專利名稱：羊包蟲可溶性抗原的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗原的制備方法，尤其涉及羊包蟲可溶性抗原的制備方法以及由該制備方法所制備得到的產(chǎn)品，屬于羊包蟲基因工程疫苗領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
綿羊的棘球蚴病俗稱包蟲病(Hydatidosis，)，又被稱為棘球蚴病或囊型包蟲病 (cystic echinococcosis ；CE)。是由棘球?qū)俚募?xì)粒棘球絳蟲(俗稱羊包蟲)(Echinococcus granulosus)或多房棘球絳蟲(E. multilocularis)的幼蟲感染綿羊所引起一種人獸共患病。它是由細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus ；Eg)的續(xù)絳期幼蟲寄生在人體肝、肺等臟器引起的一種嚴(yán)重危害健康的人畜共患寄生蟲病，是中國衛(wèi)生部規(guī)劃防治的五大寄生蟲病之一。患者以兒童和青壯年居多，在人體內(nèi)生長緩慢，往往在感染后5 10年才出現(xiàn)癥狀，其主要危害為壓迫所寄生的器官、破壞周圍組織和毒性作用。一旦棘球蚴囊膜破裂， 可引起繼發(fā)性感染或休克，甚至死亡。CE呈世界性分布，主要是流行于高原和氣候寒冷的牧區(qū)和半牧區(qū)，在國外主要流行于歐洲的俄羅斯、南斯拉夫、法國、德國和英國，南美洲的阿根廷、巴西、智利，大洋洲的澳大利亞和新西蘭，亞洲的中國、蒙古、日本、印度、土耳其、土庫曼斯坦、伊拉克等國家，另外在非洲的埃及和摩洛哥等國家也有流行；在我國，細(xì)粒棘球絳蟲的危害非常嚴(yán)重，現(xiàn)已證實(shí)全國有31個(gè)省市區(qū)存在包蟲病感染病例，主要流行于西北的新疆、青海、甘肅、寧夏、西藏以及陜西、山西、河北和四川西部等省區(qū)，高發(fā)區(qū)約占到全國面積的44% (余森海，中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2008年，26 (4) =241-44)。家犬是棘球絳蟲病主要的傳染源和終宿主，平均感染率為35%。感染的家犬在排出成熟節(jié)片及大量蟲卵時(shí)，污染草地、水源、家居環(huán)境，或附著在其毛皮上，食草動(dòng)物和人均因食入蟲卵而被感染。作為中間宿主，人和10余種家畜可被感染，其中人的平均感染率為 23.0%、綿羊的平均感染率約為64%、牛55%、豬13% (衛(wèi)生部，2006-2015年全國重點(diǎn)寄生蟲病防治法規(guī)，疾控發(fā)(2006) 107號(hào)，2006，幻。據(jù)有關(guān)報(bào)道，我國有100多萬包蟲病現(xiàn)癥患者，受威脅人口約5000萬，包蟲病畜超過4000萬頭，每年發(fā)病牲畜達(dá)800多萬頭，年經(jīng)濟(jì)損失超過10億元，該病已成為西部牧區(qū)群眾因病致貧、因病返貧的主要原因。隨著現(xiàn)代社會(huì)的發(fā)展，人口流動(dòng)的增加，寵物犬和經(jīng)濟(jì)動(dòng)物狐貍的養(yǎng)殖數(shù)量日益增多，導(dǎo)致包蟲病蔓延擴(kuò)散(李文桂，中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2006,22(11) =1070-72) 0另外據(jù)近年普查，全國有25個(gè)省市區(qū)有該病的散發(fā)病例報(bào)道，2005年《全國人體重要寄生蟲病現(xiàn)狀調(diào)查》的結(jié)果可知，流行區(qū)人群的血清學(xué)陽性率為1.06% 32%，人群患病率在 0. 6 % 4. 5 %之間，綿羊的棘球蚴感染率在3. 3 % 90 %之間，家犬的成蟲感染率在7 % 71%之間，該病有從牧業(yè)區(qū)向農(nóng)業(yè)區(qū)和城市擴(kuò)散的趨勢，極大地危害著人群的身體健康和畜牧業(yè)的發(fā)展，CE已成為我國乃至世界的一種危害嚴(yán)重的寄生蟲病。細(xì)粒棘球絳蟲Eg屬于扁形動(dòng)物門、絳蟲綱、多節(jié)亞綱、圓葉目、帶科、棘球?qū)伲c多房棘球絳蟲、少節(jié)棘球絳蟲和福氏棘球絳蟲等是目前已經(jīng)被學(xué)者確認(rèn)的四種棘球絳蟲。
4它的幼蟲稱棘球蚴(hydatid cyst)，為圓型或不規(guī)則的囊狀體，由囊壁、生發(fā)囊、原頭蚴、囊砂和囊液組成，有的還有子囊和孫囊，囊壁外由宿主的纖維組織包繞。Lightowlers等發(fā)現(xiàn) Eg95是一種分子量為24. 5kDa的天然六鉤蚴抗原。其編碼基因全長7Mbp，其中462bp基因可編碼分子量為16. 5kDa的含153個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)Eg95蛋白含纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域，與免疫球蛋白超家族、細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞表面受體和糖結(jié)合蛋白有部分同源性，在Eg六鉤蚴入侵小腸絨毛上皮的過程中起重要作用。Woollard等用肽指紋圖分析發(fā)現(xiàn)Eg95抗原分子呈線形，含有4個(gè)免疫顯性區(qū)域，分別為2條20和40個(gè)氨基酸的序列肽(Peterson SN 等，Proc Natl Acad Sci USA, 1995,92(25) :11829-11833) 包蟲病的防治已經(jīng)作為衡量一個(gè)國家經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平和文明程度的重要指標(biāo)，目前我國的寄生蟲感染情況不容樂觀，只相當(dāng)于日本和韓國20世紀(jì)60年代到80年代的感染水平，與我國目前的社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展速度大不相適應(yīng)。常用的防治手段有1、健康教育和藥物與外科手術(shù)治療健康教育是預(yù)防CE的根本措施，已發(fā)CE病例的首選治療方法仍是外科手術(shù)，但對人體損傷較大；對于早期小棘球蚴或難做手術(shù)的病例可采用阿苯噠唑或甲苯咪唑等藥物進(jìn)行化療，臨床發(fā)現(xiàn)這些藥物存在嚴(yán)重的毒副作用，部分患者不能耐受，同時(shí)某些化療患者可產(chǎn)生耐藥性，而且在發(fā)展中國家效果較差，因此這就需要研究更有效的防治措施。2細(xì)粒棘球絳蟲Eg疫苗的疫苗防治近年來，分子生物學(xué)、蛋白組學(xué)、細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)等的研究突飛猛進(jìn)，尤其是分子生物學(xué)的快速發(fā)展促進(jìn)了寄生蟲免疫應(yīng)答和免疫診斷的研究，為研制理想的eg疫苗提供了新方法。細(xì)粒棘球絳蟲Eg疫苗相應(yīng)的抗原主要有特異性診斷抗原和保護(hù)性抗原，其中與診斷有關(guān)的抗原主要有天然抗原和重組抗原及合成肽，與保護(hù)性相關(guān)的抗原主要有寄生蟲免疫原和分子疫苗。用于疫苗防治的抗原主要有寄生蟲免疫原、基因工程抗原和多肽抗原等。寄生蟲免疫原主要包括原頭蚴、囊液和囊腫膜，六鉤蚴或蟲卵、成蟲或成蟲分泌物等。張文寶1999年用細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴勻漿可溶性抗原一次接種犬，孕節(jié)抑制率為 74. 1%，三次接種犬，其孕節(jié)抑制率達(dá)100%，也取得了相同的結(jié)果，這一點(diǎn)在流行病學(xué)上具有重要的意義，因?yàn)橐种屏讼x卵的產(chǎn)生也就切斷了病原的生活史(張文寶等，中國獸醫(yī)科技，1999，四(9) :23 M)。經(jīng)包蟲囊液免疫的羊用細(xì)粒棘球絳蟲卵攻擊感染時(shí)，羊的包蟲囊數(shù)明顯減少，但感染率則與對照組相似(賈世玉等，中國獸醫(yī)雜志，1994,20(11) 40-4 。曾用囊液注射和囊腫膜誘發(fā)免疫都顯示了一定的免疫效果，又用六鉤蚴接種綿羊后，用細(xì)粒棘球絳蟲幼蟲卵攻擊，結(jié)果表明免疫的綿羊都具有了堅(jiān)強(qiáng)的抵抗力(Heath DD. In" Immunology of Echinococus，，,Edited by Thompson, The Biology of Echinococcus and Hydatid Disease. George Allen & Unwi London, 1986. 164-188)。雖然六鉤蚴及排泄分泌抗原是免疫防治理想的抗原，但是其工藝化生產(chǎn)相當(dāng)困難，來源極其有限，很難在免疫防治中大規(guī)模使用。Heath用棘球絳蟲蟲體的凍干粉注射幼犬，與對照組比較后其體內(nèi)平均蟲數(shù)大為減少，說明成蟲和成蟲分泌物抗原均能使犬獲得不同程度的保護(hù)?；蚬こ炭乖饕侵富蚬こ讨亟M抗原疫苗、核酸疫苗以及多肽疫苗。Fraize M表達(dá)了 Eg幼蟲期的兩種抗原EgA31和EgTrp，試驗(yàn)證明了這兩種抗原單獨(dú)使用或混合使用都使小鼠獲得了免疫應(yīng)答(Heath，DD. Hie use of a Recombinant Antigen to immunize Sheep against Echinococcus granulosus, Procedings of the International Congress
5of Hydatidology. Beijing, 1993，10-13)。1993年首次研制成功抗細(xì)粒棘球絳蟲蟲卵感染的基因工程重組抗原疫苗，命名為Eg95，動(dòng)物試驗(yàn)使二免后的試驗(yàn)羊獲得了 95%以上的免疫保護(hù)(Lightowlers MW 等，Parasite Immunol. 1996, Sep ； 18 (9) :457-62)，它是棘球蚴病最具有發(fā)展前途的疫苗。多肽抗原是按照病原體抗原基因中已知或預(yù)測的某段抗原表位的氨基酸序列，通過化學(xué)合成技術(shù)制備的疫苗。由于多肽疫苗完全是人工合成的，不存在毒力返祖或滅活不完全的問題，特別是對一些還不能通過體外培養(yǎng)方式獲得足夠抗原量的病原體具有重要意義，多肽疫苗必將成為一種新型疫苗，在未來得到廣泛的應(yīng)用。研究表明位于棘球蚴病重組抗原疫苗Eg95的cDNA克隆5’端的9個(gè)核苷酸所編碼的多肽片段為宿主保護(hù)性抗原表位 (賈萬忠等，中國獸醫(yī)寄生蟲病[J] ,1998,6 ) :49-50)。但合成的Eg95表位的四條肽，分別與白喉類毒素(DT)偶聯(lián)成偶聯(lián)肽，加福氏佐劑后免疫小羊，后用Eg活蟲灌胃攻擊。結(jié)果表明，Eg95的4個(gè)合成肽具有免疫原性，但不能誘導(dǎo)小羊產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。細(xì)粒棘球絳蟲的傳染途徑細(xì)粒棘球絳蟲長僅1. 5 6mm由一個(gè)頭節(jié)和3個(gè)體節(jié)組成。成蟲寄生于狗的小腸內(nèi)，但狼狐、豺等野生動(dòng)物亦可為其終宿主。蟲卵呈圓形有雙層胚膜，其形態(tài)與帶絳蟲蟲卵相似，對外界抵抗力較強(qiáng)。當(dāng)蟲卵隨狗糞便排出體外，污染牧場、畜舍蔬菜、土壤和飲水，被人或羊等其他中間宿主吞食后經(jīng)胃而入十二指腸。經(jīng)消化液的作用，六鉤蚴脫殼而出鉆入腸壁，隨血循環(huán)進(jìn)入門靜脈系統(tǒng)，幼蟲大部被阻于肝臟發(fā)育成包蟲囊(棘球蚴)；部分可逸出而至肺部或經(jīng)肺而散布于全身各器官發(fā)育為包蟲囊。狗吞食含有包蟲囊的羊或其他中間宿主的內(nèi)臟后，原頭蚴進(jìn)入小腸腸壁隱窩內(nèi)發(fā)育為成蟲(約經(jīng)7 8周)而完成其生活史。 從其生活史來看，羊是最重要的中間宿主，如果能夠阻斷細(xì)粒棘球絳蟲在終宿主犬與中間宿主羊等之間的傳染環(huán)節(jié)，那么人接觸感染細(xì)粒棘球絳蟲的可能性也大大降低，這是最有效的降低人和經(jīng)濟(jì)動(dòng)物感染細(xì)粒棘球絳蟲的防治方法。由于家蠶生物反應(yīng)器和畢赤酵母生物反應(yīng)器分別具有以下優(yōu)點(diǎn)和大量的基因工程表達(dá)產(chǎn)物的成功表達(dá)實(shí)例家蠶生物反應(yīng)器與大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比具有以下有優(yōu)
點(diǎn)A 家蠶桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)效率高是區(qū)別于其它真核表達(dá)系統(tǒng)的明顯特征，據(jù)報(bào)道，在感染細(xì)胞中重組蛋白的表達(dá)水平最高可達(dá)到細(xì)胞總蛋白的50%。而且它表達(dá)產(chǎn)物具有很高的生物活性和可溶性，其抗原性、免疫原性均與天然蛋白相似。B 家蠶桿狀病毒能容納較大的外源基因而不影響其本身的增殖。桿狀的衣殼與較大的基因組(約1301Λ)可容納較大片段的DNA插入(約101Λ)，因此可同時(shí)插入多個(gè)外源基因，可形成病毒樣顆粒(virus-like particle ;VLP)，提高疫苗的免疫活性。C 應(yīng)用晚晚期多角體蛋白基因啟動(dòng)子表達(dá)外源基因，即使重組基因產(chǎn)物對細(xì)胞有毒性，也不影響表達(dá)水平。D 借多元表達(dá)載體或借幾個(gè)不同重組病毒共感染，可以同時(shí)表達(dá)2個(gè)或更多個(gè)外源蛋白，研究肽鏈超分子裝配以及蛋白寡聚體的結(jié)構(gòu)與功能。E 桿狀病毒對脊椎動(dòng)物無病原性，家蠶沒有與人畜共患的疾病，被認(rèn)為遺傳學(xué)上是安全的表達(dá)載體。
動(dòng)物疾病的免疫疫苗和治療藥物的研究和開發(fā)隨著家蠶生物反應(yīng)器的成熟也越來越受到重視。如口蹄疫病毒的空衣殼表達(dá)、狂犬病的N、P、N-P的聯(lián)合表達(dá)均已獲得了我國農(nóng)業(yè)部遺傳工程安全生產(chǎn)委員會(huì)頒發(fā)的商品化生產(chǎn)許可證。1997年，田鄂等(生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1997，29 (1) 33-38)在家蠶細(xì)胞和幼蟲中成功表達(dá)了日本血吸蟲中國大陸株^KD谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因，在家蠶培養(yǎng)細(xì)胞 (IO6個(gè)/mL)中的表達(dá)產(chǎn)量為0. 77mg，在家蠶幼蟲中則超過5mg/條蠶。日本國家動(dòng)物衛(wèi)生研究所的研究人員利用家蠶表達(dá)體系對豬的細(xì)胞因子，包括IL 系列、GM-CSF、TNF及其受體、Caspase等進(jìn)行了系統(tǒng)深入的基礎(chǔ)和開發(fā)研究，用BmNPV體系生產(chǎn)的寵物(貓和狗)的預(yù)防重組IL制劑(Intercat)最近已由日本“T0RAY”株式會(huì)社生產(chǎn)并投入市場(木村滋，昆蟲生物工廠[M]，日本工業(yè)調(diào)查會(huì)，2000，124-127)。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(diǎn)高表達(dá)量由于醇氧化酶基因啟動(dòng)子是強(qiáng)啟動(dòng)子，細(xì)胞生長速度很快，所以該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白產(chǎn)量很高；高穩(wěn)定性外源基因通過質(zhì)粒整合到基因組上，基因工程菌株遺傳穩(wěn)定性好；胞內(nèi)表達(dá)蛋白的分選和區(qū)域化，增加了表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，減少表達(dá)產(chǎn)物對宿主菌的毒害作用；高分泌釀酒酵母中一些分泌信號(hào)和先導(dǎo)序列(如α因子)的分子生物學(xué)特性已經(jīng)研究的十分清楚，可用于巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，加之它自身的生物學(xué)特性，其分泌表達(dá)可達(dá)10g/L，這在已知的分泌表達(dá)系統(tǒng)中十分少見；易放大巴斯德畢赤酵母容易適應(yīng)重組蛋白的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，重組蛋白在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)已在1000L發(fā)酵罐中實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；具有生物活性 作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可對表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工與修飾，從而使表達(dá)出的蛋白具有生物活性；便于純化表達(dá)的外源蛋白可分泌到胞外，分泌的內(nèi)源蛋白少，外源蛋白分離純化簡便；糖基化程度低P. pastoris不產(chǎn)生過度的糖基化，且糖基化位點(diǎn)與哺乳類細(xì)胞的相同，其所分泌的糖蛋白的免疫原性較低，更利于臨床應(yīng)用。成本較低該酵母菌營養(yǎng)要求低、生長快、培養(yǎng)基廉價(jià)，易于進(jìn)行操作和培養(yǎng)；其高密度發(fā)酵技術(shù)業(yè)已成熟，便于工業(yè)化生產(chǎn)。近年來，已有300多種外源蛋白在該系統(tǒng)中得到表達(dá)，如乙肝疫苗及一些來自動(dòng)植物和微生物的各種酶、膜受體蛋白、抗原和抗體及一些用來研究晶體結(jié)構(gòu)的蛋白等。雖然羊包蟲對阿笨達(dá)唑和甲苯咪唑等的苯并咪唑類化合物敏感，但是對于動(dòng)物來說長期給藥無疑在勞力和經(jīng)濟(jì)效益上都是不合算的，此外大量的無主犬或其它犬科野生動(dòng)物的感染和傳播，很難從根本上防止羊的感染，因此迫切需要能有一種長期有效的疫苗能防治中間宿主羊，以阻斷羊包蟲的生活史循環(huán)，達(dá)到防治的目的。大量的研究證明源自于羊包蟲(E. granulosus)的Eg95基因是目前為止研發(fā)的最有效的防止綿羊羊包蟲的抗原組分，為了改善Eg95的表達(dá)性能，它和源自日本血吸蟲的具有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活力的蛋白抗原進(jìn)行聯(lián)合表達(dá)，以期待改善其表達(dá)量與表達(dá)產(chǎn)物的可信性，然而即使如此sj-GST-eg95的表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌中絕大部分仍以不可溶的包涵體形式存在。在制備疫苗時(shí)，仍需要用高濃度尿素溶解，這不僅由于重復(fù)的變性復(fù)性， 不僅導(dǎo)致其抗原性降低而且也大大增加了抗原的生產(chǎn)成本。為了提高其免疫源性還需要用 Quil-A作為佐劑，因此，每劑疫苗需要高達(dá)50 μ g的抗原量，導(dǎo)致生產(chǎn)成本居高不下，極大地限制了其推廣應(yīng)用(Lightowlers，Parasitology, 2006，S27-S42)，此外，GST 雖然是一個(gè)很好的免疫佐劑，本身也有很好的增加免疫效果(Scott JC,Parasitol. Int. ,2000,49(4)
7289-300)，但是源自于日本血吸蟲的GST對羊包蟲的疫苗效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及源自于羊包蟲自身的 GST。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種羊包蟲可溶性抗原的制備方法，該制備方法采用真核生物表達(dá)系統(tǒng)，在昆蟲體內(nèi)或畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行安全、高效、分泌型的表達(dá)羊包蟲可溶性的抗原或融合抗原。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種制備羊包蟲可溶性抗原的方法，包括將SEQ ID NO =USEQ ID NO :3或SEQ ID NO 5所示的基因在昆蟲生物反應(yīng)器或畢赤酵母生物反應(yīng)器中進(jìn)行表達(dá)；收集、純化所表達(dá)的抗原，即得。優(yōu)選的，一種制備羊包蟲可溶性抗原的方法，包括⑴將SEQ IDNO =USEQ ID NO 3或SEQ ID NO :5所示的基因分別克隆到桿狀病毒運(yùn)載載體中，獲得轉(zhuǎn)移載體；(2)用所獲得的轉(zhuǎn)移載體DNA與桿狀病毒基因組DNA共轉(zhuǎn)染進(jìn)昆蟲細(xì)胞，進(jìn)行DNA同源重組，經(jīng)過重組病毒篩選、克隆純化獲得重組桿狀病毒；C3)用重組桿狀病毒感染昆蟲宿主和細(xì)胞；培養(yǎng)被感染的昆蟲宿主；收獲并純化所表達(dá)的抗原，即得。其中，所述的桿狀病毒運(yùn)載載體的所用表達(dá)盒的啟動(dòng)子為多角體蛋白，plO，ie-1 等及與增強(qiáng)子組合，優(yōu)選自 pBm034，pBm93, BacPAK6, Bac to Pac, Bacmid, pVL1391, ρVL 1392，ρVL 1393，pVL941, ρVL 945，ρVL 985，ρVTBac, pBm030, pUAC-5 或其它類似的桿狀病毒同源重組或轉(zhuǎn)座載體，更優(yōu)選為pBm93。所述的桿狀病毒優(yōu)選自BmNPV、AcMNPV, ApNPV,、HaNPV, HzNPV, LdMNPV, MbMNPV, OpMNPV, SIMNPV, SeMNPV 或 SpltNPV ；更優(yōu)選為家蠶桿狀病毒 Bm-NPV_ZJ8 ；所述的重組桿狀病毒優(yōu)選為以下任意一種(1)用于表達(dá)SEQ ID NO :1基因(羊包蟲eg95抗原蛋白)的重組家蠶核型多角體病毒rBmNPV(eg95)，其微生物保藏號(hào)是CGMCC No. 3981 ；分類命名是家蠶核型多角體病毒(Bombyx Mori Nucleopolyhedrovirus)；保藏時(shí)間是2010年7月2日；保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心； 保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所。(2)用于表達(dá) SEQ ID N0:3基因(eg-95和來自于日本血吸蟲的sj-GST (谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)融合的融合蛋白)的重組家蠶核型多角體病毒rBmNPV(Sj-GST-eg%)；其微生物保藏號(hào)是CGMCC No. 3959 ；分類命名是家蠶核型多角體病毒(Bombyx Mori Nucleopolyhedrovirus)；保藏時(shí)間是2010年7月2日；保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心； 保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所。(3)用于表達(dá) SEQ ID NO 5基因(eg-95和來自于羊包蟲本身的eg-GST (谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)融合的融合蛋白)的重組家蠶核型多角體病毒rBmNPV(eg-GST-eg%)；其微生物保藏號(hào)是CGMCC No. 3960 ；分類命名是家蠶核型多角體病毒(Bombyx Mori Nucleopolyhedrovirus)；保藏時(shí)間是2010年7月2日；保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心； 保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所。所述的昆蟲宿主選自包括家蠶(Bombyx mori)、野蠶(Bombyx mandarina)、蓖麻蠶 (Philosamia cynthia ricim)(Dictyoploca japanica)(Philosamia cynthia
8pryeri)、昨香(Antheraea pernyi)、曰本昨香(Antheraea yamamai)、野天香(Antheraea polyphymus)、苜猜尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropis obliqua)、甘蘭夜蛾(Mamestra brassicae)、斜紋夜蛾(Spodoptera littoralis)、秋粘蟲(Spodoptera frugiperda)、粉紋夜娥(Trichoplusia ni)、tf 軍蟲(Thaumetopoea wilkinsoni)、豐帛鈴蟲 (Heliothis armigera)、美國棉鈴蟲(Heliothis zea)、煙青蟲(Heliothis assulta)、煙草夜蛾(Heliothis virescens)、東方粘蟲(Pseudaletia separata)、舞毒蛾(Lymantria dispar)等；更優(yōu)選為家蠶(Bombyx mori)。所述的感染是指重組桿狀病毒通過吞食或透過表皮來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹體；更優(yōu)選為將重組家蠶桿狀病毒感染家蠶細(xì)胞或穿刺接種5齡起蠶的家蠶幼蟲或蛹， 在感染3-6天后收集含各種羊包蟲抗原的家蠶幼蟲或蛹的體液或組織勻漿；其中，所述的蛹體為1-2天的早期嫩蛹。本發(fā)明采用基因重組技術(shù)，將來源于羊包蟲的不同抗原基因組合包括SEQID NO l(eg95)、SEQ ID NO :3 (s j_GST_eg95)或 SEQ ID NO :5 (eg-GST_eg95)構(gòu)建到各種由啟動(dòng)子為多角體蛋白，Pl0，ie-1等及與增強(qiáng)子組合所驅(qū)動(dòng)的桿狀病毒表達(dá)所用表達(dá)盒的桿狀病毒表達(dá)轉(zhuǎn)移運(yùn)載載體(如選自 pBm034，pBm93，BacPAK6，Bac to Pac, Bacmid, pVL1391, pVL 1392, pVL 1393, pVL941, pVL 945, pVL 985, pVTBac, pBm030, pUAC-5)上，使羊包蟲不同的抗原基因組合在多角體啟動(dòng)子、PlO啟動(dòng)子或別的病毒和真核生物的強(qiáng)啟動(dòng)子控制之下，通過體內(nèi)或體外(in vivo/in vitro)重組，將羊包蟲抗原不同的基因組合通過同源重組或轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)整合到桿狀病毒的基因組上，通過多輪的篩選和純化，得到重組病毒。重組病毒可通過經(jīng)口食下或采用各種手段透過表皮感染1-5齡(最優(yōu)時(shí)間為四或五齡起蠶)的昆蟲幼蟲或蛹體(最優(yōu)時(shí)間為1-2天的早期嫩蛹)，表達(dá)生產(chǎn)各種狂犬病病毒抗原。本發(fā)明中最優(yōu)選的一個(gè)技術(shù)方案是將SEQ ID NO :l(eg95)、SEQ IDNO 3(sj-GST-eg95)或SEQ ID NO :5 (eg-GST_eg95)所示的基因插入到運(yùn)載載體pBm93上， 為了在真核生物昆蟲中得到可溶性的高效表達(dá)，避免昆蟲自身的蛋白酶降解表達(dá)的融合抗原蛋白，上述 SEQ ID NO :5(eg-GST-eg95)或 SEQID NO :3 (sj-GST_eg95)所示的基因序列中，將在大腸桿菌中表達(dá)的 pGEX (Lightowlers MW 等，Parasite Immunol. 1996 Sep ； 18(9) :457-62)系列載體中的蛋白酶酶切位點(diǎn)通過融合PCR的方法將之去除，再通過體內(nèi)重組將 SEQID NO :l(eg95)、SEQ ID NO :3 (s j_GST_eg95)或 SEQ ID NO :5 (eg-GST_eg95) 所示的基因分別通過同源重組轉(zhuǎn)移到家蠶桿狀病毒親本株Bm-NPV-ZJS的基因組上，敲除掉基因組上的Polyhedrin基因，通過反復(fù)多輪的空斑篩選技術(shù)和PCR檢測技術(shù)確證重組病毒的正確性，獲得攜帶羊包蟲不同基因組合的重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(eg95)、 rBmNPV(eg-GST-eg95)、rBmNPV (s j-GST-eg95)。將其感染家蠶細(xì)胞系或穿刺接種1_5齡的家蠶幼蟲或蛹，大量繁殖 rBmNPV (eg95)、rBmNPV (eg-GST_eg95)、rBmNPV (s j_GST_eg95)。當(dāng) rBmNPV (eg95)、rBmNPV (eg-GST_eg95)、rBmNPV (s j_GST_eg95)在蠶體內(nèi)開始復(fù)制后，在多角體蛋白基因(Polh)啟動(dòng)子控制下eg95、Sj-GST-eg95、eg-GST-eg95等開始大量表達(dá)，產(chǎn)生相應(yīng)的羊包蟲抗原蛋白，由于發(fā)現(xiàn)上述重組病毒在昆蟲體內(nèi)的脂肪體內(nèi)優(yōu)先表達(dá)，當(dāng)大量病毒復(fù)制和羊包蟲抗原蛋白表達(dá)后，脂肪體組織和細(xì)胞破裂，抗原蛋白隨之釋放到昆蟲的體液中，加之eg95、sj-GST-eg95、eg-GST-eg95這些基因中沒有與膜能結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，因此所得到的蛋白質(zhì)均為可溶性的抗原蛋白。在感染3-6天(最佳為5天，25度飼養(yǎng)溫度)后
9收集含羊包蟲抗原的家蠶幼蟲或蛹的體液(或整體勻漿)，每毫升蠶血淋巴可產(chǎn)生2毫克以上的相應(yīng)的羊包蟲抗原，殺滅感染性昆蟲病毒和其它可能的微生物后，上述抗原蛋白經(jīng)過純化后便得到安全、高效、可溶性的羊包蟲抗原，此種家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)的可溶性抗原經(jīng)可用于制備預(yù)防羊包蟲的疫苗。另外一種制備羊包蟲可溶性抗原的方法，包括⑴將SEQ ID NO =USEQ ID NO 3 或SEQ ID NO :5所示的基因分別克隆到畢赤酵母表達(dá)載體中，獲得表達(dá)質(zhì)粒；(2)先將所獲得的表達(dá)質(zhì)粒DNA進(jìn)行線性化，轉(zhuǎn)化酵母的感受態(tài)細(xì)胞，在酵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行DNA同源重組進(jìn)行雙交換，獲得大量的重組酵母，篩選得到最高表達(dá)的重組酵母；( 將所獲得的重組酵母進(jìn)行發(fā)酵(經(jīng)過高密度發(fā)酵技術(shù)，相應(yīng)的羊包蟲抗原蛋白在信號(hào)肽的引導(dǎo)下，分泌到酵母細(xì)胞外)收獲發(fā)酵的上清液，純化即得所表達(dá)和分泌的可溶性羊包蟲抗原。其中，步驟(1)中所述的畢赤酵母表達(dá)載體優(yōu)選為分泌型畢赤酵母表達(dá)載體， 例如。可選自pPIC9、pPIC9K、pHIL-Slp、YAM7SP6或pGAP^i等分泌型表達(dá)載體，更優(yōu)先是 pPIC9 ；所獲得的表達(dá)質(zhì)粒優(yōu)選為 pPIC9 (si-GST-eg95)、pPIC9 (eg-GST_eg95)或 pPIC9(eg95)；步驟O)中所述的重組酵母優(yōu)選為以下任意一種(1)用于表達(dá)SEQ IDNO 1基因(羊包蟲eg95抗原蛋白)的重組酵母PC(eg95)，其微生物保藏號(hào)是CGMCC No. 3976 ； 分類命名是巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)；保藏時(shí)間是2010年7月2日；保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所。(2)用于表達(dá)SEQ ID NO :3基因的重組酵母PC(Si-GST-eg%)，其微生物保藏號(hào)是CGMCC No. 3978 ；分類命名是巴斯德畢赤酵母 (Pichia pastoris)；保藏時(shí)間是2010年7月2日；保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所。(3)用于表達(dá)SEQ ID N0:5基因的重組酵母PC(eg-GST-eg95)，其微生物保藏號(hào)是CGMCC No. 3977 ；分類命名是巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)；保藏時(shí)間是2010 年7月2日；保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址是 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所。上述方法中一個(gè)整體最優(yōu)選的一個(gè)技術(shù)方案是將SEQ ID NO=U SEQ IDNO 3 或SEQ ID NO :5所示的基因分別插入到畢赤酵母的分泌型表達(dá)載體pPIC9中，分別得到表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9(eg95)、pPIC9(sj-GST-eg95)和 pPIC9 (eg-GST_eg95)；為了在真核生物畢赤酵母中得到可溶性的高效表達(dá)，避免宿主畢赤酵母的蛋白酶降解表達(dá)的融合抗原蛋白，上述SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :3或SEQID NO :5所示的基因中，將在大腸桿菌中表達(dá)的 pGEX(Lightowlers MW 等，Parasite Immunol. 1996 Sep ； 18 (9) :457-62)系列載體中的蛋白酶酶切位點(diǎn)通過融合PCR的方法將之去除。將表達(dá)質(zhì)粒pPIC9(eg-GST-eg95)、 pPIC9(si-GST-eg95)或pPIC9 (eg95) DNA分別用限制性內(nèi)切酶Bgl II酶切進(jìn)行線性化處理，證明其酶切完全后，用于電轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。在畢赤酵母細(xì)胞體內(nèi)，線性化的表達(dá)質(zhì)粒的DNA，通過體內(nèi)同源重組的雙交換或單交換將全長的si-GST-eg95、eg-GST-eg95或eg95基因分別整合到酵母的基因組中，導(dǎo)致畢赤酵母基因組內(nèi)AOXl基因被表達(dá)單元所替換，整合到強(qiáng)啟動(dòng)子PAOXl下游，得分泌性表達(dá)重組畢赤酵母pC(eg-GST-eg%)和pC (si-GST-eg%)或pC(eg%)，以獲得高效表達(dá)；用
10PCR的方法鑒定出大量重組子；利用甲醇大批量誘導(dǎo)重組的畢赤酵母以在酵母培養(yǎng)基中檢測表達(dá)目的蛋白Si-GST-eg95、Eg-GST-eg95或eg95，將表達(dá)后的菌液進(jìn)行離心，取上清液用于ELISA檢測。以原核表達(dá)得到的融合蛋白免疫家兔之后得到的兔血清抗體作為第一抗體，以HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體為第二抗體，以包被液作為空白對照，以未轉(zhuǎn)重組質(zhì)粒但經(jīng)過同樣誘導(dǎo)的酵母作為陰性對照，各通過篩選1000個(gè)以上的重組子，獲得高表達(dá)、高分泌型的畢赤酵母重組子，在發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵，得到可溶性的羊包蟲的融合抗原，經(jīng)初步純化，可用于制備羊包蟲抗體。本發(fā)明方法在家蠶生物反應(yīng)器和畢赤酵母生物反應(yīng)器中生產(chǎn)可溶性的羊包蟲抗原，表達(dá)量是同體積的大腸桿菌生產(chǎn)量的10-100倍，同時(shí)改進(jìn)了融合抗原的基因結(jié)構(gòu)，使得其抗原性得到了極大的提高，加之生產(chǎn)的抗原均為可溶性的，生產(chǎn)中不需要經(jīng)過高濃度的尿素變性和隨之的復(fù)性過程，佐劑也不需要用進(jìn)口的專用佐劑Quil-A，這樣抗原的生產(chǎn)和疫苗制備的加工成本得到了極大的下降。由于家蠶已經(jīng)被我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)為食藥兼用昆蟲，所以將本發(fā)明方法所制備的抗原純化后，安全性極高，可直接制作疫苗免疫動(dòng)物。總體而言，本發(fā)明方法采用家蠶生物反應(yīng)器或畢赤酵母生物反應(yīng)器制備羊包蟲抗原，其產(chǎn)物是可溶性的，免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)證明其抗原性良好，單位表達(dá)量分別比大腸桿菌的量要高10-100倍，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明其具有很好的減蟲效率。本發(fā)明方法可以大幅度降低羊包蟲抗原的生產(chǎn)成本，簡化了以前用大腸桿菌生產(chǎn)抗原的純化過程，具有安全、高效、成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)。


圖1蠶表達(dá)基因工程羊包蟲抗原sj-GST-eg95蛋白的Western檢測。圖2蠶表達(dá)基因工程羊包蟲抗原eg-GST-eg95蛋白的Wfestern檢測。圖3蠶表達(dá)基因工程羊包蟲EG95抗原表達(dá)時(shí)相的Western檢測。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1羊包蟲Sj-GST_eg95抗原基因(SEQ ID NO 3)在家蠶生物反應(yīng)器中的可溶性表達(dá)及免疫實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)方法1. 1.有關(guān)溶液和培養(yǎng)基的配置溶液I :50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl (ρΗ8· 0)，10mmol/L EDTA。溶液II :0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS(現(xiàn)配現(xiàn)用)。溶液III IOOmL 體系，5mol/L 醋酸鉀 80mL，冰乙酸 12mL，ddH208mL。TAE (50 X) :242gTris 堿，57. ImL 冰乙酸，IOOmL 0. 5mol/LEDTA (pH8. 0)，無菌水定容至 1000mL。TER 溶液胰 RNAse(RNAse Α)溶解于 IOmM Tris-HCl U 5mMNaCl 中，配成 10mg/mL的儲(chǔ)存液_20°C凍存，再用1 XTE buf稀釋成20 μ g/mL的工作液4°C保存。PPt Buffer 異丙醇 22mL ;5mol/mL KAc ImL ；ddw 2mL。PEG溶液稱取一定質(zhì)量的NaCl，配成1. 6M的鹽溶液，加入一定量的PEG，使其終濃度為13%。6mol/L NaI 將 0. 75g Na2SO3溶于 40mL ddH20 中，加入 45gNaI 并攪拌至完全溶解， 4°C儲(chǔ)存。玻璃奶(Glassmilk)將IOg(100mg/mL, Sigma S-5631)的 Silica 溶于 IOOmL PB 中，沉淀2h，棄上清，重復(fù)該步驟2 3次；2000g離心2min，將沉淀物溶于3mol/L的NaI 中，終濃度為100mg/mL，4°C下避光保存。New Wash 洗液Tris_HCl (pH 7. 4)20mmol/L ；EDTA lmmol/L ；NaC1100mmol/L ；與等體積的無水乙醇配制而成。LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，調(diào)整pH值到7. 0 (固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂)。蛋白上樣緩沖液QX) :100mmol/L Tris-HCl (pH6. 8)、200mmol/L 二硫蘇糖醇 (DTT)、4% SDS,0. 2%溴酚藍(lán)、10%甘油。30%丙烯酰胺溶液^g 丙烯酰胺，IgN, N'-亞甲叉丙烯酰胺，溶于IOOmL水，過
濾ο考馬斯亮藍(lán)染液0. 24g考馬斯亮藍(lán)R250溶于90mL甲醇水(1 l,v/v)和IOmL 冰乙酸中。脫色液10%冰乙酸。1. 2. Eg95 (Echinococcus granulosus)基因組 DNA 的提取(朱衡等，真菌學(xué)報(bào)， 1994，13(1) :34-40.)離心收集患有包蟲病的動(dòng)物的包囊中的包蟲，盡量吸干水分，每克菌體材料加入 5mL提取液(IOOmMTris/HCL，pH9. 0 ；40mMEDTA, pH8. 0)，振蕩使之與菌體充分混均，再加入 ImLlO% SDS、3mL氯化芐，劇烈振蕩，使管內(nèi)混合物呈乳狀。在50°C保溫lh，每隔IOmin振蕩一次。然后加入3mL3MNaAc(pH5. 2)混均，冰水浴15min，6000rpm 4°C離心15min，取上清，加入等體積異丙醇室溫沉淀20min，有絮狀沉淀出現(xiàn)。IOOOOrpm室溫離心15min，沉淀用 70%乙醇洗一次，吹干后溶于適量的TE。1. 3TRIzol 法提取 RNA(1)將樣品組織放入盛有Trizol (50 IOOmg組織/ImL)的玻璃勻漿器中勻漿，組織體積不要超過iTrizol體積的10%。(2)將勻漿液在室溫下放置5min以使核蛋白質(zhì)復(fù)合體完全裂解。(3)加入氯仿(0. 2mL/lmlLTrizol)，蓋緊管蓋并漩渦劇烈震蕩15sec ；室溫放置 2 15min。(4)4°C,12000g離心15min。隨著離心，混合液被分為三相處于下層的淺紅色酚-氯仿有機(jī)相、間相和上層無色水相。RNA存留在水相中，而DNA和蛋白質(zhì)則存留于間相和有機(jī)相中，水相體積約為用于勻漿的iTrizol體積的60%。(5)將水相移入新管，加異丙醇(0. 5mL/lmLTrizol)；室溫放置5 lOmin。(6) 4 25°C，12000g離心8min。RNA沉淀(離心前通?？床坏?在管壁或管底形
12成膠狀的或白色的小球。(7)棄上清，用lmL75%乙醇清洗RNA沉淀；然后4 25°C，7500g離心5min。(8)棄上清，干燥；沉淀重溶于30 U LDEPC處理的雙蒸水(ddH20)或去離子甲酰胺 中。_70°C保存?zhèn)溆?。若沉淀難溶，可用吸管吹打數(shù)次并55 60°C溫育10 15min。1.4引物的設(shè)計(jì)與合成參考已發(fā)表文獻(xiàn)中的引物，并結(jié)合國內(nèi)外已發(fā)表和登陸GenBank中的青海羊源的 EG95 基因EG95-QH-1、EG95-QH-2 和 EG95-QH-3，總稱為 EG95-QH 序列(GenBank 上的登錄 號(hào)為AY421716、AY421717和AY421718)，設(shè)計(jì)合成下列的引物來擴(kuò)增Eg95全基因序列，弓丨 物設(shè)計(jì)如下上游弓I物 1:5' -ggaattcatggcattccagttatgtctcat-3 ‘(弓IAEcoR I 酶切位 占)下游弓丨物 2:5' -gctgcagatccacaatgagaggtcataca-3‘(弓丨入 Pst I 酶切位點(diǎn))根據(jù)克隆的EG95全基因序列分析，已得到的外顯子以及Eg95基因的特性和序列 的保守性，設(shè)計(jì)如下引物來擴(kuò)增該基因的開放閱讀框(ORF)，引物的序列如下上游弓丨物 3(F) :5' -ggaattcatggcattccagttatgtctcat-3‘；下游引物 4(R) 5' -ggaattctcaagtaaggacaaccactatgc-3‘(上、下游引物都弓丨 入EcoR I的酶切位點(diǎn))。1.5Eg95基因擴(kuò)增的PCR反應(yīng)50 U L反應(yīng)體系PCR反應(yīng)程序10XPCR 緩沖液5ii L95°C 預(yù)變性 5mindNTP (IOmM) 1 U L95°C40sec模板DNA :0.5 ii L58°CImin引物 K20pmol/ii L) :0. 5ii L 72°CImin引物2Q0pmol/iiL) :0. 5iiL 以上三步為一個(gè)循環(huán)，循環(huán)30次Taq 酶1 ii L72°C延伸 IOminddH20 補(bǔ)充至 50 ii L1. 6RT-PCR 反應(yīng)LcDNA第一鏈合成(1)取 2iiLRNA(< 1 ii g)+2 ii LOligod (T)2tlV (0. 5 ii g)+13. 75 ii LDEPC 處理水； 70°C，5min,迅速置冰上5min。(2)力口入 5ii L5XM-MLV buffer+1. 25 u LlOmM dNIPs+l ii LM-MLV-RT Q00U)，使終 體積為25 u L0(3)混勻后室溫放置IOmin。(4)42°〇反應(yīng)111。(5) 70 "C 2min 滅活 RTase，-20 "C 保存?zhèn)溆谩?. PCR 反應(yīng)50 U L反應(yīng)體系PCR反應(yīng)程序10XPCR 緩沖液 5 ii L95°C 預(yù)變性 5mindNTP (IOmM) 1 U L95°C40sec
模板cDNA:lyL58°CImin引物 3θ0ρπιο1/μ L) 1 μ L 72°C50sec引物Μ20ρπιΟ1/μυ :lyL 以上三步為一個(gè)循環(huán)，循環(huán)30次Taq 酶IyL72°C延伸 IOminddH20 40 μ LPCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5. 0 μ L反應(yīng)產(chǎn)物用1. 0%的TAE瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠中含有0. 5μ g/mL的溴化乙錠，電泳緩沖液為1XTAE，80-100V，大約10 20min于紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察片段大小，與標(biāo)準(zhǔn)的DNA Marker比較，進(jìn)行分析。1.7玻璃奶純化回收DNA片段(I)PCR產(chǎn)物用普通凝膠進(jìn)行電泳后，切下所需目的大小的DNA條帶，放入 Eppendorf管中后稱重；(2)加入3倍體積(v/w)的6mol/LNaI溶液，65°C下使凝膠充分溶解；(3)再加入10 μ L玻璃奶吸附DNA，混勻后室溫下放置5min ； IOOOOrpm稍離心，達(dá)到轉(zhuǎn)速即可，去上清；(4)沉淀用New Wash洗液洗滌三次，IOOOOrpm重復(fù)離心，前兩次達(dá)到轉(zhuǎn)速即可，最后一次離心2min，37°C晾干；(5)用IOyLO. IXTE Buffer溶解DNA，離心后取上清，將DNA保存于_20°C備用。 凝膠電泳檢測回收效果。1. 8PCR產(chǎn)物與克隆載體pGEM-T Easy的連接連接體系如下pGEM-T Easy0. 5 μ LpGEM-T Easy 緩沖液 IyL目的 DNA3. 5μ LddH205. 0 μ L混勻后，16°C連接過夜，連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化DH10B。1.9連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的小量制備(1)-20°C凍藏的DHlOB甘油菌在LB平板上復(fù)蘇；( 用滅菌牙簽挑取單菌落，放入4mL LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，取100 μ L 過夜培養(yǎng)物接種到另一 4mL LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2 2. 5h，使OD值在0. 6左右；(3) 5，OOOg離心4min收集菌體，將菌體重懸于800 μ L75mmol/L冷CaCl2中，冰浴 30min,；(4) 5，OOOg離心％iin，棄上清，加入200 μ L75mmol/L冷CaCl2,輕輕敲打管壁，使混合均勻，冰上放池后用于轉(zhuǎn)化。感受態(tài)細(xì)胞的大量制備(1)-70°C凍藏的DHlOB甘油菌在LB平板上復(fù)蘇；(2)挑取單菌落(直徑約2 3mm)，放入4mL LB培養(yǎng)基中(不含Amp)，另外挑一個(gè)放入加有Amp的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)他；在前者生長后者不生張說明沒有污染。 前者取ImL接種IOOmL新鮮的LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)2 池；
(3)培養(yǎng)物收集在滅菌的離心管中，5，000r/min 4°C離心5min，將菌體重懸于 20 30mL 75mmol/L的預(yù)冷CaCl2溶液中，冰浴30min ；(4)5，00017/11^11低溫離心51^11，棄上清，加入 IOmL 含 10 % 甘油的 75mmol/L 冷 CaCl2溶液，輕輕敲打管壁，使混合均勻，冰上放3 4h后分裝小管，_70°C凍存。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化(1)質(zhì)粒DNA20 IOOng或連接混合物5 μ L加到100 μ L上述制備的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min ；(2)進(jìn)行熱休克(42°C保溫anin)，迅速置冰上1 2min，加入ImL已溫育至37°C 的LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)lh，(3)稍離心，去部分上清后重懸沉淀，涂布于數(shù)個(gè)含相應(yīng)抗生素的LB平板上。370C 倒置培養(yǎng)過夜。1.10重組質(zhì)粒的鑒定細(xì)胞破碎法快速鑒定重組后的質(zhì)粒與原來的質(zhì)粒分子量有一定差別時(shí)可用此法檢出重組子(Beuken, et al.，1998)。(1)分別挑取多個(gè)單菌落轉(zhuǎn)化子接種于4mL含80 μ g/mLAmp的LB培養(yǎng)基中，37°C 振蕩培養(yǎng)過夜；(2)取300 500 μ L菌液于Eppendorf管中，12，OOOg離心lOsec，棄上清，加入 30yL緩沖液(6%蔗糖，0. 溴酚藍(lán))，再加入20yL酚/氯仿(1 1)，充分振蕩將菌體彈起；(3) 12，OOOg離心5min，取上清上樣電泳，觀察結(jié)果。重組質(zhì)粒的進(jìn)一步酶切鑒定(1)質(zhì)粒DNA的提取A.取上面快速鑒定后，顯示一定差別的質(zhì)粒對應(yīng)的菌液1.5mL于Eppendorf管內(nèi)， 5，OOOg離心5min收集菌體，棄上清；B.用150 μ LSol I懸浮沉淀，冰上放置5min ；C.加300 μ LSol II和50 μ L氯仿，輕輕倒轉(zhuǎn)混勻后冰浴5min ；D.加 450 μ LSolIII，劇烈混勻后冰浴 5-lOmin ；E. 4°C 12，00(^離心101^11，取上清，加45(^1^異丙醇，混勻后于-201放置20111士11 ；F. 12，OOOg 離心 IOmin,棄上清，沉淀溶于 250 μ LTER(含 20 μ g/mLRNaseA 的 TE) 中，37°C消化 20min ；加入 350 μ LPPt 沉淀 Buffer，混勻后置 4°C 20min ；G. 12，OOOg離心lOmin，棄上清，70 %乙醇洗一次，真空干燥沉淀，用 40 μ LO. IXTE (ρΗ8. 0)溶解，_20°C保存?zhèn)溆谩?2)重組質(zhì)粒的酶切鑒定后本發(fā)明選用的是pGEM-T Easy克隆載體，該載體最大的優(yōu)點(diǎn)之一就是在多克隆位點(diǎn)的兩端都有一個(gè)EcoR I的酶切位點(diǎn)，因此用EcoR I進(jìn)行單酶切后，即可進(jìn)行鑒定。鑒定體系如下IOXBuffer H 1. 5μ L 重組質(zhì)粒 2. O μ LEcoRI0. 5μ L ddH20 IlyL37°C酶切1 2h，加Marker作為參考標(biāo)準(zhǔn)，用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。
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1. 11重組質(zhì)粒的測序鑒定以及分析將鑒定為陽性克隆(全長基因和ORF片段分別命名為pGEM-T Easy/Eg95和pGEM_T Easy/eg95)加入含有Amp的LB培養(yǎng)液，220r/min搖培過夜后后，吸取ImL新鮮菌液至無菌的Eppendorf管中，加入少量甘油，以封口膜封好后，到中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家重大工程實(shí)驗(yàn)樓測序部進(jìn)行測序。測序結(jié)果用DNAMar、DNAMAN軟件對序列進(jìn)行分析；(l)eg95基因和pGEX-5X_l片段的獲得將測序鑒定過的克隆有eg950RF片段的重組質(zhì)粒pGEM-T EaSy/eg95和原核表達(dá)載體質(zhì)粒pGEX-5X-l分別都用EcoR I單酶切，酶切體系如下pGEM-T Easy/eg95 管10 X buffer2. O μ LEcoRI0. 5μ LpGEM-T Easy/eg95 10. O μ L無菌水補(bǔ)至總體積20LpGEX-5X_l 管10Xbuffer 2. O μ LEcoRI0. 5μ LpGEX-5X-l 2. O μ L無菌水補(bǔ)至總體積20 μ L輕輕混勻，置37°C水浴消化3_4h ；目的片段用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，切下所需的
目的片段，用Glassmilk Kit純化目的片段；載體片段在70°C滅活15min。(2) eg95基因和pGEX-5X_l片段的連接用T4DNA連接酶將膠回收的eg95基因和pGEX_5X_l片段連接。連接體系如下eg95 基因6. O μ LpGEX-5X-l2. O μ LΤ4 DNA Ligasel.OyLΤ4 DNA Ligase Bufferl.OyL混勻后離心，16°C連接過夜。(3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、鑒定將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌DHlOB感受態(tài)細(xì)胞，在含Amp+LB瓊脂平板上篩選，挑選克隆后，提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒EcoR I酶切鑒定，將經(jīng)酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒命名為 pGEX-5X-l/sj-GST-eg95。1. 12sj-GST-eg95 基因的改造融合PCR反應(yīng)設(shè)計(jì)特異性的引物，除去重組原核表達(dá)載體pGEX-5X-l/eg95中GST片段和eg95 片段中間36堿基的蛋白酶切位點(diǎn)，使eg95緊跟在GST之后，形成融合基因。根據(jù)兩個(gè)片段的序列以及載體的特征，設(shè)計(jì)如下的引物設(shè)計(jì)特異性的引物，除去重組原核表達(dá)載體pGEM-T easy/eg95中GST片段和eg95 片段中間36個(gè)堿基的蛋白酶切位點(diǎn)。根據(jù)序列以及載體pBm93的特征，我們設(shè)計(jì)如下的引物，上游引物中aat為加入了的Kozak保守序列GST F:G AGATCT AATG TCC CCT ATA CTA GGT T(Bgl II)GST R:ACATAACTGGAATGCCATTTTTGGAGGATGGTCGCC
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eg95F=GGCG ACCATCCTCCA A AA ATGGCATTCCAGTTATGTeg95R:G CTGCAG TCAAGTAAGGACAACCAC (Pst I)(1)分別利用GST、eg95的上下游引物PCR擴(kuò)增GST、eg95片段，使得即將用于構(gòu)建融合片段GST-eg95的GST的3'端和eg95的5'端各自含有了對方5'端、3'端18個(gè)堿基。共36個(gè)堿基的重復(fù)堿基。分別回收兩個(gè)片段。(2)融合 PCR:50 μ L反應(yīng)體系PCR反應(yīng)程序10XPCR buffer :5μ L95°C 預(yù)變性 5mindNTP (IOmM) 1 μ L95°C40sec模板GST、eg95回收片段各 0. 5yL 58°CIminTaq 酶IyL72 °CIminddH20 41 μ L以上三步為一個(gè)循環(huán)，循環(huán)30次
混勻，放入PCR儀 72°C延伸IOmin兩個(gè)模板互為引物，在Taq酶的作用下擴(kuò)增3 5個(gè)循環(huán)之后，冰上放置2 !Bmin 后，加入引物GST F、eg95!U20pmOl/L)各0.5yL，繼續(xù)把剩余的程序做完。瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收目的條帶。融合片段sj-GST-eg95的回收、克隆以及鑒定方法同上部分。重組質(zhì)粒命名為pMD 18-T/sj-GST-eg95。將sj-GST-eg95基因(SEQ ID NO 3)克隆到pET系列大腸桿菌表達(dá)載體中，用鎳柱純化法純化變性的表達(dá)蛋白，經(jīng)質(zhì)譜分析確認(rèn)表達(dá)的蛋白質(zhì)正確后，免疫兔子獲得抗體， 以檢測后續(xù)的目的蛋白檢測。1. 13重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBm93 (s j-GST_eg95)的構(gòu)建(l)pMD 18-T/sj-GST-eg95和桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBm93質(zhì)粒的雙酶切sj-GST-eg95 管10 X buffer4 μ LBgl II、EcoRI各 1 μ LpMD 18-T/GST-eg9510 μ L無菌水補(bǔ)至總體積40 μ LpBm93 管IOXbuffer4μ LBamH I、EcoRI各 IyLpBm93 質(zhì)粒4yL無菌水補(bǔ)至總體積40 μ L按上述體系加好混勻后，在37°C消化2 池。目的片段電泳后glassmilk法回收； pBm93質(zhì)粒在70°C在滅活15min，涂Amp+LB平板檢測酶切是否完全。(2) sj-GST-eg95 與 pBm93 質(zhì)粒的連接在T4DNA連接酶的作用下連接將膠回收的GST_eg95片段和pBm93質(zhì)粒。連接體
系如下GST_eg95 片段6μ LpBm932μ LΤ4 DNA Ligase1 μ L
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T4 DNA Ligase IOXBuffer 1 μ L混勻后離心，16°C連接過夜。重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與鑒定將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌DHlOB感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐青霉素抗性的瓊脂平板上篩選，挑選克隆后，提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切和菌液PCR鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pBm93 (s j-GST-eg95)。1. 14Bm-N細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代及病毒繁殖迅速取出液氮中凍存的細(xì)胞，置于37°C水浴中，輕輕搖動(dòng)，待凍存液完全融化后， 將之轉(zhuǎn)移入25cm2培養(yǎng)瓶中，并逐滴加入至少5倍體積的新鮮的冷)的TC-100培養(yǎng)基 (含10% FBS, 100 μ g/mL鏈霉素，50 μ g/mL青霉素)，讓細(xì)胞在室溫下貼壁lh，再將之置于 27°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 池。細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)基。根據(jù)細(xì)胞生長狀況，進(jìn)行換液或傳代。待細(xì)胞鋪滿細(xì)胞瓶后，倒掉舊培養(yǎng)液，向細(xì)胞瓶中加入新鮮培養(yǎng)基，用彎頭吸管吹打貼壁細(xì)胞，使其脫落，按照1 2-3的比例(根據(jù)細(xì)胞密度)將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中。家蠶桿狀病毒(BmNPV)感染&ιι細(xì)胞進(jìn)行傳代繁殖。溶液配方如下(I)IXTC-IOO細(xì)胞培養(yǎng)液按Gibco BRL公司產(chǎn)品說明書進(jìn)行。將1個(gè)包裝 (IXlL)TC-100粉邊攪拌邊加到雙蒸水中，加0. 35g NaHCO3,用5mol/LNaOH緩慢調(diào)pH至 6. 22，調(diào)節(jié)滲透壓，定容至1L，在消毒濾器中，將培養(yǎng)基通過0. 22 μ m消毒濾膜加壓過濾除菌。(2)1 XTC-100完全培養(yǎng)基1 XTC-100細(xì)胞培養(yǎng)液補(bǔ)加FBS和抗生素。FBS保存于_20°C，使用前融化，并經(jīng)56°C水浴保溫30min使補(bǔ)體滅活，然后按10%加入上述配制的 1 X TC-100培養(yǎng)基中。鏈霉素終濃度為100 μ g/mL,氨芐青霉素為50 μ g/mL。1. 15超速離心法制備病毒BmNPV_ZJ8基因組DNA收集BmNPV-ZJ8病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)液或感染的家蠶血淋巴，5000r/min離心 IOmin,除去細(xì)胞沉淀，上清25000rpm超速離心lh，用ImL游離病毒抽提液懸浮病毒粒子，加蛋白酶K至終濃度50ug/mL，50°C保溫2h。再加入35%的Sarkorsel至終濃度1 %，繼續(xù)于 50°C保溫池。分別用等體積的飽和酚、苯酚氯仿(1 1)、氯仿各抽提一次，5000rpm離心5min，將上層水相轉(zhuǎn)入新管中，添加1/10體積的3mol/LNaCl (pH 6.5),2倍體積的無水乙醇，-20°C放置濁以上，DNA呈絮狀沉淀。5000rpm離心lOmin，用70%乙醇洗沉淀一次，干燥后，用適量TE溶解DNA，4°C保存?zhèn)溆谩?. 16 共轉(zhuǎn)染接種約0. 5 1 X IO6Bm-N細(xì)胞于15cm2培養(yǎng)瓶中，貼壁培養(yǎng)過夜(即細(xì)胞密度約為80%)。除去含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞二次，再加ImL無血清培養(yǎng)基。在 50 μ L反應(yīng)體系中加入線性化的Bm NPV-ZJ8病毒DNAl μ g, pBm93 (s j_GST_eg95)質(zhì)粒DNA 2ug，脂質(zhì)體5uL混合，加水補(bǔ)足體積，輕輕混勻，27°C溫育15min，逐滴加入培養(yǎng)瓶中，邊加邊搖勻。27°C培養(yǎng)4- 后傾去含轉(zhuǎn)染液的無血清培養(yǎng)基，補(bǔ)加4. 5mL無血清培養(yǎng)基并加入 500 μ L的FBS，使其終濃度為10%，封口，27°C培養(yǎng)4_5d，至細(xì)胞浮起后，收集上清液用于重組病毒的篩選。1. 17重組病毒的篩選、純化和擴(kuò)增接種適量細(xì)胞(平皿底部面積的80% )于35mm小dish中，27°C培養(yǎng)IMi至細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)基，將共轉(zhuǎn)染上清液按10_3-10_5作適當(dāng)稀釋后，取ImL稀釋液加到貼壁細(xì)胞中，分布均勻。27°C感染lh，將2%低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠于60°C水浴中融化，冷至40°C與等體積經(jīng)40°C預(yù)熱的2XTC-100培養(yǎng)基(含20% FBS)混合均勻，添加Χ-gal使其終濃度達(dá)150 μ g/mL,沿小dish邊緣將膠慢慢倒入，凝固后用Parafilm封口，27°C倒置培養(yǎng)4_7d。 顯微鏡下選取無色重組病毒空斑，超凈臺(tái)內(nèi)用Tip頭挑取重組病毒斑，溶于400 μ L TC-100 培養(yǎng)基中，4°C放置4h使病毒粒子釋放出來，取100 μ L病毒液感染M孔板中的細(xì)胞，27°C 培養(yǎng)3d后，取150uL感染細(xì)胞上清按堿變性法快速制備病毒基因組DNA，進(jìn)行PC R擴(kuò)增分析。將能擴(kuò)增出目的片段的病毒上清液鋪斑進(jìn)行第一次篩選。最終獲得含目的基因的重組病毒。分別取IOOpL重組病毒感染正常生長的Bm-5貼壁細(xì)胞，在感染后約5d待細(xì)胞浮起后，4°C保存，用以注射。1. 18 重組病毒 rBmNPV(sj-GST_eg95)的鑒定提取rBmNPV(sj-GST_eg95)基因組DNA 取重組病毒感染的細(xì)胞上清150 μ L，加入 150 μ L(0. 5mol/L)的NaOH后混勻，再加入20 yL(8mol/L)的醋酸銨，混勻后用等體積的酚和氯仿分別抽提一次，酒精沉淀后用20 μ L的TE溶解DNA。利用PCR方法分析外源基因整合參照多角體基因啟動(dòng)子序列在ATG上游40bp 處設(shè)計(jì)一條引物，poIh-F 5 ‘ -ACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAA-3 ‘，以提取的病毒基因組 DNA為模板，以polh-F/G2為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為94°C變性5min、94°C lmin、 59°C lmin、72°C lmin，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物，表明得到了重組病毒 rBmNPV(sj-GST-eg95)。1. 19sj-GST-eg95融合基因在家蠶中的表達(dá)以及ELISA和^festern檢測將重組病毒培養(yǎng)液按IO5Pfu/頭注射五齡幼蠶，待家蠶發(fā)病后，剪掉足，收集蠶血，-20°C凍存，用ELISA法檢測GST-eg95抗原基因在蠶體中的表達(dá)情況。注射病毒后的家蠶，待發(fā)病時(shí)收集蠶血。ELISA方法檢測sj-GST-eg95抗原蛋白表達(dá)量的高低，包被液作為空白對照，以正常蠶血作為陰性對照，原核表達(dá)的GST-eg95蛋白免疫家兔之后的兔血清為第一抗體，HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體為第二抗體。(1)任意選取了所收蠶血中的M號(hào)，用包被液做梯度稀釋，從IOOX (3μ L蠶血加到270 μ L包被液)兩倍倍比稀釋到204800倍。每個(gè)梯度處做雙孔檢測，各取100 μ L包被到酶標(biāo)板上。結(jié)果表明找到1觀00倍為一個(gè)較為合適的稀釋度，可用以下一步比較不同蠶血中sj-GST-eg95的表達(dá)量。通過ELISA檢測家蠶中s j-GST_eg95的表達(dá)。結(jié)果表明s j-GST_eg95基因在家蠶中得到了高量的表達(dá)，在1觀00倍稀釋甚至更高稀釋度下仍能檢測到抗原與抗體的特異性反應(yīng)。表明sj-GST-eg95在家蠶血淋巴中為可溶性表達(dá)，檢測結(jié)果表明其表達(dá)量為同樣體積的大腸桿菌表達(dá)量的30倍以上，達(dá)到每毫升2毫克以上。將含表達(dá)有sj-GST-eg95的蠶蛹用預(yù)冷的PBS(料液比為1 幻在勻漿器中研磨后，用400目濾器過濾后，離心去碎片，上清與谷胱甘肽-瓊脂糖珠震蕩混勻，高速離心去上清，用預(yù)冷的PBS洗兩次，離心得螯合sj-GST-eg95的谷胱甘肽-瓊脂糖珠，用適量的50mmol的Tri鹽酸(pH8. 0)/5mmol的還原型谷胱甘肽洗脫下螯合的sj-GST-eg95蛋白，得率可達(dá)80%以上，證明在家蠶中表達(dá)的目的蛋白是可溶的，而且還建立了相應(yīng)的蠶表達(dá)基因工程羊包蟲抗原sj-GST-eg95蛋白的純化方法。Western檢測表明在重組病毒感染后家蠶的血淋巴樣品的上清液中可檢測到 46kD大小的特異性條帶(圖1)，比大腸桿菌表達(dá)的產(chǎn)物明顯要大從Western檢測表明其抗原蛋白得到了糖基化進(jìn)一步表明其為可溶性表達(dá)。1. 20表達(dá)產(chǎn)物的減卵率實(shí)驗(yàn)BALB/C小鼠(SPF) 14周齡購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體重平均在25-27克左右；羊包蟲的細(xì)粒棘球幼蟲用沙鼠傳代法的方法保存和繼代(羊包蟲的細(xì)粒棘球幼蟲可按文獻(xiàn)所公開的方法分離、保存和繼代；李文佳等，免疫學(xué)雜志，2007，23 ) 383-389)。用50微克左右的表達(dá)抗原sj-GST-eg95混合完全弗氏佐劑以替代Quil-A佐劑肌肉免疫免疫小鼠一次。免疫8周后用保存的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)進(jìn)行腹腔注射，接種劑量為每只小鼠100只原頭蚴，分別攻擊免疫組和非免疫組的小鼠，每組各30頭小鼠。攻擊感染20周后，剖殺各組小鼠，以調(diào)查不同處理組中每組小鼠的細(xì)粒棘球蚴組織，用精密電子稱稱重，計(jì)算成蚴率，計(jì)算公式為減蚴率(<% ) = (1-免疫處理組的細(xì)粒棘球蚴組織平均重量/對照組的細(xì)粒棘球蚴組織的平均重量)X100%本發(fā)明所制備的疫苗免疫BACB/C小鼠的成蚴率為82%，有明顯的保護(hù)效果。實(shí)施例2羊包蟲Eg-GST-eg95抗原基因(SEQ ID NO 5)在家蠶生物反應(yīng)器中的可溶性表達(dá)及免疫實(shí)驗(yàn)GSTs (EC2. 5. 1. 18)是廣泛存在于各種生物體內(nèi)的由多個(gè)基因編碼的、具有多種功能的一組同工酶，分子量為23 ^KDa。GSTs蛋白作為疫苗除可誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫保護(hù)外， 還可有效減少成蟲數(shù)量和產(chǎn)卵數(shù)，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用羊包蟲自身的eg-GST基因與EG95基因進(jìn)行融合獲得Eg-GST-eg95融合抗原基因，并在家蠶生物反應(yīng)器中獲得可溶性的高表達(dá)產(chǎn)品， 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明其有良好的保護(hù)效果。2. 1. eg-GST基因的克隆和載體構(gòu)建及抗體制備羊包蟲RNA的制備，反轉(zhuǎn)錄和cDNA模板的制備同實(shí)施例1，為了擴(kuò)增eg_GST基因， 根據(jù)Genbank中報(bào)道的序列設(shè)計(jì)下列引物，擴(kuò)增eg-GST基因上游弓 I物g gga tcc aacatggctcccactctggcttact (BamHI)下游弓 |物堪 gaa ttc acagtca ccacgccattttgc (EcoRI)根據(jù)Genbank中報(bào)道的序列設(shè)計(jì)下列引物，擴(kuò)增eg95基因上游弓丨物(F) :ggaattcatggcattccagttatgtctcat (EcoRI)下游弓 I物(R) :gctgcagtcaagtaaggacaaccactatgc (PstI)在引物中分別導(dǎo)入所需的酶切位點(diǎn)便于下一步操作。PCR操作、克隆等具體實(shí)驗(yàn)見實(shí)施例1 ；分別擴(kuò)增eg-GST和Eg95片斷，先構(gòu)建pBm93-eg-GST，分別以EcoRI和 PstI酶切pBm93-eg-GST和Eg95_T，再將回收得到的Eg95片斷連接至pBm93_eg-GST得到 pBm93-eg-GST-Eg95 質(zhì)粒。將eg-GST基因首先克隆到通用載體pMD-easy中，測序并于Eg95融合。重組病毒的獲得、純化和表達(dá)同實(shí)施例1。
20
將eg-GST-Eg95基因克隆到pET系列大腸桿菌表達(dá)載體中，用鎳柱純化法純化變性的表達(dá)蛋白，經(jīng)質(zhì)譜分析確認(rèn)表達(dá)的蛋白質(zhì)正確后，免疫兔子獲得抗體，以檢測后續(xù)的目的蛋白檢測。2. 2. eg-GST-eg95融合基因在家蠶中的表達(dá)以及ELISA和^festern檢測將重組病毒培養(yǎng)液按K^pfu/頭注射五齡幼蠶，待家蠶發(fā)病后，剪掉足，收集蠶血，_20°C凍存，用ELISA法檢測eg-GST-eg95抗原基因在蠶體中的表達(dá)情況。注射病毒后的家蠶，待發(fā)病時(shí)收集蠶血。ELISA方法檢測eg-GST-eg95抗原蛋白表達(dá)量的高低，包被液作為空白對照，以正常蠶血作為陰性對照，原核表達(dá)的eg-GST-eg95蛋白免疫家兔之后的兔血清為第一抗體，HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體為第二抗體。(1)任意選取了所收蠶血中的16號(hào)，用包被液做梯度稀釋，從100X (3 μ L蠶血加到270 μ L包被液)后兩倍倍比稀釋到204800倍。每個(gè)梯度處做雙孔檢測，各取100 μ L包被到酶標(biāo)板上。結(jié)果表明找到1觀00倍為一個(gè)較為合適的稀釋度，可用以下一步比較不同蠶血中eg-GST_eg95的表達(dá)量。通過ELISA檢測家蠶中eg-GST-eg95的表達(dá)。結(jié)果表明eg-GST-eg95基因在家蠶中得到了高量的表達(dá)，在1觀00倍稀釋甚至更高稀釋度下仍能檢測到抗原與抗體的特異性反應(yīng)。表明eg-GST-eg95在家蠶血淋巴中為可溶性表達(dá)，檢測結(jié)果表明其表達(dá)量為同樣體積的大腸桿菌表達(dá)量的50倍左右，達(dá)到每毫升蠶血淋巴3毫克以上。將含表達(dá)有eg-GST-eg95的蠶蛹用預(yù)冷的PBS(料液比為1 5)在勻漿器中研磨后，用400目濾器過濾后，離心去碎片，上清與谷胱甘肽-瓊脂糖珠震蕩混勻，高速離心去上清，用預(yù)冷的PBS洗兩次，離心得螯合eg-GST-eg95的谷胱甘肽-瓊脂糖珠，用適量的 50mmol的Tri鹽酸(pH8. 0)/5mmol的還原型谷胱甘肽洗脫下螯合的eg-GST-eg95蛋白，得率可達(dá)80%以上，證明在家蠶中表達(dá)的目的蛋白是可溶的，而且還建立了相應(yīng)的蠶表達(dá)基因工程羊包蟲抗原eg-GST-eg95蛋白的純化方法。Western檢測表明在重組病毒感染后家蠶的4個(gè)血淋巴樣品的上清液中可檢測到 45kD大小的特異性條帶(圖幻，比預(yù)期的41kD的明顯要大，進(jìn)一步表明其為可溶性表達(dá)且得到了糖基化后加工。2. 3. eg-GST-eg95表達(dá)產(chǎn)物的減卵率實(shí)驗(yàn)BALB/C小鼠(SPF) 14周齡購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體重平均在 25-27克左右；羊包蟲的細(xì)粒棘球幼蟲由本所用沙鼠傳代法保存。用50微克左右的表達(dá)抗原eg-GST-eg95混合完全弗氏佐劑以替代Quil-A佐劑肌肉免疫免疫小鼠一次。免疫8周后用保存的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)進(jìn)行腹腔注射，接種劑量為每只小鼠100只原頭蚴，分別攻擊免疫組和非免疫組的小鼠，每組各30頭小鼠。攻擊感染20周后，剖殺各組小鼠，以調(diào)查不同處理組中每組小鼠的細(xì)粒棘球蚴組織，用精密電子稱稱重，計(jì)算成蚴率，計(jì)算公式為減蚴率(<% ) = (1-免疫處理組的細(xì)粒棘球蚴組織平均重量/對照組的細(xì)粒棘球蚴組織的平均重量)X100%所制備的疫苗免疫BACB/C小鼠的減蚴率為95. 6%。具有明顯的保護(hù)效果。實(shí)施例3羊包蟲EG95抗原基因(SEQ ID NO 1)在家蠶生物反應(yīng)器中的可溶性表達(dá)及免疫實(shí)驗(yàn)
多年來，國內(nèi)外學(xué)者為了能有效控制該病，在研制疫苗方面做了大量的工作，取得了很大進(jìn)展。早期的工作主要是對寄生蟲免疫原的研究，雖證實(shí)羊包蟲整體研磨后及其排泄分泌抗原作為疫苗接種都能獲得較好的免疫預(yù)防效果，但病原生活史復(fù)雜，來源有限，難于批量生產(chǎn)，因而在實(shí)際工作中受到限制。近年來，免疫學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)飛速發(fā)展，Lightowlers等發(fā)現(xiàn)在這個(gè)羊包蟲及其排泄分泌抗原作為疫苗的主要保護(hù)性抗原為 EG95 蛋白(Lightowlers MW, et al.，Int. J. Parasitol. 1999，四，531 534)。然而在用基因工程技術(shù)在表達(dá)eg95基因時(shí)碰到了巨大的困難，Lightowlers不得不借助日本血吸蟲的谷胱甘肽(GST)基因一起作為融合蛋白來進(jìn)行表達(dá)，其實(shí)日本血吸蟲的谷胱甘肽在羊包蟲的免疫保護(hù)中是非必需的，因此能夠用eg95基因能進(jìn)行高效表達(dá)的話，對羊包蟲的基因工程疫苗生產(chǎn)是個(gè)巨大的突破。本實(shí)施例應(yīng)用羊包蟲自身的eg-95基因在家蠶生物反應(yīng)器中進(jìn)行高效表達(dá)，并在家蠶生物反應(yīng)器中獲得可溶性的高表達(dá)產(chǎn)品，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明其有最好的保護(hù)效果。3. 1. eg95基因的克隆和載體構(gòu)建羊包蟲RNA的制備，反轉(zhuǎn)錄和cDNA模板的制備同實(shí)施例1，為了擴(kuò)增eg95基因，根據(jù)前面克隆和測序所得的eg95基因的序列設(shè)計(jì)下列引物，擴(kuò)增eg95基因上游弓丨物(F) :gagatctattatggcattccagttatgtctcat (BglII)下游弓 I物(R) :gctgcagtcaagtaaggacaaccactatgc (PstI)將其克隆到T-easy載體，通過測序證明所得的序列正確無誤。在引物中分別導(dǎo)入所需的酶切位點(diǎn)便于下一步操作。PCR操作?？寺〉染唧w實(shí)驗(yàn)見實(shí)施例1。分用BamHI和I3StI先分別酶解pBm93載體，再分別以Bgl II和I3StI酶切含eg95 基因的T載體，分離得eg95基因片段，由于BglII和BamHI為同尾酶，因此再將回收得到的 Eg95片斷連接至用BamHI和PstI酶解的pBm93載體得到pBm93_Eg95轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。先將eg95 基因首先克隆到通用載體pMD-easy中，測序正確后克隆于pBm93載體。重組病毒的獲得、 純化和表達(dá)同實(shí)施例1。3. 2. eg95融合基因在家蠶中的表達(dá)以及ELISA和Western檢測將重組病毒培養(yǎng)液按105pfu/頭注射五齡幼蠶，待家蠶發(fā)病后，剪掉足，收集蠶血，_20°C凍存，用ELISA法檢測eg95抗原基因在蠶體中的表達(dá)情況。注射病毒后的家蠶，待發(fā)病時(shí)收集蠶血。ELISA方法檢測EG95抗原蛋白表達(dá)量的高低，包被液作為空白對照，以正常蠶血作為陰性對照，原核表達(dá)的eg-GST-eg95蛋白免疫家兔之后的兔血清為第一抗體，HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體為第二抗體。(1)任意選取了所收蠶血中的18號(hào)，用包被液做梯度稀釋，從IOOX (3 μ L蠶血加到270 μ L包被液)兩倍倍比稀釋到204800倍。每個(gè)梯度處做雙孔檢測，各取100 μ L包被到酶標(biāo)板上。結(jié)果表明找到25600倍為一個(gè)較為合適的稀釋度，可用以下一步比較不同蠶血中EG95的表達(dá)量。通過ELISA檢測家蠶中EG95的表達(dá)。結(jié)果表明EG95基因在家蠶中得到了高量的表達(dá)，在25600倍稀釋甚至更高稀釋度下仍能檢測到抗原與抗體的特異性反應(yīng)。表明EG95 在家蠶血淋巴中為可溶性表達(dá)，檢測結(jié)果表明其表達(dá)量為同樣體積的大腸桿菌表達(dá)量的 60-100倍左右，達(dá)到每毫升4毫克以上。
將含有表達(dá)EG95的蠶蛹用預(yù)冷的PBS (料液比為1 幻在勻漿器中研磨后，用400 目濾器過濾后，離心去碎片，上清過用實(shí)施例2中制備的抗體標(biāo)記的親和層析柱，上清過柱后先行保留，用預(yù)冷的PBS洗柱子兩次，按標(biāo)準(zhǔn)的抗原抗體洗脫步驟進(jìn)行EG95的純化，得率可達(dá)60%以上，證明在家蠶中表達(dá)的目的蛋白EG95是可溶的，而且還建立了相應(yīng)的蠶表達(dá)基因工程羊包蟲EG95抗原的純化方法。Western檢測表明在重組病毒感染后家蠶的血淋巴樣品的上清液中，在表達(dá)的早期可檢測到16kD的條帶，隨著表達(dá)時(shí)間推延，16kD的條帶越來越少，ISkD糖基化的條帶越來越多，至感染后108小時(shí)，完全是糖基化的ISkD大小的特異性條帶(圖幻，進(jìn)一步表明其為可溶性表達(dá)且得到了糖基化。3. 3. EG95表達(dá)產(chǎn)物的減卵率實(shí)驗(yàn)BALB/C小鼠(SPF) 14周齡購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體重平均在 25-27克左右；羊包蟲的細(xì)粒棘球幼蟲由本所用沙鼠傳代法保存。用10微克左右的表達(dá)抗原EG95混合完全弗氏佐劑以替代Quil-A佐劑肌肉免疫免疫小鼠一次，或用50微克等量的未經(jīng)純化的家蠶表達(dá)的EG95抗原溶于500微升PBS灌注小鼠。免疫8周后用保存的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)進(jìn)行腹腔注射，接種劑量為每只小鼠100只原頭蚴，分別攻擊肌肉注射免疫組、 口服灌注組和非免疫組的小鼠，每組各30頭小鼠。攻擊感染20周后，剖殺各組小鼠，以調(diào)查不同處理組中每組小鼠的細(xì)粒棘球蚴組織，用精密電子稱稱重，計(jì)算成蚴率，計(jì)算公式為減蚴率(<% ) = (1-免疫處理組的細(xì)粒棘球蚴組織平均重量/對照組的細(xì)粒棘球蚴組織的平均重量)X100%本實(shí)驗(yàn)所制備的疫苗肌肉注射免疫BACB/C小鼠的減蚴率為99. 1%, 口服灌注組的減蚴率為97. 3%，兩者基本上未見有明顯的細(xì)粒棘球蚴組織。均具有最佳的保護(hù)效果。實(shí)施例4羊包蟲抗原基因(SEQ ID NO 3)在真核生物畢赤酵母中的可溶性表達(dá)及免疫實(shí)驗(yàn)一、SEQ ID NO 3基因的克隆和載體構(gòu)建1、引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)特異性的引物，除去重組原核表達(dá)載體pGEX-5X-l/eg95中GST片段和eg95 片段中間36堿基的蛋白酶切位點(diǎn)，使eg95緊跟在GST之后，形成融合基因。根據(jù)兩個(gè)片段的序列以及載體的特征，設(shè)計(jì)如下的引物GST F :G GAATTC ATG TCC CCT ATA CTA GGTT(EcoR I)GST R:ACATAACTGGAATGCCATTTTTGGAGGATGGTCGCCeg95F=GGCG ACCATCCTCCA A AA ATGGCATTCCAGTTATGTeg95R:G GCGGCC GC TCAAGTAAGGACAACCAC (Not I)分別以pGEX-5X-l (賈如等，生物技術(shù)通報(bào)2008第5期，171-175)和實(shí)施例1的 pGEM-T easy/eg95為模板，經(jīng)各自的引物PCR擴(kuò)增后，sj_GST與eg95均擴(kuò)增出與目的大小一致的條帶(分別應(yīng)該是654bp和471bp)，與預(yù)測的結(jié)果一致。Sj-GST-eg95融合擴(kuò)增之后，得到目的大小約1134bp的片段，回收后檢測大小也大約為1134bp。2、sj-GST 與 eg95 融合 PCR 反應(yīng)(1)分別利用GST、eg95的上下游引物PCR擴(kuò)增GST、eg95片段，使得即將用于構(gòu)
23建融合片段GST-eg95的GST的3，端和eg95的5，端各自含有了對方5，端、3，端18個(gè)堿基。共36個(gè)堿基的重復(fù)堿基。分別回收兩個(gè)片段。(2)融合 PCR:50 μ L反應(yīng)體系PCR反應(yīng)程序10XPCR buffer :5μ L95°C預(yù)變性 5mindNTP (IOmM) 1 μ L95°C40sec模板GST、eg95回收片段各 0. 5 μ L 58°CIminTaq 酶IyL72 °CIminddH20 41 μ L以上三步為一個(gè)循環(huán)，循環(huán)30次混勻，放入PCR儀72°C延伸IOmin兩個(gè)模板互為引物，在Taq酶的作用下擴(kuò)增3 5個(gè)循環(huán)之后，冰上放置2 ;3min 后，加入引物GST F、eg95lU20pmOl/yL)各0.5yL，繼續(xù)把剩余的程序做完。瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收目的條帶。Sj-GST_eg95融合片斷回收后，連接到克隆載體pGEM-T easy上，得到重組載體 pGEM-T easy/sj-GST-eg95，經(jīng)EcoR I酶切鑒定，得到預(yù)期大小的片段，表明sj-GST_eg95 的融合片段成功地連到PGEM-T easy上，將克隆到的融合片段sj-GST-eg95送去測序，測序結(jié)果表明eg95正確地接在了 sj-GST后面，中間的蛋白酶切位點(diǎn)被融合掉，而且引入的酶切位點(diǎn)正確，這樣就可以避免重組蛋白在真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)被其內(nèi)部的蛋白酶消化掉。 sj-GST-eg95片段的序列測定表明融合片段基因全長為1134bp，翻譯377個(gè)氨基酸?？梢杂糜谙旅娴谋磉_(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。3、真核生物畢赤酵母重組表達(dá)載體pPIC9/sj-GST-eg95的構(gòu)建用EcoR I、Not I對畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9進(jìn)行雙酶切處理，將帶有EcoR I、Not I的s j-GST-eg95的融合片段連于畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9/ sj-GST_eg950酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9經(jīng)EcoR I、Not I雙酶切，70°C滅活15min ；重組質(zhì)粒pGEM_T easy/sj-GST-eg95經(jīng)EcoR I、Not I雙酶切后，用瓊脂糖凝膠電泳后回收sj-GST_eg95的片段；在iM連接酶的作用下構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9/sj-GST-eg95。用EcoR I.BamH I雙酶切鑒定，因?yàn)锽amH I位于GST_eg95的3’段，故應(yīng)該切下IOOObp左右目的大小的片段結(jié)果表明連接正確。二、羊包蟲可溶性抗原基因sj-GST-eg95在真核生物畢赤酵母中的表達(dá)1、質(zhì)粒DNA的線性化處理大量提取重組表達(dá)質(zhì)粒，取IOug用2 3倍過量的Bgl II作線性化處理，電泳檢測酶切是否完全。酚/氯仿，氯仿各抽提一次，乙醇沉淀，70%乙醇洗兩次，無菌水溶解，-20°C保存?zhèn)溆谩?、酵母感受態(tài)的制備(1)將畢赤酵母菌種GS115接種到含5mL YPD液體培養(yǎng)基的IOOmL三角瓶中，
搖床過夜培養(yǎng)。(2)將過夜培養(yǎng)物按1/100-5/100的接種量轉(zhuǎn)接到含500mL YPD液體培養(yǎng)基的 IOOOmL三角瓶中培養(yǎng)至OD600 = 1. 3-1. 5。
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(3)4°C、5000r/m 離心 5min，收集菌體。(4)用500mL冰預(yù)冷的去離子水輕柔重懸沉淀，4°C、5000rpm離心5min，收集菌體。(5)用250mL冰預(yù)冷的去離子水輕柔重懸沉淀，4°C、5000rpm離心5min，收集菌體。(6)用20mL冰預(yù)冷的lmol/L山梨醇輕柔重懸沉淀，4°C、5000rpm離心5min，收集菌體。(7)用ImL預(yù)冷的lmol/L山梨醇輕柔重懸沉淀，按每管80 μ L分裝成備用的畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，保存于-70°C。3、酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和重組子的獲得(1)將80 μ L已制備好的感受態(tài)細(xì)胞與10 μ L已制備好的線性化待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA 混合，并將其轉(zhuǎn)至0. 2cm電轉(zhuǎn)化杯中；(2)將裝有混合液的轉(zhuǎn)化杯冰浴5分鐘；(3)調(diào)整好基因?qū)雰x的參數(shù)(置于畢赤酵母檔)，電擊一次，電壓2000V，時(shí)間一般應(yīng)約為5ms ；(4)立即往轉(zhuǎn)化杯中加入ImL預(yù)冷的lmol/L山梨醇溶液，混勻，并將其轉(zhuǎn)至滅過菌的離心管中；(5)將混合液涂于RDB板上，每個(gè)RDB板上約涂200 μ L 600 μ L的混合液；(6)將RDB板置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 3d，直到長出菌落為止。按下述方法篩選含目的基因的轉(zhuǎn)化子(1)用滅過菌的牙簽從長有轉(zhuǎn)化子的RDB板上挑取單菌落，按照編號(hào)點(diǎn)到MM上，再點(diǎn)到相應(yīng)編號(hào)的MD平板上，每個(gè)平板上一般點(diǎn)100個(gè)單菌落；(2)將點(diǎn)有轉(zhuǎn)化子的匪、MD平板置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 2d，至菌落長出。陽性轉(zhuǎn)化子應(yīng)在MM平板上不生長或生長緩慢，而在MD平板上能正常生長。重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9 (sj-GST-eg95)電轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)后的菌液按煮-凍-煮方法處理之后，用PCR的方法鑒定重組子，陽性重組子擴(kuò)增出目的大小的片段， 表明重組質(zhì)粒確實(shí)轉(zhuǎn)酵母細(xì)胞中去了。4、羊包蟲sj-GST-eg95在畢赤酵母中的表達(dá)檢測(1)按編號(hào)挑取MD平板上的單克隆接種于裝有5mL BMGY培養(yǎng)基的20mL離心管中，30°C、250-280rpm 搖床培養(yǎng) 2 3d ；(2)將搖床培養(yǎng)2 3d的培養(yǎng)液3000g離心15min，取沉淀(盡量將上清除盡)， 再往沉淀中加入4mL含有0. 5%甲醇的BMMY培養(yǎng)基，重新在30°C、250 ^Orpm誘導(dǎo)培養(yǎng)；(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)4 后，每管取出20(^1^菌液，300(^離心51^11，取上清，用于進(jìn)行 SDS-PAGE凝膠電泳檢測，對上清進(jìn)行初步酶活性檢測，對那些篩選出有酶活性的，進(jìn)行進(jìn)一步的誘導(dǎo)表達(dá)；(4)為補(bǔ)償甲醇的揮發(fā)損失，在篩選出有酶活性的菌液中加入100 μ LlOX甲醇溶液，使菌液中的甲醇濃度保持在0. 5%，以后每隔12h取樣一次，并補(bǔ)加甲醇，直至(4d)， 篩選出幾株表達(dá)量高的準(zhǔn)備上發(fā)酵罐，進(jìn)行發(fā)酵工藝研究。按下述方法進(jìn)行發(fā)酵罐水平的重組酵母的高細(xì)胞密度發(fā)酵重組酵母的高細(xì)胞密度發(fā)酵流程5%誘導(dǎo)菌體接種Basal Salts培養(yǎng)基C源4%葡萄糖 N源:28%氨水無機(jī)鹽
菌體生長階段
丨24h
流加25%葡萄糖(36mL/h/L)
丨4h
流加25%葡萄糖甲醇⑴1) (9mL/h/L)
碳源飼喂階段
j 4h
甲醇誘導(dǎo)(維持終濃度0. 3%左右)
混合飼喂階段誘導(dǎo)表達(dá)階段發(fā)酵過程分為四個(gè)階段(1)菌株培養(yǎng)階段發(fā)酵培養(yǎng)基IOXBasal Salts接種前首先加入氨水使培養(yǎng)基的PH達(dá)到5. 0(氨水同時(shí)也作為菌株生長的氮源)，再按每升培養(yǎng)基加4. 37mL的量加入PTM1。5-10%接種種子液，通氣攪拌培養(yǎng)18-24h，在培養(yǎng)過程中隨著菌株的生長，培養(yǎng)基中的溶氧量由100%逐漸降低。當(dāng)碳源消耗完后溶氧量會(huì)再度升高，當(dāng)溶氧升高至80%以上時(shí)，開始碳源飼喂階段。(2)碳源飼喂階段流加25%葡萄糖(每升中含12mL PTM1)，流加量為36mL/h/L， 培養(yǎng)4h。調(diào)整通氣量使溶氧量始終大于20%。(3)碳源-甲醇混合飼喂階段流加25%葡萄糖甲醇(8 1)培養(yǎng)4h，流加量為9mL/h/L，控制溶氧量始終大于20%。(4)誘導(dǎo)表達(dá)階段加入誘導(dǎo)劑甲醇(每升中含12mL PTM1)，使甲醇終濃度維持在 0.3%，溶氧量始終大于20%。在誘導(dǎo)過程中每隔1 取樣一次測定表達(dá)的乳糖酶的活性。利用甲醇大批量誘導(dǎo)畢赤酵母表達(dá)目的蛋白sj-GST-eg95，將表達(dá)后的菌液進(jìn)行離心，取上清液用于ELISA檢測。以原核表達(dá)得到的融合蛋白免疫家兔之后得到的兔血清抗體作為第一抗體，以HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體為第二抗體，以包被液作為空白對照，以未轉(zhuǎn)重組質(zhì)粒但經(jīng)過同樣誘導(dǎo)的酵母作為陰性對照，以大腸桿菌表達(dá)的樣品做陽性對照。篩選了大概300個(gè)重組子，這里只列出一批檢測到的吸光值較高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，總共94個(gè)菌株， 每個(gè)樣品都做雙孔檢測，陰性和空白對照統(tǒng)一做5000倍稀釋后做ELISA檢測，通過酶標(biāo)儀 G92nm處)檢測酶標(biāo)板上各孔的吸光值的大小。最高的重組子經(jīng)高密度發(fā)酵所得的表達(dá)量為同樣體積的大腸桿菌表達(dá)量的10倍左右.5、畢赤酵母生產(chǎn)的羊包蟲可溶性抗原基因sj-GST_eg95和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的減蚴實(shí)驗(yàn)高密度發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)2000g離心10分種去掉酵母后，用MilliporelOKD的截流膜包濃縮脫鹽后，過陰離子凝膠柱純化后，得初步可溶的表達(dá)產(chǎn)物sj-GST-eg95蛋白，經(jīng)ELISA 定量后用50微克的表達(dá)蛋白，混合完全弗氏佐劑以替代Quil-A佐劑肌肉免疫免疫小鼠一次。實(shí)驗(yàn)所用的BALB/C小鼠(SPF) 14周齡購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體重平均在25-27克左右；羊包蟲的細(xì)粒棘球幼蟲由本所用沙鼠傳代法保存。用15微克左右的畢赤酵母表達(dá)的抗原sj-GST-eg95混合完全弗氏佐劑以替代Quil-A佐劑肌肉免疫免疫小鼠一次。免疫8周后用保存的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)進(jìn)行腹腔注射，接種劑量為每只小鼠100 只原頭蚴，分別攻擊免疫組和非免疫組的小鼠，每組各30頭小鼠。
攻擊感染20周后，剖殺各組小鼠，以調(diào)查不同處理組中每組小鼠的細(xì)粒棘球蚴組織，用精密電子稱稱重，計(jì)算減蚴率，計(jì)算公式為減蚴率(<% ) = (1-免疫處理組的細(xì)粒棘球蚴組織平均重量/對照組的細(xì)粒棘球蚴組織的平均重量)X100%疫苗免疫BACB/C小鼠的減蚴率為84. 7%。具有明顯的保護(hù)效果。實(shí)施例5羊包蟲Eg-GST-eg95抗原基因(SEQ ID NO 5)在真核生物畢赤酵母中的可溶性表達(dá)及免疫實(shí)驗(yàn)一、畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-eg-GST_Eg95的構(gòu)建以實(shí)施例2中的質(zhì)粒pBm93 (eg-GST-Eg95)質(zhì)粒為模板設(shè)計(jì)上下游引物上游弓丨物g gcggccgc g atggctcccactctggcttact (NotI)下游弓丨物g gcggccgc tcaagtaaggacaaccactatgc (NotI)經(jīng)過PCR擴(kuò)增后導(dǎo)入NotI位點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入T載體，經(jīng)測序證明沒有發(fā)生突變并正確導(dǎo)入了所需的NotI位點(diǎn)，pPIC9載體經(jīng)NotI酶切，T載體中的eg-GST_Eg95基因同樣經(jīng)NotI酶解后，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、篩選、基因插入方向的鑒定得正確的畢赤酵母表達(dá)載體 pPIC9 (eg-GST-Eg95)。二、羊包蟲可溶性抗原基因eg-GST-Eg95在真核生物畢赤酵母中的表達(dá)1、質(zhì)粒DNA的線性化處理大量提取重組表達(dá)質(zhì)粒，取IOug用2 3倍過量的Bgl II作線性化處理，電泳檢測酶切是否完全。酚/氯仿，氯仿各抽提一次，乙醇沉淀，70%乙醇洗兩次，無菌水溶解，-20°C保存?zhèn)溆谩?、酵母感受態(tài)的制備(1)將畢赤酵母菌種GS115接種到含5mL YPD液體培養(yǎng)基的IOOmL三角瓶中，
搖床過夜培養(yǎng)。(2)將過夜培養(yǎng)物按1/100-5/100的接種量轉(zhuǎn)接到含500mL YPD液體培養(yǎng)基的 IOOOmL三角瓶中培養(yǎng)至OD600 = 1. 3-1. 5。(3)4°C、5000r/m 離心 5min，收集菌體。(4)用500mL冰預(yù)冷的去離子水輕柔重懸沉淀，4°C、5000rpm離心5min，收集菌體。(5)用250mL冰預(yù)冷的去離子水輕柔重懸沉淀，4°C、5000rpm離心5min，收集菌體。(6)用20mL冰預(yù)冷的lmol/L山梨醇輕柔重懸沉淀，4°C、5000rpm離心5min，收集菌體。(7)用ImL預(yù)冷的lmol/L山梨醇輕柔重懸沉淀，按每管80 μ L分裝成備用的畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，保存于-70°C。3、酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和重組子的獲得(1)將80 μ L已制備好的感受態(tài)細(xì)胞與10 μ L已制備好的線性化待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA 混合，并將其轉(zhuǎn)至0. 2cm電轉(zhuǎn)化杯中；(2)將裝有混合液的轉(zhuǎn)化杯冰浴5分鐘；(3)調(diào)整好基因?qū)雰x的參數(shù)(置于畢赤酵母檔)，電擊一次，電壓2000V，時(shí)間一般應(yīng)約為5ms ；(4)立即往轉(zhuǎn)化杯中加入ImL預(yù)冷的lmol/L山梨醇溶液，混勻，并將其轉(zhuǎn)至滅過菌的離心管中；(5)將混合液涂于RDB板上，每個(gè)RDB板上約涂200 μ L 600 μ L的混合液；(6)將RDB板置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 3d，直到長出菌落為止。按下述方法篩選含目的基因的轉(zhuǎn)化子(1)用滅過菌的牙簽從長有轉(zhuǎn)化子的RDB板上挑取單菌落，按照編號(hào)點(diǎn)到MM上，再點(diǎn)到相應(yīng)編號(hào)的MD平板上，每個(gè)平板上一般點(diǎn)100個(gè)單菌落；(2)將點(diǎn)有轉(zhuǎn)化子的匪、MD平板置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 2d，至菌落長出。陽性轉(zhuǎn)化子應(yīng)在MM平板上不生長或生長緩慢，而在MD平板上能正常生長。重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9 (eg-GST-Eg95)電轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)后的菌液按煮-凍-煮方法處理之后，用PCR的方法鑒定重組子，陽性重組子擴(kuò)增出目的大小的片段， 表明重組質(zhì)粒確實(shí)轉(zhuǎn)酵母細(xì)胞中去了。4、羊包蟲eg-GST-Eg95在畢赤酵母中的表達(dá)檢測(1)按編號(hào)挑取MD平板上的單克隆接種于裝有5mL BMGY培養(yǎng)基的20mL離心管中，30°C、250-280rpm 搖床培養(yǎng) 2 3d ；(2)將搖床培養(yǎng)2 3d的培養(yǎng)液3000g離心15min，取沉淀(盡量將上清除盡)， 再往沉淀中加入4mL含有0. 5%甲醇的BMMY培養(yǎng)基，重新在30°C、250 ^Orpm誘導(dǎo)培養(yǎng)；(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)4 后，每管取出20(^1^菌液，300(^離心51^11，取上清，用于進(jìn)行 SDS-PAGE凝膠電泳檢測，對上清進(jìn)行初步酶活性檢測，對那些篩選出有酶活性的，進(jìn)行進(jìn)一步的誘導(dǎo)表達(dá)；(4)為補(bǔ)償甲醇的揮發(fā)損失，在篩選出有酶活性的菌液中加入100 μ LlOX甲醇溶液，使菌液中的甲醇濃度保持在0. 5%，以后每隔12h取樣一次，并補(bǔ)加甲醇，直至(4d)， 篩選出幾株表達(dá)量高的準(zhǔn)備上發(fā)酵罐，進(jìn)行發(fā)酵工藝研究。按下述方法進(jìn)行發(fā)酵罐水平的重組酵母的高細(xì)胞密度發(fā)酵重組酵母的高細(xì)胞密度發(fā)酵流程5%誘導(dǎo)菌體接種Basal Salts培養(yǎng)基
C源4%葡萄糖 N源:28%氨水無機(jī)鹽丨24h
流加25%葡萄糖(36mL/h/L) 丨4h
流加25%葡萄糖甲醇⑴1) (9mL/h/L) I 4h
甲醇誘導(dǎo)(維持終濃度0. 3%左右)發(fā)酵過程分為四個(gè)階段(1)菌株培養(yǎng)階段發(fā)酵培養(yǎng)基IOXBasal Salts接種前首先加入氨水使培養(yǎng)基的PH達(dá)到5. 0(氨水同時(shí)也作為菌株生長的氮源)，再按每升培養(yǎng)基加4. 37mL的量加入PTM1。5-10%接種種子液，通氣攪拌培養(yǎng)18-24h，在培養(yǎng)過程中隨著菌株的生長，培養(yǎng)基
菌體生長階段
碳源飼喂階段
混合飼喂階段誘導(dǎo)表達(dá)階段中的溶氧量由100%逐漸降低。當(dāng)碳源消耗完后溶氧量會(huì)再度升高，當(dāng)溶氧升高至80%以上時(shí)，開始碳源飼喂階段。(2)碳源飼喂階段流加25%葡萄糖(每升中含12mL PTM1)，流加量為36mL/h/L， 培養(yǎng)4h。調(diào)整通氣量使溶氧量始終大于20%。(3)碳源-甲醇混合飼喂階段流加25%葡萄糖甲醇(8 1)培養(yǎng)4h，流加量為9mL/h/L，控制溶氧量始終大于20%。(4)誘導(dǎo)表達(dá)階段加入誘導(dǎo)劑甲醇(每升中含12mL PTM1)，使甲醇終濃度維持在 0.3%，溶氧量始終大于20%。在誘導(dǎo)過程中每隔1 取樣一次測定表達(dá)的乳糖酶的活性。利用甲醇大批量誘導(dǎo)畢赤酵母表達(dá)目的蛋白eg-GST-Eg95，將表達(dá)后的菌液進(jìn)行離心，取上清液用于ELISA檢測。以原核表達(dá)得到的融合蛋白免疫家兔之后得到的兔血清抗體作為第一抗體，以HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體為第二抗體，以包被液作為空白對照，以未轉(zhuǎn)重組質(zhì)粒但經(jīng)過同樣誘導(dǎo)的酵母作為陰性對照，以大腸桿菌表達(dá)的樣品做陽性對照。篩選了大概400個(gè)重組子，這里只列出一批檢測到的吸光值較高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，總共107個(gè)菌株， 每個(gè)樣品都做雙孔檢測，陰性和空白對照統(tǒng)一做5000倍稀釋后做ELISA檢測，通過酶標(biāo)儀 G92nm處)檢測酶標(biāo)板上各孔的吸光值的大小。最高的重組子經(jīng)高密度發(fā)酵所得的表達(dá)量為同樣體積的大腸桿菌表達(dá)量的12倍左右.5、畢赤酵母生產(chǎn)羊包蟲可溶性抗原基因eg-GST_Eg95和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的減蚴實(shí)驗(yàn)高密度發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)2000g離心10分種去掉酵母后，用MilliporeIOKD的截流膜包濃縮脫鹽后，過陰離子凝膠柱純化后，得初步可溶的表達(dá)產(chǎn)物eg-GST-Eg95蛋白，經(jīng)ELISA 定量后用50微克的表達(dá)蛋白，混合完全弗氏佐劑以替代Quil-A佐劑肌肉免疫免疫小鼠一次。實(shí)驗(yàn)所用的BALB/C小鼠(SPF) 14周齡購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體重平均在25-27克左右；羊包蟲的細(xì)粒棘球幼蟲由本所用沙鼠傳代法保存。用15微克左右的畢赤酵母表達(dá)的抗原sj-GST-eg95混合完全弗氏佐劑以替代Quil-A佐劑肌肉免疫免疫小鼠一次。免疫8周后用保存的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)進(jìn)行腹腔注射，接種劑量為每只小鼠100 只原頭蚴，分別攻擊免疫組和非免疫組的小鼠，每組各30頭小鼠。攻擊感染20周后，剖殺各組小鼠，以調(diào)查不同處理組中每組小鼠的細(xì)粒棘球蚴組織，用精密電子稱稱重，計(jì)算減蚴率，計(jì)算公式為減蚴率(<% ) = (1-免疫處理組的細(xì)粒棘球蚴組織平均重量/對照組的細(xì)粒棘球蚴組織的平均重量)X100%本實(shí)驗(yàn)所制備的疫苗免疫BACB/C小鼠的減蚴率為87. 3%。具有明顯的保護(hù)效果。實(shí)施例6羊包蟲EG95抗原基因在真核生物畢赤酵母中的可溶性表達(dá)及免疫實(shí)驗(yàn)一、畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9_Eg95的構(gòu)建以實(shí)施例2中的質(zhì)粒pBm93 (eg-GST-Eg95)質(zhì)粒為模板設(shè)計(jì)上下游引物上游弓丨物(F) :ggaa ttc atg gcattccagttatgtctcat (EcoR I)下游弓丨物ggcggccgc tcaagtaaggacaaccactatgc (NotI)經(jīng)過PCR擴(kuò)增后導(dǎo)入EcoR I和NotI位點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入T載體，經(jīng)測序證明沒有發(fā)生突變并正確導(dǎo)入了所需的EcoR I和NotI位點(diǎn)，pPIC9載體經(jīng)EcoR I和NotI酶切， T載體中的Eg95基因同樣經(jīng)EcoR I和NotI酶解后，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、篩選、酶切鑒定得正確的畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9 (Eg95)。
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二、羊包蟲可溶性抗原基因Eg95在真核生物畢赤酵母中的表達(dá)1、質(zhì)粒DNA的線性化處理大量提取重組表達(dá)質(zhì)粒，取IOug用2 3倍過量的Bgl II作線性化處理，電泳檢測酶切是否完全。酚/氯仿，氯仿各抽提一次，乙醇沉淀，70%乙醇洗兩次，無菌水溶解，-20°C保存?zhèn)溆谩?、酵母感受態(tài)的制備(1)將畢赤酵母菌種GS115接種到含5mL YPD液體培養(yǎng)基的IOOmL三角瓶中，
搖床過夜培養(yǎng)。(2)將過夜培養(yǎng)物按1/100-5/100的接種量轉(zhuǎn)接到含500mL YPD液體培養(yǎng)基的 IOOOmL三角瓶中培養(yǎng)至OD600 = 1. 3-1. 5。(3)4°C、5000r/m 離心 5min，收集菌體。(4)用500mL冰預(yù)冷的去離子水輕柔重懸沉淀，4°C、5000rpm離心5min，收集菌體。(5)用250mL冰預(yù)冷的去離子水輕柔重懸沉淀，4°C、5000rpm離心5min，收集菌體。(6)用20mL冰預(yù)冷的lmol/L山梨醇輕柔重懸沉淀，4°C、5000rpm離心5min，收集菌體。(7)用ImL預(yù)冷的lmol/L山梨醇輕柔重懸沉淀，按每管80 μ L分裝成備用的畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，保存于-70°C。3、酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和重組子的獲得(1)將80 μ L已制備好的感受態(tài)細(xì)胞與10 μ L已制備好的線性化待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA 混合，并將其轉(zhuǎn)至0. 2cm電轉(zhuǎn)化杯中；(2)將裝有混合液的轉(zhuǎn)化杯冰浴5分鐘；(3)調(diào)整好基因?qū)雰x的參數(shù)(置于畢赤酵母檔)，電擊一次，電壓2000V，時(shí)間一般應(yīng)約為5ms ；(4)立即往轉(zhuǎn)化杯中加入ImL預(yù)冷的lmol/L山梨醇溶液，混勻，并將其轉(zhuǎn)至滅過菌的離心管中；(5)將混合液涂于RDB板上，每個(gè)RDB板上約涂200 μ L 600 μ L的混合液；(6)將RDB板置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 3d，直到長出菌落為止。按下述方法篩選含目的基因的轉(zhuǎn)化子(1)用滅過菌的牙簽從長有轉(zhuǎn)化子的RDB板上挑取單菌落，按照編號(hào)點(diǎn)到MM上，再點(diǎn)到相應(yīng)編號(hào)的MD平板上，每個(gè)平板上一般點(diǎn)100個(gè)單菌落；(2)將點(diǎn)有轉(zhuǎn)化子的MM、MD平板置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 2d，至菌落長出。陽性轉(zhuǎn)化子應(yīng)在MM平板上不生長或生長緩慢，而在MD平板上能正常生長。重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9 (Eg95) DNA電轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)后的菌液按煮-凍-煮方法處理之后，用PCR的方法鑒定重組子，陽性重組子擴(kuò)增出目的大小的片段，表明重組質(zhì)粒確實(shí)轉(zhuǎn)酵母細(xì)胞中去了。4、羊包蟲Eg95在畢赤酵母中的表達(dá)檢測(1)按編號(hào)挑取MD平板上的單克隆接種于裝有5mL BMGY培養(yǎng)基的20mL離心管中，30°C、250-280rpm 搖床培養(yǎng) 2 3d ；(2)將搖床培養(yǎng)2 3d的培養(yǎng)液3000g離心15min，取沉淀(盡量將上清除盡)，再往沉淀中加入4mL含有0. 5%甲醇的BMMY培養(yǎng)基，重新在30°C、250 ^Orpm誘導(dǎo)培養(yǎng)；(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)4 后，每管取出20(^1^菌液，300(^離心5!^11，取上清，用于進(jìn)行 SDS-PAGE凝膠電泳檢測，對上清進(jìn)行初步酶活性檢測，對那些篩選出有酶活性的，進(jìn)行進(jìn)一步的誘導(dǎo)表達(dá)；(4)為補(bǔ)償甲醇的揮發(fā)損失，在篩選出有酶活性的菌液中加入100 μ LlOX甲醇溶液，使菌液中的甲醇濃度保持在0. 5%，以后每隔12h取樣一次，并補(bǔ)加甲醇，直至(4d)， 篩選出幾株表達(dá)量高的準(zhǔn)備上發(fā)酵罐，進(jìn)行發(fā)酵工藝研究。
權(quán)利要求
1.一種制備羊包蟲可溶性抗原的方法，包括將SEQ ID NO 1, SEQ IDNO :3或SEQ ID NO 5所示的基因在昆蟲生物反應(yīng)器或畢赤酵母生物反應(yīng)器中進(jìn)行表達(dá)；收集、純化所表達(dá)的抗原，即得。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將SEQID N0:1、SEQ IDNO :3或SEQ ID NO :5所示的基因在昆蟲生物反應(yīng)器中進(jìn)行表達(dá)包括以下步驟(1)將SEQ ID NO=USEQ ID N0:3或SEQ ID NO :5所示的基因分別克隆到桿狀病毒運(yùn)載載體中，獲得轉(zhuǎn)移載體；(2)用所獲得的轉(zhuǎn)移載體DNA與桿狀病毒基因組DNA共轉(zhuǎn)染進(jìn)昆蟲細(xì)胞，進(jìn)行DNA同源重組，經(jīng)過重組病毒篩選、克隆純化獲得重組桿狀病毒；C3)用重組桿狀病毒感染昆蟲宿主和細(xì)胞；培養(yǎng)被感染的昆蟲宿主；(4)收集、純化所表達(dá)的抗原，即得。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的桿狀病毒運(yùn)載載體選自pBm034， pBm93，BacPAK6，Bac to Pac, Bacmid,pVL1391,pVL 1392,pVL 1393,pVL941,pVL 945,pVL 985，ρVTBac, pBm030 或 pUAC-5 ；優(yōu)選為 pBm93。
4.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的桿狀病毒選自BmNPV、AcMNPV、 ApNPV、、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SIMNPV、SeMNPV 或 SpltNPV ；優(yōu)選的，所述的桿狀病毒為家蠶桿狀病毒Bm-NPV-ZJS。
5.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的重組桿狀病毒選自以下任意一種(1)重組家蠶核型多角體病毒rBmNPV(eg95)，其微生物保藏號(hào)是CGMCCNo. 3981 ； (2)重組家蠶核型多角體病毒rBmNPV(sj-GST-eg%)；其微生物保藏號(hào)是CGMCC No. 3959 ； (3)重組家蠶核型多角體病毒rBmNPV(eg-GST-eg%)；其微生物保藏號(hào)是CGMCC No. 3960。
6.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的昆蟲宿主包括家蠶(Bombyx mori)、野香(Bombyx mandarina)、蓖麻香(Philosamia cynthiaricim)、樟香(Dictyoploca japanica)、樗香(Philosamia cynthiapryeri)、昨香(Antheraea pernyi)、曰本昨香(Antheraea yamamai)、野天香(Antheraea polyphymus)、苜猜尺蠖(Atographa califorica)、荼尺蠖(Ectropis obliqua)、甘蘭夜蛾(Mamestra brassicae)、斜紋夜蛾 (Spodoptera littoralis)、秋粘蟲(Spodoptera frugiperda)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)、行軍蟲(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉鈴蟲(Heliothis armigera)、美國棉鈴蟲 (Heliothis zea)、煙青蟲(Heliothisassulta)、煙草夜蛾(Heliothis virescens)、東方粘蟲(Pseudaletiaseparata)或舞毒蛾(Lymantria dispar)。
7.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的感染是指重組桿狀病毒通過吞食或透過表皮來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹體；優(yōu)選的將重組家蠶桿狀病毒感染家蠶細(xì)胞或穿刺接種5齡起蠶的家蠶幼蟲或蛹，在感染3-6天后收集含各種羊包蟲抗原的家蠶幼蟲或蛹的體液或組織勻漿；其中，所述的蛹體為1-2天的早期嫩蛹。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將SEQID NO=U SEQ IDNO 3或SEQ ID NO :5所示的基因在畢赤酵母生物反應(yīng)器中進(jìn)行表達(dá)包括以下步驟(1)將SEQ ID NO=U SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :5所示的基因分別克隆到畢赤酵母表達(dá)載體中，獲得表達(dá)質(zhì)粒；(2)先將所獲得的表達(dá)質(zhì)粒DNA進(jìn)行線性化，轉(zhuǎn)化酵母的感受態(tài)細(xì)胞，在酵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行 DNA同源重組進(jìn)行雙交換，獲得大量的重組酵母，篩選得到最高表達(dá)的重組酵母；C3)將所獲得的重組酵母進(jìn)行發(fā)酵收獲發(fā)酵的上清液，純化即得。
9.按照權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于其中，步驟(1)中所述的畢赤酵母表達(dá)載體為分泌型畢赤酵母表達(dá)載體，優(yōu)選自pPIC9、pPIC9K、pHIL-Slp、YAM7SP6或pGAPh。
10.按照權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于步驟O)中所述的重組酵母選自以下任意一種(1)重組酵母PC(eg%)，其微生物保藏號(hào)是CGMCCNo. 3976 ； (2)重組酵母 PC(Si-GST-eg95)，其微生物保藏號(hào)是CGMCCNo. 3978 ； (3)重組酵母 PC (eg-GST_eg95)，其微生物保藏號(hào)是CGMCCNo. 3977。
11.由權(quán)利要求1-10任何一項(xiàng)方法所制備得到的羊包蟲抗原。
12.權(quán)利要求11所述的羊包蟲抗原在制備防制包蟲病的生物制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備羊包蟲可溶性抗原的方法及其產(chǎn)品，其制備方法包括將SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5所示的基因在昆蟲生物反應(yīng)器或畢赤酵母生物反應(yīng)器中進(jìn)行表達(dá)；收集、純化所表達(dá)的抗原，即得。本發(fā)明方法采用家蠶生物反應(yīng)器或畢赤酵母生物反應(yīng)器制備羊包蟲抗原，其產(chǎn)物是可溶性的，免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)證明其抗原性良好，單位表達(dá)量分別比大腸桿菌的量要高10-100倍，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明其具有很好的減蟲效率。本發(fā)明方法可以大幅度降低羊包蟲抗原的生產(chǎn)成本，簡化了以前用大腸桿菌生產(chǎn)抗原的純化過程，具有安全、高效、成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K14/435GK102311957SQ20101022221
公開日2012年1月11日 申請日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月9日
發(fā)明者張志芳, 易詠竹, 李軼女, 沈桂芳, 舒惠國, 賈如, 鄒媛媛, 韓賓 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所