專利名稱：：恩諾沙星單克隆抗體及應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及恩諾沙星的特異性單克隆抗體及其制備方法和應用，還涉及其雜交瘤細胞林，屬于免疫化學
技術領域：
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背景技術：
：恩諾沙星(enrofloxacin)是第一個畜禽專用的氟喹諾酮類藥物，因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強、易吸收、體內分布廣等優點而被廣泛應用于獸醫臨床預防和治療。隨著該藥物在食源性動物中的廣泛應用，由其引起的毒副作用如神經中毒、腎功能損傷、過敏反應、幼畜關節炎等也日益增多。由于該藥物在動物性食品中的殘留而誘導人類致病菌產生耐藥性問題的發現，進一步加深了人們對該藥的認識。為了減少該藥物對人類的危害，美國禁止將恩諾沙星用于食品動物，而日本厚生勞動省自2007年5月將魚、貝類產品中恩諾沙星的殘留限量由0.lppm調整為0.Olppm。因此，開展其殘留4企測方法的研究至關重要。為了監控恩諾沙星在動物性食品中的殘留，聯合國糧農組織(FAO)/世界衛生組織(冊0)和食品添加劑聯合專家委員會(JCEFA)制定了恩諾沙星在牛、豬、禽的最高殘留限量(maximumresiduelimit,MRL)。美國FDA規定恩諾沙星禁用于食品動物，歐盟(EC)規定恩諾沙星在牛、豬、家禽的肝、腎、肌肉中最高殘留限量(MRL)為30ug/kg;世界衛生組織(WHO)推薦的恩諾沙星MRL為40jng/kg。我國農業部規定恩諾沙星在肌肉、牛奶中的MRL不得超過100yg/kg。因此加強對該藥在動物性食品中的殘留檢測和監督顯得尤為突出。然而作為半抗原的恩諾沙星本身不能誘導機體產生抗體，必須將其與載體蛋白偶聯獲得人工合成的完全抗原才具有抗原性。而小分子抗原與載體蛋白的偶聯效果及細胞融合后陽性克隆的篩選都直接影響著抗體的制備效果，是抗體制備的關鍵。為了建立恩諾沙星酶免疫分析方法和金標試紙，需要制備特異性強、可大量生產的抗恩諾沙星的單克隆抗體。申請人4企索發現中國農業科學(2004,37(7):1060-1064)的一篇文獻中介紹了恩諾沙星單克隆抗體的制備及其鑒定，主要是用碳二亞胺法合成了2種恩諾沙星(enrofloxacin，ENFX)人工抗原ENFX-BSA和ENFX-0VA,用紫外掃描和分析載體蛋白的氨基酸組成等方法對人工抗原進行鑒定，ENFX與BSA的結合比約為48:1。用ENFX-BSA免疫BALB/C小鼠，采用顯微克隆技術最終篩選出2抹特異性分泌細胞2C5和5D5并獲取腹水，純化后腹水效價分別為1:3200和1:6400。2C5和5D5均屬IgG2a型抗體。該單抗對氟會諾酮類藥物有很高的選擇性，與環丙沙星、麻保沙星、沙拉沙星、達氟沙星的交叉反應率分別為110.84%、27.40%、71.05%和37.41%,交叉反應率比較高，特異性不強。
發明內容本發明的目的是針對以上現有技術存在的缺點，提出與環丙沙星和沙拉沙星無交叉反應的，并具有特異性的、可大量生產的恩諾沙星單克隆抗體。本發明的另一個目的是提供分泌該特異性抗恩諾沙星單克隆抗體的雜交瘤細胞抹。本發明的目的是通過以下技術方案實現的本發明產生恩諾沙星單克隆抗體的雜交瘤細胞4朱6A4或8E6，6A4是小鼠雜交瘤細^^系CGMCCNo.3016，于2009年4月9日j呆藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號是CGMCCNo.3016;8E6是小鼠雜交瘤細胞系CGMCCNo.3017，于2009年4月9曰保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號是CGMCCNo.3017。由小鼠雜交瘤細胞林6A4或小鼠雜交瘤細胞林8E6分泌的單克隆抗體。小鼠雜交瘤細胞林6A4或小鼠雜交瘤細胞抹8E6分泌的單克隆抗體的的制備方法，包括以下步驟a.制備免疫原和包被原采用碳二亞胺法將載體蛋白與恩諾沙星偶聯，合成免疫原和包被原；b.動物免疫注射以小鼠作為免疫動物，腹腔注射免疫原與等量弗氏完全佐劑混合液，進行第一次免疫注射；3周后進行第二次免疫注射；再間隔2周后進行第三次免疫注射；c.篩選動物免疫血清用酶聯免疫吸附法和竟爭酶4關免疫吸附法篩選免疫鼠血清，對小鼠進行加強免疫注射；d.制備雜交瘤細胞取經過加強免疫的小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，經過3次亞克隆獲得穩定分泌抗恩諾沙星的單克隆抗體細胞4朱6A4或8E6;e.制備并純化單克隆抗體用滅菌石蠟對小鼠進行免疫，7天后分別腹腔注射所述單克隆抗體細胞抹6A4或8E6,7-10天采集腹水，用辛酸-硫酸銨鹽析法對腹水純化，即得恩諾沙星單克隆抗體。其中，步驟a中所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白和卵清白蛋白的至少一種，對應的免疫原為ENR-BSA、ENR-HAS，包被原為ENR-0VA;所述石友二亞胺法中，EDC和NHS活化恩^i若沙星的反應時間為2小時，恩諾沙星與載體蛋白反應12小時。所述步驟b中的各次免疫注射劑量是50-100ng/只。所述步驟d中，在進行細胞融合之前，將免疫鼠血清利用間接ELISA方法進行效價4企測，同時利用間接竟爭ELISA方法4企測血清對恩諾沙星的抑制效果，用#企測后的鼠脾細胞進行融合。所述步驟e中對免疫小鼠腹腔進行單克隆抗體細胞林的注射量為1-5x106個/只。通過亞型鑒定得出本發明單克隆抗體的亞型為IgGl型。本發明的再一個目的是提供該單克隆抗體在制備檢測恩諾沙星試劑中的應用。其主要是將其應用于制備恩諾沙星殘留檢測試劑盒和膠體金試條紙。本發明的有益效果是通過兩林小鼠雜交瘤細胞林6A4和8E6產生特異性強的恩諾沙星單克隆抗體，與其它氟喹諾酮類藥物交叉反應率低，能夠大量生產，可用于制備檢測恩諾沙星的酶聯免疫分析法試劑盒和膠體金試紙條，達到快速且靈敏地檢測牛奶，肌肉及水產品中的恩諾沙星藥物殘留的效果。下面結合附圖對本發明作進一步的說明。圖1:ENR-HSA免疫原質譜檢測圖。圖2:ENR-BSA免疫原質譜檢測圖。圖3:ENR-OVA包被原質譜檢測圖。圖4:兩個單克隆抗體8E6，和6A4，的亞型鑒定圖。圖5:本發明的單克隆抗體8E6，與恩諾沙星標準品的反應曲線。圖6:本發明的單克隆抗體6A4，與恩諾沙星標準品的反應曲線。具體實施例方式實施例一試劑與材料準備恩諾沙星標準品(中國獸醫藥品監察所)，牛血清白蛋白(BSA)(Amresco，0332)、人血清白蛋白(HSA)(Sigma,A9511),卵清白蛋白(OVA)(Sigma,A5503),碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)(Sigma，E6383)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(Sigma,130672)，N，N-二曱基曱酰胺(DMF)(Sigma,D4551),弗氏完全佐劑(Sigma,F5881),弗氏不完全佐劑(Sigma,F5506),四曱基聯苯胺(TMBXAmresco，0759)，HAT(Sigma，H0262)和HT(Sigma，H0137)，氯化鈉(Amresco，0241)，氯化鉀(Amresco,0395)，磷酸二氬鐘(Sigma,P9791)，磷酸氬二鈉(Sigma,71639),羊抗鼠IgG-HRP(Jackson,115-035-044)，二甲基亞砜(DMSO)(Applichem，0231),聚乙二醇4000(PEG4000)(Sigma,P7306),DMEM高糖培養基(Gibco，11995)，胎牛血清(Gibco，C2027050)。實驗動物與細胞Balb/c小鼠(6-8周齡，雌性)，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，SP2/0(小鼠骨髓瘤細胞)由中科院生物物理研究所感染與免疫研究中心唐捷教;l受惠贈。本發明的實驗步驟如下a.制備免疫原ENR-BSA、ENR-HSA和包^皮原ENR-OVA:本發明所述的人工抗原采用碳二亞胺法[1制備恩諾沙星藥物與載體蛋白復合物，并略做改進(1)取100jliL的DMF分別溶解2.4mg,2.5mg,1.6mg的恩諾沙星，將溶解后的恩諾沙星加入100iL的PBS(pH8.0)中，混勻；(2)在震蕩狀態下緩慢加入150iiL0.3M的EDC，繼續加入150jnL0.2M的NHS，室溫反應2h;(3)將反應產物緩慢加入含10mgBSA,HSA和OVA的500jiL的PBS(pH8.0)溶液中，4。C避光反應12小時；(4)將上述反應產物裝入透析袋(截留分子量3500)進行透析，2小時換液一次，共換液3次，以13000轉離心30min，收集上清，分裝保存于-2(TC備用。(5)對透析后的免疫原ENR-HSA，ENR-BSA和包被原ENR-OVA，分別進行質譜檢測，結果見圖1、圖2，圖3。圖1顯示偶聯物ENR-HSA和載體蛋白的偶聯比是9:1;圖2顯示偶聯物ENR-BSA和載體蛋白BSA的偶聯比是5:1;圖3顯示偶聯物ENR-OVA和載體蛋白OVA的偶聯比是9:1，從圖示結果可以判定偶聯成功。b.動物免疫采用Balb/c小鼠作為免疫動物，免疫原是ENR-HSA或ENR-BSA,免疫劑量是50-100jug/只，第一次用免疫原與等量弗氏完全佐劑混合乳化，腹腔注射，劑量為100pg/0.2ml/只；3周后用免疫原與等量弗氏不完全佐劑混合乳化進行笫二次免疫注射，劑量為50|ag/0.2ml/只，間隔2周后，以不完全佐劑乳化的抗原進行第三次免疫注射，劑量同上。c.篩選動物免疫血清以上免疫小鼠在第三次免疫后7-IO天用ELISA法測血清效價，同時利用間接竟爭ELISA方法[2)檢測血清對恩諾沙星的抑制效果。選取血清效價高的小鼠進行加強免疫，免疫三天后取脾臟。d.制備雜交瘤細胞取上述免疫Balb/c小鼠的脾細胞，以50%的PEG4000作融合劑，將免疫脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按5:1的比例進行細胞融合。采用間接ELISA法檢測細胞上清，篩選出陽性克隆，對陽性克隆進一步用間接竟爭ELISA法檢測，仍為陽性者利用有限稀釋法進行亞克隆，經3次亞克隆以后，檢測有單克隆生長孔的細胞培養上清，陽性率達到100%,得到穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞才朱6A4和8E6;該步驟中建立間接ELISA法的步驟如下最佳抗原包被稀釋度的選擇，采用方陣法確定包被原濃度(1)包被用O.05mol/L、PH9.6的碳酸鹽緩沖液將包被原稀釋成一系列濃度加入酶標板中，100nL/孔，4。C包被過夜；(2)洗滌甩凈包被液，洗滌液是含1%。吐溫的0.01mol/LPH7.4的PBS，用洗板機洗板3次，并在吸水紙上拍干；(3)封閉每孔加入200pL的0.5%BSA封閉液，37。C孵育lh;(4)洗滌同上；(5)—抗加入系列濃度的抗體，100nL/孔，37。C孵育lh;(6)洗滌同上；(7)酶標二抗加入l:IOOOO稀釋的羊抗鼠-HRP,100^07孔,37。C孵育lh，洗滌同上；(8)顯色每孔加入10(VL的TMB顯色液，20-25。C顯色10min;(9)終止反應加入2M的H2S04終止液終止反應，50pL/孔，并于酶標儀上讀取ODw值。判定標準根據陽性血清0D值及P/N》2.1,確定包,皮原最佳包被稀釋度為l:28000(濃度為O.lng/ml)。具體結果見表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表1抗原、抗體最佳工作濃度該步驟中建立間接竟爭ELISA法的步驟如下(1)包被用O.05mol/L、PH9.6的碳酸鹽緩沖液將包被原稀釋為O.lug/ml,加入酶標板中，100nL/孔，4。C包^皮過夜；(2)洗滌甩凈包被液，洗滌液是含1%。吐溫的0.Olmol/LPH7.4的PBS，用洗板機洗板3次，并在吸水紙上拍干；(3)封閉每孔加入200pL的0.5%BSA封閉液，37。C孵育lh;(4)洗滌同上；(5)加樣先將相鄰兩孔酶標板孔內加入稀釋液，50pL/孔，與此兩孔相鄰的孔內加入適當濃度的恩諾沙星標準品，50pL/孔，最后加入稀釋好的抗體，50pL/孔，酶標;tl稍作震蕩混勻，37。C孵育lh;(6)洗滌同上；(7)酶標二抗加入l:10000稀釋的羊抗鼠-HRP,100nL/孔，37°C孵育lh，洗滌同上；(8)顯色每孔加入100pL的TMB顯色液，20-25。C顯色10min;(9)終止反應加入2mol/L的H2S04終止液終止反應，50nL/孔，并于酶標^義上讀取OD"。值。判定標準首先，乂人肉眼可以看出，抑制孔與未抑制孔顏色的變化，若抑制孔顏色較淺或者無色，說明有特異性抗體產生，反之則無特異性抗體產生。其次，根據OD值可以判定，抑制孔OD值小于未抑制孔OD值，說明有特異性抗體產生。采用有抑制效果血清的免疫小鼠脾細胞進行細胞融合，并篩選出能分泌特異性抗體的雜交瘤細胞林。抗體特異性的強弱可纟艮據竟爭抑制率的大小來判定。竟爭抑制率=1-B/BO(B為加竟爭物的抑制孔OD值，BO為不加竟爭物的陽性對照孔OD值)。e.制備并純化單克隆抗體，效價測定首先制備和鑒定單克隆抗體細胞復蘇時取出凍存管，立即于37°C水浴中融解，之后移入培養亞內擴大培養，培養基為含10。/。FBS的DMEM培養基。其中，凍存管內凍存的是對數生長期的能夠穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞抹6A4和8E6。用滅菌石蠟免疫8只Balb/c小鼠，0.5ml/只，將小鼠分為兩組，每組4只，7天后分別對每組小鼠腹腔注射雜交瘤細胞6A4和8E6，注射劑量為1-5><106個/只，7-10天采集腹水，得到單克隆抗體，命名為6A4'和8E6'。采用購自Pierce/>司的鼠源單抗亞型鑒定試劑盒(MouseMonoclonalAntibodySubtypeIdentificationKit)對本發明所得到的單克隆抗體進行亞型鑒定，其亞型鑒定結果表明，單克隆抗體6A4，和8E6，均為IgGl亞型，與已有文獻才艮道的IgG2a亞型不同，結果見表2和圖4。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>然后純化單克隆抗體(以下簡稱單抗)用辛酸J危酸銨鹽析法對上述腹水進行處理，具體步驟如下(1)取1倍體積的腹水，加入4倍體積的0.06mol/LPH4.8的NaAC-HAC緩沖液，輕輕混勻；(2)按每ml腹水加入30%的辛酸的量，加好后，室溫于搖床上搖30min。之后4'C靜置3h;(3)4。C在13謂rpm，離心30min，取上清，用NaOH調PH至7.4;(4)向上清中加入等體積的飽和硫酸銨溶液，使其終濃度為50%,4。C-睜置lh。之后4。C13000rpm，離心10min;(5)棄上清，用適量的0.OlmolPH7.2的PBS懸浮沉淀；(6)將單抗懸液轉入透析袋內透析12h,中間換3次透析液；(7)透析后的單抗用離子交換法做進一步純化，所用的離子交換柱為HiTrapQHPlmL，上樣緩沖液為20mMTris-HCL，pH8.6，洗脫緩沖液為20mMTris-HCL，1MNaCL，pH8.6,當鹽濃度達到30%時開始收集單抗，lml/管。(8)純化后的單抗進行SDS-PAGE電泳檢測其純度。利用紫外分光光度計測定其濃度，根據測定結果將單抗調整為lmg/ml，然后測其效價，分裝，-8(TC保存；(9)單抗效價的測定以0.lpg/ml的包被原ENR-OVA包被ELISA板，將純化的6A4，單抗進行1:2000，1:4000,1:8000，1:16000，1:32000,1:64000，1:128000稀釋，<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(0.05pig/ml)和8E6，(0.05pg/ml)抗體，同時加入不同濃度的恩諾沙星標準品，加有8E6，抗體的孔內加入的恩諾沙星濃度分另U為10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.313ng/mL、0ng/mL，加有6A4，才元體的孑L內加入的恩諾沙星濃度分別為100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL,、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、0ng/mL,重復測定3次，結果分別見表4、表5。以藥物濃度的自然對數為橫坐標，以B/BO值為縱坐標繪制標曲，結果見圖5，圖6。根據試驗數據計算6A4，和8E6，單抗的IC50值分別為14ng/ml和2.3ng/ml。從標準曲線的OD值和IC50值可以看出，6A4，單抗在ENR濃度為3.125ng/ml時，仍具有很好的抑制效果；而8E6，單抗在ENR濃度為0.313ng/ml時，抑制效果明顯，這說明本發明中篩選到的兩抹單克隆抗體具有4艮高的特異性和敏感性。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表4單克隆抗體8E6，的抑制效果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表5單克隆抗體6A4，的抑制效果(11)單克隆抗體親和力的測定根據Gosling介紹的ELISA方法進^f亍抗體親和力的測定，其親和力的大小用親和常數Ka的大小來表示，公式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>親和常數的單位為濃度的倒數，即克分子濃度(L/moL)，其值越高表示抗原抗體結合的緊密程度越高。其檢測過程如下第一步、確定抗原，抗體最佳作用濃度1、將人工抗原分別進行13000,26000，52000，104000,208000,416000倍稀釋后各包被4條，100L/孑L，37°C，溫育2h,洗滌、封閉；2、將抗體進^f于7500,15000，30000,60000，120000，240000，480000倍稀釋，分別加于2條中，100L/孔，室溫溫育1h;3、將這兩條中的抗體分別移入第二條中，室溫溫育1h;4、將這兩條洗滌加酶標二抗，繼續做ELISA，最后測定OD值Al;5、后兩條按上述步驟，最后測定0D值A2。6、根據公式A丄(c卜A2(c)計算f值，選取所有f值都小于10%的抗原，抗體稀釋度，根據OD值大小確定最佳抗原濃度為208000倍稀釋，最佳抗體濃度為120000倍稀釋。第二步、測定親和力1、配制一系列濃度抗原6個；2、在加有最佳濃度抗體的EP管內加入等量系列濃度抗原，共7管，最后一管加入抗原稀釋液，室溫下過夜；3、同時將抗原進行208000倍稀釋后進行包^:，室溫下過夜，洗板，封閉；4、將第二步的反應產物取100juL加入以上封閉的板孔內，室溫下進行ELISA,最后測定OD值A;5、根據Scatchard公式-V)計算其斜率值，其中，ot為游離抗原的濃度，V為結合抗體位點與總抗體位點的比，所得親和力的大小即親和常數Ka,為斜率值的負數。得到的結果是單克隆抗體8E6，的親和常數為1.8*1(T，單克隆抗體6A4，的親和力為1.2*101()。實施例二藥物交叉反應試-驗按實施例一中建立的單抗篩選間接竟爭ELISA方法進行，恩諾沙星的單克隆抗體與恩諾沙星半抗原結構類似物如鹽酸環丙沙星，氧氟沙星，曱磺酸達氟沙星，曱磺酸培氟沙星，鹽酸二氟沙星，諾氟沙星，洛美沙星進行竟爭試驗，將這些標準品稀釋成不同濃度進行間接竟爭ELISA，繪制抑制曲線，計算竟爭物的I"值和交叉反應率，其最高交叉反應率為1.464%。文獻中報道的恩諾沙星的單克隆抗體與環丙沙星的交叉反應率達到110.874，與沙*扭沙星的交叉反應率達到71.05%，與其它的會諾酮類藥物反應的交叉率也達到20%以上，而本發明所制備的抗恩諾沙星的單克隆抗體只與恩諾沙星反應，與其它喹諾酮類藥物反應的交叉率在1.5%以下，因此，本發明中所制備的抗恩諾沙星的單克隆抗體具有更高的特異性，具體結果見表6。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表6單克隆抗體8E6，和6A4，與其他喹諾酮類藥物的交叉反應實施例三本實施例是本發明中單克隆抗體8E6，在建立檢測恩諾沙星殘留ELISA方法的應用舉例，可以用于雞肉，水產品，牛奶及蜂蜜中恩諾沙星殘留的才企測。以雞肉(市場購買)為例，說明;險測雞肉中恩i若沙星殘留的主要步驟如下1、樣品前處理稱取15g雞肉樣品進行勻漿，稱取0.5g勻漿液，加入1.5ml80%的用樣品稀釋液稀釋的曱醇溶液，震蕩混勻30min，2000g，離心10min,耳又lOOjaL上清與90(VL樣品稀釋液混勻，取5OpL進4亍4會測。2、本發明中試劑盒的檢測原理是間接竟爭ELISA方法，將包被原OVA-ENR包被于微孔板上，加入系列稀釋的恩諾沙星標準品或者樣品，再加入抗恩諾沙星的單克隆抗體(本實施例中選取的單克隆抗體是8E6，)，樣品中殘留的恩諾沙星與包被的抗原同時與抗恩諾沙星的抗體竟爭性結合，然后加入酶標二抗，TMB顯色，顯色后在酶標^[義上讀取OD45。，樣品中恩諾沙星的含量與樣本吸光度值呈負相關，與標準曲線相比，即可得出相應殘留物恩諾沙星的含量。3、本發明中抗恩諾沙星的單克隆抗體的高特異性，使得與現有的樣品處理方法相比，大大簡化了肌肉樣品的前處理步驟，只需要80%曱醇提取后直接進行10倍稀釋即可用于檢測。由于抗體的高親和力，使得檢測的靈敏度大大提高，標準曲線范圍為0.313-10ng/ml。采用以上方法，對20份雞肉樣品進行檢測，見表7，結果表明利用恩諾沙星抗體建立的ELISA方法檢測雞肉組織中恩諾沙星的殘留，結果與高效液相色譜法測得的結果符合率達到畫。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實施例四本實施例是本發明中的單克隆抗體6A4，在制備恩諾沙星殘留的膠體金試紙條中的應用舉例，主要是應用于沖企測月幾肉(雞肉，魚肉，豬肉)、牛奶、蜂蜜中的恩諾沙星殘留。反應原理采用竟爭法對小分子藥物恩諾沙星進行半定量檢測，樣品中存在的恩諾沙星分子在沿試紙條上移過程中先與金顆粒標記的抗體蛋白結合，固定在NC膜上的包被原與恩諾沙星同時竟爭結合抗體，T線的顯色強弱與樣品中殘留恩諾沙星的含量成反比，若樣品中無恩諾沙星殘留，則金標抗體全部與包被原反應，試紙條的T線顯色。當C、T線均顯色時表示陰性，當C線顯色T線不顯色時則表示為陽性，當C線不顯色，T線顯色或不顯色都表示試紙條失效。(1)具體操作步驟如下1、樣品前處理本方法中各種樣品的處理方法同ELISA方法中的樣品前處理方法；2、將試紙條^:于干凈平整的臺面上，用滴管吸取^f寺測樣品溶液，滴加12滴于樣品墊上；3、等待紫紅色條帶的出現，靜置反應5-IO分鐘時讀取測試結果,IO分鐘以后判定無效。(2)試紙條檢測限的確定1、取試紙條平放于試驗臺上，分別用含不同濃度(O，1，2,3,4，5，6，7，8,9,10ng/ml)恩諾沙星的PBS溶液作為待測樣品液，滴加于樣品墊上，反應后5-10min判定結果，確定試紙條的-險測限為2ng/ml，對牛奶和各種肌肉的4企測限可以才艮據;險測要求進行不同的稀釋，2乘以不同的稀釋倍數即為各種樣品的檢測限。舉例如下如果樣品進行10倍稀釋，則對該樣品的4全測限為20ng/ml，含量大于20ng/ml的樣品判定為陽性，含量小于20ng/ml的樣品判定為陰性。按上述方法對20份購買于市場的不含恩諾沙星(經高效液相色譜法證實不含恩諾沙星)的牛奶樣品進行不同濃度的恩諾沙星添加試驗，然后采用膠體金試紙法與高效液相色譜法進行對比，結果表明兩種方法的符合率達到100%,檢測結果見表8。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>20陰性(C、T線均顯色)<25表8膠體金方法與高效液相色譜法檢測結果比較除上述實施例外，本發明還可以有其他實施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術方案，均落在本發明要求的保護范圍。參考文獻1、HoltzappleCK,BuckleySA,StankerLH.Productionandcharacterizationofmonoclonalantibodiesagainstsarafloxacinandcros畫reactivitystudiesofrelatedfluoroquinolones.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,1997，45:1984-1990.2、楊利國，《酶免疫測定技術》，南京大學出版社，1998.權利要求1.產生恩諾沙星單克隆抗體的雜交瘤細胞株6A4或8E6，6A4是小鼠雜交瘤細胞系CGMCCNo.3016,8E6是小鼠雜交瘤細胞系CGMCCNo.3017。2.由小鼠雜交瘤細胞抹6A4或小鼠雜交瘤細胞林8E6分泌的單克隆抗體6A4，或8E6，。3.根據權利要求2所述小鼠雜交瘤細胞抹6A4或小鼠雜交瘤細胞林8E6分泌的單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟a.制備免疫原和包被原采用碳二亞胺法將載體蛋白與恩諾沙星偶聯，合成免疫原和包被原；b.動物免疫注射以小鼠作為免疫動物，腹腔注射免疫厚與等量弗氏完全佐劑混合液，進行第一次免疫注射；3周后進行第二次免疫；再間隔2周后進行第三次免疫注射；c.篩選動物免疫血清用酶聯免疫吸附法和竟爭酶聯免疫吸附法篩選免疫鼠血清，對小鼠進行加強免疫注射；d.制備雜交瘤細胞取經過加強免疫的小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，經過3次亞克隆獲得穩定分泌抗恩諾沙星的單克隆抗體細胞抹6A4或8E6;e.制備并純化單克隆抗體用滅菌石蠟對小鼠進行免疫注射，7天后分別腹腔注射所述單克隆抗體細胞抹6A4或8E6,7-10天采集腹水，用辛酸-硫酸銨鹽析法對腹水純化，即得恩諾沙星單克隆抗體6A4，或8E6'。4.根據權利要求3所述小鼠雜交瘤細胞抹6A4或小鼠雜交瘤細胞抹8E6分泌的單克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟a中所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白和卵清白蛋白的至少一種，對應的免疫原為ENR-BSA、ENR-HAS,包^皮原為ENR-OVA;所述石友二亞胺法中，EDC和NHS活化恩諾沙星的反應時間為2小時，恩諾沙星與載體蛋白反應12小時。5.根據權利要求3所述小鼠雜交瘤細胞林6A4或小鼠雜交瘤細胞抹8E6分泌的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述步驟b中的各次免疫注射劑量是50-100|ag/只。6.根據權利要求3所述小鼠雜交瘤細胞抹6A4或小鼠雜交瘤細胞林8E6分泌的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述步驟d中，在進行細胞融合之前，將免疫鼠血清利用間接ELISA方法進行效價檢測，同時利用間接竟爭ELISA方法檢測血清對恩諾沙星的抑制效果，用沖企測后的鼠脾細月包進4亍融合。7.根據權利要求3所述小鼠雜交瘤細胞抹6A4或小鼠雜交瘤細胞抹8E6分泌的單克隆抗體的腹水制備方法，其特征在于所述步驟e中對免疫小鼠腹腔進行單克隆抗體細胞林的注射量為l-5xl(^個/只8.根據權利要求2所述小鼠雜交瘤細胞抹6A4或小鼠雜交瘤細胞抹8E6分泌的單克隆抗體，其特征在于所述抗體亞型為IgGl型。9.根據權利要求2所述小鼠雜交瘤細胞抹6A4或小鼠雜交瘤細胞抹8E6分泌的單克隆抗體在制備檢測恩諾沙星試劑中的應用。全文摘要本發明涉及恩諾沙星的特異性單克隆抗體及應用，還涉及其雜交瘤細胞株，屬于免疫化學
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。由小鼠雜交瘤細胞株6A4和8E6產生的，其制備方法是采用碳二亞胺法將恩諾沙星和載體蛋白BSA、HSA及OVA偶聯，合成人工免疫原EnR-BSA，EnR-HSA和包被原EnR-OVA；用合成的人工免疫原EnR-BSA，EnR-HSA免疫Balb/c小鼠，取其免疫小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合，用包被原EnR-OVA包被，建立間接ELISA法和間接競爭ELISA法篩選出能穩定分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株。用獲得的細胞株免疫Balb/c小鼠制備腹水，用辛酸-硫酸銨法和離子交換法純化腹水，兩細胞株純化后的抗體效價分別達1.024×10^-6和1.28×10^-5以上。該單克隆抗體特異性強，應用于制備恩諾沙星殘留檢測試劑盒和膠體金試紙條，可靈敏快速地檢測恩諾沙星殘留。文檔編號C07K16/44GK101565690SQ20091002779公開日2009年10月28日申請日期2009年5月21日優先權日2009年5月21日發明者宏唐,王曉艷申請人:泰州市蛋白質工程研究院