專利名稱：一種具有三螺旋結構的活性膠原的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種具有三螺旋結構的活性膠原的制備方法，屬于蛋白質工程領域， 該產品為保持三螺旋結構的活性膠原，具有低免疫原性、高生物相容性，可生物降解，適用于醫療用途。
背景技術：
膠原是脊椎動物體內含量最豐富、分布最廣泛的一組硬蛋白，分子量約為300000， 均可在細胞外形成超分子聚集物，大量存在于骨、軟骨、肌腱及皮膚中，占人體或其他動物體總蛋白含量的25%-33%。同一組織中常含有幾種類型的膠原，常以某種為主。I型膠原遍布于肌體的各部分，主要為皮膚、肌腱及韌帶中，具有很強的抗張能力。II型膠原主要存在于透明軟骨、玻璃體中，具有較強的抗壓能力。III型膠原廣泛分布于伸展性大的組織中，如疏松結締組織等，具有伸展性及應變性。其中，I型膠原占生物體總膠原量的90%，因此，I型膠原在生物材料中的使用也最廣泛。膠原在分子水平結構相同，由3條a鏈多肽組成，每一條膠原鏈都是左手螺旋構型。3條左手螺旋鏈又相互纏繞成右手螺旋結構，即超螺旋結構為膠原蛋白獨特的三重螺旋結構，使其分子結構非常穩定。3條鏈富含甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸，缺乏半胱氨酸和色氨酸，酪氨酸含量也很低，但含獨特的羥化氨基酸(羥脯氨酸和羥賴氨酸)。由于原纖維的方向性和成束直徑及密度的不同，不同組織的膠原存在結構差異，并具有各自的功能和結構特征。在結締組織中，膠原除了機械支撐外，還是細胞粘附和移動的重要物質基礎，因此，膠原被認為是胚胎發育和組織再生中重要的形態發生因素，在組織工程中得到廣泛應用。能被稱為膠原的，必須是其三螺旋結構沒有改變的那類蛋白質，還保留有完全生物活性。而膠原蛋白是膠原的水解產物，膠原的三螺旋結構徹底松開，成為3條自由的肽鏈，且降解成多分散的肽段，其中包括小肽。因此膠原蛋白是多肽混合物，相對分子量從幾千到幾萬，分子量分布很寬，沒有生物活性，能溶于冷水，而且能被蛋白酶利用。CNl 110284中公開了一種膠原的制備方法，以酸提取，鹽沉淀，膜過濾，最后凍干， 其提取效率和純度都較低。CN101250218公開了一種以鱈魚皮為原料制備膠原蛋白的方法， 其制備方法會破壞膠原的三螺旋結構。現有技術公開的方法在膠原的提取制備過程中往往破壞膠原的三螺旋結構，或者提取效率較低，無法實現既能夠保留活性膠原的三螺旋結構， 又同時提高提取效率和純度。

發明內容
針對上述情況，本發明的目的是提供一種具有三螺旋結構的活性膠原的制備方法。本發明使用酸酶結合處理加漸進式超聲波處理的制備方法，不僅能夠保持膠原的三螺旋結構，同時顯著的提高了膠原的提取效率。本發明使用H2A溶液處理加酸溶鹽析純化加透析純化有效的提高了膠原產品的純度。—種具有三螺旋結構的活性膠原的制備方法，包括如下步驟原料預處理、除脂、酸酶結合處理、超聲波處理、H2A溶液處理、酸溶鹽析純化、透析純化、干燥。所述的原料為選自新鮮豬皮、牛皮、牛跟腱中的一種。所述的酸酶結合處理為經過預處理的原料浸入0. 6 0. 7mol/L冰醋酸和600 700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持續攪拌25 30小時左右。所述的超聲波處理優選采用漸進式超聲波處理，先使用100 200W超聲處理30 分鐘，再使用200 300W超聲處理30分鐘，最后使用300 400W超聲處理1小時。所述的一種具有三螺旋結構的活性膠原的制備方法，具體步驟如下(1)取新鮮豬皮，切割清除油脂層和毛皮層，去除雜質，清洗，將豬皮破碎成小顆粒狀，按照固液比1 30 1 40的比例，加入0.01 0.03mol/L的氫氧化鈉水溶液，于 6 8°C浸泡1 2小時，過濾，備用；( 在上述預處理后的豬皮中加入質量為豬皮質量6 8倍的無水乙醚或者丙酮， 于35 40°C回流5-8小時，之后用蒸餾水沖洗至無異味，備用；(3)將上述豬皮浸入0. 6 0. 7mol/L冰醋酸和600 700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持續攪拌25 30小時左右；(4)對上述混合物采用漸進式超聲波處理，先使用100 200W超聲處理30分鐘， 再使用200 300W超聲處理30分鐘，最后使用300 400W超聲處理1小時；(5)加入2 3%的H202溶液，混合靜置2 4小時，調節pH至5. 0，離心；(6)取上清液，加入NaCl，攪拌20-30小時，離心，沉淀物加入0. 6-0. 7moL/L冰醋酸溶解，離心，取上清液，調節PH至7. 5，加入NaCl，攪拌20-30小時，離心；(7)將步驟(6)得到的沉淀物溶解于0. 6 0. 7moL/L冰醋酸，先以0. 6 0. 7moL/ L的冰醋酸為透析外液透析2次，每次4小時，再以蒸餾水為透析外液透析5 7次，每次4 小時，至外液檢測不到氯離子，得到膠原液體；(8)將上述液體冷凍干燥，得到具有三螺旋結構活性的膠原。所述的具有三螺旋結構活性膠原的大小一般為20000 30000道爾頓。酸酶結合處理本發明所述的酸酶結合處理是指經過預處理的原料浸入0. 6 0. 7mol/L冰醋酸和600 700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持續攪拌25 30小時左右。該方法結合了酸法和酶法提取制備膠原的特點，防止了對活性膠原三螺旋結構的破壞，有效的提高了提取效率。超聲波處理本發明所述的酸酶結合處理是指采用漸進式超聲波處理，先使用 100 200W超聲處理30分鐘，再使用200 300W超聲處理30分鐘，最后使用300 400W 超聲處理1小時。本發明采用超聲波處理結合酸酶法提取制備膠原蛋白，經過實驗研究發現，采用超聲波處理能夠有效的提高提取效率。采用漸進式超聲波處理與采用固定功率超聲處理相比，能夠更好的防止膠原的三螺旋結構的破壞，并且有效的降低超聲波處理階段的生產能耗。本發明的有益效果本發明使用酸酶結合處理加漸進式超聲波處理的制備方法， 最大程度上減少了對膠原結構的破壞，保持活性膠原的三螺旋結構，同時顯著的提高了膠原的提取效率，降低了生產成本。同時，漸進式超聲波處理也在超聲波處理環節一定程度上降低了能耗。本發明使用H2O2溶液處理加酸溶鹽析純化加透析純化有效的提高了膠原產品的純度。本發明的方法直接制得的膠原產品具有低免疫原性和高生物相容性，已經通過工業化生產，并廣泛應用于醫療產品，如皮膚代用品、骨骼代用品、膠原蛋白敷料、生物工程膜等。
具體實施例方式下面結合實施例，進一步闡述本發明實施例1(1)取新鮮牛皮，切割清除油脂層和毛皮層，去除雜質，清洗，將牛皮破碎成小顆粒狀，按照固液比1 30的比例，加入0.03mol/L的氫氧化鈉水溶液，于6 8°C浸泡2小時， 過濾，備用；(2)在上述預處理后的牛皮中加入質量為牛皮質量8倍的無水乙醚或者丙酮，于 35°C回流8小時，之后用蒸餾水沖洗至無異味，備用；(3)將上述牛皮浸入0. 6mol/L冰醋酸和700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持續攪拌 25小時左右；(4)對上述混合物采用漸進式超聲波處理，先使用100W超聲處理30分鐘，再使用 300W超聲處理30分鐘，最后使用400W超聲處理1小時；(5)加入2%的H2A溶液，混合靜置4小時，調節pH至5. 0，離心；(6)取上清液，加入NaCl，攪拌20小時，離心，沉淀物加入0. 7moL/L冰醋酸溶解， 離心，取上清液，調節pH至7. 5，加入NaCl，攪拌20小時，離心；(7)將步驟(6)得到的沉淀物溶解于0. 7moL/L冰醋酸，先以0. 7moL/L的冰醋酸為透析外液透析2次，每次4小時，再以蒸餾水為透析外液透析5次，每次4小時，至外液檢測不到氯離子，得到膠原液體；(8)將上述液體冷凍干燥，得到具有三螺旋結構活性的膠原。實施例2(1)取新鮮牛跟腱，切割清除油脂層和毛皮層，去除雜質，清洗，將牛跟腱破碎成小顆粒狀，按照固液比1 40的比例，加入0. 01mol/L的氫氧化鈉水溶液，于6 8°C浸泡1 小時，過濾，備用；(2)在上述預處理后的牛跟腱中加入質量為牛跟腱質量6倍的無水乙醚或者丙酮，于40°C回流5小時，之后用蒸餾水沖洗至無異味，備用；(3)將上述牛跟腱浸入0. 7mol/L冰醋酸和600mg/L胃蛋白酶的混合液中，持續攪拌30小時左右；(4)對上述混合物采用漸進式超聲波處理，先使用100W超聲處理30分鐘，再使用 200W超聲處理30分鐘，最后使用300W超聲處理1小時；(5)加入3%的H2A溶液，混合靜置2小時，調節pH至5. 0，離心；(6)取上清液，加入NaCl，攪拌30小時，離心，沉淀物加入0. 6moL/L冰醋酸溶解， 離心，取上清液，調節pH至7. 5，加入NaCl，攪拌30小時，離心；(7)將步驟(6)得到的沉淀物溶解于0. 6moL/L冰醋酸，先以0. 6moL/L的冰醋酸為透析外液透析2次，每次4小時，再以蒸餾水為透析外液透析7次，每次4小時，至外液檢測不到氯離子，得到膠原液體；(8)將上述液體冷凍干燥，得到具有三螺旋結構活性的膠原。
實施例3(1)取新鮮豬皮，切割清除油脂層和毛皮層，去除雜質，清洗，將豬皮破碎成小顆粒狀，按照固液比1 35的比例，加入0. 02mol/L的氫氧化鈉水溶液，于6 8°C浸泡1. 5小時，過濾，備用；(2)在上述預處理后的豬皮中加入質量為豬皮質量7倍的無水乙醚或者丙酮，于 37°C回流6小時，之后用蒸餾水沖洗至無異味，備用；C3)將上述豬皮浸入0.65mol/L冰醋酸和650mg/L胃蛋白酶的混合液中，持續攪拌 28小時左右；(4)對上述混合物采用漸進式超聲波處理，先使用150W超聲處理30分鐘，再使用 250W超聲處理30分鐘，最后使用350W超聲處理1小時；(5)加入2. 5%的H2A溶液，混合靜置3小時，調節pH至5. 0，離心；(6)取上清液，加入NaCl，攪拌25小時，離心，沉淀物加入0. 65moL/L冰醋酸溶解， 離心，取上清液，調節PH至7. 5，加入NaCl，攪拌25小時，離心；(7)將步驟(6)得到的沉淀物溶解于0. 65moL/L冰醋酸，先以0. 65moL/L的冰醋酸為透析外液透析2次，每次4小時，再以蒸餾水為透析外液透析6次，每次4小時，至外液檢測不到氯離子，得到膠原液體；(8)將上述液體冷凍干燥，得到具有三螺旋結構活性的膠原。
權利要求
1.一種具有三螺旋結構的活性膠原的制備方法，其特征在于，包括如下步驟原料預處理、除脂、酸酶結合處理、超聲波處理、H2A溶液處理、酸溶鹽析純化、透析純化、干燥。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的原料為選自新鮮豬皮、牛皮、 牛跟腱中的一種。
3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的酸酶結合處理為經過預處理的原料浸入0. 6 0. 7mol/L冰醋酸和600 700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持續攪拌25 30小時左右。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的超聲波處理優選采用漸進式超聲波處理，先使用100 200W超聲處理30分鐘，再使用200 300W超聲處理30分鐘， 最后使用300 400W超聲處理1小時。
5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，具體步驟如下(1)取新鮮豬皮，切割清除油脂層和毛皮層，去除雜質，清洗，將豬皮破碎成小顆粒狀， 按照固液比1 30 1 40的比例，加入0. 01 0. 03mol/L的氫氧化鈉水溶液，于6 8°C浸泡1 2小時，過濾，備用。(2)在上述預處理后的豬皮中加入質量為豬皮質量6 8倍的無水乙醚或者丙酮，于 35 40°C回流5-8小時，之后用蒸餾水沖洗至無異味，備用。(3)將上述豬皮浸入0.6 0. 7mol/L冰醋酸和600 700mg/L胃蛋白酶的混合液中， 持續攪拌25 30小時左右。(4)對上述混合物采用漸進式超聲波處理，先使用100 200W超聲處理30分鐘，再使用200 300W超聲處理30分鐘，最后使用300 400W超聲處理1小時。(5)加入2 3%的H2A溶液，混合靜置2 4小時，調節pH至5.0，離心。(6)取上清液，加入NaCl，攪拌20-30小時，離心，沉淀物加入0.6-0. 7moL/L冰醋酸溶解，離心，取上清液，調節PH至7. 5，加入NaCl，攪拌20-30小時，離心。(7)將步驟(6)得到的沉淀物溶解于0.6 0. 7moL/L冰醋酸，先以0. 6 0. 7moL/L的冰醋酸為透析外液透析2次，每次4小時，再以蒸餾水為透析外液透析5 7次，每次4小時，至外液檢測不到氯離子，得到膠原液體。(8)將上述液體冷凍干燥，得到具有三螺旋結構活性的膠原。
全文摘要
本發明涉及一種膠原的制備方法，以新鮮豬皮為原料，經預處理，去除脂肪，經酸酶法處理后，使用超聲波處理，進一步提高提取效率，最后純化制得高純度的膠原產品。本發明膠原的制備方法提取效率高，產品純度達到98％以上。該產品為保持三螺旋結構的活性膠原，具有低免疫原性、高生物相容性，可生物降解，適用于醫療用途。
文檔編號C07K14/78GK102391374SQ20111036103
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者任偉業 申請人:無錫貝迪生物工程有限公司