專利名稱：滑膜間充質親干細胞親和多肽的氨基酸序列、篩選方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學領域，特別涉及一種滑膜間充質親干細胞親和多肽的氨基酸序列、篩選方法及應用。
背景技術：
經過近20年的發展，組織工程(Tissue Engineering, TE)術已經廣泛地應用于臨床的各個領域，包括骨組織、軟骨、神經、血管、皮膚以及胃腸道和泌尿生殖系統的再生和修復。在組織工程的發展過程中，針對各種組織的支架的不斷改進和更新是關鍵，包括材料的更新、制作方法的改進以及構建理念的不斷創新。而近期組織工程學另一個比較明顯的理念上的轉變，就是“化繁為簡”，即與其在體外通過各種復雜的手段和技術來盡可能地去模擬正常組織的組成，然后再植入體內，不如為人體提供一個自我修復的支架，讓人體這個天然的“生物反應器”依附這個支架來進行自我修復。因為人體內環境是十分復雜的，所以才會導致很多實驗設想與結果相差很大，并且支架植入步驟的繁復也會限制其在臨床上的推廣和應用。但這樣的支架就要求根據需要來進行特定的修飾，從而起到誘導特定細胞粘附、 增殖和分化的作用。正常組織中，細胞周圍基質對細胞的生物功能具有重要的意義，通過基質中的蛋白或多肽分子的功能結構域與細胞表面受體結合，激活細胞內復雜的信號通路，對細胞的基因表達、粘附、遷移、增殖以及分化等生物學功能進行調控，而這些功能域也許僅僅只有幾個氨基酸片段的長度。這種調控方式，為我們構建活性多肽序列，對組織工程支架進行表面修飾，以模擬細胞周圍基質對細胞本身的調控功能提供了理論依據。采用不同類型的多肽對支架進行修飾，也賦予支架不同的生物功能。有研究表明，采用細胞周圍基質蛋白對人工支架進行表面修飾，可提高細胞對支架的貼附率和增殖率，進一步的研究發現，在這些細胞周圍基質蛋白中，纖粘連蛋白(fibronectin)是促進細胞貼附、遷移的主要成分。實際上，真正影響細胞生物功能的只是纖粘連蛋白中幾個氨基酸片段構成的功能域。例如，采用 RGD多肽對支架進行修飾，即可提高肌細胞對支架的貼附率，也提高了細胞的增殖效率，說明僅需三個氨基酸片段長度的結構域就能對細胞功能產生顯著影響。Duan等4人也有類似的發現，利用角膜細胞特異親和性多肽序列對支架進行修飾后，可提高角膜上皮細胞對支架的貼附率，并誘導角膜細胞在支架上分層排列，出現類似于生理情況下的組織結構。同時，利用多肽對支架進行修飾，也可調控蛋白分子在組織工程支架上的聚集，Ryadnov等人利用多種多肽片段構建的小分子蛋白對支架進行修飾，利用多肽對特定蛋白分子表現出的親和性，賦予支架捕獲這些蛋白分子的功能，使蛋白分子在支架周圍富集，進而調控支架內細胞的生物學功能。Siah等人利用TGF-β高度親和的多肽序列對多肽兼性分子納米支架 (PA)進行修飾，極大提高了支架對軟骨缺損的修復效果，這種支架對干細胞向軟骨定向分化的誘導能力大大增強，粘多糖的表達程度也顯著提高。說明多肽修飾后的支架，可裝載、 保護，并緩釋生長因子，這種緩釋作用，與支架的降解時間以及親和多肽對支架的修飾程度密切相關，當修飾程度為5%-10%時，植入體內第4周后，支架仍能發揮優良的生長因子緩釋功能。而且最關鍵的是，裝載外源性TGF-β和沒有轉載外源性TGF-β的支架對軟骨缺損的最終修復效果沒有顯著差別，這說明這種TGF-β親和多肽修飾后的支架，在沒有裝載外源性生長因子的情況下，可大量富集內源性的TGF-β生長因子，改善支架內的微環境， 實現誘導干細胞向軟骨分化的功能。滑膜間充質干細胞(SMSC)作為間充質干細胞(MSC)家族中的新成員，最早由De Bariet al.在2001年首次從滑膜組織中成功提取出來，經過了近十年的研究，滑膜間充質干細胞具有與間充質干細胞類似的多向分化潛能已經被眾多的實驗所證實，并且滑膜間充質干細胞相較其他組織來源的間充質干細胞具有更強的增殖活性，其多向分化潛能受供體年齡、傳代次數以及保存保存方式的影響也相對較小，取材部位也較為寬泛，更為重要的是大量研究結果顯示，滑膜間充質干細胞相較于其他組織來源的間充質干細胞具有更強的向軟骨細胞分化的潛能。在實現本發明的過程中，發明人發現現有技術至少存在以下間題現有技術中還沒有一種滑膜間充質親干細胞親和多肽的篩選方法，該方法能夠提高生物材料對于滑膜間充質干細胞特異性親和能力，在組織工程軟骨修復領域里有著深遠的意義和廣泛的應用前
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發明內容
本發明實施例的目的是針對上述現有技術的缺陷，提供一種能夠提高生物材料對于滑膜間充質干細胞特異性親和能力的滑膜間充質親干細胞親和多肽的篩選方法。本發明另一目的提供滑膜間充質親干細胞親和多肽的氨基酸序列。本發明又一目的提供滑膜間充質親干細胞親和多肽的應用。為了實現上述目的本發明采取的技術方案是一種利用改進的噬菌體展示技術篩選能夠提高生物材料對于滑膜間充質干細胞特異性親和能力的滑膜間充質親干細胞親和多肽的方法，包括以下步驟(1)人滑膜間充質干細胞以及人成纖維細胞原代培養通過人滑膜間充質干細胞的原代培養并傳一代，獲得陽性篩選細胞；通過人成纖維細胞的原代培養并傳十代以上，獲得陰性篩選細胞；(2)陰性篩選在陰性篩選細胞中加入噬菌體文庫，去除噬菌體文庫中與PlO代 ACL成纖維細胞結合的多肽片段；(3)陽性篩選在陽性篩選細胞中加入步驟⑵中陰性篩選后得到的噬菌體多肽文庫菌液，獲得經陽性篩選后的滑膜間充質干細胞，該細胞結合了噬菌體文庫中與其特異性結合的親和多肽片段；(4)噬菌體擴增提取步驟3所得滑膜間充質干細胞，制備細胞裂解液，對其內的噬菌體滴度進行擴增；(5)測量擴增后的噬菌體提取液的滴度，4°C保存；以上(1) ( 步驟重復4輪，第1輪篩選加入噬菌體文庫原液，以后每輪加入前輪細胞裂解液擴增后的噬菌體提取液；
(6)提取每一輪所得的和滑膜間充質干細胞特異性親和的噬菌體DNA片段，進行測序，篩選出對滑膜間充質干細胞具有高度親和性的多肽序列即序列表中的SEQ ID NO. 1 :LTHPRWP，其 DNA 序列如序列表中的 SEQ ID NO. 2 所示CTTACGCATCCTCGTTGGCCT。本發明的另一技術方案是滑膜間充質親干細胞親和多肽修飾植入人體支架的應用及其修飾方法，包括以下步驟將選出的滑膜間充質干細胞親和多肽的3’ C末端，連接一個半胱氨酸(C)，利用該半胱氨酸(C)殘基與聚己內酯(PCL)電紡絲膜經氨化后的表面-NH2 共價耦聯，使得PCL納米纖維膜支架具有特異性富集滑膜間充質干細胞的性能。具體包括以下步驟1)將PCL納米纖維膜置于異丙醇配置的10% w/v的1，6_己二胺中，37°C，放置 lh；2)通過交聯齊[J (4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate (sulfo-SM CC) )4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環己烷-1-羧基磺基琥珀酰亞胺將PCL納米纖維膜表面的氨基和親和多肽相連接。更具體的步驟為1)將PCL納米纖維膜修剪成與M孔板的孔面積相等的圓形，然后將其放入M孔板的孔內，每孔加入500 μ 1的10% w/v的1，6_己二胺/異丙醇溶液，37°C，放置Ih ；2)去離子水漂洗3 5遍，雙蒸水漂洗3 5遍，PBS (0. 01M, pH 7. 4)沖洗3遍；3)每孔加入400 μ 1的交聯劑4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷羧酸_3_磺基琥珀酰亞胺酯(lmg/ml SMCC, Thermo公司)，室溫下放置Ih ；4)用含 EDTA 的緩沖液(500ml 0. 01M/pH 7. 4 的 PBS+18. 612gEDTA，pH 7. 2 7. 5) 沖洗3遍5)加入0. lmg/ml的多肽溶液(用上述含EDTA的緩沖液配置)，每孔400 μ 1,4°C 過夜；6)去離子水漂洗3遍，-20°C預凍，真空凍干后4°C保存。本發明實施例提供的技術方案帶來的有益效果是1、通過噬菌體展示技術獲得滑膜間充質干細胞特異性的親和多肽片段，使之能夠靶向性地和滑膜間充質干細胞高度親合。2、通過將親和多肽片段與PCL電紡絲膜進行共價耦聯，從而對PCL納米纖維膜表面進行修飾，使之能夠特異性地富集滑膜間充質干細胞，使得該材料作為支架在體內進行軟骨再生修復的時候，能夠持續性地粘附滑膜間充質干細胞，并產生正常細胞外基質 (ECM)，從而達到更好的修復效果。3、在對該多肽進行種屬特異性鑒定的過程中發現該多肽并無明顯的種屬特異性， 所以該親和多肽序列還可廣泛應用于各種細胞學實驗和動物實驗中，作為一種篩選滑膜間充質干細胞的親和載體，可以更加高效地篩選、純化滑膜間充質干細胞。


圖1是本發明實施例1中提供的人滑膜間充質干細胞原代培養結果圖；圖2a、圖2b和圖2c是本發明實施例1的噬菌體滴度測定中提供的噬菌體藍斑實驗結果；將倍比稀釋后的噬菌體10 μ 1加入200 μ 1大腸桿菌菌液中孵育1-5分鐘，加入頂層培養基迅速混勻，平鋪四環素抗性的LB-tet培養板上，37°C，5% CO2過夜，計算平板上的噬菌體藍斑數。然后用此數目乘以稀釋因子即得到每10 μ 1噬菌體的空斑形成單位(pfu) 滴度。并挑取單個藍斑在LB/大腸桿菌培養液中擴增，提取噬菌體DNA測序。圖加藍斑數量10° ；圖2b、藍斑數量IO1 ；圖2c 藍斑數量IO20圖3是本發明實施例1的噬菌體親和多肽篩選中提供的四輪篩選的噬菌體的回收率；圖如是本發明實施例2提供的人的MSC親和多肽的流式細胞檢測結果圖；圖4b是針對圖如的的熒光強度的定量分析結果圖；參見圖如和圖4b，InM的FITC熒光標記的滑膜間充質干細胞親和多肽 (SMSC-affinity peptide sequence)和錯配多肽(Scramble peptide)分別與滑膜間充質干細胞孵育1小時后，進行流式細胞分析；由圖4b可見，FITC標記的錯配多肽與滑膜間充質干細胞共同孵育，平均熒光強度為5 ；FITC標記的親和多肽與滑膜間充質干細胞共同孵育，平均熒光強度為174，親和多肽組的熒光強度(174)遠高于錯配多肽組的熒光強度 (5)；圖fe是是本發明實施例2提供的大鼠的MSC親和多肽的流式細胞檢測結果圖；圖恥是針對圖fe的的熒光強度的定量分析結果圖；圖5c是是本發明實施例2提供的家兔的MSC親和多肽的流式細胞檢測結果圖；圖5d是針對圖5c的的熒光強度的定量分析結果圖；參見圖fe和圖恥，大鼠(Rat) :FITC標記的錯配多肽與大鼠滑膜間充質干細胞共同孵育，平均熒光強度為4 ；FITC標記的親和多肽與大鼠滑膜間充質干細胞共同孵育，平均熒光強度為99，親和多肽組的熒光強度(99)遠高于錯配多肽組的熒光強度；參見圖5c和5d，家兔(Rabbit) =FITC標記的錯配多肽與家兔滑膜間充質干細胞共同孵育，平均熒光強度為5 ；FITC標記的親和多肽與家兔滑膜間充質干細胞共同孵育，平均熒光強度為92，親和多肽組的熒光強度(9 遠高于錯配多肽組的熒光強度(5)；其中，圖如、圖fe和圖5c中，左邊的峰代表的是錯配多肽，右邊的峰代表的是親和多肽。圖6是本發明實施例2提供的激光共聚焦顯微鏡觀察結果；標記FITC的親和多肽和錯配多肽分別與滑膜間充質干細胞共同孵育lh，鬼筆環肽復染細胞骨架，hochest復染胞核，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞與多肽結合情況；結果顯示親和多肽序列(LTHPRWP)對于滑膜間充質干細胞的親和力顯著高于錯配多肽(PRHLPTW)；圖7是本發明實施例3提供的利用共價結合方式，將親和多肽片段連接到聚己內酯(PCL)納米電紡絲纖維膜表面的示意圖；圖8是本發明實施例3提供的滑膜間充質干細胞特異性多肽修飾的PCL納米電紡絲纖維膜在激光共聚焦顯微鏡下觀察的多肽連接；圖中顯示連接了 FITC標記的親和多肽片段(LTHPRWP)的聚己內酯(PCL)納米纖維，可見綠色熒光強度較高，提示較高的連接效率；圖9a和圖9b是本發明實施例3提供的滑膜間充質干細胞特異性多肽修飾PCL納米電紡絲支架的效果；圖9a為連接了滑膜間充質干細胞親和多肽片段；圖9b為連接了錯配多肽片段；
分別將連接了滑膜間充質干細胞親和多肽片段(LTHPRWP)和錯配多肽片段 (PRHLPTff)的聚己內酯(PCL)納米纖維膜置于滑膜間充質干細胞懸液中，共同培養，結果顯示連接了親和多肽的PCL納米纖維膜相較連接錯配多肽的PCL納米纖維膜更有利于滑膜間充質干細胞的粘附和生長。(藍色1 :h0CheSt-胞核；綠色2 連接多肽的PCL納米纖維膜；紅色3 鬼筆環肽-細胞骨架)。
具體實施例方式為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明實施方式作進一步地詳細描述。實施例1噬菌體展示技術篩選滑膜間充質干細胞親和多肽序列(1)人滑膜間充質干細胞以及人成纖維細胞原代培養a.人滑膜間充質干細胞原代培養及傳代從接受全膝關節置換(TKA)的患者手術過程中獲取膝關節髕上囊中的滑膜組織， 放入PBS(0. 01M，pH 7. 4)中洗滌2次，將滑膜組織用眼科剪剪碎，加入胰酶，37°C消化30min 去除膜性組織；離心，PBS(0. 01M，pH 7. 4)洗滌，棄上清液，加入0.2% I型膠原酶37°C消化 2小時；離心，PBS(0. 01M，pH 7.4)洗滌2遍，加入含10% FBS的DMEM(LG)完全培養基，2 3天換一次培養液，并傳一代，作為陽性篩選細胞(參見圖1)。其中DMEM是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養基。b.人成纖維細胞原代培養及傳代從接受全膝關節置換(TKA)的患者手術過程中獲取ACL(人前交叉韌帶)組織， PBS (0. 01M, pH 7.4)沖洗，去除表面的膜性組織及血凝塊，用眼科剪將其剪碎，37°C下用胰酶消化30min去除雜質，加入完全培養基中止消化，PBS (0. 01M, pH 7. 4)洗滌2次，再加入 0. 2% I型膠原酶(用DMEM配制)，37°C消化2-3小時，每小時置37°C恒溫振蕩箱振蕩5min， 直到組織塊大部分呈肉眼可見的絮狀物，倒置顯微鏡下觀察細胞大部分分離后，以彎頭吸管輕輕吹打，加入等體積的完全培養基以中和膠原酶，消化后的細胞懸液經離心，棄上清液后，用完全培養基重懸、鋪板，并傳十代以上。作為陰性篩選細胞。(2)陰性篩選(去除與PlO代ACL成纖維細胞結合的多肽片段)a.取一皿PlO代ACL成纖維細胞，用胰酶消化、PBS (0. 01M, pH 7. 4)洗滌2 3 遍；加入 blocking buffer (封閉緩沖液，0. IM NaCO3 (ρΗ8· 6)，5mg/ml BSA, 0. 02% NaN3)重懸于ImlEP管中，4°C封閉lh，減少非特異性結合；b.離心(1500rpm,5min)，棄上清液，加入0. 5ml的無血清DMEM(HG)，細胞計數 (2 X IO6)；c.加入 Ιμ 的噬菌體文庫(PH.D.-7TM PHage Display Library, NEB) (1 X 10nPFU/10 μ 1 噬菌體原液，100 μ 1)，室溫放置 30min ；d.離心(lOOOOrpm，5min)，吸取上清液，得到陰性篩選后的噬菌體多肽文庫菌液， 移至新EP管中備用；(3)陽性篩選a.取一皿Pl代人來源SMSC(滑膜間充質干細胞)，用胰酶消化，PBS (0. 01M, pH7.4)洗滌2 3遍；加入blocking buffer重懸于Iml EP管中，4°C封閉lh，減少非特異性
結合；b.離心，棄上清液，加入0. 5ml的無血清DMEM(HG)，細胞計數(2 X IO6)；c.加入步驟( 所得陰性篩選后的噬菌體多肽文庫菌液，室溫放置30min ；d.離心，棄上清液，PBS洗滌2 3遍，得到陽性篩選后的細胞；(4)噬菌體擴增(參見 PH. D.-7TM PHage Display Peptide Library Kit 操作手冊)a.將步驟( 所得陽性篩選后的細胞制備細胞裂解液，對其內的噬菌體滴度進行擴增將細胞裂解提取液加入20ml ER2738培養液中(處于early-log)，在37°C搖晃，孵育 4. 5小時；b.將步驟1)中的培養液加入離心管中，4°C下，10，OOOrpm離心10分鐘，將上清移入新管中，再次離心(10, OOOrpm, IOmin)；c.抽取80%上清，移到新離心管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，讓噬菌體在4°C下沉淀過夜；d.次日，10，OOOrpm, 4 °C下，將噬菌體菌液離心，15分鐘，棄上清，再次離心 (10，OOOrpm, IOmin)，棄上清液；e 用 Iml TBS (50mM Tris-HCl (ρΗ7· 5)，150mM NaCl)重新懸浮噬菌體沉淀，4°C下， 離心5分鐘。f.將上清移到新離心管中，用1/6體積的PEG/NaCl再次沉淀。在冰上孵育60分鐘。4°C，10，OOOrpm離心10分鐘，棄上清液，重新短暫離心，再次棄上清。g.用200 μ 1的TBS (ρΗ7. 5，含0. 02% NaN3)重新懸浮沉淀，離心1分鐘，將上清移到新離心管中。此即為擴增后的噬菌體提取液。(5)噬菌體滴度測定(參見 PH. D.-7ΤΜ PHage Display Peptide Library Kit 操作手冊)a.接種ER2738單菌落于5-10ml LB培養基中，37°C，250rpm搖床孵育至對數中期 (OD600 0. 5)。b.微波爐加熱融化上層瓊脂，分成:3ml/份分裝到滅菌試管中，每個稀釋度的噬菌體一管。保存于45°C備用。c. 37°C預溫LB/IPTG/Xgal平板，每個噬菌體稀釋梯度取一個平板備用。d.用LB培養液對噬菌體進行10倍比列稀釋。建議稀釋范圍擴增的噬菌體培養物上清=IO8-IO11 ；未擴增的淘選洗脫物-.IO1-IO4O每個稀釋度換一新鮮吸頭，建議使用帶濾芯吸頭以避免交叉污染。e當大腸桿菌菌液達對數中期，分成200 μ 1/等份于微量離心管中，每個噬菌體稀
釋度用一管。f.每管大腸桿菌菌液中分別加入10 μ 1不同稀釋倍數的噬菌體，快速震蕩混勻， 室溫溫育l-5min。g.將噬菌體感染的大腸桿菌菌液加入45°C預溫的頂層瓊脂培養管中，每次一管， 快速混勻，立即傾注于37°C預溫的LB/IPTG/Xgal平板上。適當傾斜平板將上層瓊脂均勻鋪開。
h.待平板冷卻5min后，倒置于37°C孵箱，培養過夜。i檢查平板，計數有 IO2個噬菌斑的平板上的斑數(參見圖2a、圖2b和圖2c)。 然后，用此數目乘以稀釋因子即得到每10μ 1噬菌體的空斑形成單位(Pfu)滴度。以上(1) ( 步驟重復4輪，然后對每一輪的噬菌體提取液進行測序。(6)噬菌體多肽片段測序(參見PH.D. -7TM PHage Display Peptide Library Kit 操作手冊)a.噬菌斑的擴增將大腸桿菌擴增菌液(0D 0. 5)按1 100用LB培養液稀釋， 每個待測序的噬菌斑克隆分裝一管，Iml/管；b.用滅菌牙簽或吸頭，在菌斑數在10-100之間的平皿內挑取單克隆藍色菌斑，放入上述Iml培養管中。共挑取20個單克隆。c. 37 "C，250rpm 搖床，孵育 4. 5_5h ；d.孵育后的噬菌體菌液轉入離心管中，離心30秒。上清移入新管，再離心。吸取 80%上清液轉入新離心管，此即為擴增噬菌體貯液，可以4°C貯存幾個星期而對滴度影響不大。長期貯存應用滅菌甘油1 1稀釋后，-20°C貯存；e.從上述擴增的單克隆噬菌體菌液中，吸取500 μ 1到新離心管中；f.加 200ul PEG/NaCl，顛倒混勻，室溫放置 IOmin ；g.離心lOmin，棄上清液，再次短暫離心(lOOOOrpm，30sec)吸去殘余上清液；h.噬菌體沉淀徹底重懸于100 μ 1碘化物緩沖液中，加入250 μ 1乙醇。室溫孵育 IOmini.離心lOmin，棄上清液。用70%的乙醇洗沉淀，短暫真空干燥；j.沉淀重懸于20 μ 1雙蒸水中，即為噬菌體模版DNA溶液；k.測序，經過四輪篩選，得到一組對滑膜間充質干細胞具有高度親和性的多肽序列。本發明實施例試驗結果a、噬菌體親和多肽篩選利用噬菌體展示文庫(PHD. -7TM PHage Display Peptide LibraryKit ；New England Biolabs)，一共進行了 4輪篩選，每次篩選后，測定獲取噬菌體滴度，乘以菌液總體積，即為篩選后回收的噬菌體總量，同時，將篩選后的噬菌體進行擴增，采用擴增后的噬菌體進行下一輪篩選。第一輪篩選加入1 μ 1的噬菌體原液(滴度1X1013PFU/I0l·! 1)，裂解細胞后，提取噬菌體滴度為1X103PFU/I0y 1，將提取的噬菌體擴增后，噬菌體滴度為lXlO^PFU/lOy 1 ；第二輪篩選加入擴增后的噬菌體10 μ 1，篩選后，回收噬菌體滴度為5.3X104PFU/10y 1，擴增后滴度為1 X 10"PFU/10 μ 1 ；第三輪篩選 篩選后，回收噬菌體滴度為1. 2X106PFU/10 μ 1，擴增后滴度為6.0X1010PFU/10 μ 1 ；第四輪篩選篩選后，回收噬菌體滴度為9.0X105PFU/10l·! 1。Table 1 噬菌體回收率
權利要求
1.一種滑膜間充質親干細胞親和多肽氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列為序列表中的SEQ ID NO. 1。
2.一種如權利要求1所述的滑膜間充質親干細胞親和多肽氨基酸序列的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟采用噬菌體展示技術分別進行人成纖維細胞的陰性篩選和滑膜間充質干細胞的陽性篩選；篩選之后，提取滑膜間充質干細胞，裂解細胞，再提取和滑膜間充質干細胞特異性親和的噬菌體DNA片段，對其進行測序，即可獲取對滑膜間充質干細胞具有高度親和性的多肽氨基酸序列。
3.根據權利要求2所述的滑膜間充質親干細胞親和多肽的篩選方法，其特征在于，具體包括以下步驟(1)人滑膜間充質干細胞以及人成纖維細胞原代培養通過人滑膜間充質干細胞的原代培養并傳一代，獲得陽性篩選細胞；通過人成纖維細胞的原代培養并傳十代以上，獲得陰性篩選細胞；(2)陰性篩選在陰性篩選細胞中加入噬菌體文庫，去除噬菌體文庫中與PlO代ACL細胞結合的多肽片段；(3)陽性篩選在陽性篩選細胞中加入步驟O)中陰性篩選后得到的噬菌體多肽文庫菌液，獲得陽性篩選后的滑膜間充質干細胞，該細胞結合了噬菌體文庫中與其特異性結合的親和多肽片段；(4)噬菌體擴增提取步驟C3)所得滑膜間充質干細胞，制備細胞裂解液，對其內的噬菌體滴度進行擴增；(5)測量擴增后的噬菌體提取液的滴度，4°C保存；以上(1) ( 步驟重復4輪，第1輪篩選加入噬菌體文庫原液，以后每輪加入前一輪細胞裂解液擴增后的噬菌體提取液；(6)提取每一輪所得的和滑膜間充質干細胞特異性親和的噬菌體DNA片段，進行測序， 篩選出對滑膜間充質干細胞具有高度親和性的多肽序列LTHPRWP。
4.一種如權利要求1所述的滑膜間充質親干細胞親和多肽用于修飾植入人體支架的應用。
5.一種用如權利要求1所述的滑膜間充質親干細胞親和多肽修飾植入人體支架的方法，其特征在于，包括以下步驟將選出的滑膜間充質干細胞親和多肽的3’ C末端，連接一個半胱氨酸(C)，利用該半胱氨酸(C)殘基與聚己內酯(PCL)電紡絲膜經氨化后的表面-NH2 共價耦聯，使得PCL納米纖維膜支架具有特異性富集滑膜間充質干細胞的性能。
6.一種權利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步驟1)將PCL納米纖維膜置于異丙醇配置的10%w/v的1，6_己二胺中，37°C，放置Ih ；2)通過交聯劑4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亞胺酯將 PCL納米纖維膜表面的氨基和親和多肽相連接。
7.—種權利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步驟1)將PCL納米纖維膜修剪成與M孔板的孔面積相等的圓形，然后將其放入M孔板的孔內，每孔加入500 μ 1的10% w/v的1，6_己二胺/異丙醇溶液，37°C，放置Ih ；2)去離子水漂洗3 5遍，雙蒸水漂洗3 5遍，PBS沖洗3遍；3)每孔加入400μ 1的交聯劑4-(Ν-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亞胺酯，室溫下放置Ih;4)PBS沖洗3遍;5)加入0.lmg/ml的多肽溶液，每孔400 μ 1，4°C過夜；6)去離子水漂洗3遍，-20°C預凍，真空凍干后4°C保存。
全文摘要
本發明公開了一種滑膜間充質親干細胞親和多肽的氨基酸序列、篩選方法及應用，屬于生物制藥領域。所述篩選方法包括以下步驟采用噬菌體展示技術分別進行人成纖維細胞陰性篩選和滑膜間充質干細胞的陽性篩選；篩選之后，提取滑膜間充質干細胞，裂解細胞，再提取和滑膜間充質干細胞特異性親和的噬菌體片段，對其進行測序，即可獲取對滑膜間充質干細胞具有高度親和性的多肽片段。本發明能夠提高生物材料對于滑膜間充質干細胞特異性親和能力，在組織工程軟骨修復領域里有著深遠的意義和廣泛的應用前景。
文檔編號C07K7/06GK102229647SQ20111015363
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月9日 優先權日2011年6月9日
發明者周春燕, 張辛, 敖英芳, 皮彥斌, 邵振興 申請人:北京大學第三醫院