專利名稱：含有治療性tpo/epo模擬肽的抗體的制作方法
技術領域：
本發明的領域是醫學、免疫學、分子生物學和蛋白質化學。背景血小板減少癥與多種疾病有關，其特征在于通常因血小板產生不足、血小板隔離、 缺陷型血小板產生或血小板破壞增加而引起的血液血小板計數異常低下。血小板減少癥的癥狀包括例如不適、瘀傷(例如紫癜)和出血(例如鼻出血或牙齦出血)。血小板減少癥相關疾病的一個實例是血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，該病的特征在于在全身小血管中形成廣泛性顯微鏡性血凝塊(血栓)。如果不治療，則患者的情況會迅速惡化成包括重度神經功能缺損(例如木僵或昏迷)、腎衰竭、中風和心臟停搏。未治療的TTP的死亡率大于 90%。血小板減少癥相關疾病也可因輻射暴露(例如放射治療方案)、癌癥、給予某些化合物(例如細胞毒性藥物)和對某些疫苗的免疫應答而引起。血小板生成素(TPO)是一種糖基化生長因子，它刺激巨核細胞這種產生大量血小板的骨髓細胞的產生和分化。(參見例如Kaushansky (2006)N. Engl. J. Med. 354(19) 2034-45)。TPO與在巨核細胞祖細胞上表達的c_Mpl受體結合，從而刺激細胞增殖并分化成血小板。事與愿違的是，患者用重組人TPO治療導致抗TPO中和抗體的產生，該抗TPO中和抗體與患者的天然存在TPO結合并干擾其活性。(參見例如Kuter和Begley (2002)Blood 100 :3457-3469 ；Li 等 O001)Blood巡3241-3248 ；以及 Vadhan-Raj 等 O000)Ann Intern Med 132 :364-368)。因此，需要用于血小板減少癥相關疾病的患者的新的更好的治療方法。鍵本公開內容涉及含有治療性肽的有治療活性的重組抗體(這些抗體在下文中稱為“治療性抗體”)。在一些實施方案中，抗體含有本公開內容的血小板生成素(TPO)模擬肽(這些抗體在下文中稱為“ΤΡ0模擬抗體”)。本公開內容還涉及治療性抗體的治療活性片段(例如TPO模擬抗體的治療活性片段)。例如，可以在各種診斷和/或治療應用中使用治療性抗體及其片段。例如，如工作實施例中所述，TPO模擬抗體和/或其片段可用于治療需要增加血小板產生的受試者，例如暴露于輻射(例如進行放射治療的癌癥患者)或消耗骨髓、降低血小板產生和/或增加血小板破壞的其它物質的受試者。TPO模擬抗體和/或片段還可用于治療患有血小板水平不足(血小板減少癥)相關病癥(例如本文描述的或本領域已知的這類病癥中的任一種)的受試者。
與相應的分離的治療性肽相比，本文所述治療性抗體及其治療活性片段具有多個優勢。首先，抗體的血清半壽期延長。其次，可穩定抗體支架內治療性肽的活性區域的構象， 就其與靶標結合而言，賦予它比分離的治療性肽更大的活性和特異性。另外，與其分離的天然TPO肽對應物相比，本文描述的TPO模擬抗體和片段具有多個額外優勢。例如，給予哺乳動物受試者(例如人受試者)時，TPO模擬抗體或其治療活性片段顯著降低對天然TPO產生有害免疫應答的可能性。這與采用天然TPO蛋白的重組形式的治療相反，后者通常導致在患者中產生TPO中和抗體，該抗體干擾患者的天然存在的TPO的活性。參見例如Kuter和 Begley (2002) Blood 100 :3457-3469 ；Li 等 O001) Blood 98 :3241-3248 ；以及 Vadhan-Raj 等O000)Arm Intern Medl巡364-368。本文描述的TPO模擬抗體(和治療活性片段)的又一個優勢是在提高受試者的血小板水平方面，單劑量的TPO模擬抗體與多劑量方案一樣有效，或者比多劑量方案更有效。本文所述治療性抗體的許多優勢由治療性肽在抗體支架內的獨特位置造成。如本文詳述和工作實施例中舉例說明的一樣，本發明人開發了含有在輕鏈多肽恒定區內的獨特位置上和/或在重鏈多肽恒定區內的獨特位置上整合的治療性肽的治療性抗體。例如， 本發明人已證實，將治療性肽整合到重鏈多肽鉸鏈區上或附近，導致治療性抗體具有本文描述的多個優勢。同樣，通過將治療性肽整合到結構上允許治療性肽存在于抗體的中心裂口(central cleft)的輕鏈恒定區的位置上(例如在輕鏈多肽恒定區的β轉角區或輕鏈恒定區的羧基端)，產生具有本文描述的多個優勢的治療性抗體。本文使用的抗體的“中心裂口”是指其中完整抗體兩“臂”相交的該抗體的區域。也就是說，所有的完整免疫球蛋白 (Ig)分子由4條蛋白質鏈O條重鏈多肽和2條輕鏈多肽)組成，呈三維結構，形狀像大寫字母“Y”，其由二硫鍵連接在一起。“Y”結構的“臂”含有抗體可變區，中心裂口區之間位于 “Y”結構兩臂的連接處。因此，一方面，本公開內容的特征在于治療性抗體或抗體的治療活性片段，其中抗體或片段包含至少兩個治療性肽，且其中至少一個治療性肽在結構上允許治療性肽存在于抗體中心裂口的位置上整合到輕鏈多肽的恒定區。治療性抗體或其片段還可含有重鏈多肽，所述重鏈多肽含有至少一個治療性肽。所述至少一個治療性肽如下整合到鉸鏈區(a) 整合到重鏈多肽的鉸鏈區中；(b)整合在鉸鏈區的氨基端與鉸鏈區上游的重鏈多肽區之間的連接處；(c)整合在鉸鏈區的羧基端與鉸鏈區下游的重鏈多肽區之間的連接處；或(d)整合在始于重鏈多肽鉸鏈區的氨基端上游少于20個氨基酸或者重鏈多肽鉸鏈區的羧基端下游少于20個氨基酸內的位置上。另一方面，本公開內容的特征在于治療性抗體或抗體的治療活性片段，其中抗體或片段包含至少兩個治療性肽，且其中抗體的重鏈多肽包含至少一個如下整合到重鏈中的治療性肽(a)整合到重鏈多肽的鉸鏈區中；(b)整合在鉸鏈區的氨基端與鉸鏈區上游的重鏈多肽區之間的連接處；(c)整合在鉸鏈區的羧基端與鉸鏈區下游的重鏈多肽區之間的連接處；或(d)整合在始于重鏈多肽鉸鏈區的氨基端上游少于20個氨基酸或者重鏈多肽鉸鏈區的羧基端下游少于20個氨基酸內的位置上。治療性抗體或其治療活性片段還可含有輕鏈多肽，其中輕鏈多肽的恒定區包含至少一個治療性肽。治療性肽(例如TPO模擬肽)在結構上允許治療性肽存在于抗體中心裂口的位置上整合到輕鏈多肽的恒定區。在本文描述的任何治療性抗體或其片段的一些實施方案中，治療性肽可因在輕鏈多肽恒定區的β轉角區內的插入和/或置換而整合。在本文描述的任何治療性抗體或其片段的一些實施方案中，治療性肽可因添加至輕鏈多肽的羧基端而整合。在一些實施方案中，治療性肽可因多肽中最終的β折疊下游的輕鏈多肽恒定區某一區域的插入和/或置換而整合。在任何治療性抗體或其治療活性片段的一些實施方案中，重鏈的整個鉸鏈區被治療性肽置換。在任何治療性抗體或其治療活性片段的一些實施方案中，輕鏈多肽的羧基端包含至少一個治療性肽，重鏈多肽包含至少一個治療性肽。在任何治療性抗體或其治療活性片段的一些實施方案中，抗體或片段包含至少3 個(例如至少4、5、6、7、8、9、10、11、12或15或更多個)治療性肽。在任何治療性抗體或其治療活性片段的一些實施方案中，至少兩個治療性肽是相同的。在一些實施方案中，至少兩個治療性肽彼此不同。例如，至少兩個不同的治療性肽可具有不同的氨基酸序列，但卻具有相同類型的治療活性(例如兩個TPO模擬物具有不同的氨基酸序列)，或者至少兩個不同的治療性肽可具有不同的氨基酸序列和不同的治療活性 (例如TPO模擬物和EPO模擬物)。在任何治療性抗體或其治療活性片段的一些實施方案中，所有治療性肽是相同的。在一些實施方案中，所有治療性肽彼此不同(例如一個或兩個不同的氨基酸序列和不同的治療活性)。在任何治療性抗體或其治療活性片段的一些實施方案中，治療性抗體或其治療活性片段的至少一個抗原結合部位保持與抗原結合的能力。在一些實施方案中，治療性抗體或其治療活性片段的至少兩個抗原結合部位保持與抗原結合的能力。在一些實施方案中，任何治療性抗體或其治療活性片段可包括作為至少一個治療性肽的氨基端的間隔基氨基酸序列和/或作為至少一個治療性肽的羧基端的間隔基氨基酸序列。在一些實施方案中，間隔基氨基酸序列可存在于治療性肽的氨基端和羧基端兩端。 兩個間隔基可具有相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列。在任何治療性抗體或其治療活性片段的一些實施方案中，至少一個治療性肽是拮抗劑肽。在任何治療性抗體或其治療活性片段的一些實施方案中，至少一個治療性肽是激動劑肽。在任何治療性抗體或其治療活性片段的一些實施方案中，至少一個治療性肽是肽模擬物(例如TPO模擬物或EPO模擬物)。在任何治療性抗體或其治療活性片段的一些實施方案中，所有治療性肽是TPO模擬物(例如含有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2所述氨基酸序列，或者由SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2所述氨基酸序列組成的TPO模擬物)。在任何治療性抗體或其治療活性片段的一些實施方案中，治療性抗體可含有包含 SEQ ID NO 10所述氨基酸序列的輕鏈多肽和/或包含SEQ ID NO 12所述氨基酸序列的重鏈多肽。在任何治療性抗體或其治療活性片段的一些實施方案中，抗體含有包含SEQ ID NO: 10所述氨基酸序列的輕鏈多肽和包含SEQ ID NO: 12所述氨基酸序列的重鏈多肽，或者由所述輕鏈多肽和所述重鏈多肽組成。在任何治療性抗體或其治療活性片段的一些實施方案中，抗體由包含SEQ ID NO: 10所述氨基酸序列的輕鏈多肽和包含SEQ ID N0:12所述氨基酸序列的重鏈多肽組成。在任何治療性抗體或其治療活性片段的一些實施方案中，抗體可以是單克隆抗體、人源化抗體、嵌合化抗體(chimerized antibody)、嵌合抗體、去免疫化人抗體(deimmunized human antibody)、完全人抗體或 F(ab，)2 片段。在任何治療性抗體或其治療活性片段的一些實施方案中，治療活性片段可選自Fd 片段、Fab片段和Fab’片段，其中治療活性片段含有至少兩個治療性肽以及至少部分的重鏈多肽鉸鏈區或至少部分的輕鏈多肽羧基端。在任何治療性抗體或其治療活性片段的一些實施方案中，抗體或治療活性片段含有異源部分。在一些實施方案中，本文描述的任何治療活性片段包括抗體輕鏈多肽和/或重鏈多肽的可變區的至少部分或全部。部分可變區包括至少2個(例如至少3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31。 32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100 個或超過 100 個)輕鏈多肽和 / 或重鏈多肽的氨基酸。至少部分可變區可包括一個或多個輕鏈(LC)多肽或重鏈(HC)多肽 CDR(例如 LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3、HC-CDR1、HC-CDR2 或 HC-CDR3)、構架區(FR)(例如 LC-FRl、LC-FR2、LC-FR3、LC-FR4、HC-FRl、HC-FR2、HC-FR3 或 HC-FR4)或任何前述部分的任何組合。在一些實施方案中，治療活性片段不是抗體的Fc片段。另一方面，本公開內容的特征在于任何治療性抗體或其治療活性片段和藥學上可接受的載體的組合物。例如，在一些實施方案中，組合物可含有本文描述的任何TPO模擬抗體。在一些實施方案中，可配制本文描述的任何組合物用作單劑量。在一些實施方案中，可配制本文描述的任何組合物用于多劑量。在一些實施方案中，本文描述的任何組合物還可含有至少一種用于降低輻射暴露的副作用或用于降低化學治療的副作用的活性劑。至少一種活性劑可選自抗生素、麻醉劑、 止吐藥、類固醇、螯合劑和利尿藥。在一些實施方案中，本文描述的任何組合物還可包括至少一種用于增加受試者的血小板產生的其它活性劑。至少一種其它活性劑可為例如艾曲波帕(eltrombopag)、奧普瑞白介素、羅米司亭(romiplostim)、培非司亭、紅細胞生成素刺激劑(ESA)或本文描述的或本領域已知的任何其它合適的物質。又一方面，本公開內容的特征在于用于增加受試者的血小板產生的方法。所述方法包括將治療有效量的包含本文描述的任何TPO模擬抗體或其治療活性片段的組合物給予有需要的受試者的步驟。另一方面，本公開內容的特征在于用于增加受試者的血小板產生的方法，所述方法包括將包含治療有效量的本文描述的任何TPO模擬抗體或其治療活性片段的組合物給予有需要的受試者。在本文所述任何方法的一些實施方案中，受試者是哺乳動物，例如人或非人類靈長類動物。在本文所述任何方法的一些實施方案中，受試者是非人類哺乳動物。在本文所述任何方法的一些實施方案中，受試者患有與血小板計數不足相關的病癥。所述病癥可為例如以下中的任一種伯-索綜合征(Bernard-Soulier syndrome)、特發性血小板減少性紫癜、威-奧綜合征、脾功能亢進、血栓性微血管病、彌散性血管內凝血、肝素誘發的血小板減少癥(HIT)、馮維勒布蘭德病(von Willebrand disease)、變型馮維勒布蘭德病(variant von Willebrand disease)、因HIV感染所致的血小板減少癥、因慢性肝病所致的血小板減少癥或格蘭茲曼血小板機能不全(Glanzmann，s thrombasthenia)。在一些實施方案中，所述病癥可因治療受試者的病毒感染、癌癥或炎性疾病而引起。例如，病癥可因細胞毒性藥物療法所致(例如藥物誘導性血小板機能不全)。在一些實施方案中，可因給予受試者放射治療方案而引起所述病癥。在本文所述任何方法的一些實施方案中，受試者可能患有癌癥，例如但不限于肺癌、乳癌、結腸癌、胰腺癌、腎癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液學癌癥(hematological cancer)、神經組織癌、黑素瘤、甲狀腺癌、卵巢癌、睪丸癌、前列腺癌、子宮頸癌、陰道癌或膀胱癌。在本文所述任何方法的一些實施方案中，血小板機能不全由化學治療藥引起。在本文所述任何方法的一些實施方案中，已經給予或將要給予受試者化學治療方案或放射治療方案。化學治療方案可包括將一種或多種選自以下的細胞毒性劑給予受試者環磷酰胺、泰素、甲氨蝶呤、氮芥、硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥、氟尿嘧啶、順鉬、諾考達唑、羥基脲、長春新堿、長春堿、依托泊苷(etopiside)、多柔比星、博來霉素、卡鉬、吉西他濱、紫杉醇、托泊替康和硫鳥嘌呤。放射治療方案可包括X射線或Y輻射。放射治療方案可包括將放射性試劑給予受試者。在一些實施方案中，可在化學治療方案或放射治療方案之前將組合物給予受試者。在一些實施方案中，可在化學治療方案或放射治療方案期間或之后將組合物給予受試者。在本文所述任何方法的一些實施方案中，可以靜脈內、皮下、腹膜內或肌內給予受試者組合物。在本文所述任何方法的一些實施方案中，按單劑量或不止一個(例如2、3、4、 5、6、7、8、9、10或15個或更多個)劑量的組合物，將組合物給予受試者。在本文所述任何方法的一些實施方案中，可以在化學治療方案或放射治療方案 (i)之前和(ii)期間或之后將組合物給予受試者。在本文所述任何方法的一些實施方案中，化學治療方案或放射治療方案與在不給予所述組合物的情況下可能是安全可行的相比，可(i)更有效，或(ii)更頻繁地給予受試
者ο在一些實施方案中，本文所述任何方法還可包括給予受試者至少一種用于降低化學治療方案或放射治療方案的副作用的其它物質。所述至少一種物質可選自抗生素、麻醉劑、止吐藥和類固醇，例如雄烯二醇。在一些實施方案中，本文所述任何方法還可包括給予受試者至少一種增加血小板產生的其它物質。所述至少一種增加血小板產生的其它物質可選自以下之一艾曲波帕、奧普瑞白介素、羅米司亭、培非司亭和ESA。在一些實施方案中，本文所述任何方法還可包括在給予組合物后，監測受試者的血小板水平的提高。又一方面，本公開內容的特征在于用于增加受試者的血小板產生的方法，所述方法包括將單劑量的增加血小板產生量的本文描述的TPO模擬抗體或其治療活性片段給予有需要的受試者。本公開內容的特征還在于用于治療受試者的輻射暴露或降低血小板水平的化學治療方案的方法。所述方法包括將單劑量的增加血小板產生量的本文描述的TPO模擬抗體或其治療活性片段給予受試者。受試者可以是已經進行、很可能進行或按計劃進行化學治療方案或放射治療方案的受試者。受試者可以是已經暴露、可能暴露或按計劃暴露
10于輻射的受試者。又一方面，本公開內容的特征在于用于增加受試者的血小板產生的方法，所述方法包括將多次(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次或更多次)劑量的增加血小板產生量的本文描述的TPO模擬抗體或其治療活性片段給予有需要的受試者。本公開內容的特征還在于用于治療受試者的輻射暴露或降低血小板水平的化學治療方案的方法。所述方法包括將多劑量的增加血小板產生量的本文描述的TPO模擬抗體或其治療活性片段給予受試者。受試者可以是已經進行、很可能進行或按計劃進行化學治療方案或放射治療方案的受試者。受試者可以是已經暴露、很可能暴露或按計劃暴露于輻射的受試者。另一方面，本公開內容的特征在于編碼含有至少一種(例如至少2、3、4、5、6或8 種)TPO模擬肽的多肽的核酸，其中所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID N0:10或SEQ ID NO 12所述氨基酸序列有至少80% (例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% )同一性。在一些實施方案中，所述核酸編碼具有與SEQ ID NO: 10的氨基酸1-214有至少80%同一性或與 SEQ ID NO 10的氨基酸1-218有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽，其中SEQ ID NO 10的氨基酸219-232在所述氨基酸序列和SEQ ID NO 10之間有100%同一性。在一些實施方案中，所述核酸編碼具有與SEQ ID NO: 12的氨基酸1-234有至少80%同一性和與SEQ ID N0:12的氨基酸對9-461有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽，其中SEQ ID NO 12 的氨基酸235-248在所述氨基酸序列和SEQ ID NO :12之間有100%同一性。在一些實施方案中，核酸編碼與SEQ ID NO 12的氨基酸1-232有至少80%同一性和與SEQ ID NO 12 的氨基酸251-461有至少80%同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO 12的氨基酸235448 在所述氨基酸序列和SEQ ID NO 12之間有100%同一性。將百分比(％ )氨基酸序列或核酸序列同一性定義為在比對序列和必要時引入空位以達到最大百分比序列同一性之后，候選序列中與參比序列的氨基酸或核酸相同的氨基酸或核酸的百分比。可按本領域技術人員掌握的不同方法實現用于確定百分比序列同一性目的的比對，例如，應用可公開獲取的計算機軟件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或 Megalign(DNASTAR)軟件。測定比對的合適參數，包括對在比較中的全長序列內獲得最大比對所需的任何算法，可通過已知方法確定。除非另有說明，否則本文使用的全部科技術語都具有本公開內容所屬領域普通技術人員通常理解的相同含義。萬一發生抵觸，則以本文件(包括定義)為準。下面描述了優選的方法與材料，然而類似或等同于本文描述的方法與材料也可用于實施或檢驗本發明公開的方法和組合物。所有出版物、專利申請、專利和本文提及的其它參考文獻均通過引用以其整體結合到本文中。根據下面的說明書、實施例和隨附權利要求書，本公開內容的其它特征和優勢 (例如用于增加受試者的血小板產生的方法)是顯而易見的。附圖簡述

圖1是表示重組人TPO和若干TPO模擬物組合物的多劑量方案對小鼠血小板水平的作用的線圖。Y軸表示血小板計數，單位為106/mL。X軸表示開始治療方案后的天數。如雙箭頭所示，治療進行了 5天。黑色圓圈表示用在F(ab’)2抗體的重鏈⑶R3區和輕鏈⑶R2 區含有TPO模擬物的F(ab’)2抗體片段治療的小鼠。空心圓圈表示用不含TPO模擬物的抗補體成分C5抗體(5G1. 1)治療的小鼠。黑色正方形表示用重組人TPO治療的小鼠，黑色菱形表示用在CDR3區含有TPO模擬物的抗補體成分C5抗體(5G1. 1)治療的小鼠。含有TPO 模擬物的抗C5抗體不與C5結合。抗C5抗體的重鏈恒定區是IgG2/IgG4恒定區融合物。圖2是表示TPO模擬抗體的多劑量方案對小鼠血小板水平的作用的線圖。Y軸表示血小板計數，單位為106/mL。X軸表示開始治療方案后的天數。如雙箭頭所示，治療進行了 5天。黑色菱形表示用在重鏈⑶R3區含有TPO模擬物的抗補體成分C5抗體(5G1. 1)治療的小鼠。含有TPO模擬物的抗C5抗體不與C5結合，且抗C5抗體的重鏈恒定區是IgG2/ IgG4恒定區融合物。空心正方形表示用不含TPO模擬物并具有IgGl同種型恒定區的抗炭疽抗體治療的小鼠。黑色三角形(左下角為直角)表示用抗炭疽抗體治療的小鼠，其中每條輕鏈多肽在其羧基端含有TPO模擬肽。黑色三角形(右下角為直角)表示用抗炭疽抗體治療的小鼠，其中每條重鏈多肽在鉸鏈區附近含有TPO模擬物。黑色正方形表示用抗炭疽抗體治療的小鼠，其中每條輕鏈多肽和重鏈多肽含有TPO模擬肽。含有TPO模擬物的各種抗炭疽抗體還含有IgG2/IgG4融合重鏈恒定區。圖3表示TPO模擬抗體的單劑量方案對小鼠血小板水平的作用的線圖。Y軸表示血小板計數，單位為106/mL。X軸表示開始治療方案后的天數。實心正方形表示用在⑶R3 區含有TPO模擬物的抗補體成分C5抗體(5G1. 1)治療的小鼠。含有TPO模擬物的抗C5抗體不與C5結合。含有TPO模擬物的各種抗C5抗體還含有IgG2/IgG4融合重鏈恒定區。星號表示用不含TPO模擬物的抗炭疽抗體治療的小鼠。抗炭疽抗體含有IgGl同種型重鏈恒定區。實心三角形表示用抗炭疽抗體治療的小鼠，其中各輕鏈多肽含有TPO模擬肽。空心三角形表示用抗炭疽抗體治療的小鼠，其中各輕鏈多肽和重鏈多肽含有TPO模擬肽。抗炭疽抗體含有IgG2/IgG4融合重鏈恒定區。菱形表示用不含TPO模擬物的抗炭疽抗體治療的小鼠，其中重鏈恒定區為IgG2/IgG4恒定區。圖4是表示在骨髓抑制療法后CDR-TPO抗體對血小板水平的作用的線圖。Y軸表示血小板計數，單位為106/mL。X軸表示開始治療方案后的天數。實心圓圈表示用絲裂霉素C(MMC)和不含TPO模擬物的抗C5抗體(5G1. 1)治療的小鼠。實心正方形表示用MMC和 ⑶R-TPO抗體(含有插入⑶R3的TPO模擬物的抗C5抗體(5G1. 1))治療的小鼠。含有TPO 模擬物的抗C5抗體不與C5結合。實心菱形表示未用抗體或MMC治療的小鼠。各種含有 TPO模擬物的抗C5抗體還含有IgG2/IgG4融合重鏈恒定區。詳述描述本公開內容的特征在于治療性抗體(例如TPO模擬抗體)及其治療活性片段以及用于制備和使用所述抗體和片段的方法。在不以任何方式予以限制的同時，下面對示例性抗體和片段、綴合物、藥物組合物和制劑以及使用任何前述物質的方法進行詳細說明，并且在工作實施例中舉例說明。治療性抗體及其治療活性片段本文描述的治療性抗體(例如TPO模擬抗體)含有至少兩個(例如2、3、4、5、6、 7、8、9或10個或更多個)治療性肽(例如TPO模擬肽)，其中(i)抗體的輕鏈多肽包含至少一個治療性肽(例如TPO模擬肽)和/或(ii)抗體的重鏈多肽包含至少一個治療性肽 (例如TPO模擬肽)。至少一個治療性肽(例如TPO模擬肽)如下整合到重鏈中(a)整合到鉸鏈區本身；(b)整合到鉸鏈區氨基端和重鏈上游區之間的連接處；(c)整合到鉸鏈區羧基端和重鏈下游區之間的連接處；或(d)整合到始于鉸鏈區氨基端上游少于20 (例如少于 19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 1)個氨基酸內的位置上或者始于鉸鏈區羧基端下游少于 20(例如少于 19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2
或1)個氨基酸內的位置上。按照本公開內容，至少一個治療性肽(例如TPO模擬肽)在結構上允許治療性肽存在于抗體中心裂口的位置上整合到輕鏈多肽的恒定區。在輕鏈多肽恒定區情況下，本文使用的“結構上允許的”區域或位置是指在輕鏈恒定區內的這樣的區域或位置其(1)可容許插入、置換和/或添加治療性肽而又基本上不影響恒定區的三維結構，和( 允許治療性肽存在于抗體的中心裂口而又不影響治療性肽的治療活性。例如，治療性肽可如下整合 (a)添加至輕鏈多肽的恒定區羧基端，或(b)在輕鏈多肽恒定區最終的羧基端β折疊結構下游的位置上插入和/或置換氨基酸。在一些實施方案中，可將治療性多肽整合到輕鏈多肽恒定區的β轉角區，所述β轉角在結構上位于允許整合的治療性肽存在于抗體的中心裂口的位置上。本領域普通技術人員應了解的是如何測定輕鏈多肽恒定區內哪個氨基酸或氨基酸序列可適于這類添加、插入或置換。例如，許多免費可獲得的計算機程序可用來對抗體或其片段的三維結構建模，例如以鑒定治療性肽可整合到其中的合適的輕鏈恒定區β轉角區。合適的計算機程序包括例如C3nD和Rasmol，兩者可分別以電子形式獲自美國國家生物技術信息中心/國立衛生研究院和美國國家科學基金會(U. S. National Center for Biotechnology Information/National Institutes of Health and the U. S. National Science Foundation)。其它程序包括例如 JMol、YASARA、Oscai 1、TINKER、MAGE、ArgusLab 禾口 SwissPDBViewer。在一個實例中，技術人員可使用C3nD觀察人抗破傷風類毒素Fab抗體片段的分子結構，參見 Faber 等(1998) ImmunotechnologyKil :253-270。(另參見 MMDB Id No. 6997)。 技術人員可在片段內鑒定出輕鏈羧基端β轉角序列“EQWKSHK” (SEQ ID NO :13)作為整合治療性肽的可能的合適部位。技術人員還可在片段內鑒定出輕鏈羧基端氨基酸序列 "PAECS"(SEQ ID NO 14)作為整合治療性肽的可能的合適部位。在其它實例中，C3nD可用來觀察與HIV-I gpl40內的表位結合的2F5抗體的人Fab片段分子結構。(參見MMDB Id No. 65747)。因此，技術人員可按照與本公開內容治療性肽的整合潛在地結構上的相容性， 在片段內鑒定出輕鏈羧基端β轉角序列“SDEQLKS”(SEQ ID Ν0 15)和“ADYEKH”(SEQ ID NO 16)和/或輕鏈羧基端氨基酸序列“GEC”。可使用例如Kabat等(1991)“kquenceS of Proteins of Immunological Interest (免疫學所關心的蛋白質序列)”，第1卷，第5版，美國衛生與公眾服務部國立衛生研究院(U. S. D印artment of Health and Human Services, National Institutes of Health) (NIH公布號91-3M2)，鑒定其它抗體的結構上相似區域的氨基酸序列。在這類實施方案中，可將治療性肽插入輕鏈多肽的主題恒定區(例如恒定區的β 轉角區或最終的β折疊結構下游的區域)，和/或肽的整合可全部或部分置換輕鏈多肽的主題恒定區。本文使用的“部分輕鏈多肽恒定區”是指該區域的至少1個(例如至少2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11或12個或更多個)氨基酸。因此，在一些實施方案中，輕鏈多肽恒定區的至少5個氨基酸可被治療性肽(例如TPO模擬肽)置換。要理解的是，置換不必是一對
13一，即原輕鏈恒定區的一個氨基酸被治療性肽(例如TPO模擬肽)的一個氨基酸置換。例如，輕鏈恒定區的最后五( 個氨基酸可以缺失，并被14個氨基酸的TPO模擬肽(例如具有SEQ ID NO :1所述氨基酸序列的TPO模擬肽)置換，從而導致輕鏈羧基端區域的部分置換，并在輕鏈末端有效添加9個氨基酸。在另一個實例中，輕鏈多肽恒定區β轉角區的五 (5)個氨基酸可被14個氨基酸的TPO模擬肽(例如具有SEQ ID NO=I所述氨基酸序列的 TPO模擬肽)置換，從而導致β轉角區部分置換，并有效插入9個氨基酸。在其中治療性肽(例如TPO模擬肽)整合到鉸鏈區本身的實施方案中，治療性肽可為插入物和/或全部或部分鉸鏈區可被治療性肽置換。本文使用的“部分鉸鏈區”是指抗體鉸鏈區的至少 1 個(例如至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、對或25個或更多)氨基酸。因此，在一些實施方案中，鉸鏈區的至少5個氨基酸可被治療性肽(例如TPO模擬肽)置換。部分鉸鏈區可包括重鏈多肽鉸鏈區的氨基端或羧基端上的氨基酸，或者該部分可包括鉸鏈區內部的氨基酸。要理解的是，置換不必一對一，即原鉸鏈區的一個氨基酸被治療性肽(例如TPO模擬肽)的一個氨基酸置換。例如，鉸鏈區氨基端的五(5)個氨基酸可缺失，并被14個氨基酸的TPO模擬肽(參見例如SEQ ID NO 1)置換，從而導致鉸鏈的部分置換，并在重鏈恒定區I(CHl)和部分鉸鏈之間有效插入 9個氨基酸。然而，在一些實施方案中，例如，鉸鏈區的14個氨基酸可被治療性肽(例如具有SEQ ID NO :1或2所述氨基酸序列的TPO模擬肽)等量的14個氨基酸置換。在一些實施方案中，完整鉸鏈區被治療性肽置換。在其中部分或全部鉸鏈區被治療性肽置換的實施方案中，可能是有益的是，包括位于肽的氨基端和羧基端中的一個或兩個的側翼的間隔基氨基酸序列(見下文)。因此，在一些實施方案中，治療性抗體(例如TPO模擬抗體)可含有兩(2)個各自含有至少一個治療性肽的輕鏈多肽和不含治療性肽的兩個重鏈多肽。在一些實施方案中， 本文描述的治療性抗體可含有各自含有至少一個治療性肽(例如TPO模擬肽)的2個重鏈多肽和不含治療性肽的2個輕鏈多肽。在又一個實施方案中，治療性抗體(例如TPO模擬抗體)可含有2條重鏈和2條輕鏈，其中重鏈和輕鏈多肽的每一個含有至少一個本公開內容的治療性肽(例如TPO模擬肽)。在一些實施方案中，各輕鏈多肽和重鏈多肽中的治療性肽可以是相同的治療性肽。例如，各輕鏈多肽和重鏈多肽可具有相同的TPO模擬肽(例如具有SEQ ID Ν0:1所述氨基酸序列的TPO模擬肽)。在一些實施方案中，輕鏈多肽的治療性肽可不同于重鏈多肽中的治療性肽。例如，抗體可包括2個輕鏈多肽和2個重鏈多肽，每個輕鏈多肽含有第一種 TPO模擬肽(例如具有SEQ ID NO 1所述的氨基酸序列)，每個重鏈多肽含有第二種TPO模擬肽(例如具有SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列)。在一些實施方案中，治療性抗體可以是雙重治療性的，因為治療性抗體的一 “臂”(例如Fab區)含有一種類型的本公開內容的治療性肽(例如TPO模擬肽)，而治療性抗體的第二“臂”(例如第二 Fab區)含有不同類型的本公開內容的治療性肽(例如EPO模擬肽)(見下文)。要了解的是，治療性抗體可含有多于2個(例如多于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或
15個或更多個)治療性肽，只要按照本公開內容將至少一個治療性肽整合到重鏈或輕鏈中即可。在其中治療性抗體含有多于2個治療性肽的一些實施方案中，按照本公開內容將至少一個治療性肽整合到輕鏈中，且按照本公開內容將至少一個治療性肽整合到重鏈中。抗體重鏈內鉸鏈區的位置和氨基酸序列為本領域技術人員所熟知。示例性的鉸鏈區氨基酸序列如PCT公布號W007/048022的圖觀中所述，其公開內容(特別是圖28)通過引用以其整體結合到本文中。在一些實施方案中，治療性抗體的至少一個(例如2、3、4個或全部)治療性肽包括具有 IEGPTLRQWLAARA(SEQ ID NO 1)或 IEGPTLRQWLAARAP(SEQ ID NO 2)的氨基酸序列的TPO模擬肽，或者由該TPO模擬肽組成。在一些實施方案中，治療性抗體的至少一個(例如2、3、4個或全部)治療性肽包括具有美國專利申請公布號20030049683圖5中描述的氨基酸序列的TPO模擬肽，或者由該TPO模擬肽組成，其公開內容(特別是圖5)通過引用以其整體結合到本文中。在一些實施方案中，治療性抗體的至少一個(例如2、3、4個或全部) 治療性肽包括具有美國專利號6，083，913表1或表2中所述的氨基酸序列的TPO模擬肽， 或者由該TPO模擬肽組成，其公開內容(特別是表1和表2)通過引用以其整體結合到本文中。可包括在本文描述的治療性抗體中的其它治療性肽包括例如其它模擬肽，例如但不限于EPO模擬肽。例如，合適的EPO模擬肽包括例如DYHCRMGPLTWVCKPLGG(SEQ ID NO: 3)或例如美國專利號5，835，382和5，830，851中描述的任何EPO模擬物。其它實例包括與由配體誘導的同二聚化激活的受體結合的肽，包括具有G-CSF活性、GHR活性和催乳素活性的活性片段，參見Whitty和Borysenko (1999) Chem Biol. 4 :R107-18o合適肽的其它實例包括得自⑶環的神經生長因子模擬物，參見^iccaro等Q000)Med. Chem. 43(19) 3530-40 ；IL-2 模擬物，參見 Eckenberg 等 Q000)J. Immunol. 165(8) :4312-8 ；胰高血糖素樣肽-1，參見Evans等(1999)Drugs R. P. 2 (2) :75-94 能夠促進細胞凋亡并參與例如T細胞穩態、免疫特權(immune privilege)和母體耐受(maternal tolerance)的FasL肽(參見例如 Sheikh 等(2000) Leukemial4 (8) :1509-1513)；胰島素 c_ 肽；胰島素 β-鏈；以及刺激促分裂原活化B細胞增殖的四肽I (D-賴氨酸-L-天冬酰胺酰基-L-脯氨酰基-L-酪氨酸)，參見&^11011等0000) Vaccine 18(18) :1886_92。治療性肽(例如模擬肽)對于其關聯配體或受體可具有激動劑或拮抗劑活性。例如，用于本文描述的治療性抗體的具有受體拮抗活性的肽可包括例如vMIP-II的氨基端肽作為CXCR4的拮抗劑用于治療HIV，參見Luo等Q000) Biochemistry 39 (44) :13545-50 ；用于抗血栓療法的凝血酶受體的拮抗劑肽配體 “AFLARAA” (SEQ ID NO 4)，參見 Pakala 等 Q000) Thromb. Res. 100(1) :89-96 ； 用于減小對麻醉品的耐受性的肽CGRP受體拮抗劑CGRP (8-37)，參見Powe 11等Q000) Br. J. Pharmacol 131(5) :875-84 ；甲狀旁腺激素(PTH) _1受體拮抗劑，參見Hoare等 (2000)PharmacoI.Exp. Ther. 295(2) :761-70 ；用于治療冠狀動脈血栓形成、哮喘、炎性腸病和/或癌癥的整聯蛋白特異性肽模擬物拮抗劑，參見例如PCT公布號W097/36858、TCheng 等(1995) Circulation 丑2151 和 Bovy 等(1994) Bioorg. Med Chem 2 :881 ；阿片樣物質生長因子，參I^igon等(2000) Int. J. Oncol. 17 (5) 1053-61 ；高親和力I型白介素1受體拮抗劑，參見 Yanofsky 等(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :7381-7386 和 Vigers 等 (2000) J. Biol. Chem. 275(47) :36927-36933 ；酸性成纖維細胞生長因子結合肽，參見Fan等 (2000) IUBMBL Life 49(6) :545-48 以及可用于治療受試者的血管生成的模擬肽，參見例如 Mazitschek 等 Q002)Mini Rev Med Chem 2(5) :491_506。
用于鑒定其它治療性肽(例如肽模擬物(p^tidomimetics))的方法是本領域已知的。例如，為了鑒定參與特定生物學功能的蛋白質區域，研究構成該蛋白質的較短的肽片段可揭示履行責任的線性肽表位。或者，通過研究隨機肽的文庫，可以發現模擬天然蛋白質的活性的表示最佳線性表位或不連續表位的肽。一種選擇方法稱為肽噬菌體展示。在這種方法中，產生隨機肽表位文庫，使得肽存在于噬菌體顆粒的表面。然后，可研究肽的這些集合體或文庫中能夠與特定的固定化靶蛋白結合的肽。參見例如Kieber-Emmons等(1997) Curr Opin Biotechnol8 (4) 435~441 ；Gentilucci 等 U006)Curr Med Chem 13(20) 2449-2466 ；Pasqualini 等(1995)J.Cell Biol. 130 :1189-1196 ；Wrighton 等(1996) Science 273 :458-463 ；Cwirla 等(1997)kience 276 1696-1699 ；Koivunen 等(1993) J.Biol Chem. 268 :20205-20210 ；Koivunen 等(1995)Bio/technol. 13:265-270 ；Healy 等 (1995)Biochem. 34 :3948-3955 ；Pasqualini 等(1995) J. Cell Biol. 130 :1189_1196。備選的肽選擇系統也是可行的，包括細胞表面展示和核糖體展示。本文使用的“多肽”、“肽”和“蛋白質”可互換使用，是指任何氨基酸的肽鍵鏈，不論長度或翻譯后修飾。在一些實施方案中，治療性肽(例如TPO模擬肽)可在羧基端和氨基端的一個或兩個上側接間隔基氨基酸序列(或間隔基序列)。可使用間隔基序列例如降低對模擬物的結構約束、允許模擬物更容易地采取生物活性構象和/或使肽更有效地存在于抗體支架的環境下。在一些實施方案中，間隔基序列可包括而不限于一個或多個(例如2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30個或更多個)氨基酸。間隔基序列可包括例如一個或多個脯氨酸或甘氨酸殘基。在一些實施方案中，間隔基氨基酸序列可以是或者可含有氨基酸ARSL(SEQ ID NO :5)。在一些實施方案中，間隔基氨基酸序列可包括或者可以是“PI”(SEQ ID N0:6)、“NP” (SEQ ID NO :7)或“LVG” (SEQ ID NO :8)。在一些實施方案中，TPO 模擬物可在氨基端具有“ARSL”間隔基序列，而在羧基端具有“LVG”間隔基序列。任何抗體(或抗體片段)可用作治療性肽(例如TPO模擬肽)植入其中的支架序列。然而，如果抗體或其片段用于人時，抗體優選為人抗體或人源化抗體。用作支架的一種合適的抗體是人抗破傷風類毒素(TT)抗體或其片段(例如Fab片段)。參見例如Barbas等 (1994) J. Am. Chem. Soc. 116 :2161-2162 和 Barbas 等(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA92 2529-2533.用作本公開內容的支架的其它合適的抗體包括例如工作實施例中給出的抗炭疽抗體(例如抗炭疽PA83或抗炭疽PA63抗原抗體)。在一些實施方案中，可以足以改變或者部分或完全消除抗體的抗原結合特異性的方式，對支架抗體的一個或多個互補決定區(CDR)進行修飾(例如取代、缺失或翻譯后修飾)。用于修飾抗體的CDR的方法是分子生物學領域眾所周知的，并可參見例如Sambrook 等(1989) "Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗指南)，第 2 版，，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.禾口 Ausubel 等 (1992) "Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學最新方案)，”Greene Publishing Associates.此外，測定抗體是否與蛋白質抗原結合和/或抗體對蛋白質抗原的親和力(或喪失親和力)的方法是本領域已知的。例如，可采用各種技術檢測和/或定量測定抗體與蛋白質抗原的結合，例如但不限于蛋白質印跡法、點漬法、等離子表面共振法 (例如BIAcore 系統；Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，N. J.)或酶聯免疫吸附測定(ELISA)法。參見例如Harlow和Lane(1988)“Antibodies :A Laboratory Manual (抗體實驗指南)”CoId Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ；Benny K.C.Lo(2004) "Antibody Engineering :Methods and Protocols (抗體 工程方法與方案)，”Humana Press (ISBN 1588290921) ；Borrebaek (1992) "Antibody Engineering, A Practical Guide (抗體工程實用指導)，” W. H. Freeman 和 Co.，NY ； Borrebaek (1995) "Antibody Engineering (抗體工禾呈)，，，第 2 版，Oxford University Press，NY，Oxford Johne 等(1993) J. Immunol. Meth. 160 :191-198 Jonsson 等(1993) Ann. Biol. Clin.墜19-26 ；以及 Jonsson 等(1991)Biotechniques 11:620-627。另參見美國專利號6，355，M5。這類技術還可用于測定在治療性抗體背景下治療性肽(例如TPO模擬肽)是否保持與其關聯靶標(例如細胞表面受體，例如c-Mpl)結合的能力。例如，工作實施例中給出了測定TPO模擬抗體對c-Mpl的親和力的合適方法。在一些實施方案中，可對治療性抗體(例如TPO模擬抗體)的一個或多個Fc恒定區(例如CH2、CH3或CH4)進行修飾以部分或全部消除其與在宿主細胞上表達的Fc受體結合的能力。修飾包括例如一個或多個Fc恒定區的誘變以及翻譯后修飾。在一些實施方案中，可對治療性抗體(例如TPO模擬抗體)進行修飾，使得該抗體結合Fc受體的能力小于未修飾治療性抗體結合Fc受體的能力的50 % (例如小于45 %、40 %、35 %、30 %、25 %、20 %、 15%,10%,9%,8%,7%,6%,5%,4%,3%,2%,1%>0. 5%或小于 0. 01% ) 測定抗體是否與Fc受體結合的方法是本領域已知的，可參見例如Lund等(1991) J Immunol. 147(8) 2657-62。在一些實施方案中，治療性抗體(例如TPO模擬抗體)的至少一部分可包括由SEQ ID NO :9所述核苷酸序列編碼的氨基酸序列。在一些實施方案中，治療性抗體(例如TPO模擬抗體)的至少一部分可包括由SEQ ID NO :11所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列。在一些實施方案中，治療性抗體(例如TPO模擬抗體)可含有由SEQ ID NO 9所述核苷酸序列編碼的輕鏈氨基酸序列和由SEQ ID NO :11所述核苷酸序列編碼的重鏈氨基酸序列，或者由該輕鏈氨基酸序列和該重鏈氨基酸序列組成。在一些實施方案中，治療性抗體(例如TPO模擬抗體)的至少一部分可包括具有下列氨基酸序列的輕鏈多肽DIQMTQSPSSLSASVCTIRVTLTCRASQGVRNALVWYQQKPGKAPERLIYAASILOSGVPSRFSGSGSGTEFTLTIGG10PEDFATYYCLQHNSYPffTFGQGTKVEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF
YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECARSLlEG^LRQWhAARA
PI(SEQ ID NO :10)。在一些實施方案中，治療性抗體(例如TPO模擬抗體)的至少一部分可包括具有下列氨基酸序列的重鏈多肽QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTYYAMHWVRQAPGQRPEWMGWING⑶GKTKYAQKFQGRLAITRDTSARTAYMELISLTSEDTAYYYCAKGAEMTYGSffGPGTLYTYSS ASTKGPSVFPLAPCSRS
17
TSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS
WTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVA
NPIEGFTLRQWLAARARGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW
D VSQEDP E VQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTYR WSVLTVLHQ
DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO 12)。(上文抗體可變區序列用下劃線表示；各個多肽中的TPO模擬肽氨基酸序列用粗體字表示；抗體恒定區氨基酸序列用斜體字表示。未加強顯示的氨基酸序列相當于間隔基序列)。本公開內容全文中使用的術語“治療性抗體”和“ΤΡ0模擬抗體”是指含有至少兩個(例如至少2、3或4個)本公開內容的治療性肽(例如TPO模擬肽)的整個或完整抗體 (例如IgM、IgG(包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA、IgD或IgE)分子。治療性抗體(例如TPO模擬抗體)還包括完整抗體，其具有至少兩個治療性肽和雜合恒定區或其部分，例如 G2/G4 雜合恒定區(參見例如 Burton 等(1992)Adv. Immun. 51 1-18 ；Canfield 等(1991) J. Exp. Med. 173 1483-1491 ；以及 Mueller 等(1997)Mol. Immunol. 34(6) :441-452)。例如 (并按照Kabat編號)，IgGl和IgG4恒定區含有(；249(；25(1殘基，而IgG2恒定區不含殘基M9， 但卻含有&5。。在其中M9-250區域源自G2序列的G2/G4雜合恒定區中，可對該恒定區進行進一步修飾以便在249位引入甘氨酸殘基，產生具有&49/G25(i的G2/G4融合物。含有(；249/ G250的其它恒定結構域雜合體還可用作本公開內容的TPO模擬抗體的支架。術語“抗體”包括例如嵌合化抗體或嵌合抗體、人源化抗體、去免疫化人抗體和完全人抗體。抗體支架可以在各種物種的任一種中制備或可來源于各種物種的任一種，例如哺乳動物，例如人、非人類靈長類動物(例如猴、狒狒或黑猩猩)、馬、牛、豬、綿羊、山羊、狗、 貓、兔、豚鼠、沙鼠、倉鼠、大鼠和小鼠。本文使用的術語“治療活性抗體片段”，或者在某些情況下“抗體片段”或“治療活性片段”是指以下治療性抗體片段(例如TPO模擬抗體的片段)其(i)在結構上保持至少兩個(例如至少2、3或4個；見上)治療性肽(例如TPO模擬肽)存在于本公開內容的完整治療性抗體上；和(ii)功能上保持至少10% (例如至少12%、至少15%、至少20%、 至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、至少99. 5%或100%或更多)的完整治療性抗體的治療活性。例如，本文描述的 TPO模擬抗體的治療活性片段，可保持至少10%的完整TPO模擬抗體的TPO樣活性(見下文的“用于產生治療性抗體或其治療活性片段的方法”)。在另一個實例中，含有紅細胞生成素(EPO)模擬肽的抗體的治療活性片段可保持至少10%的完整“ΕΡ0模擬抗體”的EPO 樣活性。治療性抗體的治療活性片段包括例如單鏈抗體、單鏈Fv片段(ScFv)、Fd片段、 Fab片段、Fab，片段或F(ab，)2片段。scFv片段是包括scFv從其中衍生的抗體的重鏈和輕鏈可變區兩者的單一多肽鏈。另外，可以制備與至少部分重鏈和/或輕鏈恒定區融合且含有至少兩個本公開內容的治療性肽的微型抗體(minibodies)、三鏈抗體和雙鏈抗體(參見例如！"odorovska 等 Q001)J Immunol Methods 248(1) :47-66 ；Hudson 和 Kortt (1999) J Immunol Methods 231 (1) :177-189 ；以及 Pol iak (1994) Structure〗(12) :1121-1123,所述每份文獻的公開內容通過引用以其整體結合到本文中)，并將其用于本文所述方法中。在一些實施方案中，雙特異性抗體(或其片段例如F(ab’)2)可用作引入至少兩個本公開內容的治療性肽的支架。在一些實施方案中，保持了雙特異性抗體的至少一個(或兩個)抗原結合部位的抗原結合能力。例如，可將兩個或更多個治療性肽整合到本公開內容的雙特異性抗體的一個臂(例如Fab區)上，但不整合到雙特異性抗體的第二臂(例如第二 Fab區)上。在另一個實例中，治療性肽可整合到雙特異性抗體的兩個臂(例如兩個 Fab區)上，其中抗體臂的至少一個(或兩個)的抗原結合能力不受治療性肽的整合的影響。例如，可以使用這種治療性雙特異性抗體(其全部包括在術語“治療性抗體”中)，以使治療性抗體的治療性肽靶定特定靶細胞。例如，如果治療性雙特異性抗體含有TPO模擬肽， 則治療性雙特異性抗體的至少一個抗原結合部位可與巨核細胞上的蛋白質標志物結合。合適的巨核細胞蛋白質標志物包括例如⑶41 (Ilb/IIIa)和⑶42 (Ib)。ffl〒一臺牛本ggj^臺牛M·胃白句力fe可采用分子生物學和蛋白質化學領域已知的各種技術制備治療性抗體(例如 TPO模擬抗體)或其治療活性片段。例如，可采用重組DNA技術，例如但不限于PCR重疊、 限制性內切酶位點克隆、位點特異性誘變和完全合成法，將編碼治療性肽(例如TPO模擬肽)的DNA序列植入編碼抗體的DNA序列中，從而用所述肽序列置換抗體的鉸鏈區。位點特異性誘變可按若干方法實現。一種以dut/ung Kunkel誘變(Kunkel (198 Natl. Acad. Sci. USA 82 :488-92)為基礎。若干基于PCR擴增的誘變方法也是市售的，例如 QuickChange⑧位點定向誘變試劑盒和ExSite PCR型位點定向誘變試劑盒(Stratagene， La Jol la，California)。另一種非PCR方法是GeneEditor 體外位點定向誘變系統 (Promega Corporation, Madison, Wisconsin)。完全合成法也是眾所周知的,可參見例如 Deng等(19%)Methods Mol. Biol. 51 :329-42 ；Kutemeler 等(1994)Biotechniques 17(2) 242-246 ;Shi 等(1993)PCRMethods Appl. 3(1) :46-53 以及 Knuppik 等(2000)J. Mol. Biol.296(1) :571-86。還可應用標準分子生物學技術引入位于治療性肽(例如TPO模擬肽)的羧基端和 /或氨基端側翼的間隔基氨基酸序列。如上所述，這種側翼序列可用于例如降低對治療性肽的結構約束，并允許肽更易于采取生物活性所必需的構象。在一些實施方案中，側翼區可包括例如一個或多個脯氨酸殘基。參見例如Kini和 Evans(1995)Biochem Biophys Res Commun212(3) :115-24和 Kini 等(1995)FEBS Letters @:15-17。在一些實施方案中，將一個或多個脯氨酸殘基添加至治療性肽(例如TPO模擬肽)的羧基端。在一些實施方案中，間隔基氨基酸序列可包括例如任何SEQ ID N0s:5_8中的一個或多個。可將核酸插入含有轉錄和翻譯調節序列的表達載體中，所述轉錄和翻譯調節序列包括例如啟動子序列、核糖體結合部位、轉錄起始序列和終止序列、翻譯起始序列和終止序列、轉錄終止子信號、聚腺苷酸化信號和增強子或激活因子(activator)序列。調節序列包括啟動子及轉錄起始序列和終止序列。另外，表達載體可包括不止一個復制系統，從而可保持在兩種不同的生物中，例如在哺乳動物或昆蟲細胞中用于表達，在原核宿主中用于克隆和擴增。可得到若干可行的載體系統用于在哺乳動物細胞中自核酸表達克隆的重鏈和輕鏈多肽。載體的一個類別依賴于所需基因序列整合到宿主細胞基因組中。可通過同時引入抗藥基因例如大腸桿菌 gpt (Mulligan 和 Berg (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 :2072) 或 Tn5 neo (Southern 和 Berg (1982)Mol. App 1. Genet. 1:327)，來選擇具有穩定整合的 DNA 的細胞。可將選擇標記基因與待表達的DNA基因序列連接，或者通過共轉染導入相同細胞中(Wigler等(1979)Cell星:77)。載體的第二個類別利用賦予染色體外質粒自主復制能力的DNA元件。這些載體可來源于動物病毒，例如牛乳頭瘤病毒(Sarver等(1982)Proc. Natl. Acad. ki.USA，！^ :7147)、多瘤病毒(Deans 等(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 1292)或 SV40 病毒(Lusky 和 Botchan (1981) Nature293 :79)。可以適于隨后的核酸表達的方式，將表達載體導入細胞中。導入方法大部分由下述靶定的細胞類型規定。示例性方法包括CaPO4沉淀、脂質體融合、lipofectin、電穿孔、病毒感染、葡聚糖介導的轉染、1，5_ 二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物介導的轉染、原生質體融合和直接顯微注射。用于表達治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其治療活性片段的合適宿主細胞包括酵母、細菌、昆蟲、植物和哺乳動物細胞。特別關注的是細菌，例如大腸桿菌；真菌，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)；昆蟲細胞， 例如SF9 ；哺乳動物細胞系(例如人細胞系)以及原代細胞系。在一些實施方案中，治療性抗體可在轉基因動物(例如轉基因哺乳動物)中表達和純化。例如，治療性抗體可在轉基因非人類哺乳動物(例如嚙齒動物)中產生，并且從乳汁中分離，參見例如 Houdebine(2002)Curr Opin Biotechnol 13(6) :625-629 ；van Kuik-Romeijn等 Q000)Transgenic Res 9(2) :155-159 ；以及Pollock等(1999) J Immunol Methods231(l-2) :147_157。通過在以下條件下和持續以下時間量，培養用含有編碼治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其片段的核酸的表達載體轉化的宿主細胞，從該細胞中產生所述抗體和片段， 所述條件和時間量足以允許蛋白質表達。用于蛋白質表達的這類條件隨表達載體和宿主細胞的選擇而變化，且本領域技術人員通過常規實驗法容易確定。例如，在大腸桿菌中表達的治療性抗體可從包含體中再折疊(參見例如Hou等(1998)Cytokine叢319-30)。細菌表達系統及其應用方法是本領域眾所周知的(參見Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學最新方案)，ffiley&Sons ；以及 Molecular Cloning—A Laboratory Manual—3rd Ed.(分子克隆實驗室指南第三版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(2001))。密碼子、合適的表達載體和合適的宿主細胞的選擇取決于許多因素而變化，并且可根據需要容易地使之最優化。治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其片段可在哺乳動物細胞或其它表達系統中表達，包括但不限于酵母、桿狀病毒和體外表達系統(參見例如Kaszubska等 Q000)ftOtein Expression and Purification 18 :213-220) 在表達后，可以分離治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其片段。應用于本文描述的任何蛋白質(例如TPO模擬抗體蛋白質或其片段)的術語“純化的”或“分離的”是指從天然與之相伴(例如表達蛋白質的原核生物中的其它蛋白質、脂質和核酸)的組分(例如蛋白質或其它天然存在的生物分子或有機分子)中分離或純化的多肽。通常，當多肽構成樣品中總蛋白質重量的至少60% (例如至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、 95%、97%或99%)時，該多肽是純的。可以本領域技術人員已知的各種方法，分離或純化治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其片段，這取決于樣品中存在哪些其它組分。標準純化方法包括電泳技術、分子技術、免疫技術和層析技術，包括離子交換層析法、疏水層析法、親和層析法和反相HPLC層析法。例如，可采用標準抗抗體柱(例如A蛋白柱或G蛋白柱)純化TPO模擬抗體。還可使用與蛋白質濃縮聯合的超濾和滲濾技術。參見例如kopes (1994) "Protein Purification, 3rd edition(蛋白質純化第三版)，”Springer-Verlag，New York City,New York。所需的純化程度將隨所需要的應用而變化。在某些情況下，可能需要未純化的表達的治療性抗體 (例如TPO模擬抗體)或片段。測定純化的治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其片段的產量或純度的方法是本領域已知的，包括例如Bradford測定法、紫外光譜法、雙縮脲蛋白質測定法、Lowry蛋白質測定法、胺黑蛋白質測定法、高壓液相層析法(HPLC)、質譜法(MQ和凝膠電泳法(例如采用蛋白質染色，例如考馬斯藍或膠體銀染色)。在一些實施方案中，可從治療性抗體或片段中除去內毒素。從蛋白質樣品中除去內毒素的方法是本領域已知的，并在工作實施例中舉例說明。例如，可采用各種市售試劑，包括而不限于ftOteoSpin 內毒素去除試劑盒(Norgen Biotek Corporation)、 Detoxi-Gel 內毒素去除凝膠(Thermo Scientific ；Pierce Protein Research Products)、MiraCLEAN 內毒素去除試劑盒(Mirus)或 Acrodisc -Mustang E 膜(Pall Corporation)從蛋白質樣品中除去內毒素。用于檢測和/或測定樣品中存在的內毒素的量的方法(純化之前和之后)是本領域已知的，并且可獲得市售試劑盒。例如，可采用QCL-1000顯色試劑盒(BioWhittaker)、基于鱟變形細胞溶解物(LAL)的試劑盒例如可得自Associates of Cape Cod Incorporated 的 Pyrotell 、Pyrotell -T、Pyrochrome ⑧、Chromo-LAL 和 CSE 試劑盒，測定蛋白質樣品中內毒素的濃度。工作實施例中還給出了用于產生和純化治療性抗體的合適方法。治療性抗體和片段的修飾可在治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其治療活性片段表達和純化后對其進行修飾。修飾可以是共價修飾或非共價修飾。可通過例如使多肽的靶定氨基酸殘基與能夠與所選的側鏈或末端殘基反應的有機衍生劑反應，將這類修飾引入抗體或片段內。可采用多種標準的任一種(包括例如治療性抗體或片段蛋白質的結構分析或氨基酸序列分析)選擇用于修飾的合適部位。在一些實施方案中，可使治療性抗體或其治療活性片段與異源部分綴合。異源部分可為例如異源多肽、治療劑(例如毒素或藥物)或可檢測標記，例如但不限于放射性標記、酶標記、熒光標記或發光標記。合適的異源多肽包括例如用于純化治療性抗體或片段的抗原標簽(例如FLAG、聚組氨酸、血凝素(HA)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)或麥芽糖結合蛋白(MBP))。異源多肽還包括用作診斷標記或檢測標記的多肽，例如螢光素酶、綠色熒光蛋白(GFP)或氯霉素乙酰基轉移酶(CAT)。合適的放射性標記包括例如％P、33P、14C、125I、131I、35S 和3H。合適的熒光標記包括而不限于熒光素、異硫氰酸熒光素(FITC)、GFP、DyLight 488、 藻紅蛋白(PE)、碘化丙錠(PI), PerCP, PE-Alexa Fluor 700、Cy5、別藻藍蛋白和Cy7。發光標記包括例如各種發光鑭系元素(例如銪或鋱)螯合物的任一種。例如，合適的銪螯合物包括二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)的銪螯合物。酶標記包括例如堿性磷酸酶、CAT、螢光素酶和辣根過氧化物酶。可使用許多已知化學交聯劑的任一種使兩種蛋白質(例如TPO模擬抗體和異源氨基酸序列)交聯。這類交聯劑的實例為通過包括“受阻的”二硫鍵在內的鍵連接兩個氨基酸殘基的交聯劑。在這些鍵中，交聯單元內的二硫鍵受保護(通過二硫鍵任一側的阻礙基團)不被例如還原型谷胱甘肽或二硫化物還原酶作用的還原。一種合適的試劑，4-琥珀酰亞胺基氧基羰基-α-甲基-α (2-吡啶基聯硫基)甲苯(SMPT)，在兩種蛋白質之間利用一種蛋白質的末端賴氨酸和另一種蛋白質的末端半胱氨酸形成這類鍵。還可使用通過各種蛋白質上的不同偶聯部分交聯的異雙官能試劑。其它有用的交聯劑包括而不限于連接以下基團的試劑兩個氨基(例如Ν-5-疊氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亞胺)、兩個巰基(例如1，4_雙-馬來酰亞胺丁烷)、氨基與巰基(例如間馬來酰亞胺苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯)、氨基與羧基(例如4-[對疊氮基水楊基酰氨基]丁胺)和氨基與存在于精氨酸側鏈的胍基(例如對疊氮基苯基乙二醛一水合物)。放射性標記可與蛋白質的氨基酸主鏈直接綴合。或者，還可包括放射性標記作為較大分子的部分(例如間-[125I]碘苯基-N-羥基琥珀酰亞胺([125I]mIPNHS)中的1251，其與游離氨基結合形成相關蛋白質的間碘苯基(mIP)衍生物(參見例如Rogers等(1997) J. Nucl. Med. 38 =1221-1229)或螯合物(例如與DOTA或DTPA)，其繼而與蛋白質主鏈結合。 使放射性標記或含有放射性標記的較大分子/螯合物與治療性抗體或其治療活性片段綴合的方法是本領域已知的。這類方法包括在有利于放射性標記或螯合物與蛋白質結合的條件下(例如PH、鹽濃度和/或溫度)，將蛋白質與放射性標記一起溫育(參見例如美國專利號 6，001，329)。使熒光標記(有時稱為“熒光團”)與蛋白質(例如治療性抗體或其治療活性片段)綴合的方法是蛋白質化學領域已知的。例如，可使用與熒光團連接的琥珀酰亞胺基 (NHS)酯或TFP酯部分，使熒光團與蛋白質的游離氨基(例如賴氨酸的游離氨基)或巰基 (例如半胱氨酸的巰基)綴合。在一些實施方案中，可使熒光團與異雙官能交聯劑部分例如磺基-SMCC綴合。合適的綴合方法包括在有利于熒光團與蛋白質結合的條件下，使治療性抗體蛋白質或其片段與熒光團一起溫育。參見例如Wfelch和RedvanlyOOO； ) "Handbook of Radiopharmaceuticals = Radiochemistry and Applications (放射性藥品手冊放射化學與應用)，”John Wiley and Sons (ISBN 0471495603)。如上所述，本文描述的治療性抗體或其治療活性片段對包含在其中的治療性肽提供延長的血清半壽期。然而，在一些實施方案中，可用例如促進抗體本身在循環(例如血液、血清或其它組織)中穩定和/或保留的部分，對抗體或片段進行修飾。例如，可如下所述對抗體或片段進行聚乙二醇化例如Lee等(1999) Bioconjug. ChemlO (6) :973-8 ； Kinstler^ (2002)Advanced Drug Deliveries Reviews M :477-485 ； 1 Roberts φ (2002)Advanced Drug Delivery Reviews M :459_476。穩定部分可將抗體(或片段)的穩定性或保留提高至至少1. 5倍(例如至少2、5、10、15、20、25、30、40或50倍或更多倍)。 穩定部分還可將治療性肽(與游離形式治療性肽相比)的穩定性或保留提高至至少1. 5倍 (例如至少2、5、10、15、20、25、30、40或50倍或更多倍)。測定治療件抗體或片段的牛物活件可應用各種體外和體內生物測定法測定本文描述的治療性抗體或抗體的治療活性片段的生物活性。所述方法可隨抗體中所包含的特定治療性肽的活性而改變。例如，可采用例如集落形成測定法、增殖測定法、磷酸化測定法和/或基于轉錄的測定法，來測定所述TPO模擬抗體、片段或綴合物的血小板生成素樣活性。集落形成測定法測定由從受試者中獲得的骨髓樣品中形成的巨核細胞集落(參見例如MegaCUlt C試劑盒，得自Mem Cell Technologies Inc. , Vancouver BC，Canada)。可采用增殖測定法測定與缺乏TPO模擬抗體、片段或綴合物時相比，TPO模擬抗體、片段或綴合物存在時表達c-Mpl受體的Ba/F3細胞的增殖。參見例如 Cwirla 等(1997)kience 互1696-1699 和 de Sauvage 等(1994) Nature 2巡533。與缺乏TPO模擬抗體(或片段)時的細胞增殖量相比，與TPO模擬抗體 (或片段)接觸的細胞增殖的增加表示TPO模擬抗體(或片段)具有TPO樣生物活性。可通過測定JAK2或Mat3或Mat5的磷酸化，來測定c_Mpl受體的活化，作為對TPO模擬抗體活性的衡量，參見例如 Drachman 等(1999) J. Biol. Chem. 274 :13480-13484 和 Miyakawa 等(1996)Blood 87^21:439-46ο可采用美國專利申請公布號20030049683中描述的基于轉錄的測定法，測定TPO模擬抗體或其治療活性片段的活性。例如，哺乳動物細胞可用編碼全長c-Mpl受體和螢光素酶基因的核酸(其表達受C-Fos啟動子的控制)轉染。使細胞表達c-Mpl受體后，在以下條件下并持續以下時間，使細胞與TPO模擬抗體或其治療活性片段接觸，所述條件和時間允許抗體與受體結合。與未與抗體接觸的細胞產生的螢光素酶的量相比，該細胞中產生的螢光素酶量的增加表示TPO模擬抗體具有TPO樣活性。另外，可采用本領域已知的各種體內技術，測定TPO模擬抗體或其治療活性片段的TPO樣活性。例如，可在給予TPO模擬抗體或其片段后，測定小鼠中產生的血小板水平。 與未接受治療的小鼠相比，受治療小鼠產生的血小板的增加表示TPO模擬抗體或片段具有 TPO樣活性。工作實施例中舉例說明了示例性體內測定法(例如測定動物中的血小板產生和/或研究TPO模擬抗體對暴露于輻射中的動物存活的影響)。對于含有紅細胞生成素(EPO)模擬肽的治療性抗體(或片段)，可采用以下測定法測定抗體或片段的EPO樣活性骨髓類紅細胞集落形成測定法(參見例如Wrighton等 (1996) Science 273 :458-463)；人紅白血病細胞增殖測定法(Kitamura 等(1989) J. Cell Physiol. 140 :323-334)和/或磷酸化或轉錄活化測定法，參見例如Witthuhn等(1993) Cell74 :227-236。例如，一種有用的體外測定法利用來源于急性成巨核細胞白血病患者的 EPO 依賴性UT-7/EP0細胞系(參見例如 Komatsu 等(1993)Blood 82(2) :456-464)。在撤除補充了 rHuEPO的培養基后，UT-7/EP0細胞經歷細胞凋亡。然而，如果用rHuEPO或EPO激動劑處理，則細胞得救。因此，可使含有EPO的治療性抗體或其治療活性片段與饑餓的UT-7/ EPO細胞接觸，并測定細胞的存活力。與缺乏治療性抗體情況下的細胞存活率相比，與治療性抗體接觸的饑餓細胞存活率的提高表示治療性抗體具有EPO樣活性。藥物組合物可將含有本文描述的治療性抗體(例如TPO-模擬抗體)或其治療活性片段的組
23合物配成藥物組合物，用于例如給予受試者以增加血小板產生。藥物組合物一般包括藥學上可接受的載體。本文使用的“藥學上可接受的載體”是指并包括生理上相容的任何和所有溶劑、分散介質、包衣材料、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延緩劑等。組合物可包含藥學上可接受的鹽，例如酸加成鹽或堿加成鹽(參見例如Berge等(1977) J. Pharm. Sci. 66 1-19)。可按照標準方法配制組合物。藥物配制是充分確立的領域，可進一步參見例如 Gennaro (2000) "Remington :The Science and Practice of Pharmacy (Remington :制藥科學與實踐)，，，第 20 版，Lippincott, Williams&ffilkins (ISBN :0683306472) ；Ansel 等 (1999) "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (藥物劑型與遞藥系統)，”第 7 版，Lippincott Wi lliams&ffi lkins Publishers (ISBN :0683305727)；以及 Kibbe(2000) "Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association (美國制藥協會藥用賦形劑手冊)，”第3版(ISBN :091733096X)。在一些實施方案中，可將組合物配成例如合適濃度并適于2-8°C (例如4°C)保存的緩沖溶液。在一些實施方案中，可配制用于保存在低于0°C (例如-20°C或-80°C)溫度的組合物。在一些實施方案中，可配制在2-8°C (例如4°C )下保存長達2年(例如1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、1 年或2年)的組合物。 因此，在一些實施方案中，本文描述的組合物在2-8°C (例如4°C )保存至少1年是穩定的。藥物組合物可以呈各種形式。這些形式包括例如液體、半固體和固體劑型，例如液體溶液劑(例如注射溶液劑和輸注溶液劑(infusible solution))、分散劑或混懸劑、片劑、丸劑、散劑、脂質體和栓劑。優選的形式部分取決于預定的給藥方式和治療應用。例如， 欲全身或局部遞送的含有抗體或片段的組合物可呈注射溶液劑或輸注溶液劑的形式。因此，可制備通過胃腸外方式(例如靜脈內、皮下、腹膜內或肌內注射)給藥的組合物。本文使用的“胃腸外給藥”、“胃腸外給予”和其它語法上的等同表述，是指腸內和局部給藥以外的給藥方式，通常通過注射，包括而不限于靜脈內、鼻內、眼內、經肺、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心臟內、真皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、 硬膜外、大腦內、顱內、頸動脈內和胸骨內注射和輸注(見下文)。可將組合物制成溶液劑、微乳劑、分散劑、脂質體或適于以高濃度穩定保存的其它有序結構。可以所需要的量將本文所述抗體(或抗體的片段)與一種上文列舉的成分或所述成分的組合(按需要)一起加入合適的溶劑中，接著過濾除菌，來制備無菌注射溶液劑。 總的來講，通過將本文所述抗體或片段加入含有基礎分散介質和來自上文列舉那里的所需其它成分的無菌溶媒中，來制備分散劑。在用于制備無菌注射溶液劑的無菌粉末的情況下， 制備方法包括將其前述過濾除菌溶液真空干燥和冷凍干燥，得到本文描述的治療性抗體 (例如TPO模擬抗體)或其治療活性片段加任何其它所需成分(見下文)的粉末。例如，可通過使用包衣材料(例如卵磷脂)、在分散劑的情況下通過保持所需粒度、以及通過使用表面活性劑，來維持溶液的適當流動性。可通過在組合物中包含延緩吸收的試劑(例如一硬脂酸鹽和明膠)，使注射組合物的吸收延遲。在某些實施方案中，可用保護化合物不快速釋放的載體制備治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其治療活性片段，例如控釋制劑，包括植入物和微囊化遞送系統。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這類制劑的許多方法是本領域已知的。參見例如 J. R. Robinson (1978) "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (緩釋和控釋遞藥系統)，”Marcel Dekker，Inc.，New York。可將編碼治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其治療活性片段的核酸整合到基因構建體中，所述構建體將用作基因療法方案的部分以遞送可用來在細胞內表達和產生作用劑的核酸(見下文)。可在任何治療有效的載體(例如體內能夠將成分基因有效遞送到細胞中的任何制劑或組合物)中給予這類組分的表達構建體。方法包括將主題基因插入包括重組反轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、慢病毒和單純皰疹病毒-I(HSV-I)在內的病毒載體或者重組細菌質粒或真核質粒。病毒載體可直接轉染細胞；可借助例如陽離子脂質體(Iipofectin)或衍生化(例如抗體綴合的)、聚賴氨酸綴合物、短桿菌肽S、人工病毒包膜或其它這類胞內載體以及直接注射基因構建體或體內進行CaPO4沉淀(參見例如 W004/060407)，來遞送質粒DNA。(另參見下文的“離體方法”)。合適反轉錄病毒的實例包括本領域技術人員已知的pLJ、pZIP、pTO和pEM(參見例如Eglitis等(1985)kience 230 1395-1398 ；Danos 和 Mulligan(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :6460-6464 ；Wilson 等(1988) Proc. Natl. Acad. ki. USA 85 :3014-3018 ；Armentano 等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :6141-6145 ；Huber 等(1991) Proc. Natl. Acad. ki. USA巡8039-8043 ； Ferry 等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :8377-8381 ；Chowdhury ^ (1991)Science 254 :1802-1805 ；van Beusechem 等(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :7640-7644 ； Kay 等(1992)Human Gene Therapy 3 :641-647 ；Dai 等(1992)Proc. Natl. Acad, ki. USA89 :10892-10895 ；Hwu 等(1993) J. Immunol. 150 4104~4115 ；美國專利號 4，868，116 和 4，980, 286 ；PCT 公布號 W089/07136、W089/0M68、W089/05345 和 1092/0757 。另一種病毒基因遞送系統利用腺病毒衍生載體(參見例如Berkner等(1988)Biotechniques 6 :616 ； Rosenfeld 等(1991) Science 252 :431-434 以及 Rosenfeld 等(1992) CellM 143-155)。 自腺病毒毒株Ad型5dl3M或其它腺病毒毒株(例如Ad2、Ad3、Ad7等)衍生的合適的腺病毒載體為本領域技術人員所知。可用于遞送主題基因的又一種病毒載體系統為腺伴隨病毒 (AAV)。參見例如 Flotte 等(1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7 :349-356 ；Samulski 等 (1989) J. Virol. M :3822-3828 ；以及 McLaughlin 等(1989) J. Virol62 :1963_1973。在一些實施方案中，TPO模擬抗體或其治療活性片段可與可用于增加受試者的血小板產生的一種或多種其它活性劑一起配制。用于增加受試者的血小板產生的其它活性劑包括而不限于 Promacta /Revolade (艾曲波帕；GlaxoSmithKline)、Nplate (羅米司亭；Amgen, Inc.)禾口 Neumega (奧普 1晶白介素；rhIL—11, Genetics Institute, Inc.)。 在一些實施方案中，TPO模擬抗體或其治療活性片段可與可用于治療貧血癥或中性粒細胞減少癥的一種或多種其它活性劑一起配制，所述活性劑包括例如，紅細胞生成刺激劑 (erythropoiesis stimulating agent, ESA)或 Neulasta (培非司亭；Amgen，Inc.)。ESA 包括而不限于Procrit (阿法依泊汀；Ortho Biotech)、Epogen (阿法依泊汀；Amgen, Inc.)禾口 Aranesp (達貝泊汀 α ；Amgen, Inc.)。 在一些實施方案中，TPO模擬抗體或其治療活性片段可與可用于治療輻射暴露癥狀的一種或多種其它作用劑一起配制。例如TPO模擬抗體或片段可與抗生素、麻醉劑、止吐藥、類固醇(例如雄烯二醇例如4-雄烯二醇或5-雄烯二醇)、螯合劑和干細胞一起配制。合適的止吐藥包括而不限于5-HT3受體拮抗劑、多巴胺拮抗劑和大麻素。參見例如Dormerer J. (2003) "Antiemetic Therapy (止吐療法)，” Karger Publishers (ISBN 3805575475)。 具有螯合劑的制劑可用于其中待治療的受試者是暴露于放射性核素例如銫-137或鉈-201 的受試者的實施方案。合適的螯合劑包括例如Ca-DTPA、Zn-DTPA、Radi0gardaseTM(亦稱“普魯士藍”)、去鐵胺(deferoximine)和青霉胺(penicillamine)。在一些實施方案中，TPO模擬抗體或其片段可與放射性核素頂替劑(例如但不限于碘化鉀或鈣鹽)一起配制。在一些實施方案中，TPO模擬抗體或其片段可與刺激放射性同位素從受試者中排泄的作用劑一起配制。例如，抗體或片段可與利尿藥一起配制。在一些實施方案中，例如，如果受試者中血小板計數降低由感染引起(例如感染相關性血栓性血小板減少性紫癜或DIC)，則抗體或其片段可與用于治療感染(例如細菌感染或病毒例如HIV感染)的一種或多種作用劑一起配制。例如，抗體或片段可與抗生素或抗病毒藥一起配制。抗生素根據感染類型而變化，但可包括例如青霉素、紅霉素、克拉霉素或多西環素。同樣，抗病毒藥根據感染類型而變化。例如，可用于治療HIV感染的抗病毒藥包括例如HIV蛋白酶抑制劑、HIV整合酶抑制劑、HIV反轉錄酶抑制劑或抑制HIV結合和/ 或HIV進入細胞的抑制劑。當治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其治療活性片段與第二活性劑聯用時，作用劑可單獨配制或一起配制。例如，可將各種藥物組合物例如在臨給藥前混合、同時給予或者各種組合物可在例如同一時間或不同時間分開給予(見下文)。如上所述，可以配制組合物使得它包含治療有效量(例如增加血小板產生的量) 的治療性抗體或其治療活性片段，或者可將組合物配制成包含亞治療量的抗體和亞治療量的一種或多種其它活性劑，使得總組分是治療有效的(例如對于治療輻射暴露的受試者或增加受試者的血小板產生是治療有效的)。例如，組合物可包含亞治療量的各TPO模擬抗體和艾曲波帕，使得兩種藥劑的總量對受試者而言是治療有效的。測定治療有效劑量的方法是本領域已知的并描述于本文。治療方法根據特定的治療性肽，上述組合物尤其可用于各種治療方法。例如，TPO模擬抗體可用于增加有需要的受試者(例如人)的血小板產生的方法。可采用各種方法將組合物給予受試者，例如人受試者，這部分取決于給藥途徑。給藥途徑可為例如靜脈內注射或輸注 (IV)、皮下注射(Sc)、腹膜內(IP)或肌內注射。可以通過例如局部輸注、注射或通過植入物的方法給藥。植入物可為多孔材料、無孔材料或膠狀材料，包括膜，例如硅橡膠膜(sialastic membrane)或纖維。可將植入物配成向受試者持續釋放或定期釋放組合物。(參見例如美國專利公布號20080241223 ；美國專利號 5，501，856,4, 863，457 以及 3，710，795、EP 488401 和 EP 430539，所述每份文獻的公開內容通過引用以其整體結合到本文中)。可通過基于例如擴散、易蝕或對流系統的可植入裝置將組合物遞送給受試者，例如滲透泵、生物可降解植入物、電致擴散系統、電滲系統、蒸氣壓泵、電解泵、泡騰泵(effervescent pump)、壓電泵、侵蝕型系統或機電系統。治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其治療活性片段的合適劑量(例如能夠增加受試者的血小板產生的劑量)可取決于多種因素，包括例如待治療的受試者的年齡、性別和體重以及所使用的具體治療性抗體。例如，與治療同一受試者所需要的TPO模擬抗體片段的劑量相比，可能需要不同劑量的TPO模擬抗體以增加受試者的血小板產生。影響給予受試者的TPO模擬抗體的劑量的其它因素包括例如受試者中血小板水平下降的原因或血小板計數降低的嚴重程度。例如，與患有輻射誘發性血小板減少癥的受試者相比，患有特發性血小板減少性紫癜(ITP)的受試者可能需要給予不同劑量的TPO模擬抗體(或片段)。 影響特定治療性抗體(或片段)的劑量的其它因素可包括例如同時或之前累及受試者的其它醫學病癥、受試者的一般健康狀況、受試者的遺傳素因、飲食、給藥時間、排泄率、藥物組合和給予受試者的任何其它額外的治療藥。還應當理解的是，任何特定受試者的具體劑量和治療方案將取決于治療醫學從業人員(例如醫生或護士)的判斷。可按固定劑量或者以微克/千克(yg/kg)或毫克/千克(mg/kg)劑量給予治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或片段。在一些實施方案中，還可以選擇劑量以進一步降低或避免針對組合物中的一種或多種活性劑產生抗體或其它宿主免疫應答。雖然絕無意限制，但是本文描述的抗體或其片段的示例性劑量包括例如1-100μ g/kg、0. 5-50 μ g/ kg、0. 1-100 μ g/kg、0. 5-25 μ g/kg、1-20 μ g/kg 禾口 1-10 μ g/kg、l-100mg/kg、0. 5_50mg/kg、 0. l-100mg/kg、0. 5-25mg/kg、l-20mg/kg 和 l-10mg/kg。治療性抗體(例如 TPO模擬抗體)的示例性劑量包括而不限于 0. 1 μ g/kg、0. 5 μ g/kg、1. 0 μ g/kg、2. 0 μ g/kg、4 μ g/kg 和 8 μ g/ kg、0. lmg/kg、0. 5mg/kg、l. 0mg/kg、2. 0mg/kg、4mg/kg 禾口 8mg/kg。藥物組合物可包含治療有效量的治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其治療活性片段。本領域普通技術人員部分根據所給予的抗體(或片段)的作用或者所述抗體和一種或多種其它活性劑(如果使用不止一種活性劑)的聯合作用，可容易地確定這類有效量。治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其片段的治療有效量還可隨例如個體的疾病狀態、年齡、 性別和體重以及抗體(和一種或多種其它活性劑)在個體中引起所需反應的能力(例如受試者中血小板產生的增加)等因素而變化。例如，治療有效量的TPO模擬抗體或其片段可增加個體的血小板產生，因此可例如在輻射暴露或化學治療后抑制(減小血小板消耗的嚴重程度或消除血小板消耗的發生)和/或防止血小板消耗。治療性抗體的治療有效量也是其中組合物的治療有益作用超過任何毒性作用或有害作用的有效量。本文所用術語“治療有效量”或“治療有效劑量”或類似術語意指引起所需要的生物應答或醫學應答(例如增加受試者的血小板產生)的作用劑(例如本文描述的治療性抗體或片段)的量。在一些實施方案中，本文描述的組合物含有治療有效量的治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其片段。在一些實施方案中，所述組合物含有治療性抗體(例如TPO 模擬抗體)或其片段以及一種或多種(例如3、4、5、6、7、8、9、10或11種或更多種)其它治療劑，使得作為整體的組合物是治療上有效的。例如，所述組合物可含有TPO模擬抗體和艾曲波帕，其中抗體和小分子各自處于以下濃度，當該濃度組合時是治療上有效的。可通過細胞培養物或實驗動物中的已知藥學方法測定這類組合物的毒性和治療功效。可采用這些方法例如測定LD5tl(使50%群體致死的劑量)和ED5tl(50%群體中治療有效的劑量)。毒性作用和治療作用之間的劑量比率為治療指數，可以表示為LD5(i/ED5(i比。 優選具有高的治療指數的治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其治療活性片段的組合物。 雖然可以使用具有毒副作用的組合物，但應小心設計將這類化合物靶向受累組織部位的遞送系統以使對正常細胞的潛在損害降到最低，從而降低副作用。適于測定本文描述的治療性抗體或治療活性片段的毒性和/或治療功效的動物
27模型是本領域已知的。當然，這類模型部分將隨包含在抗體或片段中的特定治療性肽的生物活性而改變。例如，測定TPO模擬抗體或其治療活性片段的治療功效的合適動物模型 (例如小鼠和非人類靈長類動物模型)是本領域已知的，參見例如，Thomas等(1996)Mem Cells 11:244 ；Winton 等(1995)Experimental Hematology 監486 ;Neelis 等(1998) Blood 92(5) :1586-1597 以及 Mouthon 等(1999) Int J Radiat Oncol Biol Phys 43(4) 867-875。另外，工作實施例中舉例說明了適于測定TPO模擬抗體的毒性和/或治療功效的動物模型。從細胞培養測定法和動物研究獲得的數據可用于配制用于人的各種劑量。用于評價組合物(例如包含在其中的TPO模擬抗體或片段)的合適動物模型是本領域已知的，以工作實施例為例予以說明。這類治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或片段的劑量一般在包括幾乎沒有毒性或無毒性的ED5tl的抗體的循環濃度范圍內。劑量可在該范圍內改變，這取決于所使用的劑型和所采用的給藥途徑。對于按本文描述使用的治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其治療活性片段(例如用于增加受試者的血小板產生)，可從細胞培養測定法開始估計治療有效劑量。可在動物模型中配制劑量以達到包括在細胞培養中測定的IC5tl(即達到癥狀最大抑制一半的試驗化合物的濃度)的循環血漿濃度范圍。這類信息可用來更準確地確定人用劑量。可通過例如高效液相層析法測定血漿水平。可在例如I期劑量遞增研究中進一步評價治療性抗體的合適的人用劑量。參見例如van 611印等0008^!11 J Transplantation8 (8) :1711-1718 :Hanouska 等 Q007)Clin cancer Res 13 ,第 1 部) 523-531 ；以及Hetherington等(2006)Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50(10) 3499-3500。如上所述，可部分根據受試者血液中的血小板計數，測定所需要的TPO模擬抗體或其治療活性片段的劑量。例如，與血小板計數較高的受試者相比，血小板計數較低的受試者可能需要較高劑量的TPO模擬抗體。本文描述的包括TPO模擬抗體或其治療活性片段的使用的任何方法可包括在給予含有TPO模擬抗體或其片段的組合物后監測血小板計數。如果組合物與化學治療方案或放射治療方案聯合給予，則可在暴露至化學治療方案或放射治療方案之前、期間和/或之后進行監測。在受試者的血液衍生樣品中測定血小板計數的方法是醫學領域眾所周知的，可參見例如 Sallah 等(1998) Postgraduate Medicinel03 :209-210 ；Kottke-Marchant (1994) Hematol Oncol Clin North Am. § :809-853 ;Redei 等(1995)J Crit Illn 10 :133-137 ； Butkiewicz 等 0006)Thrombosis Research 118(2) 199~204 ；Tomita 等 O000)Am J Hematol63(3) :131-135 以及 Schrezenmeier 等(1998)Br J HaematollOO (3) :571_576。要了解的是，醫學從業人員可根據受試者血小板水平的實時監測，選擇改變組合物的劑量、劑量頻率或給藥途徑。本文使用的“受試者”可以是任何哺乳動物。例如受試者可以是人、非人類靈長類動物(例如猴、狒狒或黑猩猩)、馬、牛、豬、綿羊、山羊、狗、貓、兔、豚鼠、沙鼠、倉鼠、大鼠或小鼠。在一些實施方案中，受試者是嬰幼兒(例如人嬰幼兒)。本文使用的“需要預防”、“需要治療”或“有需要”的受試者是指根據合格醫學從業人員(例如在人的情況下為醫生、護士或執業護士 ；在非人類哺乳動物的情況下為獸醫)的判斷，可合理地獲益于既定治療(例如用例如TPO模擬抗體等治療性抗體的治療)的受試者。例如，患有血小板水平不足相關病癥(血小板減少癥相關疾病)的受試者可以是需要用本文描述的TPO模擬抗體或其片段治療的受試者。因此，可將TPO模擬抗體或其治療活性片段給予患有血小板計數不足(血小板減少癥)相關病癥的受試者。這類病癥是醫學領域眾所周知的，包括而不限于伯-索綜合征、 特發性血小板減少性紫癜(ITP)、威-奧綜合征、脾功能亢進、血栓性微血管病、彌散性血管內凝血(DIC)、再生障礙性貧血、溶血性尿毒癥綜合征(HUS ；典型或非典型的)、災難性抗磷脂綜合征(CAPQ、新生兒同種免疫性特發性血小板減少性紫癜、輸血后紫癜、陣發性夜間血紅蛋白尿、尿毒癥、馮維勒布蘭德病、變型馮維勒布蘭德病、格蘭茲曼血小板機能不全、TTP、 狼瘡和維生素缺乏。所述病癥還包括輻射誘發性血小板減少癥(見下文)和藥物誘發性血小板減少癥(DIT ；亦稱“藥物誘導性血小板機能不全”)，例如但不限于由以下藥物引起的血小板減少癥肝素、金雞納屬生物堿衍生物(奎寧和奎尼丁)、青霉素、磺胺類藥、非甾體抗炎藥(NSAID)、抗驚厥藥、抗風濕藥和口服抗糖尿病藥、金鹽、利尿藥、利福平、干擾素Y、 ribovarin 和雷尼替丁。參見例如 Chong 等(1991) Blood 77 :2190-2199 ；Curtis 等(1994) Blood M :176-183 ；Gentilini 等(1998)Blood92 :2359-2365 ；Burgess 等(2000)Blood 95 :1988-1992 ；van de Bemt 等 ^)04) Drug Saf. 27 :1243-1252 ；Aster 和 Bougie U007) New Eng J Med357(6) :580-587 ；George 等(1998)Ann Intern Med 129(11) :886-890 ；以及 Li 等Q007)Drug Saf. 30(2) :185-186,所沭各文獻的公開內容通過引用以其整體結合到本文中。治療以下各種病況可能引起DIT 例如但不限于腫瘤、骨髓增生異常綜合征和某些病毒感染，例如HIV和肝炎感染。例如，下面還詳細說明了與化學治療方案有關的DIT。也可將TPO模擬抗體或其片段與化學治療方案或放射治療方案聯合給予患者。由于化學治療或放射治療的骨髓抑制作用所致，進行這些治療的患者可因出血風險而形成可能危及生命的重度中性粒細胞減少癥和血小板減少癥。血小板減少癥常常可限制醫學從業人員(例如腫瘤學家)例如逐步加大化學治療劑量和/或維持化學治療方案的能力，這繼而阻礙緩解癌癥或治愈癌癥患者或者降低緩解癌癥或治愈癌癥患者的可能性。參見例如 Neelis 等(1997)Blood 90(7) :2565-2573 ;Allen 等 U004) “Ansel， s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,，，Lippincott ffilliams&ffilkins(ISBN 0781746124) ；Beutler (1993)Blood 81 :1411 ；以及 Niremburg(2003)cancerNurs26(6) 32S-37S。因此，醫學從業人員可將TPO模擬抗體或其治療活性片段與放射治療方案或化學治療方案結合使用以加快血小板恢復(見下文)。如上所述，并以工作實施例為例說明，本文描述的TPO模擬抗體在提高動物的血小板總水平方面是十分有效的。TPO模擬抗體在快速恢復動物消耗的血小板水平方面也是有效的。因此，本文描述的TPO模擬抗體或片段當給予患有癌癥的受試者時，與缺乏TPO模擬抗體(或片段)時可能是安全的相比，可允許醫學從業人員給予更有效的劑量的化學治療或放射治療或更頻繁地將化學治療或放射治療給予受試者。上文使用的“安全的”或“安全可行的”是指醫學從業人員斷定的在受試者中足以開始治療有效的化學治療方案或放射治療方案的受試者的血小板水平。因此，可在給予化學治療方案或放射治療方案之前、期間和/或之后將TPO模擬抗體或片段給予受試者。如上所述，需要化學治療方案或放射治療方案的受試者包括患有癌癥的受試者。例如，受試者可患有選自以下的癌癥肺癌、乳癌、結腸癌、胰腺癌、腎癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液學癌癥、神經組織癌、黑素瘤、甲狀腺癌、卵巢癌、睪丸癌、前列腺癌、子宮頸癌、陰道癌和膀胱癌。需要化學治療方案或放射治療方案的受試者還包括患有炎性疾病或自身免疫性疾病、某些神經障礙或者某些病毒或真菌感染的受試者。炎性疾病可包括例如骨關節炎、 類風濕性關節炎(RA)、脊椎關節病、POEMS綜合征、炎性腸病(例如克羅恩病(Crohn’ s disease)或潰瘍性結腸炎)、多中心性巨大淋巴結增生癥(multicentric Castleman' s disease)、系統性紅斑狼瘡(SLE)、古德帕斯徹綜合征(Goodpasture，s syndrome)、多發性硬化(MS)、風濕性多肌痛、肌營養不良(MD)、多肌炎、皮肌炎、炎癥性神經病例如格-巴綜合征(Guillain Barre syndrome)、血管炎(例如韋格納肉芽腫病(Wegener，s granulomatosus))、結節性多動脈炎(polyarteritis nodosa)、風濕性多肌痛、顳動脈炎、 斯耶格倫綜合征(Sjogren，s syndrome)、貝切特病(Behcet，s disease)、丘-施綜合征 (Churg-Strauss syndrome)或高安動脈炎。可包括各種細胞毒性藥物作為化學治療方案的部分。特定細胞毒性劑或藥劑的組合可取決于例如癌癥的類型和待治療癌癥的嚴重程度。例如，可給予受試者多種細胞毒性藥物的任一種或多種，包括而不限于環磷酰胺、泰素、甲氨蝶呤、氮芥、硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥、氟尿嘧啶、順鉬、諾考達唑、羥基脲、長春新堿、長春堿、依托泊苷、多柔比星、博來霉素、 卡鉬、吉西他濱、紫杉醇、托泊替康、硫鳥嘌呤、任何前述藥物的治療性類似物和已知引起受試者的血小板計數降低(或血小板產生減少)的其它化合物。放射治療可包括例如差異在于輻射源的位置的體外射束放射治療(EBRT或 XBRT)、近程治療(或密封源放射治療)和非密封源放射治療。“體外”是指來自體外的治療性輻射源，而密封和非密封源放射治療包括內部給予受試者放射性材料。輻射的類型可以是例如X射線或Y輻射。在一些實施方案中，輻射療法包括質子射束輻射療法。“體內” 放射治療可通過輸注或攝入給予受試者。例如間碘苯甲胍(MIBG)輸注可用于治療成神經細胞瘤。可口服給予碘-131治療甲狀腺癌或甲狀腺毒癥。與镥-177或-90綴合的激素可用來治療神經內分泌腫瘤。治療性抗體也可與放射性核素綴合用于放射治療。例如，可采用替伊莫單抗(Zevalin )、與釔_90綴合的抗CD20抗體和托西莫單抗碘_131 (Bexxar )、與碘-131綴合的抗⑶20抗體治療非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin，s lymphoma)。在一些實施方案中，可將TPO模擬抗體或其片段給予已經進行或正要進行骨髓移植、手術和/或自體輸血的受試者。本文描述的TPO模擬抗體或其治療活性片段可用來治療輻射暴露的受試者。在一些實施方案中，可以在輻射暴露后將TPO模擬抗體或其片段給予受試者。在一些實施方案中，可將TPO模擬抗體或其片段給予很可能暴露于輻射的受試者。如上所述，很可能暴露于輻射的受試者可為例如診斷患有癌癥且很可能進行化學治療或放射治療的受試者、很可能進行骨髓移植的受試者或很可能進行手術的受試者。很可能暴露于輻射的受試者還可以是在加工或使用放射性材料的設施或設施附近工作的人員。例如，受試者可以為在核電廠或核廢料貯存設施或其附近工作的人員。測定受試者所暴露的輻射量的合適方法也是本領域已知的。如果受試者在暴露時穿戴監測裝置和/或如果醫學從業人員給予已知的治療有效劑量的輻射，則暴露量計算大大簡化。在缺乏監測裝置時，醫學從業人員可能需要有關暴露的信息，例如輻射強度和類型、暴露持續時間和與暴露源的距離。臨床上，即時全血細胞分類計數可用來建立血液學基線。白細胞和血小板在數天到數周的時間內發生改變。這些改變的嚴重程度還可用來估計暴露量。例如，全身輻射暴露超過100拉德(1戈瑞)可引起淋巴細胞的循環水平下降。可在暴露之后的頭M小時內觀察到這種下降。由于下降的量與暴露的嚴重程度成比例，因此淋巴細胞可以用作生物劑量計。鑒于本文描述的TPO模擬抗體和治療活性片段的功效，可將其作為單劑量給予受試者。(參見工作實施例)。在人體中使用TPO模擬肽的單劑量療法的功效已描述于例如徹叫等 O004)ciin Pharm TherI^ :6沘_638 和 Kuter 等 Q009) Annu Rev Med 60 33. 11-33. 141 (印刷前于2008年10月31日在線發表)。在一些實施方案中，可按不止一個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或15或更多個)
劑量將TPO模擬抗體或片段給予受試者。在多劑量實施方案中，劑量可為例如每日一次、每兩天一次、每周兩次、每周一次、每兩周一次或每月一次。例如，可每天一次給予受試者TPO 模擬抗體，為期至少5天。在另一個實例中，可每天一次給予受試者TPO模擬抗體，為期3 天。如上所述，給藥可發生在暴露于減少血小板計數事件(例如輻射暴露或化學治療)之前、期間和/或之后。在一些實施方案中，例如，可在輻射暴露或進行化學治療方案之前約一天(例如約20小時、約M小時或約30小時)，給予受試者單劑量的TPO模擬物或其片段。在一些實施方案中，可在暴露于輻射(例如放射治療方案)或進行化學治療方案之前或之后少于一 (1)天(例如少于23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、 7、6、5、4、3、2、1小時或少于1小時)，給予受試者TPO模擬抗體或其治療活性片段。例如， 可在輻射暴露之前6或12小時給予受試者單劑量的TPO模擬抗體或其治療活性片段。在另一個實例中，可在輻射暴露后6、12或M小時給予受試者單劑量的TPO模擬抗體或其治療活性片段。在一些實施方案中，可按至少3 μ g/kg受試者(例如至少4、5、6、7、8、9或IOyg/ kg)的劑量，每周一次連續六(6)周，將本文描述的TPO模擬抗體或其治療活性片段皮下給予人受試者。參見例如Bussel等Q006)N Engl J Med卿1672_1681。在一些實施方案中，可按至少0. 2-10 μ g/kg受試者的劑量，每周一次連續兩( 周，將本文描述的TPO模擬抗體或其治療活性片段皮下給予人受試者(參見例如Wang等Q004)，同上)。在一些實施方案中，可按約 0. 3-10 μ g/kg 受試者(例如約 0. 5-5、1. 0-10,2. 0-5、6-10、6-8、9_10、1-4、 2-4,0. 3-1.0,0. 3-3,0. 5-2或0. 7-7 μ g/kg受試者)的劑量，將本文描述的TPO模擬抗體或治療活性片段靜脈內給予人受試者。參見例如Wang等(2004)，同上。同樣，可按單劑量給予任何治療性抗體或其治療活性片段。在一些實施方案中，可按不止一個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或15個或更多個)劑量將治療性抗體或其片段給予受試者。在多劑量實施方案中，給藥可為例如每日一次、每兩天一次、每周兩次、每周一次、每兩周一次或每月一次。在一些實施方案中，例如，如果發現治療性抗體在接受治療的受試者中引起免疫應答，則可改變具體的給藥方案。實際上，醫生、護士或其它經授權的醫學從業人員可監測接受治療的受試者產生特異性結合治療性抗體和/或抑制治療性抗體的治療活性的抗體。 在這種情況下，醫學從業人員可選擇停止給予受試者治療性抗體和/或選擇給予受試者不同的治療性抗體。例如，如果發現接受治療的受試者產生與第一 TPO模擬抗體內的特定TPO 模擬肽結合的抗體，則醫學從業人員可選擇(其中試劑是可獲得的)給予受試者不同的 TPO模擬抗體，所述抗體含有預期不與受試者的抗體結合的不同TPO模擬物。在另一個實例中，如果發現接受治療的受試者產生與第一 TPO模擬抗體的特定支架抗體的表位結合的抗體，則醫學從業人員可選擇(其中試劑是可獲得的)給予受試者不同的TPO模擬抗體，所述抗體在預期不與受試者的抗體結合的不同抗體支架附近構建。檢測受試者(例如人受試者)產生結合治療性抗體和抑制治療性抗體活性的中和抗體的方法是本領域已知的，可參見例如 Welt 等 O003)Clin cancerRes 9(4) 1338-46 :Szolar 等,J Pharm Biomed Anal 41(4) :1347-1353 以及 Lofgren 等 Q007)J Immunol 178(11) :7467_7472。在一些實施方案中，可將治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其治療活性片段作為單一療法給予受試者。或者，如上所述，可將抗體或片段作為與另一種治療的聯合療法給予受試者，所述另一種治療為例如另一種用于增加受試者的血小板產生的治療或用于治療輻射暴露的受試者的治療。例如，聯合療法可包括給予受試者(例如人患者)一種或多種為有需要的受試者提供治療益處的其它藥劑(例如艾曲波帕、奧普瑞白介素或羅米司亭)。 在一些實施方案中，同時給予治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其治療活性片段和一種或多種其它活性劑。在其它實施方案中，首先給予抗體或片段，其次給予一種或多種其它活性劑。在一些實施方案中，首先給予一種或多種其它活性劑，其次給予抗體或片段。治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其治療活性片段可替換或增強之前給予的療法或現行給予的療法。例如，在用TPO模擬抗體或其治療活性片段治療時，可停止或減少給予一種或多種其它活性劑(例如艾曲波帕、奧普瑞白介素或羅米司亭)，例如以較低水平給予。在一些實施方案中，可以維持給予之前的療法。在一些實施方案中，可以維持之前的療法直到治療性抗體或其治療活性片段的水平達到足以提供治療效果的水平。兩種療法可以聯合給予。如上所述，在一些實施方案中，可在治療后監測受試者的血小板產生的增加(或血小板水平的提高)。在一些實施方案中，可在用TPO模擬抗體或其片段治療后，監測受試者的一種或多種輻射暴露癥狀的改善。這類癥狀隨受試者所暴露的輻射類型、輻射劑量和暴露部位而改變。所述癥狀是本領域已知的，包括例如不適、疼痛、喉嚨痛、胃腸道不適 (嘔吐和/或腹瀉)、脫發、食欲減退、燒傷和出血。監測受試者(例如人患者)的本文定義的血小板計數不足相關病癥的改善，意味著評價受試者疾病參數的改變，例如該病癥的一種或多種癥狀的改善。這類癥狀隨具體病癥而改變，但是醫學領域眾所周知的。參見例如 Harker 禾口 Zimmerman (1983) "Platelet Disorders (血小板病癥)，” Saunders, 360 頁； 以及 Gresele 等(2002) "Platelets in Thrombotic and Non-thrombotic Disorders Pathophysiology, Pharmacology and Therapeutics (血檢性與非血檢性病癥中血小板的病理生理學、藥理學和治療學)，"Cambridge University Press (ISBN 052180261X) 在一些實施方案中，在給藥后至少1小時(例如至少2、4、6、8、12、對或48小時， 或者至少1天、2天、4天、10天、13天、20天或更久，或至少1周、2周、4周、10周、13周、20 周或更久)進行評價。可在一個或多個以下時期內評價受試者開始治療前；治療期間；或者給予治療的一個或多個組成部分后。評價可包括評價進一步治療的需要，例如評價是否應改變劑量、給藥頻率或治療持續時間。還可包括評價增加或放棄選定的治療方式的需要，例如按本文所述增加或放棄對輻射暴露的任何治療或增加受試者血小板產生的任何治療。離體方法。增加受試者的血小板產生的離體策略可包括用編碼本文描述的治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其治療活性片段的多核苷酸轉染或轉導獲自受試者的一種或多種細胞。例如，細胞可用編碼TPO模擬抗體的重鏈和輕鏈的單一載體轉染，或者細胞可用編碼抗體重鏈的第一載體和編碼抗體輕鏈的第二載體轉染。在一些實施方案中，載體含有誘導型啟動子，其允許醫學從業人員開啟或關閉受試者的TPO模擬抗體(或片段)的產生。 例如，醫學從業人員可選擇在計劃進行第二輪輻射療法方案的患者中開啟本文描述的TPO 模擬抗體的表達。在該方案和受試者的血小板水平恢復后，醫學從業人員可選擇在受試者中關閉抗體的表達。然后將轉染或轉導的細胞輸回受試者中。細胞可以是大范圍類型中的任一種，包括而不限于造血細胞(例如骨髓細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突細胞、τ細胞或B細胞)、成纖維細胞、上皮細胞、內皮細胞、角質形成細胞或肌細胞。這類細胞可用作治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其治療活性片段的來源(例如持續來源或定期來源)，只要它們在受試者中存活。在一些實施方案中，可將載體和/或細胞經配置用于誘導型或阻抑型表達抗體(參見例如 khockett 等(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 迎5173-5176 和美國專利號 7，056，897)。優選細胞獲自受試者(自體)，但可潛在地獲自除受試者之外的相同種的受試者 (同種異體)。從受試者中獲得細胞和轉導或轉染細胞的合適方法是分子生物學領域已知的。例如，轉導步驟可通過用于離體基因療法的任何標準方法完成，包括磷酸鈣、脂轉染、電穿孔、 病毒感染(見上文)和生物射彈基因轉移。參見例如Sambrook等(同上)和Ausubel等 (同上)。或者，可使用脂質體或聚合微粒。可選擇已成功轉導的細胞例如用于表達編碼序列或抗藥基因。在一些實施方案中，含有巨核細胞的生物樣品可獲自受試者，將其與TPO模擬抗體接觸以促進血小板產生。然后，可將經處理的生物樣品重新導入受試者中或與所述受試者相同種的另一受試者中。這類離體自體或同種異體移植方法可用于恢復已接受或正在接受放射治療或化學治療的受試者的血小板水平。在這類情況下，在放射治療或化學治療之前取出生物樣品。MA本公開內容的特征還在于制品或藥盒，其包括具有標簽的容器，以及含有本文描述的治療性抗體(例如TPO模擬抗體)或其治療活性片段的組合物。如果組合物含有TPO 模擬抗體或其治療活性片段，標簽可表明組合物用于增加有需要的受試者的血小板產生和 /或與化學治療或放射治療聯合給予受試者(例如人)。藥盒可任選包括將組合物給予受試者的工具。例如，藥盒可包括一個或多個注射器。藥盒還可任選包括將組合物給予受試者的說明書。在一些實施方案中，藥盒還可包括一種或多種用于增加受試者的血小板產生的其它活性劑。例如，藥盒可包括Promacta⑧/Revolade (艾曲波帕；GlaxoSmithKline)、 Neumega (奧普瑞白介素；rhIL-11，Genetics Institute, he.)、Nplate (羅米司亭； Amgen, Inc.)和本文描述的任何其它活性劑中的一種或多種。在一些實施方案中，藥盒可包括一種或多種用于治療受試者的輻射暴露的活性劑。例如，藥盒可包括抗生素、麻醉劑、 止吐藥、類固醇(例如雄烯二醇例如4-雄烯二醇或5-雄烯二醇)、螯合劑、利尿藥、放射性核素-頂替劑和干細胞中的一種或多種。藥盒可任選包括一種或多種用于測定獲自受試者的血樣中的血小板水平的試劑。 藥盒還可包括一種或多種用于從受試者中采集血樣的試劑。下面的實施例旨在說明而非限制本發明。
實施例實施例1.試劑下面的試劑用于下述實驗(1)重組人血小板生成素(以下稱為“rhTPO”)；(2)含有人源化抗補體成分C5抗體(5G1. 1)支架的組合物，其中重鏈的⑶R3用 TPO模擬肽置換(以下稱為“CDR-TP0抗體”)；該抗體不再與C5結合；重鏈恒定區為上述 G2/G4恒定區融合物；(3)含有不含TPO模擬肽的人源化抗補體成分C5抗體(5G1. 1)(以下稱為“抗C5 對照抗體”)的組合物；重鏈恒定區為上述G2/G4恒定區融合物；(4)含有抗破傷風類毒素抗體F (ab’)2片段的組合物，其中重鏈⑶R3含有TPO模擬肽，輕鏈⑶R2含有TPO模擬肽(以下稱為“TPO-Fab”)；( 具有人抗炭疽抗體支架的TPO模擬抗體，其中輕鏈多肽在羧基端含有TPO模擬物(以下稱為“LC-TP0抗體”)；重鏈恒定區為上述G2/G4恒定區融合物；抗體的抗原結合部位與炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)的pA83抗原結合；(6)具有人抗炭疽抗體支架的TPO模擬抗體，其中重鏈多肽含有在重鏈鉸鏈區羧基端稍稍以外插入的TPO模擬物(以下稱為“HC-TP0抗體”)，TPO模擬物被插入抗炭疽抗體支架CH2部分第5個和第6個殘基之間；重鏈恒定區為上述G2/G4恒定區融合物；抗體的抗原結合部位與炭疽芽孢桿菌的PA83抗原結合；(7)具有人抗炭疽抗體支架的TPO模擬抗體，其中輕鏈多肽在羧基端含有TPO模擬物，重鏈多肽含有在重鏈鉸鏈區羧基端稍稍以外插入的TPO模擬物(以下稱為“HC+LC-TP0 抗體”)；重鏈恒定區為上述G2/G4恒定區融合物；抗體的抗原結合部位與炭疽芽孢桿菌的 PA83抗原結合；(8)不含TPO模擬物的人抗炭疽抗體，重鏈恒定區含有上述G2/G4恒定區融合物 (以下稱為“抗炭疽G2/G4對照抗體”)；抗體的抗原結合部位與炭疽芽孢桿菌的PA83抗原結合；和(9)不含TPO模擬物的人抗炭疽抗體，其中重鏈恒定區為Gl恒定區(以下稱為“抗炭疽Gl對照抗體”)，且其中抗體的抗原結合部位與炭疽桿菌的PA83抗原結合。實施例2. HC+LC-TP0抗體的產生和純化應用標準分子生物學技術產生質粒表達載體，所述載體含有編碼上述HC+LC-TP0 抗體的輕鏈和重鏈的核酸。通過電穿孔將載體轉染到CH0K1SV細胞(中國倉鼠卵巢細胞系)中。篩選轉染子穩定表達抗體的克隆。選出克隆并用來產生用于產生和純化治療性抗體的大規模培養物。
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1ML使用A蛋白(P0R0S )樹脂，從細胞培養上清液(900mL)中純化出HC+LC-TP0抗體。在將上清液過柱前，先將柱用8柱體積的平衡緩沖液Q50mM NaCl、50mM甘氨酸，pH 8) 平衡。在柱平衡后，將上清液以9mL/分鐘的流速加到柱中。一旦將樣品加到柱中，便將柱用平衡緩沖液洗滌直到在^Onm處的UV吸光度回到零。用150mMNaCl、IOOmM甘氨酸、pH 3. 5將抗體從柱中洗脫出，手工收集峰流分。峰流分用IM Tris (pH 9)中和，并透析到磷酸緩沖鹽溶液中。透析后，使樣品經過0.22 μ m Merivex過濾器(Millipore)過濾，并通過紫外光譜法在280nm波長處測定濃度。采用QCL-1000顯色LAL終點測定試劑盒(Lonza)測定經純化的抗體的內毒素污染。實施例3. HC+LC-TP0抗體的體外功能表征應用No-Weigh Biotin(Thermo Scientific/Pierce)，按 1 1 生物素蛋白質的比例使重組TPO受體(R&D SYSTEMS ; Minneapolis，MN)生物素化。使生物素化TPO受體(5yg/mL)與鏈霉抗生物素探針偶聯15分鐘。洗滌探針，隨后與25nM HC+LC-TP0抗體接觸。在15分鐘內，通過Octet QK(Fort6_Bio ;Menlo Park, CA)監測抗體與探針的締合和解離。應用部分擬合結合i^ortS-Bio 分析軟件，測定兩種蛋白質間的結合動力學。求出Kd約為2. 32nM。使用上述生物素化TPO受體和鏈霉抗生物素探針還進行了類似實驗，其中使探針與HC+LC-TP0抗體或rhTPO接觸。在該項實驗中，對于HC+LC-TP0抗體和rhTPO的每一種， 求出Kd約為3nM。這些結果表明TPO模擬抗體對TPO受體的親和力與rhTPO對該受體的親
和力一樣。實施例4. TPO模擬物對小鼠血小板計數的作用Balb/c小鼠，13周齡，用上文實施例1中所描述的rhTPO、TPO-Fab, CDR-TPO抗體或抗C5對照抗體治療。每組治療5只小鼠。一天一次連續5天，以ang/kg⑶R-TPO或對照抗體、13. ;3mg/kgTP0-Fab或110μ g/kg rhTPO的劑量，通過皮下注射給予小鼠組合物。在第3、5、8、10和12天獲得各小鼠的血液100 μ L，第1天為首次治療。采用Cell-Dyn 3100 血液分析儀(Abbott Diagnostics, Illinois)，測定了血液中的外周血血小板。如圖1所示，與對照抗體相比，用rhTPO、CDR-TPO抗體和TPO-Fab治療的小鼠中， 血小板水平大幅提高。實施例5. TPO模擬抗體對小鼠血小板計數的作用Balb/c小鼠，13周齡，用CDR-TPO抗體、抗炭疽Gl對照抗體、HC-TP0抗體、LC-TP0 抗體或HC+LC-TP0抗體治療。抗體如上文實施例1中所述。各治療組中有5只小鼠。一天一次連續5天，以ang/kg的劑量，通過皮下注射給予小鼠抗體。在第0、4、7、9、11、16和18天獲得各小鼠的血液100 μ L，第1天為首次治療。 如上所述測定血液中的外周血血小板。如圖2所示，與抗炭疽Gl對照抗體相比，用任何TPO模擬抗體治療的小鼠的血小板水平提高。此外，用HC-TPO抗體、LC-TPO抗體或HC+LC-TP0抗體治療的小鼠中獲得的血小板水平比用CDR-TPO抗體治療的小鼠中獲得的血小板水平高許多。例如，在第11天，用 HC+LC-TP0抗體得到的血小板水平(5，375χ106血小板/mL)為用CDR-TPO抗體治療的小鼠的相應血小板水平(1，SOhlO6血小板/mL)的幾乎3倍。這些結果出人意料地表明，在提高動物血小板水平方面，在輕鏈和/或重鏈鉸鏈區羧基端具有TPO模擬物的抗體比在CDR區含有TPO模擬肽的抗體更有效。另外，與CDR-TPO抗體相比，用例如LC-TP0抗體和HC+LC-TP0抗體治療的小鼠血小板水平升高得更快(參見第4天的血小板水平；圖2)。采用上述方法，測定了若干其它CDR-TPO模擬物構建體在小鼠中刺激血小板產生的能力。抗體含有兩個或四個插入重鏈和/或輕鏈可變區的CDR的TPO模擬物。例如，一種抗體含有2條重鏈多肽和2條輕鏈多肽，其中重鏈多肽CDR3被TPO模擬物置換，且其中輕鏈多肽的CDR2被TPO模擬物置換。另一種抗體含有2條重鏈多肽和2條輕鏈多肽，其中重鏈多肽的⑶R3被TPO模擬物置換，且其中輕鏈多肽的⑶Rl被TPO模擬物置換。這些抗體在提高小鼠血小板水平方面都不如HC-TPO抗體、LC-TPO抗體或HC+LC-TP0抗體有效。總之，這些數據表明，HC-TPO抗體、LC-TPO抗體和HC+LC-TP0抗體在動物中引起更多的總血小板產生以及更快的血小板產生方面，比⑶R-TPO對應抗體分子更有效。這些數據還表明，TPO模擬肽在輕鏈的一個或兩個羧基端上(允許模擬物呈現在抗體的中心裂口上)和在重鏈鉸鏈區處或附近的特別置換為LC-TPO抗體、HC-TPO抗體和HC+LC-TP0抗體提供優良的TPO樣生物活性。^MM 6.單劑量TPO 1草擬杭體治療對小鼠血小板i十！τ 射乍用Balb/c小鼠，14周齡，用抗炭疽Gl對照抗體、CDR-TPO抗體、LC-TP0抗體、 HC+LC-TP0抗體和抗炭疽G2/G4對照抗體治療。每個治療組中有三只(3)小鼠。按ang/kg 的劑量，通過皮下注射一(1)次將抗體給予小鼠。在相對于治療的第0、2、4、7、9、11、15、18 和21天從各小鼠中收集血液。如上所述分析外周血血小板。如圖3所示，與用抗炭疽對照抗體治療的小鼠中的血小板水平相比，用LC-TPO抗體或HC+LC-TP0抗體治療的小鼠中的血小板水平升高，此外，這些數據表明，從用LC-TPO抗體或HC+LC-TP0抗體治療的小鼠中獲得血小板水平比從用CDR-TPO抗體治療的小鼠中獲得的血小板水平明顯較高。數據還表明， 與CDR-TPO抗體相比，LC-TPO抗體和HC+LC-TP0抗體更能夠在動物血液中保持高的血小板水平。(參見例如第9-15天，圖3)。此外，這些數據還出人意料地表明，單劑量的LC-TPO抗體或HC+LC-TP0抗體不僅能夠明顯提高小鼠中的血小板水平，而且單劑量幾乎與多次給藥方案一樣有效(與圖2相比較)。實施例7. TPO模擬抗體對MMC治療的小鼠中的血小板水平的作用Balb/c小鼠，14周齡，以3mg/mL的劑量靜脈內給予絲裂霉素C(MMC)。在MMC治療后，以600 μ g/kg劑量，每天一次連續5天，通過皮下注射給予小鼠上述⑶R-TPO抗體或抗 C5對照抗體。在MMC治療(第0天)后第8、11、15、18、21、25和32天，從經治療的小鼠以及假對照小鼠中采集血液。如上測定血液中的外周血血小板。如圖4所示，與用抗C5對照抗體治療的小鼠相比，在用CDR-TPO抗體治療的小鼠中血小板水平升高。這些結果表明，就在骨髓抑制療法后血小板水平的更快恢復而言，與未用提高血小板產生的作用劑的治療相比，CDR-TPO抗體在動物中是有效的。根據使用LC-TPO抗體、HC-TPO抗體和HC+LC-TP0抗體的上述實驗的結果，就在骨髓抑制療法后血小板水平的恢復而言，預期這些抗體在動物中是有效的。另外，之前的結果還表明，在血小板恢復方面，LC-TPO抗體、HC-TPO抗體和HC+LC-TP0抗體的功效等于或大于 CDR-TPO抗體的功效。檢驗該假設的實驗如下。Balb/c小鼠，14周齡，以3mg/mL的劑量靜脈內給予絲裂霉素C (MMC)。在MMC治療后，還通過皮下注射給予小鼠下列抗體之一⑶R-TPO抗體、LC-TPO 抗體、HC-TPO抗體、HC+LC-TP0抗體、抗C5對照抗體、抗炭疽Gl對照抗體和抗炭疽G2/G4對照抗體。以ang/kg的劑量，每天一次連續5天給予抗體。在MMC治療(第0天)后的第0、 2、4、7、9、11、15、18和21天從各小鼠中采集血液。如上所述分析外周血血小板。預期與對照抗體相比，用兩種TPO模擬抗體和⑶R-TPO抗體之一治療的小鼠的血小板水平升高。這些數據可表明，對于骨髓抑制療法后血小板水平的恢復，LC-TPO抗體、HC-TPO抗體和HC+LC-TP0 抗體在動物中是有效的。此外，預期該數據表明，與CDR-TPO抗體相比，LC-TPO抗體、HC-TPO 抗體或HC+LC-TP0抗體可更快提高血小板水平，并且可在動物中維持血小板水平更久。在另一項實驗中，Balb/c小鼠，14周齡，通過皮下注射給予下列抗體之一 CDR-TPO抗體、LC-TPO抗體、HC-TPO抗體、HC+LC-TP0抗體、抗C5對照抗體、抗炭疽Gl對照抗體和抗炭疽G2/G4對照抗體。根據下列給藥方案給予抗體。第一治療方案包括以600 μ g/ kg的劑量，每天一次連續5天將抗體給予小鼠。在最終劑量后一天，以:3mg/mL的劑量靜脈內給予小鼠絲裂霉素C (MMC)。第二治療方案包括在MMC治療前3天，給予小鼠一劑600 μ g/kg 劑量的抗體。第三治療方案包括在MMC治療前一天，給予小鼠一劑600μ g/kg劑量的抗體。 預期與用抗炭疽或抗C5對照抗體治療的小鼠的血小板水平相比，用LC-TPO抗體、HC-TPO抗體或HC+LC-TP0抗體治療的小鼠的血小板水平可提高。還預期，在MMC治療前給予小鼠單劑量的LC-TPO抗體、HC-TPO抗體或HC+LC-TP0抗體將顯著提高隨后MMC治療的小鼠中的血小板水平。在又一項實驗中，Balb/c小鼠，14周齡，通過皮下注射給予下列抗體之一 CDR-TPO抗體、LC-TPO抗體、HC-TPO抗體、HC+LC-TP0抗體、抗C5對照抗體、抗炭疽Gl對照抗體和抗炭疽G2/G4對照抗體。根據下列給藥方案給予抗體。第一治療方案包括以600 μ g/ kg的劑量，每天一次連續5天將抗體給予小鼠。第一劑量前一天，以:3mg/mL的劑量靜脈內給予小鼠絲裂霉素C (MMC)。第二治療方案包括MMC治療后一天給予小鼠一劑600 μ g/kg劑量的抗體。第三治療方案包括MMC治療后3天，給予小鼠一劑600 μ g/kg劑量的抗體。預期與用抗炭疽或抗C5對照抗體治療的小鼠的血小板水平相比，用LC-TPO抗體、HC-TPO抗體或HC+LC-TP0抗體治療的小鼠的血小板水平可提高。還預期剛好在MMC治療后給予小鼠單劑量的LC-TPO抗體、HC-TPO抗體或HC+LC-TP0抗體可顯著提高隨后MMC治療的小鼠的血小板水平。總之，這些研究結果可進一步支持以下結論TPO模擬肽在輕鏈的一個或兩個羧基端上(允許TPO模擬物呈現在抗體的中心裂口上)和在重鏈鉸鏈區處或附近的特定置換為這些TPO模擬抗體分子提供優良的TPO樣生物活性。因此，預期LC-TPO抗體、HC-TPO抗體和HC+LC-TP0抗體可用于治療經歷骨髓抑制療法的動物。實施例8. TPO模擬抗體對Y輻射小鼠中的血小板水平的作用(預治療)C57BL6/J小鼠，8-10周齡，通過皮下注射給予下列抗體之一 CDR_TP0抗體、LC-TPO抗體、HC-TPO抗體、HC+LC-TP0抗體、抗C5對照抗體、抗炭疽Gl對照抗體和抗炭疽 G2/G4對照抗體。根據三個治療方案給予抗體。第一治療方案包括以ang/kg的劑量，每天一次連續 5天將抗體給予小鼠。在最終劑量后的一天，以約0. 90Gy/分鐘對小鼠進行8. 0戈瑞(Gy) 輻射，參見 Mouthon 等(1999Πη . J Radiation Oncology Biol Phys 43(4) :867_875。第二治療方案包括輻射前3天給予小鼠一劑ang/kg劑量的抗體。第三治療方案包括輻射前 1天給予小鼠一劑ang/kg劑量的抗體。在輻射后30天內監測受治療小鼠的存活率。預期與用抗炭疽或抗C5對照抗體治療的小鼠的存活率相比，用LC-TPO抗體、HC-TPO抗體或 HC+LC-TP0抗體治療的輻射小鼠的存活率增加。還預期輻射前給予小鼠單劑量的LC-TPO抗體、HC-TPO抗體或HC+LC-TP0抗體可顯著增加輻射小鼠的存活率。此外，預期在增加輻射小鼠存活率方面，LC-TPO抗體、HC-TPO抗體或HC+LC-TP0抗體比在⑶R區含有TPO模擬物的抗體更有效。t施徹丨9. TPO 1草擬杭體對Y輻射小鼠中階血小板水平的作用(后治療)在另一項實驗中，C57BL6/J小鼠，8-10周齡，通過皮下注射給予下列抗體之一 CDR-TPO抗體、LC-TPO抗體、HC-TPO抗體、HC+LC-TP0抗體、抗C5對照抗體、抗炭疽Gl對照抗體和抗炭疽G2/G4對照抗體。根據一種治療方案，在以約0. 90Gy/分鐘暴露于8. 0戈瑞(Gy)輻射后6小時給予小鼠抗體，參見Mouthon等(1999)，同上。在第二治療方案中，在輻射小鼠后6小時并且每天一次連續4天給予小鼠抗體。在輻射后30天內監測受治療小鼠的存活率。預期與用抗炭疽或抗C5對照抗體治療的小鼠的存活率相比，用LC-TPO抗體、HC-TPO抗體或HC+LC-TP0 抗體治療的輻射小鼠的存活率增加。還預期與用對照抗體治療的小鼠的存活率相比，輻射后給予單劑量的LC-TPO抗體、HC-TPO抗體或HC+LC-TP0抗體可顯著增加輻射小鼠的存活率。此外，預期在增加輻射小鼠的存活率方面，LC-TPO抗體、HC-TPO抗體或HC+LC-TP0 抗體比在CDR區含有TPO模擬物的抗體更有效。雖然本公開內容已參照其具體的實施方案進行了描述，但是本領域技術人員應當理解的是可以進行各種變動，等同內容可被替換而又不背離本公開內容的真實精神和范圍。另外，可進行許多修改以便使具體情況、材料、物質組合物、方法、一個或多個方法步驟適于本公開內容的目的、精神和范圍。所有這類修改均意圖在本公開內容的范圍內。
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權利要求
1.一種治療性抗體或所述抗體的治療活性片段，其中所述抗體或片段包含至少兩個治療性肽，且其中至少一個治療性肽在結構上允許治療性肽存在于抗體中心裂口的位置上整合到輕鏈多肽的恒定區。
2.權利要求1的治療性抗體或其治療活性片段，其還包含含有至少一個治療性肽的重鏈多肽，其中將所述至少一個治療性肽整合到(a)重鏈多肽的鉸鏈區中；(b)鉸鏈區的氨基端與鉸鏈區上游的重鏈多肽區之間的連接處；(c)鉸鏈區的羧基端與鉸鏈區下游的重鏈多肽區之間的連接處；或(d)始于重鏈多肽鉸鏈區的氨基端上游少于20個氨基酸或重鏈多肽鉸鏈區的羧基端下游少于20個氨基酸內的位置上。
3.一種治療性抗體或所述抗體的治療活性片段，其中所述抗體或片段包含至少兩個治療性肽，其中重鏈多肽包含至少一個治療性肽，且其中將所述至少一個治療性肽整合到(a)重鏈多肽的鉸鏈區中；(b)鉸鏈區的氨基端與鉸鏈區上游的重鏈多肽區之間的連接處；(c)鉸鏈區的羧基端與鉸鏈區下游的重鏈多肽區之間的連接處；或(d)始于重鏈多肽鉸鏈區的氨基端上游少于20個氨基酸或重鏈多肽鉸鏈區的羧基端下游少于20個氨基酸內的位置上。
4.權利要求3的治療性抗體或其治療活性片段，其還包含輕鏈多肽，其中至少一個治療性肽在結構上允許治療性肽存在于抗體中心裂口的位置上整合到輕鏈多肽的恒定區。
5.權利要求2-4中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中至少一個治療性肽整合到重鏈多肽的鉸鏈區中。
6.權利要求2-4中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中至少一個治療性肽整合到鉸鏈區的氨基端與鉸鏈區上游的重鏈多肽區之間的連接處。
7.權利要求2-4中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中至少一個治療性肽整合到鉸鏈區的羧基端與鉸鏈區下游的重鏈多肽區之間的連接處。
8.權利要求2-4中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中至少一個治療性肽整合到始于鉸鏈區氨基端上游少于20個氨基酸內的位置上。
9.權利要求2-4中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中至少一個治療性肽整合到始于鉸鏈區羧基端下游少于20個氨基酸內的位置上。
10.權利要求1、2或4-9中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中所述治療性肽如下整合到輕鏈多肽的恒定區⑴插入所述恒定區的β轉角區內；或( )在所述恒定區的β轉角區內置換。
11.權利要求1、2或4-9中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中所述治療性肽因添加到恒定區的羧基端而整合到輕鏈多肽的恒定區。
12.權利要求1、2或4-9中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中所述治療性肽如下整合到輕鏈多肽的恒定區(iii)插入位于所述恒定區的最終β折疊結構下游的位置上；或(iv)添加到位于所述恒定區的最終β折疊結構下游的位置上。
13.權利要求1-12中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中輕鏈多肽的羧基端包含至少一個治療性肽，重鏈多肽包含至少一個治療性肽。
14.權利要求1-13中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中所述抗體或片段包含至少4個治療性肽。
15.權利要求1-14中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中至少兩個治療性肽是相同的。
16.權利要求1-15中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中所有治療性肽都是相同的。
17.權利要求1-16中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其還包含位于至少一個治療性肽的氨基端的間隔基氨基酸序列。
18.權利要求1-17中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其還包含位于至少一個治療性肽的羧基端的間隔基氨基酸序列。
19.權利要求1-18中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中至少一個治療性肽是激動劑肽。
20.權利要求1-19中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中至少一個治療性肽是肽模擬物。
21.權利要求20的治療性抗體或其治療活性片段，其中所述肽模擬物是TPO模擬物。
22.權利要求1-21中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中所有治療性肽都是 TPO模擬物。
23.權利要求21或22的治療性抗體或其治療活性片段，其中所述TPO模擬物包含SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列。
24.權利要求21-23中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中所述抗體包含含有SEQ ID NO :10所述氨基酸序列的輕鏈多肽。
25.權利要求21-23中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中所述抗體包含含有SEQ ID NO :12所述氨基酸序列的重鏈多肽。
26.權利要求21-25中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中所述抗體包含含有SEQ ID NO: 10所述氨基酸序列的輕鏈多肽和含有SEQ ID NO 12所述氨基酸序列的重鏈多肽。
27.權利要求21-23中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中所述抗體由包含 SEQ ID NO: 10所述氨基酸序列的輕鏈多肽和包含SEQ ID NO 12所述氨基酸序列的重鏈多肽組成。
28.權利要求1-27中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中所述抗體是單克隆抗體。
29.權利要求1-23中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中所述抗體是人源化抗體。
30.權利要求1- 中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中所述抗體或其治療活性片段選自嵌合化抗體、嵌合抗體、去免疫化人抗體、完全人抗體和F(ab’)2片段。
31.權利要求1- 中任一項的治療活性片段，其中所述治療活性片段選自Fd片段、Fab 片段和Fab’片段，且其中所述治療活性片段包含至少兩個治療性肽；和至少部分的重鏈多肽鉸鏈區或至少部分的輕鏈多肽羧基端。
32.權利要求1-31中任一項的治療性抗體或其治療活性片段，其中所述抗體或治療活性片段還包含異源部分。
33.一種組合物，其包含權利要求1-32中任一項的治療性抗體或治療活性片段和藥學上可接受的載體。
34.一種組合物，其包含權利要求21-32中任一項的治療性抗體或治療活性片段和藥學上可接受的載體。
35.權利要求34的組合物，其還包含至少一種用于降低輻射暴露的副作用或用于降低化學治療的副作用的活性劑。
36.權利要求35的組合物，其中所述至少一種活性劑選自抗生素、麻醉劑、止吐藥、類固醇、螯合劑和利尿藥。
37.權利要求34-36中任一項的組合物，其還包含至少一種用于增加受試者的血小板產生的其它活性劑。
38.權利要求37的組合物，其中所述至少一種用于增加受試者的血小板產生的其它活性劑選自艾曲波帕、奧普瑞白介素、羅米司亭、培非司亭和紅細胞生成素刺激劑。
39.一種用于增加受試者的血小板產生的方法，所述方法包括將治療有效量的包含權利要求21-32中任一項的治療性抗體或其治療活性片段的組合物給予有需要的受試者。
40.一種用于增加受試者的血小板產生的方法，所述方法包括將包含治療有效量的權利要求21-32中任一項的治療性抗體或其治療活性片段的組合物給予有需要的受試者。
41.權利要求39或40的方法，其中所述受試者患有血小板計數不足相關病癥。
42.權利要求41的方法，其中所述病癥選自伯-索綜合征、特發性血小板減少性紫癜、 威-奧綜合征、脾功能亢進、血栓性微血管病、彌散性血管內凝血、肝素誘發的血小板減少癥(HIT)、馮維勒布蘭德病、變型馮維勒布蘭德病、因HIV感染所致的血小板減少癥、因慢性肝病所致的血小板減少癥和格蘭茲曼血小板機能不全。
43.權利要求41或42的方法，其中所述病癥是藥物誘導性血小板機能不全。
44.權利要求39-43中任一項的方法，其中所述受試者患有癌癥。
45.權利要求44的方法，其中所述受試者患有選自以下的癌癥肺癌、乳癌、結腸癌、胰腺癌、腎癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液學癌癥、神經組織癌、黑素瘤、甲狀腺癌、卵巢癌、睪丸癌、 前列腺癌、子宮頸癌、陰道癌和膀胱癌。
46.權利要求43-45中任一項的方法，其中血小板機能不全由化學治療藥引起。
47.權利要求39-46中任一項的方法，其中已經給予或將要給予受試者化學治療方案或放射治療方案。
48.權利要求47的方法，其中所述化學治療方案包括給予受試者一種或多種選自以下的細胞毒性劑環磷酰胺、泰素、甲氨蝶呤、氮芥、硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥、氟尿嘧啶、順鉬、 諾考達唑、羥基脲、長春新堿、長春堿、依托泊苷、多柔比星、博來霉素、卡鉬、吉西他濱、紫杉醇、托泊替康和硫鳥嘌呤。
49.權利要求47的方法，其中所述放射治療方案包括X射線或γ輻射。
50.權利要求47或49的方法，其中所述放射治療方案包括將放射性試劑給予受試者。
51.權利要求47-50中任一項的方法，其中在化學治療方案或放射治療方案之前將所述組合物給予受試者。
52.權利要求47-50中任一項的方法，其中在化學治療方案或放射治療方案期間或之后將所述組合物給予受試者。
53.權利要求39-52中任一項的方法，其中所述受試者是人。
54.權利要求39-53中任一項的方法，其中將所述組合物靜脈內給予受試者。
55.權利要求39-53中任一項的方法，其中將所述組合物皮下、腹膜內或肌內給予受試者ο
56.權利要求39-55中任一項的方法，其中將所述組合物作為單劑量給予受試者。
57.權利要求39-55中任一項的方法，其中將不止一個劑量的所述組合物給予受試者。
58.權利要求57的方法，其中在化學治療方案或放射治療方案(i)之前和(ii)期間或之后將所述組合物給予受試者。
59.權利要求39-58中任一項的方法，其中與不給予所述組合物的情況下可能是安全可行的相比，所述化學治療方案或放射治療方案(i)更有效，或(ii)更頻繁地給予受試者。
60.權利要求39-59中任一項的方法，所述方法還包括將至少一種用于降低化學治療方案或放射治療方案的副作用的其它物質給予受試者。
61.權利要求60的方法，其中所述至少一種物質選自抗生素、麻醉劑、止吐藥和雄烯二
62.權利要求39-61中任一項的方法，所述方法還包括將至少一種增加血小板產生的其它物質給予受試者。
63.權利要求62的方法，其中所述至少一種增加血小板產生的其它物質選自艾曲波帕、奧普瑞白介素、羅米司亭、培非司亭和紅細胞生成素刺激劑。
64.權利要求39-63中任一項的方法，所述方法還包括在給予所述組合物后，監測受試者的血小板水平的提高。
65.一種分離多肽，其包含以下氨基酸序列，所述氨基酸序列含有至少一個TPO模擬肽氨基酸序列并且(i)與由SEQID NO 10所述核酸編碼的氨基酸序列有至少80%同一性；或(ii)與由SEQID NO :12所述核酸編碼的氨基酸序列有至少80%同一性。
66.一種分離核酸，其編碼包含以下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列含有至少一個 TPO模擬肽氨基酸序列并且(i)與由SEQID NO 10所述核酸編碼的氨基酸序列有至少80%同一性；或(ii)與由SEQID NO :12所述核酸編碼的氨基酸序列有至少80%同一性。
全文摘要
本公開內容的特征在于治療性抗體(例如TPO模擬抗體)及其治療活性片段以及用于制備和使用所述抗體和片段的方法。例如，治療性抗體及其片段可用于各種診斷和/或治療應用，例如用于增加受試者的血小板水平的方法。
文檔編號C07K16/00GK102428105SQ201080018363
公開日2012年4月25日 申請日期2010年2月18日 優先權日2009年2月24日
發明者D·吉斯, J·P·斯普林霍恩 申請人:阿雷克森制藥公司