專利名稱：重組人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種重組人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株。
背景技術：
促性腺激素FSH是腦垂體分泌的糖蛋白激素,其分子由一個alpha亞基和beta亞基組成，編碼alpha和beta亞基的基因不在同一條染色體上，成熟分子必須在體內翻譯之后經歷一系列后加工，包括每個亞基的正確折疊、兩個亞基結合形成正確的異構二聚體，然后，再經過糖基化獲得生物活性。因此，模擬自然過程開發用基因工程生產這FSH技術，難度相當大。正是由于這個原因，目前市場上銷售的FSH主要依靠從組織中提取。人類絨毛膜促性腺激素(hCG)具有有一定的FSH活性，其beta亞基在羧基端有一個羧基端肽序列(CTP)，使hCG分子其在血液中的清除率明顯降低，延長它的生理作用時間，所以hCG具有長效作用。
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促性腺激素的基本生理功能是維持卵巢和睪丸的結構和功能，動物實驗證明，摘除腦垂體的綿羊性腺萎縮，母羊卵子發育和排卵活動完全停止。但是，注射促性腺激素可以逆轉這種生理反應，而且逆轉反應的強度隨著注射促性腺激素的劑量而增加，高水平的促性腺激素可以誘導超數排卵。注射外源性促性腺激素通常用于提高人和家畜的繁殖性能，在人類輔助生殖和家畜胚胎工程中，通過促性腺激素注射增加排卵數，是必不可少的技術措施。但是，由于腦垂體的來源十分有限，商業上常用的促性腺激素制劑，主要是羊和豬腦垂體的提取物(FSH)、懷孕母馬血液提取物(eCG)、孕婦(hCG)和老年婦女(hMG)尿中的提取物。通過提取獲得的促性腺激素有許多缺點，純度和生理效價均不穩定，生產過程也難控制，常常有被病原體污染的危險。用重組DNA技術生產的促性腺激素，可以克服組織提取產品存在的諸多缺點。但是，通過培養基因工程細胞生產促性腺激素，產量通常比生產其它醫用蛋白質低，主要技術困難是促性腺激素分子由兩個亞基組成，必須在細胞中同時表達兩個基因，并同時提純alpha和beta兩種蛋白分子，然后在體外重構雜合二聚體。在這個過程中，細胞生產的亞基分子損失嚴重，原因是形成正確雜合二聚體的效果很差，即使在最佳的條件下，二聚體的正確組裝率也只有25%(Bedows et al. 1992, Ruddon et al. 1996)。由于促性腺激素的市場在不斷擴大，國際上已加強了對這類產品的研究，期望開發出更先進的生產方法。從技術發展趨勢來看，最有希望用來大規模生產基因工程促性腺激素的技術是制作單鏈FSH，即把alpha亞基和beta亞基串聯成一個基因，并在細胞中一起表達。若使用hCG的羧基端CTP氨基酸序列將alpha亞基和beta亞基的氨基酸序列串聯在一起，FSH有可能單鏈融合蛋白能變成了長效分子。

發明內容
本發明的目的是提供一種重組人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株。本發明所提供的重組人促卵泡成熟素和黃體生成素的基因，命名為rFSH，其基因工程菌命名為X33/rFSH。
X33/rFSH已于2012年06月01日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCjia :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC No. 6181。本發明是這樣來實現的，一種重組人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株，其特征在于由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質，編碼序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質的基因，其喊基序列如序列表中序列2所不，以及所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌，并有所述重組菌發酵得到重組人促卵泡成熟素rFSH ;所述基因的重組表達載體為在載體pPICZ a A的多克隆位點插入序列表的序列2所示的DNA得到的重組質粒；所述重組菌為將權利要求3所述重組質粒導入畢赤酵母X-33得到的重組菌；所述重組菌為巴斯德畢赤酵母G0ZcAia pastoris^ x33/ rFSH CGMCC No. 6181。本發明的方法生產的重組人促卵泡成熟素rFSH具有長效、穩定等優點，適于用作人和動物的促排卵激素使用。


圖I為本發明基因序列串聯不意圖。圖2為本發明重組人促卵泡成熟素rFSH表達載體構建流程圖。圖3為本發明重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖。
具體實施例方式下述實施例中如無特殊說明所用方法均為常規方法，所用試劑均可從商業途徑獲得，
實施例I、rFSH基因的核苷酸序列設計與重疊PCR擴增
根據巴斯德畢赤酵母密碼子偏好性，對GenBank報道的人FSH和hCG的CTP基因序列進行優化設計，用高使用頻率的密碼子替換低使用頻率的密碼子。將優化好的基因序列按圖I進行串聯；
根據優化設計的重組基因rFSH序列設計引物，用重疊PCR的方法進行全基因合成，在基因的5’和3’末端引入EcoRI和XbaI酶切位點。實施例2、重組表達質粒的構建與篩選
用限制性內切酶EcoRI和XbaI對重疊PCR產物酶切，酶切體系如表I所示。酶切后的基因片段與畢赤酵母表達載體PPICZaA連接，連接體系如表2所示。16° C連接10小時以上，用CaCl2法轉化大腸桿菌ToplO感受態細胞，涂布含Zeocin (25ug/mL)的平板，37° C培養過夜，帶菌落生長清晰后，在同樣的平板培養基上劃線培養。菌落PCR法鑒定重組菌。提取陽性菌落的質粒，測序。重組表達質粒命名為pPIC-rFSH ；
表I :重疊PCR產物酶切體系
權利要求
1.一種重組人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株，其特征在于由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質，編碼序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質的基因，其堿基序列如序列表中序列2所示，以及所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌，并有所述重組菌發酵得到重組人促卵泡成熟素rFSH。
2.如權利要求I所述的一種重組人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株，其特征在于所述基因的重組表達載體為在載體pPICZ a A的多克隆位點插入序列表的序列2所示的DNA得到的重組質粒。
3.如權利要求I所述的一種重組人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株，其特征在于所述重組菌為將權利要求3所述重組質粒導入畢赤酵母X-33得到的重組菌。
4.如權利要求I或3所述的一種重組人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株，其特征在于所述重組菌為巴斯德畢赤酵母pastoriS^) x33/ rFSH CGMCC No. 6181。
全文摘要
一種重組人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株，其特征在于由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質，編碼序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質的基因，其堿基序列如序列表中序列2所示，以及所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌，并有所述重組菌發酵得到重組人促卵泡成熟素rFSH；本發明還提供了所述蛋白的編碼基因以及含有所述編碼基因的工程菌(重組巴斯德畢赤酵母)；本發明的方法生產的重組人促卵泡成熟素rFSH具有長效、穩定等優點，適于用作人和動物的促排卵激素使用。
文檔編號C07K14/59GK102786589SQ20121026659
公開日2012年11月21日 申請日期2012年7月30日 優先權日2012年7月30日
發明者劉蘭花, 曹云鶴, 熊蔚, 陳備戰 申請人:南昌市萬華生化藥業有限公司