專利名稱：一種固定化呈遞免疫共刺激分子的微球及其制備方法
技術領域：
本發明涉及人工抗原遞呈技術領域，涉及一種固定化呈遞免疫共刺激分子的微球及其制備方法。
背景技術：
癌癥是世界范圍內僅次于心血管疾病的第二大嚴重威脅人類健康和生命的疾病，隨著分子生物學、免疫學和生物工程技術的快速發展，腫瘤免疫治療正成為繼腫瘤手術治療和放化療之后的另一種新的治療手段，免疫治療的目的在于使機體產生有效的細胞介導的免疫反應從而治愈疾病，對感染性疾病和抗腫瘤而言是一種非常有前景的治療方法。一般認為機體抗腫瘤免疫反應中起重要作用的是細胞免疫，以T淋巴細胞為核心。T細胞的活化、增殖及分化為效應細胞需要接受來自抗原提呈細胞(antigen-presenting cells, APC)所提供的雙重刺激信號一是T細胞受體(T cell rec印tor, TCR)與APC表面的MHC-抗原肽復合物的特異性識別和結合；二是APC和T細胞表面的多種共刺激分子和黏附分子之間(如 B7/CD28，LFA-l/ICAM-1，CD2/LFA-3 或 4-1BBL/4-1BB 等)的相互作用。這些共刺激分子及其受體在T細胞與APC相互作用時，以TCR: MHC-抗原肽復合體為中心聚集在一起，形成一種稱為免疫突觸的超分子結構，成為T細胞活化信號傳遞的通道。免疫共刺激分子是誘發機體有效的細胞免疫反應所必需的，目前已知的有B7-1、B7-2、B7-H4分子等，腫瘤細胞常常缺失B7這一類共刺激分子。B7-1和B7-2作為表達在抗 原呈遞細胞表面的主要的共刺激因子，均可與表達在淋巴細胞表面的配體CD28或CTLA-4結合來發揮作用。很多具有正常免疫力的宿主并不能有效排除體內的高免疫原性腫瘤，可能是由于腫瘤細胞缺乏T細胞活化的共刺激信號，如腫瘤細胞常常缺失B7這一類共刺激分子，從而使CTLs不能有效地對腫瘤產生免疫應答，如果給該腫瘤細胞轉染B7基因(CD80/CD86)，則可有效地激發T細胞介導的抗腫瘤免疫。研究表明，腫瘤細胞本身可通過減少B7-1、B7-2的表達，使得T細胞克隆無能；通過上調抑制性B7-H4分子的表達，誘導腫瘤的免疫逃逸。
因此，進行免疫共刺激因子的有效呈遞是激活腫瘤免疫反應的一個關鍵。游離性基因工程表達的免疫共刺激分子同樣可以參與免疫活化過程，但游離的蛋白在體內血漿清除率高，且作用缺乏特異性。樹突狀細胞(dendritic cells，DC)是體內主要的抗原呈遞細胞之一，作為免疫系統中最強的APC，其可在體內或體外作為免疫共刺激分子的天然載體參與免疫活化過程。但DC細胞的使用也有諸多局限性，如DC分離培養困難，耗時長、成本高，獲得DC的數量和質量往往也不夠穩定，且由于其表面的免疫共刺激因子種類多樣，因此其表面共刺激分子的特異性和復雜性都難于控制。有學者采用胞外體(exosome，ES)代替DC細胞，但同樣由于其表達多種T細胞共刺激分子，無法保持共刺激分子的特異性，增加了提呈的復雜性，降低了其特異性和穩定性。為解決這一問題，近年來建立的人工抗原提呈技術利用表面攜帶有特定共刺激分子的人工抗原提呈細胞(artificial antigen presenting cells, AAPC)為抗原特異性T細胞提供刺激信號，有效的刺激了 T細胞的活化增殖。人工抗原提呈細胞是將MHC-抗原肽復合物及共刺激分子或者粘附分子展現在某種載體表面，通過與T細胞表面的受體有效識別和結合達到活化淋巴細胞的目的。目前制備的AAPC可分為以細胞性的AAPC和非細胞性的AAPC。細胞性AAPC主要是以細胞為載體，通過基因改造的方法在細胞表面偶聯共刺激分子，引發特異性免疫反應，活化T細胞。常用的有K562細胞、K32細胞、鼠成纖維細胞等。但是，由于細胞性的AAPC在制備過程中對細胞基因的改造過程繁瑣，多采用逆轉錄病毒轉染技術而存在一定的安全隱患，且其載體細胞也多為異種細胞，因而目前細胞性APCC僅適合于體外應用，體內運用的遠期效果和安全性評價還有待進一步研究。非細胞性的AAPC則指的是在人工載體表面交聯不同的MHC-抗原肽復合物及共刺激分子。目前常用的人工載體包括磁珠、脂質體和乳膠微球等。其表面可直接或間接交聯各種共刺激分子。由于磁珠的制備比較昂貴，也有人用細胞大小的聚乙烯乳膠微球外包被 抗體層偶聯相應的肽四聚體或二聚體及共刺激分子作為人工APC。但目前非細胞性人工載體進行共刺激分子的呈遞也有其局限性。其制備過程需要采用化學交聯或生物素親和素修飾，工藝過程相對復雜，且容易有化學物殘留等安全問題。脂質體是另一種可用于免疫共刺激分子呈遞的非細胞載體。脂質體是由磷脂、膽固醇等為膜材包合而成的納米級顆粒。1998年van Rensen等率先以脂質體為載體融人HSP65-鼠MHC II復合物，構建成人工APC，不僅能特異性地激活T細胞,還能誘導IL-2分泌。2000年Prakken等研究發現,脂質體構建的人工APC能與T細胞作用形成免疫突觸，可鑒別和活化T細胞，提示脂質體人工APC可用于腫瘤的免疫治療。以脂質體為載體構建的人工APC可在體外大量制備，易于控制質量。但脂質體的使用在包封率、穩定性及靶向分布等方面存在一些問題，而且由于常規工藝生產規模難以放大，且需要大量使用有機溶劑，難以保證產品的安全性，導致其大量應用受到限制。

發明內容
本發明解決的問題在于提供一種固定化呈遞免疫共刺激分子的微球及其制備方法，利用負載免疫共刺激分子的疏水顆粒與目標細胞的有效識別與結合，實現免疫激活作用。本發明是通過以下技術方案來實現一種固定化呈遞免疫共刺激分子的微球，包括疏水性的納米級或微米級的微球，微球表面上呈遞有遞免疫共刺激分子，免疫共刺激分子通過親脂蛋白或疏水結合結構域與微球相連接。所述的免疫共刺激分子與親脂蛋白或疏水結合結構域是由融合基因表達并純化的融合蛋白，免疫共刺激分子與親脂蛋白或疏水結合結構域之間還設有連接肽；融合蛋白通過親脂蛋白或疏水結合結構域與疏水性的微球表面的相互作用，將免疫共刺激分子固定化呈遞于微球表面。所述的微球是由疏水性高分子材料制備的，疏水性高分子微球材料為PHA，由聚羥基丁酸酯、聚羥基辛酸酯、聚羥基癸酸酯、羥基丁酸-羥基戊酸共聚酯、羥基丁酸-羥基己酸共聚酯、羥基丁酸-羥基辛酸共聚酯、羥基丁酸-羥基戊酸-羥基己酸共聚酯中的一種或幾種聚合而成；或者疏水性高分子微球材料為聚乳酸、羥基己酸和乳酸共聚物中的一種；或者疏水性高分子微球材料為聚己內酯，由聚甲基丙烯酸甲酯、聚己內酯、聚己二醇中的一種或幾種聚合物組成。所述的親脂蛋白為PhaP、PhaZ, PhaR、PhaC中的一種，所述的疏水結合結構域為PhaP> PhaZ> PhaR、PhaC中疏水結合結構域中的一種。所述的免疫共刺激分子選自B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、IC0S 中的一種或幾種。所述的連接肽的長度為10 15個氨基酸殘基。所述的微球為由可降解的疏水性PHA材料制成，所述的融合蛋白為B7-2_PhaP，連接肽為 G4SG3SG2S。 一種固定化呈遞免疫共刺激分子的微球的制備方法，包括以下步驟I)免疫共刺激分子-親脂蛋白融合蛋白的構建分別擴增待呈遞的免疫共刺激分子、親脂蛋白的核苷酸序列，并通過PCR擴增技術將兩者通過連接肽連接得到融合基因；然后通過基因的剪切和連接，構建成表達載體并在轉染宿主細胞，誘導表達載體在宿主細胞中表達；裂解細胞并通過蛋白提純得到免疫共刺激分子-親脂蛋白融合蛋白；2)疏水性微球的構建將PVA溶液至于冰浴中，然后加入溶解有高分子疏水材料聚合物的氯仿溶液，超聲處理5 IOmin后,再在磁力攪拌器上溫和攪拌5 IOh,離心收集微球，并用水充分洗滌；最后用水重懸微球；3)負載結合將融合蛋白用水溶解后，加入到微球的懸浮液中，混勻，4°C攪拌過夜；離心，收集微球，得到融合蛋白負載的微球。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明提供的固定化呈遞免疫共刺激分子的微球，是利用生物可降解的疏水性高分子材料制備微米或納米微球，將親脂蛋白與目標免疫共刺激分子進行融合表達，通過親脂蛋白與疏水材料顆粒表面的相互作用，將免疫共刺激分子固定化表達呈遞于疏水材料顆粒表面，既可作為一種新型人工抗原提呈系統的共刺激分子呈遞部分，也可以單獨的作為提高機體免疫激活效果的固定化免疫共刺激因子使用。本發明提供的固定化呈遞免疫共刺激分子的微球，選用人工可降解的、生物相容性高的高分子材料制備微球，所以得該系統具有良好的生物相容性和生物安全性；而將親脂蛋白的編碼基因和各種免疫共刺激分子編碼基因通過基因工程操作分別進行融合表達，這樣通過融合基因的構建，就可以實現多種免疫共刺激分子的遞呈，實現遞呈分子的多樣化；進一步，還可以在同一微球表面上遞呈多種免疫共刺激分子，提高對免疫細胞的刺激。本發明利用能與疏水性高分子材料很好結合的親脂蛋白，通過其與免疫共刺激分子融合表達，可以有效的將免疫共刺激分子固定化呈遞在高分子材料微球表面。這樣就省去了化學交聯法的繁瑣工藝，避免了交聯過程中可能造成的蛋白質變性或化學物質殘留的問題。也不需要對載體或融合蛋白進行生物素或親和素的修飾后再進行融合蛋白固定化，因此具有簡便、快捷、低成本的特點。在優選的實施方案中，本發明采用的疏水性PHA材料作為微球載體進行免疫共刺激分子的固定化，由于PHA是一種具有良好生物相容性的生物可降解材料，其在生物體內可被完全降解成二氧化碳和水，不存在體內長期蓄積的隱患，因此，具有良好的安全性，具備體內應用如景。在另一些優選的實施方案中，本發明利用聚乳酸(PLA)，羥基己酸和乳酸共聚物(PLGA)，聚己內酯(PCL)等常見的疏水性材料作為免疫共刺激分子固定化呈遞載體，因其價格更為低廉且更易獲得，可以使本發明所述的免疫共刺激分子固定化呈遞系統具有更廣泛的應用前景。


圖I是免疫共刺激分子固定化呈遞系統模式圖；圖2中的A、B、C分別是B7-2、PhaP、B7_2_PhaP基因的擴增圖譜；圖3是表達載體pGEX-B72-P的質粒圖譜；圖4中的A、B分別是B7-2_PhaP基因表達后的PCR鑒定結果和雙酶切鑒定結果·圖；圖5為B7-2_PhaP融合蛋白表達SDS-PAGE檢測圖；圖6為B7_2_PhaP融合蛋白表達后Western Blot鑒定圖；圖7為B7-2_PhaP融合蛋白與PHA納米顆粒結合情況的Western Blot檢測圖；圖8為負載B7-2_PhaP蛋白的PHA納米顆粒對人淋巴細胞體外增殖的影響圖。
具體實施例方式本發明提供的一種固定化呈遞免疫共刺激分子的微球。參見圖1，首先親脂性蛋白和免疫共刺激分子通過基因工程表達成為一個一段親脂性的融合蛋白，然后通過親脂蛋白結構域與疏水性材料的吸附作用黏附在可降解微納米顆粒表面，成為免疫共刺激分子固定化表達呈遞的載體。以固定化的T細胞活化第二信號參與免疫激活過程，利用負載免疫共刺激分子的疏水顆粒與目標細胞的有效識別與結合，實現免疫激活作用。在上述三個環節中，微球要求是疏水性、良好生物相容性、可降解的材料即可。其中，疏水性一方面是為了能夠與親脂蛋白黏附，另一方面是為了在接近細胞時能夠與細胞膜相互作用，便于抗原遞呈。而生物相容性、可降解是為了提高安全性的考慮。在具體的材料選擇上可以為PHA、聚乳酸(PLA)、羥基己酸和乳酸共聚物(PLGA)、聚己內酯(PCL)；PHA，由聚羥基丁酸酯、聚羥基辛酸酯、聚羥基癸酸酯、羥基丁酸-羥基戊酸共聚酯、羥基丁酸-羥基己酸共聚酯、羥基丁酸-羥基辛酸共聚酯、羥基丁酸-羥基戊酸-羥基己酸共聚酯中的一種或幾種聚合而成；聚乳酸、羥基己酸和乳酸共聚物中的一種；聚己內酯，由聚甲基丙烯酸甲酯、聚己內酯、聚己二醇中的一種或幾種聚合組成。免疫共刺激分子選自B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、IC0S 中的一種或幾種，請說明免疫共刺激分子選擇的理由親脂蛋白為PhaP、PhaZ、PhaR、PhaC中的一種，這些蛋白含有能夠和疏水性高聚物非特異結合的疏水結合結構域，可作為蛋白固定化呈遞于高聚物表面的介導分子。下面結合具體的PHA、B7_2、PhaP組合的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。本領域技術人員能夠對滿足三個環節的要求的材料進行組合。I、免疫共刺激分子-親脂蛋白融合蛋白表達載體的構建I. IPCR擴增人B7-2基因和phaP序列根據NCBI上登陸號為NC_000003. 11和AM260479. I的人B7-2基因和phaP基因DNA序列設計引物pl/p2、p3/p4，分別擴增編碼人B7-2胞外端的基因(52_672bp)和編碼PhaP 的基因(10-580bp)。根據重疊延伸法設計引物在B7-2胞外端的下游引物p2和phaP的基因上游引物P3之間有16bp的重復序列，包含一個由36個堿基編碼的12個氨基酸的柔性linker(G4SG3SG2S)，使phaP基因和B7-2基因用該linker連接在一起。引物如下所示P IGCGGATCCATGGCTCCTCTGAAGATTC ； P2 ACCAGAGCCACCTCCTGAACCGCCTCCACCTGTAATCCAAGGAATG ；P3 GGTTCAGGAGGTGGCTCTGGTGGATCGCTCACCCCGGAACAAGTT ；P4 CGCTCGAGAGCCGTCGTCTTCTTTGCCGT ；PCR 反應體系(25 μ I ):5 X Primer STAR buffer 5 μ l,dNTP Mix 2μ Ι,ρΙΟ. 5μ I,ρ20· 5 μ I，Primer STARO. 3 μ I，DDW15. 7 μ I，Β7-2 (IgV+C)/TEasyl μ I。以含人Β7-2序列的Β7-2 (IgV+C)/TEasy質粒為模板，克隆B7-2胞外區。B7-2胞外區亞克隆PCR反應條件如下94°C預變性3min ;94°C變性lmin、76. 9°C退火lmin、72°C延伸Imin，擴增30個循環；最后72°C延伸5min，4°C保溫。以提取到的帶有phaP基因的pP’PI-EGFP (由清華大學生命科學院陳國強教授惠贈)為模板擴增PhaP基因。phaP基因亞克隆PCR反應條件如下94°C預變性3min ;94°C變性lmin、83°C退火lmin、72°C延伸Imin，擴增30個循環；最后72°C延伸5min，4°C保溫。I. 2重疊延伸PCR法拼接B7-2和phaP編碼序列分別回收純化的上述PCR擴增的B7-2和phaP片段，然后按I : I的摩爾比例混合物互為模板和引物，利用重疊延伸PCR擴增全長的B7-2-PhaP。PCR 反應體系(25 μ I)為5 X Primer STAR buffer 5μ I, dNTP Mix 2μ I,Β7-21 μ 1，phaP I μ I, Primer STAR O. 3 μ I, DDff 15. 7μ I ；PCR 反應條件為94°C變性 3min ；94°C 30s，61。。I. 5min，72°C延伸 I. 5min，4 個循環；第一次循環后兩個片段在互補的部位會準確拼接并且延伸得到編碼B7-2和phaP的兩條完整的鏈，在后續的循環中以這兩條鏈為模板，以P1/P4為引物，大量擴增B7-2-PhaP基因完整的編碼序列。上述B7-2、PhaP、B7-2_PhaP基因的擴增圖譜分別如圖2中的A、B、C、所示，其中泳道I為擴增的條帶，泳道2為mark。I. 3重組基因B7-2_PhaP表達質粒pGEX_B72_P的構建將擴增得到的B7-2_PhaP編碼序列DNA片段用凝膠分離純化后，經BamHI、XhoI限制性內切酶雙酶切。同時用BamHI、XhoI雙酶切表達載體pGEX_4T_3。膠回收PCR產物及線性表達載體酶切產物。將回收到的PCR產物和表達載體16°C連接過夜，構建表達載體PGEX-B72-P，然后轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，并對轉化菌株做PCR及雙酶切鑒定。所構建的表達載體pGEX_B72_P的質粒圖譜如圖3所示,其中LacPromoter Lac啟動子；GST Tag :GST標簽；B7_2 :免疫共刺激分子B7_2 ；PhaP :親脂蛋白；Amp :氨芐青霉素抗性基因。免疫共刺激分子B7-2編碼基因和親脂蛋白PhaP編碼基因插入到GST標簽下游，在Lac啟動子啟動下表達出B7-2_PhaP融合蛋白。I. 3. I將pGEX-B72-P載體轉化大腸桿菌DH5 α 取100 μ I感受態細胞，加入2μ I待轉連接產物，輕輕混勻，冰上放置30min。將離心管42°C熱激90s。快速將離心管放入到冰上，使其冷卻2min。每管加入800 μ I不含抗生素的LB培養基,于37°C搖床低速培養lh。低速離心，棄去約500 μ I上清，取剩余100 μ I菌液直接涂布于含50 μ g/mlAmp的LB固體培養皿上。 平板于37°C正向放置至液體被吸收，置平板于37°C培養12_16h。I. 3. 2重組陽性克隆質粒的篩選用滅菌牙簽挑取轉化平板中的菌落10個，接種于含有50 μ g/ml Amp的LB培養基中，37 °C、200rpm振蕩培養過夜。堿裂解法提取質粒。重組pGEX-B72-P質粒的PCR鑒定以提取的質粒為模板，pl、p4為引物，做PCR擴增檢測，反應條件和體系同重疊延伸PCR法擴增B7-2-PhaP融合基因。O. 7%瓊脂糖凝膠泳分析PCR結果。PCR鑒定結果如圖4中的A所示，其中泳道I為Marker，泳道2為B7_2_PhaP擴增產物，其大小為1290bp。酶切鑒定對pGEX-B72-P質粒用限制性內切酶BamHI、XhoI做雙酶切鑒定。室溫酶切過夜，O. 7%瓊脂糖凝膠電泳分析雙酶切結果。酶切驗證電泳圖如圖4中的B所示，其中泳道I為BamH I /Xho I雙酶切，泳道2為Marker ;重組質粒pGEX_B72_P經BamH I /Xho I雙酶切后，得到大小為1290bp和4900bp左右的兩條帶，和質粒理論大小一致。I. 3. 5重組質粒pGEX-B72-P的序列測定及分析PCR及雙酶切初步鑒定正確后，將含重組質粒PGEX-B72-P的陽性菌株送上海奧科生物技術公司進行測序。融合基因的序列如SEQ. ID. NO. I所示測序結果表明所構建的載體序列正確。2、B7-2_PhaP融合蛋白的原核表達及分離純化2. I在表達宿主E. coll BL21 (DE3)內的誘導表達含PGEX-B72-P質粒的表達載體在宿主菌中被異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導，將構建成功的重組質粒PGEX-B72-P通過常規CaCl2法轉化到表達宿主大腸桿菌E. coliBL21(DE3)中，挑取陽性克隆，37°C 2XYT培養至0D600值O. 6左右，加入IPTG至終濃度
O.4mM\L, 237rpm30°C搖床培養5h，裂解菌體，SDS-PAGE檢測，觀察目的蛋白表達情況。2. 2B7-2-PhaP 蛋白的 SDS-PAGE 檢測及鑒定收集O. 5ml菌體，加入20ulPBS重懸，與20ul 2 X SDS凝膠加樣緩沖液混合后，煮沸lOmin，進行8%SDS-PAGE全菌蛋白電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳安裝Bio-Rad電泳裝置，灌制5%積層膠和下層8%分離膠，各需凝固約lh。將上述已制備好了的樣品依順序加樣，每孔約20μ I。電泳起始，調電壓為90V,當染料前沿達分離膠后，調電壓至110V，繼續電泳至溴酚藍染料前沿到達分離膠底部時，停止電泳。取下凝膠置于考馬斯亮藍染液中室溫染色2-4小時，放入脫色液中脫色直至凝膠條帶清晰、背景透明為止，觀察電泳結果。Western檢測方法首先進行8%SDS_PAGE，步驟同前，電泳結束后取出凝膠，依照彩虹Marker位置切取目的凝膠，利用Bio-Rad蛋白轉印系統，依次序安裝轉印裝置陽極一墊片一濾紙一硝酸纖維素濾膜(NC膜)一凝膠一濾紙一墊片一陰極。安裝過程中修整濾紙和NC膜，兩邊濾紙不能接觸，凝膠最好大一些。內槽加入電轉緩沖液，外槽加入部分冰塊，轉印電壓70V，電流200mA，轉印2h。轉印結束后拆卸裝置，NC膜用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉2h，(為檢查蛋白轉印是否完全可將凝膠繼續置于考馬斯亮藍染液中染色、脫色)用TBST緩沖液I :1000稀釋的抗GST的小鼠IgG 4°C孵育過夜。孵育結束用TBST緩沖液洗膜3次，每次lOmin，之后用羊抗鼠IgG 二抗室溫孵育2h，TBST同樣條件洗膜3次。最后在酶聯生色底物中孵育Imin,曝光。2. 3B7-2-PhaP蛋白的分離純化常規方法裂解菌體，12000g高速離心20min取上清備用。
利用GS4B (Glutathione Sepharose 4B)樹脂純化目的蛋白。GS4B樹脂的準備取L 33ml GS4B樹脂移入15ml離心管中，500g離心5min，棄上清。加入10倍體積預冷的PBS，清洗樹脂，500g離心5min，棄上清。重復I次。加入lmlPBS，制備50%樹脂懸液。將菌體裂解離心后收集的上清液移入已準備好的樹脂中，室溫旋轉孵育O. 5h，500g離心5min,棄上清。加入10倍體積預冷的PBS,輕柔混勻,洗漆樹脂。500g離心5min,棄上清。重復2次。加入2ml谷胱甘肽洗漆液,重懸樹脂,室溫輕柔混勻lOmin。500g離心5min,收集
上清。重復二次。將用透析袋承裝的蛋白洗脫液放入IL O. 9%NaCl溶液中置于攪拌器上4°C透析，每隔3-4h換液一次，至少透析24h。之后將透析袋放入PEG20000濃縮，得到純化后的融合蛋白B7_2_PhaP,置于冷凍干燥機冷凍干燥備用。圖5及圖6顯示了 B7-2_PhaP融合蛋白的表達、分離純化及Western鑒定情況。圖5中泳道I為含PGEX-B72-P質粒的陽性克隆經誘導表達后菌體裂解蛋白電泳條帶；泳道
2為含pGEX-4T-3空載體菌株GST純化條帶；泳道3、4為陽性克隆菌體裂解后上清蛋白經GS4B樹脂純化產物電泳條帶；泳道5為空白E. coli BL21裂解后蛋白純化條帶；泳道6為蛋白Marker條帶。可見泳道3，4純化得到單一的條帶，且大小與目的蛋白相符。由圖3所示，誘導菌體及經GST柱純化后的樣品中存在一條相對分子質量約80000的蛋白富集條帶，可知有目的蛋白表達。只含空質粒PGEX-4T-3的陰性對照E. coIiBL21可見一條相對分子量約26000的蛋白條帶，表明GST表達正常。圖6中泳道1、2為含pGEX-B72-P質粒的陽性克隆經誘導表達后菌體裂解物與抗GST標簽抗體孵育后檢測得到的條帶；泳道3為空白E. coli BL21菌體裂解物與抗GST標簽抗體孵育后的檢測結果。泳道1、2中可見明顯的雜交條帶，說明其中含有B7-2-PhaP融合蛋白。上述檢測表明，在對pGEX-B72-P質粒的陽性克隆經誘導表達后產生了 B7_2_PhaP融合蛋白，經過菌體裂解后上清蛋白分離純化后得到了純度較高的B7-2-PhaP融合蛋白。
3、負載B7-2_PhaP的PHA (聚羥基脂肪酸酯)納米顆粒的制備3. IPHA納米顆粒的制備稱取2g分子量10000的PVA (聚乙烯醇)，溶解在200ml雙蒸水中，配成1%PVA (w/v), O. 45 μ m濾器過濾,備用。將20mg的聚合物PHA加入Iml氯仿中，攪拌溶解。取5ml 1%PVA冰浴中超聲，用注射器緩慢加入Iml溶解有PHA的氯仿溶液，超聲處理5min后(20kHz，40%最大功率)，將分散的溶液在磁力攪拌器上溫和攪拌6h。18000g下離心IOmin收集納米顆粒,并用雙蒸水洗漆兩次后重懸于5ml雙蒸水中。
O.45 μ m濾器過濾,定容。3. 2純化B7-2_PhaP融合蛋白與PHA納米顆粒結合
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將凍干粉狀B7-2_PhaP融合蛋白用雙蒸水溶解，終濃度為90 μ g/ml，將4ml融合蛋白溶液加入到Iml濃度為2mg/ml的PHA顆粒溶液中，輕柔混勻，4°C攪拌過夜。將攪拌過夜的混合液12000g離心30min，棄上清，沉淀用雙蒸水洗兩次，即得負載B7-2-PhaP蛋白的PHA納米顆粒。將所得負載B7-2-PhaP蛋白的PHA納米顆粒與SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸5min，12000g離心3min,取上清進行SDS-PAGE電泳及Western檢測。檢測結果如圖7所示，泳道1，2為與PHA顆粒共同孵育之前的B7_2_PhaP蛋白樣品；泳道3，4為B7-2-PhaP與PHA納米顆粒孵育后顆粒表面結合的蛋白條帶；泳道5，6為B7-2-PhaP與PHA納米顆粒孵育后上清中蛋白條帶；泳道7為彩虹Marker條帶。泳道3、4中可見明顯的雜交條帶，而泳道5、6中沒有檢測到明顯的條帶，說明融合蛋白經透析除鹽后全部與顆粒結合，每毫克納米顆粒至少可以結合180 μ g重組目的蛋白。4、固定化免疫共刺激分子對淋巴細胞的免疫激活作用。4. I淋巴細胞的分離培養淋巴細胞的分離使用淋巴細胞分離液(PAN Biotech1Aidenbach,德國)。具體方法為取2-3ml肝素抗凝靜脈血，用PBS稀釋I倍，混勻。沿管壁緩緩加入到IOml淋巴細胞分離液中，2000g水平離心20min。吸取中間灰白色層即單個核細胞層，移入另一離心管中。加入5倍以上體積的PBS液混勻，離心1500g，IOmin,棄上清。同樣方法重復洗一次。最后用1640營養液配制成1-2X 106/ml細胞懸液。4. 2固定化免疫共刺激分子對淋巴細胞增殖的影響取96孔板每孔加100 μ I (1-2X IO5細胞)細胞懸液進行淋巴細胞培養(培養基為1640營養液)，置37°C、5%C02培養箱培養，各孔分別加入植物血凝素，anti-⑶3抗體，anti-CD3+GST, B7-2-PhaP, anti-CD3+B7-2_PhaP, B7-2-PhaP-NP, anti-CD3+B7-2-PhaP_NP和不攜帶B7-2-PhaP融合蛋白的空白納米顆粒(NP)對淋巴細胞進行處理。培養72h后每孔加MTT溶液20 μ 1，繼續孵育4h，終止培養。500g離心lOmin，小心吸棄孔內培養上清液。每孔加200 μ I DMS0，于微孔板振蕩器振蕩lOmin，使結晶物充分融解。選擇570nm波長，并以630nm作為參考波長在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值。淋巴細胞增殖情況如圖8所示，體外分離培養的人外周血淋巴細胞按I X IO4個/孔接種于96孔板中，分別進行不同處理后并在體外培養72小時后進行MTT檢測。I組為體外培養的對照組淋巴細胞，將其設為100% ；2組添加了植物血凝素(1/256稀釋)培養的淋巴細胞相對增殖活力，其作為陽性對照，說明體外分離培養的淋巴細胞經適當刺激能夠發生體外增殖；3組添加了抗⑶3抗體；4組添加了 PHA納米顆粒；5組添加了負載B7-2-PhaP的PHA納米顆粒；6組添加了負載B7-2-PhaP的PHA納米顆粒+抗⑶3抗體。**代表P < O. Ol由圖中可以看出，體外培養的淋巴細胞經植物血凝素(1/256稀釋)刺激能夠得以增殖，說明淋巴細胞活力良好，而單獨采用抗CD3抗體不能使淋巴細胞發生明顯的體外增殖。空白PHA納米顆粒、負載B7-2-PhaP的PHA納米顆粒以及負載B7_2_PhaP的PHA納米顆粒加抗CD3抗體共同刺激均可以使淋巴細胞在體外大量增殖，能夠有效激活淋巴細胞。且負載B7-2-PhaP的PHA納米顆粒加抗CD3抗體對淋巴細胞體外擴增的程度最高。由結果可知，固定化呈遞于PHA納米顆粒上的免疫共刺激分子能夠刺激淋巴細胞增殖，當使用抗CD3抗體作為T細胞活化的第一信號時，淋巴細胞的活化增殖被進一步加 強。由此可以說明，本發明所述的免疫共刺激分子固定化表達呈遞系統可以作為淋巴細胞活化的信號增強體外培養淋巴細胞的活化增殖。
權利要求
1.一種固定化呈遞免疫共刺激分子的微球，其特征在于，包括疏水性的納米級或微米級的微球，微球表面上呈遞有遞免疫共刺激分子，免疫共刺激分子通過親脂蛋白或疏水結合結構域與微球相連接。
2.如權利要求I所述的固定化呈遞免疫共刺激分子的微球，其特征在于，所述的免疫共刺激分子與親脂蛋白或疏水結 合結構域是由融合基因表達并純化的融合蛋白，免疫共刺激分子與親脂蛋白或疏水結合結構域之間還設有連接肽； 融合蛋白通過親脂蛋白或疏水結合結構域與疏水性的微球表面的相互作用，將免疫共刺激分子固定化呈遞于微球表面。
3.如權利要求I或2所述的固定化呈遞免疫共刺激分子的微球，其特征在于，所述的微球是由疏水性高分子材料制備的，疏水性高分子微球材料為PHA，由聚羥基丁酸酯、聚羥基辛酸酯、聚羥基癸酸酯、羥基丁酸-羥基戊酸共聚酯、羥基丁酸-羥基己酸共聚酯、羥基丁酸-羥基辛酸共聚酯、羥基丁酸-羥基戊酸-羥基己酸共聚酯中的一種或幾種聚合而成； 或者疏水性高分子微球材料為聚乳酸、羥基己酸和乳酸共聚物中的一種； 或者疏水性高分子微球材料為聚己內酯，由聚甲基丙烯酸甲酯、聚己內酯、聚己二醇中的一種或幾種聚合物組成。
4.如權利要求I或2所述的固定化呈遞免疫共刺激分子的微球，其特征在于，所述的親脂蛋白為PhaP、PhaZ、PhaR、PhaC中的一種，所述的疏水結合結構域為PhaP、PhaZ、PhaR、PhaC中疏水結合結構域中的一種。
5.如權利要求I或2所述的固定化呈遞免疫共刺激分子的微球，其特征在于，所述的免疫共刺激分子選自B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、ICOS中的一種或幾種。
6.如權利要求2所述的固定化呈遞免疫共刺激分子的微球，其特征在于，所述的連接肽的長度為10 15個氨基酸殘基。
7.如權利要求2所述的固定化呈遞免疫共刺激分子的微球，其特征在于，所述的微球為由可降解的疏水性PHA材料制成，所述的融合蛋白為B7-2-PhaP，連接肽為G4SG3SG2S。
8.一種固定化呈遞免疫共刺激分子的微球的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 O免疫共刺激分子-親脂蛋白融合蛋白的構建分別擴增待呈遞的免疫共刺激分子、親脂蛋白的核苷酸序列，并通過PCR擴增技術將兩者通過連接肽連接得到融合基因；然后通過基因的剪切和連接，構建成表達載體并在轉染宿主細胞，誘導表達載體在宿主細胞中表達；裂解細胞并通過蛋白提純得到免疫共刺激分子-親脂蛋白融合蛋白； 2)疏水性微球的構建將PVA溶液至于冰浴中，然后加入溶解有高分子疏水材料聚合物的氯仿溶液，超聲處理5 IOmin后，再在磁力攪拌器上溫和攪拌5 IOh,離心收集微球，并用水充分洗滌；最后用水重懸微球； 3)負載結合將融合蛋白用水溶解后，加入到微球的懸浮液中，混勻，4°C攪拌過夜；離心，收集微球，得到融合蛋白負載的微球。
全文摘要
本發明公開了一種固定化呈遞免疫共刺激分子的微球及其制備方法，包括疏水性的納米級或微米級的微球，微球表面上呈遞有遞免疫共刺激分子，免疫共刺激分子通過親脂蛋白或疏水結合結構域與微球相連接。既可作為一種新型人工抗原提呈系統的共刺激分子呈遞部分，也可以單獨的作為提高機體免疫激活效果的固定化免疫共刺激因子使用。
文檔編號C07K17/08GK102718869SQ20121018472
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月6日 優先權日2012年6月6日
發明者劉倩倩, 盧曉云, 張雅利, 李明川, 王蕾蕾 申請人:西安交通大學