專利名稱：：一種梅魚酶解多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及醫(yī)藥及保健食品及其應(yīng)用，具體為一種梅魚酶解多肽及其應(yīng)用，特別是梅魚酶解多肽在制備治療高血壓藥物中的應(yīng)用。技術(shù)背景肽(p印tides)是分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物，是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能片段，并使蛋白質(zhì)具有數(shù)以千萬計的生理功能。肽本身也具有很強的生物活性。氨基酸是其基本構(gòu)成單位，由2個或3個氨基酸脫水縮合而成的肽分別叫二肽和三肽，以此類推為四肽、五肽。一般說來，肽鏈上氨基酸數(shù)目在IO個以內(nèi)的叫寡肽，1050個的叫多肽，50個以上的叫蛋白質(zhì)，肽類在生物學(xué)方面具有多種生物活性，文獻(xiàn)報道，多肽具有免疫調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)、酶抑制、抗菌以及抗病毒等的功效。高血壓已成為危及人類身體健康的主要的疾病之一。常規(guī)的降血壓藥都有明顯的副作用，而來源于食物中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽(ACEI)具有降壓效果顯著、沒有毒副作用、安全性高、成本低、易吸收等特點，更加符合人們的需求。
發(fā)明內(nèi)容-本發(fā)明的目的是，提供一種從海水魚中制備的梅魚酶解多肽(MYT)，以及提供其在醫(yī)藥或保健食品中的應(yīng)用。梅魚為小黃魚，i^ewc/cwc/ae"apo(yacto(Bleeker)、SmallYellowCroaker;大黃魚，/^ez^osc7'ae"acracea(Richardson)、LargeYellowCroaker、黃姑魚A^6eaa/6//ora(Richardson)、yellowdrum;白姑魚v4rgynwo附iwcwge"to/zwa(houttuyn)、whitecroaker等石首魚禾斗的幼魚的統(tǒng)稱。梅魚蛋白來自新鮮小梅魚肉。將梅魚去除魚骨及魚頭、魚皮，收集魚肉，獲取梅魚蛋白，將梅魚蛋白加水6-8倍勻漿，加入復(fù)配蛋白酶，復(fù)配蛋白酶的組成為堿性蛋白酶(Alcalase)、復(fù)合蛋白酶(Protamex)和風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)，三種酶等量混合；力口入量為按魚肉蛋白含量計的0.3%-0.6%，在40-60"C反應(yīng)4-6小時，85-9(TC滅酶15分鐘，離心，上清夜?jié)饪s干燥后得到干粉狀梅魚酶解多肽(MYT)。梅魚酶解多肽(MYT)總蛋白》85%，其主要氨基酸組成為天門冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸及精氨酸，其含量》45%，等電點主要集中在pH小于7范圍內(nèi)。梅魚酶解多肽(MYT)應(yīng)用于制備治療高血壓的藥物或制備防治高血壓的保健品。采用蛋白酶水解梅魚蛋白，經(jīng)離心干燥等技術(shù)制得梅魚酶解多肽(MYT、在制備治療高血壓藥物中應(yīng)用，國內(nèi)外均未見其應(yīng)用報道。梅魚酶解多肽(MYT)總蛋白>85%，其主要氨基酸組成(天門冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸及精氨酸)含量》45%。等電點主要集中在pH小于7范圍內(nèi)，主要成分為酸性多肽。本發(fā)明所述的制備治療高血壓藥物或保健品的劑型，可以為口服液型，粉劑型，片劑型或膠囊型。體外試驗研究表明梅魚酶解多肽(MYT)有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)活性的作用，動物體內(nèi)實驗證明其具有降血壓療效。可以治療高血壓疾病，達(dá)到較好的效果，長期食用無副作用。發(fā)明的優(yōu)點和應(yīng)用前景本發(fā)明制備梅魚酶解多肽(MYT)的工藝穩(wěn)定，得率高，可用作工業(yè)化生產(chǎn)，梅魚酶解多肽(MYT)降血壓功能的驗證為高血壓患者提供了一種新的預(yù)防和治療途徑，而且這種藥食同源的設(shè)計思路符合現(xiàn)代醫(yī)藥及保健食品工業(yè)發(fā)展的趨勢，將具有廣闊的市場前景和較大的社會和經(jīng)濟效益。圖l、圖2、圖3為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制活性測定圖譜；圖l為馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜。圖2為無梅魚酶解多肽樣品存在條件下的圖譜；圖3為加入梅魚酶解多肽樣品條件下的圖譜；采用梅魚酶解多肽濃度為0.3mg/ml，其ACE抑制活性如圖3所示。圖3顯示加入梅魚酶解多肽樣品，馬尿酸的生成量大大減少，表明其對ACE的抑制活性顯著。圖4、圖5、圖6、圖7為梅魚酶解多肽(MYT)對SHR自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響測定圖；圖4為MYT對SHR自發(fā)性大鼠尾動脈收縮壓(mmHg)的影響；圖5為MYT對SHR自發(fā)性大鼠尾動脈舒張壓(mmHg)的影響；圖6為MYT對SHR自發(fā)性大鼠尾動脈平均壓(mmHg)的影響；圖7為MYT對SHR自發(fā)性大鼠心率(bpm)的影響。測定結(jié)果表明給予劑量為1.02.0g'kg"的MYT能顯著降低SHR自發(fā)性高血壓大鼠尾動脈血壓，SHR自發(fā)性高血壓大鼠的血壓隨年齡的增高而升高，而MYT能抑制血壓的升高，說明MYT有一定的抑制SHR大鼠血壓升高作用。具體實施例方式實施例一梅魚酶解多肽(MYT)的制備方法將梅魚去除魚骨及魚頭、魚皮，收集魚肉，獲取梅魚蛋白，將梅魚蛋白加水6-8倍勻漿，加入復(fù)配蛋白酶，復(fù)配蛋白酶的組成為堿性蛋白酶(Alcalase)、復(fù)合蛋白酶(Protamex)和風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)，三種酶等量混合；加入量為按魚肉蛋白重量計的0.3%-0.6%，在40-60。C反應(yīng)4-6小時，85-90'C滅酶15分鐘，離心，上清夜?jié)饪s干燥后得到干粉狀梅魚酶解多肽。經(jīng)過測定梅魚酶解多肽總蛋白>85%，其主要氨基酸組成為天門冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸及精氨酸，其含量》45%，等電點集中在pH小于7范圍內(nèi)。實施例二測定實施例1所得梅魚酶解多肽(MYT)干粉對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)活性的抑制作用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的測定采用高效液相色譜系統(tǒng)WATERS2695-2696;檢測器WATERS2424;色譜柱HypersilBDSC184.6X210腿；洗脫液30%甲醇(含0.1%的三氟乙酸TFA和0.05%乙酸)；流速0.8mL/min;檢測波長228nm;上樣量10uL。取樣品15uL和ACE(溶于pH=8.3,50mM的硼酸緩沖液，酶活60mU/mL)45uL于37。C恒溫水浴中保溫5min，加入75ul7.6mM的底物(馬尿酸HHL溶于50mM的硼酸緩沖液，含6.8mM的氯化鈉)，37。C下反應(yīng)30min，加入15化10%的TFA終止反應(yīng)，至室溫取10uL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)樣，通過HPLC洗脫圖譜定量馬尿酸生成量，以生成馬尿酸的量來測定樣品的ACE抑制活性。本實驗采用梅魚酶解多肽濃度為0.3mg/ml，其ACE抑制活性如圖3所示。圖3顯示加入梅魚酶解多肽樣品，馬尿酸的生成量大大減少，表明其對ACE的抑制活性顯著。不同濃度的多肽溶液的抑制率如表l所示。根據(jù)表l所示數(shù)據(jù)，實驗對不同濃度的多肽及其對應(yīng)的抑制率進(jìn)行線型回歸，ACEI半抑制濃度為O.203mg/ml。表l不同濃度多肽的ACE抑制活性(義±&/7=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實施例三梅魚酶解多肽(MYT)對SHR自發(fā)性高血壓大鼠降血壓的作用取SPF級體重為280~300g的雄性SHR自發(fā)性高血壓大鼠16只，按血壓高低隨機分成3組，即模型對照組(6只)、高(2.0g'kg"MYT、5只)、低(l.Og'kg"MYT、5只)劑量組；另取5只SPF級體重為280300g的雄性Wistar大鼠作正常對照組。高、低劑量組分別灌胃給予MYDT2.0g.kg—1和MYT1.Og'kg.1，模型對照組和正常對照組灌胃給予蒸餾水10mhkg"體重，每R給藥一次，連續(xù)給藥40天，每4天各組大鼠測定尾動脈收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、平均壓(MBP)和心率(HR),觀察MYT對SHR自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響，結(jié)果如圖4、圖5、圖6、圖7所示。由圖4結(jié)果可見，與正常對照組比較，模型對照組大鼠尾動脈收縮壓顯著升高(PO.01);連續(xù)40天給予高、低劑量MYT的高血壓大鼠尾動脈收縮壓有不同程度的下降，MYT低劑量組于給藥第8、16、24—40天，收縮壓有顯著降低(PO.05或PO.01),MYT高劑量組于給藥第4、8、12、16、24—40天，收縮壓有顯著降低(P<0.05或PO.Ol)，其作用效果與MYT劑量呈一定的相關(guān)性。由圖5結(jié)果可見，與正常對照組比較，模型對照組大鼠尾動脈舒張壓顯著升高(PO.01);連續(xù)40天給予高、低劑量MYT的高血壓大鼠尾動脈舒張壓有不同程度的下降，MYT低劑量組于給藥第16、24—36天，舒張壓有顯著降低(P<0.05或PO.Ol)，MYT高劑量組于給藥第8—40天，舒張壓有顯著降低(P<0.05或PO.01)，其作用效果與MYT劑量呈一定的相關(guān)性。由圖6結(jié)果可見，與正常對照組比較，模型對照組大鼠尾動脈平均壓顯著升高(PO.01);連續(xù)40天給予高、低劑量MYT的高血壓大鼠尾動脈平均壓有不同程度的下降，MYT低劑量組于給藥第8、16、24—40天，平均壓有顯著降低(PO.05或PO.Ol)，MYT高劑量組于給藥第4一40天，舒張壓有顯著降低(PO.05或P〈0.01)，其作用效果與MYT劑量呈一定的相關(guān)性。由圖7結(jié)果可見，與正常對照組比較，模型對照組大鼠心率無變化(P>0.05);連續(xù)40天給予高、低劑量MYT的高血壓大鼠心率無明顯變化。試驗結(jié)果表明，給予劑量為1.02.0g'kg"的MYT能顯著降低SHR自發(fā)性高血壓大鼠尾動脈血壓，SHR自發(fā)性高血壓大鼠的血壓隨年齡的增高而升高，而MYT能抑制血壓的升高，說明MYT有一定的抑制SHR大鼠血壓升高作用。權(quán)利要求1、一種梅魚酶解多肽，其特征在于其來源于酶解的梅魚蛋白，該梅魚酶解多肽總蛋白≥85％，其中天門冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸及精氨酸含量≥45％，等電點主要集中在pH小于7的范圍內(nèi)。2、如權(quán)利要求1所述梅魚酶解多肽應(yīng)用于制備治療高血壓的藥物或制備防治高血壓的保健品。全文摘要本發(fā)明公開了一種梅魚酶解多肽(MYT)及其應(yīng)用，MYT來源于酶解的梅魚蛋白，其總蛋白≥85％，其中天門冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸及精氨酸含量≥45％，等電點主要集中在pH小于7的范圍內(nèi)。體外試驗研究表明梅魚酶解多肽(MYT)有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)活性的作用，動物體內(nèi)實驗證明其具有降血壓療效，為高血壓患者提供了一種新的預(yù)防和治療途徑，MYT可以應(yīng)用于制備治療高血壓的藥物或制備防治高血壓的保健品。本發(fā)明藥食同源的設(shè)計思路符合現(xiàn)代醫(yī)藥及保健食品工業(yè)發(fā)展的趨勢。文檔編號C07K2/00GK101225105SQ200810059648公開日2008年7月23日申請日期2008年2月1日優(yōu)先權(quán)日2008年2月1日發(fā)明者張燕平,戴志遠(yuǎn)申請人:浙江工商大學(xué)