所述人類重組可溶性腫瘤壞死因子受體-II可被抗TNFR-II多克隆抗體特異性識別。
所述人類重組可溶性腫瘤壞死因子受體-II能夠抑制腫瘤壞死因子-α的細胞毒作用。
本發明的優點是大腸桿菌遺傳特性清楚，易于分子遺傳學操作，并且生長快。大腸桿菌BL21(DE3)表達TNFR-II量高，穩定，并且易于純化。
本發明為分泌型，無需復性，不是以包涵體的形式表達，因此利用本發明的方法制備的人類重組可溶性腫瘤壞死因子受體-II具有生物學活性并且生產成本低。


圖1為SEQ ID No.1的核苷酸序列；圖2為SEQ ID No.2的氨基酸序列；圖3PCR方法擴增rTNFR-II片段圖；圖4Nco I+Xho I雙酶切PET-TNFR-II電泳圖；圖5rTNFR-II純化SDS-PAGE圖；圖6rTNFR-II的免疫印跡圖；圖7rTNFR-II對TNR-α的抑制作用；圖8為SEQ ID No.3的核苷酸序列；圖9為SEQ ID No.4的核苷酸序列。
具體實施例方式
一種人類重組可溶性腫瘤壞死因子受體-II的制備方法的工藝流程為構建大腸桿菌分泌型表達載體pET22b-TNFR-II轉化大腸桿菌BL21(DE3)→工程菌→LB培養基培養(500毫升)→離心收集菌體→胞周質蛋白抽提工藝→鎳離子螯和親和柱層析純化→產品的鑒定。
下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不限于下述實施例實施例1
PCR擴增TNFR-II基因以1μg胎盤cDNA為PCR反應模板，正向引物為5’-TAAAGCCATGGATT TGC CCG CCC AGGTGG CA-3’(SEQ ID No.3的核苷酸序列；(圖8))，反向引物為5’-TAAAACTC GAGGTC GCCAGT GCT CCC TTCA AG-3’(SEQ ID No.4的核苷酸序列)，PCR反應在50μL總體積中進行，反應條件為在94℃變性5分鐘后開始循環，然后94℃變性50秒，58℃退火1.5分鐘，72℃延伸2分鐘，共30個循環后，再于72℃延伸10分鐘，擴增出一條與預計大小(730bp)相符的DNA片段(表達TNFR-II的基因片段)(圖3)。
實施例2PET-TNFR-II表達質粒的構建凝膠回收的PCR產物和pET-22b(+)載體分別用NcoI和XhoI雙酶切，并從1％的瓊脂糖凝膠中通過凝膠回收試劑盒回收，然后進行連接(16℃，16h)，轉化BL21感受態細胞，挑選陽性克隆，提取質粒后進行雙酶切分析驗證(圖4)，并進行DNA測序鑒定，測序結果顯示插入DNA片段序列與GenBank登記的TNFR-II基因序列完全相同，構建的表達載體被稱為PET-TNFR-II。
實施例3rTNFR-II在大腸桿菌中的表達和純化以測序驗證的PET-TNFR-II表達質粒分別轉化BL-21(DE3)感受態細胞；挑取單菌落接種于含50mg/ml氨卞青霉素的LB培養基中，37℃振蕩培養至OD約為0.8時，加入終濃度為1mmol/L的IPTG，30℃誘導6小時。離心收集菌體。菌體重懸于含有20％蔗糖，1mM EDTA的20mM，pH7.9 Tris-HCl緩沖液中，0℃靜置30分鐘。離心收集菌體。菌體重懸于等體積的水中，0℃靜置30分鐘。離心收集上清。在含有0.5M NaCl，2mM咪唑的50mM，pH7.9 Tris-HCl緩沖液中透析上清。透析后樣品進行鎳離子螯和親和柱層析純化，洗脫緩沖液為0.5M NaCl，200mM咪唑的50mM，pH7.9 Tris-HCl，洗脫物在磷酸緩沖液中充分透析后濃縮。所得樣品以SDS-PAGE進行分析(圖5)。
實施例4rTNFR-II在大腸桿菌中的表達和純化以測序驗證的PET-TNFR-II表達質粒分別轉化BL-21(DE3)感受態細胞；挑取單菌落接種于含50mg/ml氨卞青霉素的LB培養基中，37℃振蕩培養至OD約為0.8時，加入終濃度為1mmol/L的IPTG，30℃誘導6小時。離心收集菌體。取100g菌體重懸于300ml含有20％蔗糖，1mM EDTA的2mM，pH7.9 Tris-HCl緩沖液中，4℃靜置60分鐘。離心收集菌體。菌體重懸于等體積的水中，4℃靜置10分鐘。離心收集上清。在含有0.5M NaCl，2mM咪唑的50mM，pH7.9 Tris-HCl緩沖液中透析上清。透析后樣品進行鎳離子螯和親和柱層析純化，洗脫緩沖液為0.5M NaCl，200mM咪唑的50mM，pH7.9Tris-HCl，洗脫物在磷酸緩沖液中充分透析后濃縮。
實施例5rTNFR-II的免疫印跡檢測常規SDS-PAGE和免疫印跡方法，特異性抗可溶性腫瘤壞死因子受體-II的兔多克隆抗體作為第一抗體，第二抗體為辣根過氧化物酶標記的抗兔抗體。結果證明rTNFR-II可被特異性抗可溶性腫瘤壞死因子受體-II的兔多克隆抗體識別見(圖6)。
實施例6rTNFR-II的活性測定競爭性結合法測定rTNFR-II活性。rTNFR-II與不同濃度的人腫瘤壞死因子-α(TNF-α)反應2小時后，檢測游離的TNF-α對L929細胞的毒性作用。結果證明rTNFR-II能夠結合TNF-α從而降低TNF-α對L929細胞的毒性作用(圖7)。
權利要求
1.一種人類重組可溶性腫瘤壞死因子受體-II的制備方法，其特征是由如下步驟組成用SEQ ID No.1所述的核苷酸序列和SEQ ID No.2所述的氨基酸序列設計SEQ ID No.3、SEQID No.4所述的核苷酸序列作為PCR引物，進行PCR擴增，獲得表達TNFR-II的基因片段；通過NcoI和XhoI雙酶切位點，將表達TNFR-II的基因片段克隆到原核表達載體pET-22b(+)中，構建表達載體pET-TNFR-II；將重組載體pET-TNFR-II經轉入大腸桿菌BL21(DE3)內獲得工程菌；誘導后的工程菌，經低溫離心，收集菌體，使用低溫低滲緩沖液抽提，再次低溫離心，取上清，經層析純化后，獲得一種人類重組可溶性腫瘤壞死因子受體-II。
2.根據權利要求1所述的一種人類重組可溶性腫瘤壞死因子受體-II的制備方法，其特征是所述抽提的方法為按100克菌體使用300ml的2mmol/L～20mmol/L pH為7.9Tris-HCl緩沖液，再加入1mmolEDTA，充分懸浮菌體，0℃～4℃放置30分鐘～60分鐘。
3.根據權利要求1所述的一種人類重組可溶性腫瘤壞死因子受體-II的制備方法，其特征是所述低溫離心步驟是指0℃～4℃，12000g離心10分鐘～30分鐘。
4.根據權利要求1所述的一種人類重組可溶性腫瘤壞死因子受體-II的制備方法，其特征是所述層析純化步驟使用鎳離子螯和親和柱。
5.根據權利要求1所述的一種人類重組可溶性腫瘤壞死因子受體-II的制備方法，其特征是所述人類重組可溶性腫瘤壞死因子受體-II可被抗TNFR-II多克隆抗體特異性識別。
6.根據權利要求1所述的一種人類重組可溶性腫瘤壞死因子受體-II的制備方法，其特征是所述人類重組可溶性腫瘤壞死因子受體-II能夠抑制腫瘤壞死因子-α的細胞毒作用。
全文摘要
本發明公開了一種人類重組可溶性腫瘤壞死因子受體－II的制備方法，步驟為用SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4所述的核苷酸序列作為PCR引物，進行擴增，獲得表達TNFR－II的基因片段；通過NcoI和XhoI雙酶切，將基因片段克隆到原核表達載體pET－22b(+)中，構建表達載體pET－TNFR－II；將重組載體轉入大腸桿菌BL21(DE3)內獲得工程菌；誘導后的工程菌經離心，收集，抽提，再次離心，取上清，經層析純化后，獲得一種人類重組可溶性腫瘤壞死因子受體－II，本發明的方法制備的人類重組可溶性腫瘤壞死因子受體－II，不是以包涵體的形式表達，因此具有生物學活性并且生產成本低。
文檔編號C07K14/435GK1986790SQ20051012243
公開日2007年6月27日 申請日期2005年12月19日 優先權日2005年12月19日
發明者徐斌, 孟磊, 文峰, 任倩, 韓忠朝 申請人:中國醫學科學院血液學研究所泰達生命科學技術研究中心