專利名稱：一種利用離子液體及酶法提取分離餅粕中蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)分離純化領(lǐng)域，具體涉及一種利用離子液體及酶法提取分離餅柏中蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
油料餅柏一般含有蛋白、多酚、植酸、多糖等具有較高利用價值的成分。餅柏是一種潛在營養(yǎng)價值很高的植物蛋白資源，其蛋白含量為359^40%，這是餅柏中利用價值最高的成分。這種蛋白中含有大量人體所需的多種必須氨基酸，因此也是極為重要的食品蛋白質(zhì)源。我們在此以菜籽柏中的菜籽蛋白為例，菜籽餅柏氨基酸總量占其蛋白質(zhì)總量的83. 8%， 其賴氨酸含量和大豆接近，而蛋氨酸含量比大豆還高，適用于用來補充谷物和許多缺乏這類氨基酸的豆類。與其它蛋白質(zhì)相比，菜籽蛋白質(zhì)的優(yōu)勢在于①其氨基酸組成模式與FAO及WHO推薦模式很接近，比大豆蛋白更理想；②含硫氨基酸一蛋氨酸、胱氨酸和組氨酸含量比大豆?jié)饪s蛋白為高。含硫氨基酸是食品中一類最重要氨基酸，也屬必須氨基酸，在食品感觀功能、營養(yǎng)功能和理調(diào)節(jié)功能方面作用重大。菜籽蛋白富含谷物中所缺少的含硫氨基酸與堿性基酸，可彌補谷物氨基酸缺陷。我國膳食結(jié)構(gòu)以谷物為主，菜籽蛋白可彌補我國人民膳食結(jié)構(gòu)不足，更好地滿足食品等生產(chǎn)和國人生活對蛋白質(zhì)需要。離子液體是近十年來迅速發(fā)展起來的一種可替代傳統(tǒng)揮發(fā)性有機物的綠色溶劑，離子液體具有不易揮發(fā)、不可燃、穩(wěn)定性高、溶解能力強、功能可調(diào)節(jié)等優(yōu)點。離子液體可與多種物質(zhì)如鹽、糖、表面活性劑等形成雙水相體系，其在萃取分離生物物質(zhì)方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，這無疑會開拓一種新的綠色分離技術(shù)。傳統(tǒng)的提取分離蛋白質(zhì)的方法仍存在著提取率低、成本高且操作復(fù)雜等缺點，因此尋找一種高效、綠色且經(jīng)濟的提取分離蛋白質(zhì)的方法已成為技術(shù)研究的重點。因而，發(fā)明者根據(jù)離子液體-鹽雙水相體系較傳統(tǒng)雙水相技術(shù)所不具備的諸多優(yōu)點，如操作簡單、無污染、分離效率高、可控制乳化、可循環(huán)使用離子液體等，結(jié)合酶解提取蛋白質(zhì)的技術(shù)，研究開發(fā)了一種更加高效且經(jīng)濟的綠色分離餅柏中蛋白質(zhì)的新技術(shù)。同時本方法在提取分離中極大限度地保持了蛋白質(zhì)的生物活性不受破壞，提高了蛋白質(zhì)的品質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用離子液體及酶法提取分離餅柏中蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種利用離子液體及酶法提取分離餅柏中蛋白質(zhì)的方法，包括以下步驟(I)將原料餅柏粉碎過篩后用有機溶劑脫脂，得到脫脂餅柏粉；(2)將步驟(I)所述的脫脂餅柏粉與pH值為7 10的緩沖溶液混合后加入復(fù)合酶制成混合液，將混合液在4(T65 °C條件下酶解2 5 h后，離心分離，得到酶解液和沉淀；所述脫脂餅柏粉與緩沖溶液的料液質(zhì)量比為1:7 1:15，所述混合液中的總酶活為9(T250U g ；(3)然后將步驟(2)所述的沉淀堿溶后離心分離，將分離得到的上清液與步驟(2)所述的酶解液合并后，進行酸沉并離心分離，將沉淀水洗后冷凍干燥，得到粗蛋白；(4)將步驟(3)得到的粗蛋白加到離子液體/鹽雙水相體系中，在溫度4(T70 °C、PH4、的條件下震蕩后再靜置，取上層離子液體相；(5)最后將步驟(4)的離子液體相用膜分離法分離蛋白質(zhì)，并回收離子液體，將蛋白質(zhì)冷凍干燥得到高純度蛋白粉。
上述的利用離子液體及酶法提取分離餅柏中蛋白質(zhì)的方法，其在于，所述復(fù)合酶中的酶為a-淀粉酶和纖維素酶，或者a-淀粉酶、纖維素酶和果膠酶，且a-淀粉酶和纖維素酶的酶活力比為5:廣2:3。上述的利用離子液體及酶法提取分離餅柏中蛋白質(zhì)的方法，其在于，混合液中，a -淀粉酶和纖維素酶的酶活力分別為6(Tl50 U g ―1和3(T90 U g '上述的利用離子液體及酶法提取分離餅柏中蛋白質(zhì)的方法，其在于，所述的緩沖溶液為磷酸緩沖液或硼酸緩沖液。上述的利用離子液體及酶法提取分離餅柏中蛋白質(zhì)的方法，其在于，所述的步驟
(4)中所述粗蛋白的濃度為2(Tl00 mg*!/1，所述離子液體的濃度為20(T600 mg-mL—1，所述鹽的濃度為9(T220 mg -mr1 ;優(yōu)選為所述粗蛋白的濃度為5(T80 mg噸―1，所述離子液體的濃度為30(T400 mg 所述鹽的濃度為130 180 mg mL_10更進一步優(yōu)選為粗蛋白的濃度為70 80 mg .171,離子液體的濃度為350 380 mg *mL 鹽的濃度為150 180 mg .mL'所述的離子液體/鹽雙水相體系為親水性離子液體/鹽雙水相體系，所述的離子液體為親水性咪唑類離子液體、吡啶類離子液體或胍類離子液體，所述的鹽為磷酸鹽、碳酸鹽或硫酸鹽。所述的親水性咪唑類離子液體為[Amim]Cl、[Bmim] Cl或[Bmim]BF4,所述的卩比卩定類離子液體為[Epy]Br或[BPy]BF4,所述的磷酸鹽為K2HPO 4、KH2P04 *K3P04，所述的碳酸鹽為NaHC03、Na2CO3或(NH4) 2S04 ;優(yōu)選的所述的離子液體/鹽雙水相體系為[Bmim] C1/K2HP04、[Amim]Cl/K2HP04、[Epy] Br/K2HPO4、[Bmim] BF4A2HPO4。更進一步優(yōu)選為[Bmim] C1/K2HP04。步驟⑵和步驟(3)中所述離心分離的離心速度為3000 5000 r mirT1。步驟(3)中沉淀水洗的次數(shù)為3飛次；步驟⑷中，所述震蕩的時間為2(T50min，震蕩速度為100 300 r mirT1，所述靜置的時間為3(T60min。步驟⑴中所述的有機溶劑為石油醚、環(huán)已烷、正已烷或四號溶劑。本發(fā)明技術(shù)方案步驟(3)中用堿溶酸沉法得到粗蛋白，其中“堿溶酸沉”為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。利用蛋白質(zhì)“堿溶酸沉”的原理，即蛋白質(zhì)在堿性條件下，比較容易溶解于水中(萃取)，然后在酸性條件下到達等電點(蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最小)時，蛋白質(zhì)容易聚集沉淀的原理，將蛋白提取出來。本發(fā)明原料餅柏優(yōu)選是低溫或高溫壓榨過的餅柏。本發(fā)明中使用的酶是a -淀粉酶和纖維素酶的混合物，或者a -淀粉酶、纖維素酶和果膠酶的混合物。申請人曾經(jīng)有用其他幾種方法提取蛋白質(zhì)或別的酶進行酶解，但是結(jié)果都不是很理想，存在的問題較多，其關(guān)鍵在于如何解決高效、保持蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)且維持生物活性的問題。如果使用傳統(tǒng)的堿溶酸沉法提取蛋白質(zhì)，提取率較低，且時間較長。如果使用蛋白酶進行酶解反應(yīng)，蛋白酶或酶解條件選擇不當，蛋白質(zhì)會被水解成多肽，失去高級結(jié)構(gòu)。申請人研究發(fā)現(xiàn)在PH為疒10，溫度40 65 °C，料液比1:7 1:15的餅柏反應(yīng)液中只添加少量a-淀粉酶和纖維素酶的混合物或者a-淀粉酶、纖維素酶和或果膠酶的混合物，便可以使提取率提高，成功地完成了此項發(fā)明。a -淀粉酶、纖維素酶、果膠酶能夠分別水解淀粉、纖維素和果膠，以有效降解植物細胞壁的纖維素骨架、崩潰植物細胞壁，從而將蛋白質(zhì)釋放出來而又不破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。當a-淀粉酶和纖維素酶混合作用，或者a-淀粉酶、纖維素酶和果膠酶混合作用時能較好的體現(xiàn)上述機能，此時，a -淀粉酶和纖維素酶的酶活分別為6(T150 U g ―1和3(T90 U g1O本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)如果酶用量過多，其對蛋白質(zhì)的提取率影響不大但浪費資源，且對蛋白質(zhì)的組成及測定產(chǎn)生一定的影響。因此，本發(fā)明中最好把總酶活控制在9(T250 U . g -1,a-淀粉酶與纖維素酶的酶活力比在5:廣2:3。另外，本發(fā)明中使用的a-淀粉酶、纖維素酶和果膠酶的原料應(yīng)該首選酶活高的品種，這樣可能節(jié)省成本提高效益，以上幾種酶均可以從市場購得。
將脫脂餅柏粉和pH值為7 10的緩沖溶液混合后加入復(fù)合酶，進行酶解反應(yīng)提取蛋白質(zhì)。通常的容器中進行加熱攪拌，其條件為40飛5 °C、2飛h，料液質(zhì)量比1:7 1:15，一般攪拌速度50 100 r mirT1。然后于轉(zhuǎn)速3000 5000 r mirT1離心后，將沉淀堿溶后離心分離，將堿溶上清夜與酶解液合并后酸沉并離心分離，將沉淀水洗后冷凍干燥，得到粗蛋白。蛋白質(zhì)的提取率可達96%以上，粗品蛋白含量80%以上。本發(fā)明的提取分離餅柏中蛋白質(zhì)的要點是酶解法提取餅柏中的蛋白質(zhì)，并結(jié)合離子液體雙水相法分離純化蛋白質(zhì)的技術(shù)，其中離子液體及鹽的選擇與用量為關(guān)鍵。本發(fā)明中使用的離子液體雙水相體系優(yōu)選為I- 丁基-3-甲基咪唑氯鹽([Bmim]Cl)/ K2HPO4U-烯丙基-3-甲基咪唑氯鹽([Amim]Cl)/K2HPO4 體系、[Epy]BrA2HPO4 體系或[Bmim]BF4A2HPO4體系。曾經(jīng)有用幾種離子液體及鹽形成雙水相進行分離純化，但不很理想，存在較多的問題，其關(guān)鍵在于如何解決形成雙水相及提高分離純化效率的問題。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸鹽能較好的與離子液體形成雙水相，且[Bmim]Cl、[Amim]Cl> [Epy]Br或[Bmim]BF4與K2HPO4形成的雙水相對蛋白質(zhì)的分離純化效率較高，成功地完成了此項發(fā)明。本發(fā)明中采用的離子液體雙水相體系為離子液體-無機鹽雙水相體系。離子液體分子可看成是由疏水和親水兩部分組成。疏水部分在水溶液中聚集成核，親水部分向外張開形成膠束。加入輔助無機鹽可能起著非特征性的鹽析作用，以滲透壓作用推動雙水相的形成。當?shù)鞍踪|(zhì)進入雙水相體系后，由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等)的作用和溶液環(huán)境的影響，使其在上、下相中的濃度不同，即各成分在兩相間的選擇性分配，從而達到萃取分離的目的。在用離子液體-無機鹽雙水相體系分離純化粗蛋白中，粗蛋白的濃度為2(Tl00mg.L—1，離子液體濃度為200 600 mg mL—1，無機鹽濃度為90 220 mg.mL—1。經(jīng)過多次實驗得優(yōu)化條件為粗蛋白的濃度為50 80 mg L—1，離子液體濃度為300 400 mg mL—1，無機鹽濃度為13(Tl80 mg mL'且當體系的無機鹽濃度低于90 mg mL—1或離子液體濃度低于200 mg mL-1時體系無法形成雙水相，隨著無機鹽濃度的增加，上下相體積比逐漸減小，但蛋白質(zhì)在兩相間的分配比逐漸增大，當無機鹽濃度達到150 mg .mr1時，菜籽蛋白在兩相間的分配比最大，此時對菜籽蛋白的萃取率最高；在150^180 mg .mL-1時，分配比將趨于穩(wěn)定；無機鹽濃度大于220 mg 時，分配比將有所減小。當離子液體濃度為30(T400 mg .mr1時菜籽蛋白的萃取率逐漸增大，當離子液體濃度大于400 mg -mr1時，菜籽蛋白的萃取率逐漸減小后趨于一定。因此，優(yōu)選的本發(fā)明餅柏粗蛋白的濃度為5(T80 mg .L-1，離子液體濃度為300 400 !!^ 111171，無機鹽濃度為130 180 mg mL—1。另外，本發(fā)明所用的離子液體純度需大于99%。將以上原料混合后，進行雙水相萃取分離蛋白質(zhì)。在恒溫振蕩器中進行加熱震蕩，加熱震蕩條件通常為加熱溫度40 70 °C、時間20 50 min、振蕩速度100 300 r .mirT1, pH
4、時體系對蛋白質(zhì)的萃取率較高，最優(yōu)選為pH 6、。靜置3(T60 min后分相完全，離子液體相可通過膜分離法分離出蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)冷凍干燥后得高純度蛋白質(zhì)，離子液體可經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、真空干燥后得以回收再用。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的萃取率高達98%，離子液體回收率90%以上，且回收的離子液體對蛋白質(zhì)的萃取率仍高達94%以上，此方法高效又節(jié)能。本發(fā)明所采用的提取分離蛋白質(zhì)的方法關(guān)鍵在于水相酶解法與離子液體雙水相法共同作用以得到高純度的蛋白質(zhì)，借以提高餅柏的利用價值，得到營養(yǎng)豐富的蛋白質(zhì)。
離子液體是近年來出現(xiàn)的一種新型綠色溶劑。在室溫或接近室溫下它以液體狀態(tài)存在的有機熔融鹽，完全由離子組成。離子液體不但具有傳統(tǒng)有機溶劑的優(yōu)勢，而且與有機溶劑相比表現(xiàn)出了許多優(yōu)異性能，如液體狀態(tài)溫度范圍寬，可以從15 V 300 °C范圍內(nèi)穩(wěn)定存在；具有良好的物理化學穩(wěn)定性；幾乎沒有蒸汽壓，消除了揮發(fā)性有機溶劑對環(huán)境的污染問題；無可燃性，對大量無機和有機物都有良好的溶解能力；具有溶劑和催化劑的雙重功效，可作為反應(yīng)溶劑和催化劑活性載體；電導率高。同時，離子液體的性質(zhì)可通過調(diào)節(jié)陰陽離子進行優(yōu)化。這就決定了離子液體將成為揮發(fā)性有機溶劑的理想替代品。因此，有人把離子液體、超臨界0)2和雙水相并稱為21世紀三大綠色溶劑，具有廣闊的應(yīng)用前景。離子液體雙水相體系一般是由親水性離子液體、無機鹽(如磷酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、氫氧化物等)和水形成的雙水相體系，它綜合了離子液體和雙水相體系的優(yōu)點。離子液體雙水相萃取分離蛋白質(zhì)屬于液-液萃取，其原理與水-有機相萃取的原理相似，但其作為一種高效的新型綠色分離體系，與傳統(tǒng)聚合物雙水相體系相比，離子液體雙水相具有粘度低、分相快、不易乳化、萃取率高、離子液體可以循環(huán)利用等優(yōu)點，因此越來越受到學術(shù)界及產(chǎn)業(yè)界的重視。本發(fā)明所提出的技術(shù)方案更加高效節(jié)能，符合現(xiàn)代人的低碳環(huán)保要求。本發(fā)明的蛋白質(zhì)收集和離子液體回收工藝主要是指將上相離子液體相用超濾膜分離出蛋白質(zhì)，冷凍干燥后得蛋白質(zhì)粉；而離子液體可用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和真空干燥得以回收。本發(fā)明的酶法結(jié)合離子液體雙水相提取分離餅柏中蛋白質(zhì)具有以下特點I.提取分離的效率高、蛋白質(zhì)純度高本發(fā)明采用水相酶解法與離子液體雙水相法結(jié)合提取分離餅柏中的蛋白質(zhì)，對蛋白質(zhì)進行了多次提取分離且操作簡易，解決了大多數(shù)方法的單一性及操作復(fù)雜等使得蛋白質(zhì)純度不理想的問題。2.經(jīng)濟、環(huán)保無污染本發(fā)明采用的離子液體是一種可替代傳統(tǒng)揮發(fā)性有機物的綠色溶劑，且可以多次循環(huán)使用。本產(chǎn)品迎合了現(xiàn)代低碳節(jié)能的要求，市場前景廣闊。
具體實施例方式實施例I(I)將高溫菜籽柏粉碎過篩，石油醚脫脂，得脫脂菜籽柏粉；(2)將脫脂菜籽柏粉與pH=8. 0的磷酸緩沖液混合后加入a _淀粉酶和纖維素酶制成混合液，將混合液在60 °C條件下酶解4h后，4000 r mirT1離心20min，得到酶解液和沉淀。所述脫脂菜籽柏粉與磷酸緩沖液的料液質(zhì)量比為1:15;所述混合液中a -淀粉酶和纖維素酶的酶活力分別為110 U g ―1和60 U g '總酶活力為170 U g-1。(3)將步驟⑵沉淀加入10倍量的水中，用0. 5 mo I L—1 NaOH調(diào)至pH=10進行堿溶反應(yīng)，2h后，4000 r mirT1離心20min，將分離得到的上清液與步驟(2)酶解液合并，加0. 5 mol I71鹽酸調(diào)pH至4. 2 4. 8進行酸沉，4000 r mirT1離心20min,用蒸懼水洗漆沉淀5次后，冷凍干燥，得到粗菜籽蛋白；(4)將粗菜籽蛋白加到[Bmim] Cl /K2HPO4雙水相體系中，在溫度65 °C，pH 7.0，振蕩速度200 r mirT1恒溫振蕩30 min，再靜置40 min，取上層離子液體相；

粗菜籽蛋白濃度為70 mg L-1，[Bmim]Cl 濃度為 350 mg mL—1，K2HPO4 濃度為 150mg mL 1 o(5)離子液體相用膜分離法分離蛋白質(zhì)，并且用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和真空干燥后除去水分回收離子液體，將蛋白質(zhì)冷凍干燥得到高純度菜籽蛋白粉。實施例2(I)將高溫菜籽柏粉碎過篩，環(huán)已烷脫脂，得脫脂菜籽柏粉；(2)將脫脂菜籽柏粉與pH=8. 0的磷酸緩沖液混合后加入a _淀粉酶和纖維素酶制成混合液，將混合液在55 °C條件下酶解3 h后，4000 r mirT1離心20min，得到酶解液和沉淀。所述脫脂菜籽柏粉與磷酸緩沖液的料液質(zhì)量比為1:10 ;所述混合液中a -淀粉酶和纖維素酶的酶活力分別為90 U g ―1和50 U g S總酶活力為140 U g '(3)將步驟⑵沉淀加入10倍量的水中，用0. 5 mol噸―1 NaOH調(diào)至pH=10進行堿溶反應(yīng)，2h后，4000 !■ mirT1離心20 min，將分離得到的上清液與步驟(2)酶解液合并，力口
0.5 mol I71鹽酸調(diào)pH 4. 2 4. 8進行酸沉，4000 r mirT1離心20 min,蒸懼水洗漆沉淀5次后，冷凍干燥，得到粗菜籽蛋白；(4)將粗菜籽蛋白加到[Amim]ClA2HPO4雙水相體系中，在溫度65 °C，pH 7. 0,200r mirT1恒溫震蕩40 min,再靜置40 min,取上層離子液體相；粗菜籽蛋白濃度為80 mg L-1，[Amim] Cl 濃度為 400 mg mL—1，K2HPO4 濃度為 180mg mL 1 o(5)離子液體相用膜分離法分離蛋白質(zhì)，并且用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和真空干燥后除去水分回收離子液體，將蛋白質(zhì)冷凍干燥得到高純度菜籽蛋白粉。離子液體回收率90%以上。實施例3(I)將低溫菜籽柏粉碎過篩，正已烷脫脂，得脫脂菜籽柏粉；(2)將脫脂菜籽柏粉與pH=9. 0的硼酸緩沖液混合后加入a -淀粉酶、纖維素酶和果膠酶制成混合液，將混合液在60 °C條件下酶解5 h后,4000 r mirT1離心20min,得到酶解液和沉淀。所述脫脂菜籽柏粉與硼酸緩沖液的料液質(zhì)量比為1:15;所述混合液中a -淀粉酶、纖維素酶和果膠酶的酶活力分別為70 U *g '40 U-g-1和50 U g '總酶活力為160 U g ―1。(3)將步驟⑵沉淀加入10倍量的水中，用0. 5 mol L—1 NaOH調(diào)至pH=10進行堿溶反應(yīng)，2h后，4000 r mirT1離心20min，將分離得到的上清液與步驟(2)酶解液合并，加0. 5 mol I/1鹽酸調(diào)pH 4. 2 4. 8進行酸沉，4000 r mirT1離心20min,蒸懼水洗漆沉淀5次后，冷凍干燥，得到粗菜籽蛋白；(4)將粗菜籽蛋白加到[Epy] BrA2HPO4雙水相體系中，在溫度65 V ’ pH 6. 5,200r mirT1恒溫震蕩30 45 min,再靜置30 min,取上層離子液體相；粗菜籽蛋白濃度為60 mg L-1，[Epy]Br濃度為300 mg mL—1，K2HPO 4濃度為130mg mL 。(5)離子液體相用膜分離法分離蛋白質(zhì)，并且用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和真空干燥后除去水分回收離子液體，將蛋白質(zhì)冷凍干燥得到高純度菜籽蛋白粉。 實施例4(I)將低溫茶籽柏粉碎過篩，四號溶劑脫脂，得脫脂茶籽柏粉；(2)將脫脂茶籽柏粉與pH=9的硼酸緩沖液混合后加入a _淀粉酶、纖維素酶和果膠酶制成混合液，將混合液在60 °C條件下酶解4 h后,4000 r mirT1離心25 min,得到酶解液和沉淀。所述脫脂茶籽柏粉與硼酸緩沖液的料液質(zhì)量比為1:10 ;所述混合液中a -淀粉酶、纖維素酶和果膠酶的酶活力分別為100 U-g '65 U-g一1 和 75 U g ―1，總酶活力為 240 U g -1。(3)將步驟(2)沉淀加入10倍量的水中，用0. 5 mol .L—1 NaOH調(diào)至pH =9. 5 10. 5進行堿溶反應(yīng)，2 h后,4000 r mirT1離心20min,將分離得到的上清液與步驟(2)酶解液合并,加0. 5 mol L-1鹽酸調(diào)pH 3 4進行酸沉，4000 r mirT1離心20 min,蒸懼水洗漆沉淀5次后，冷凍干燥，得到粗茶籽蛋白；(4)將粗茶籽蛋白加到[Bmim]BF4A2HPO4雙水相體系中，在溫度70 °C，pH 6.8,200 r mirT1恒溫震蕩30 min,再靜置30 min,取上層離子液體相；粗茶籽蛋白濃度為70 mg I71, [Bmim]BF4濃度為380 mg mL' K2HPO4濃度為160mg mL 1 o(5)離子液體相用膜分離法分離蛋白質(zhì)，并且用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和真空干燥后除去水分回收離子液體，將蛋白質(zhì)冷凍干燥得到高純度茶籽蛋白粉。表I實施例1-4中采用不同的離子液體/鹽雙水相體系及反應(yīng)條件對蛋白質(zhì)萃取率的影響
—I單位 I實施例I I實施例2 I實施例3 I實施例4
M子/茶籽蛋白濃度70806070—
S子液體-一~ [Bmim] Cl ~ [Amim] Cl 一 [Epy] Br [Bmim] BF^~
S子液體濃度—mg.mL/1 ~350 ~400 一300380
瓦HPO4 濃度—mg ^mL/1 ~ 150 ~ 180 一130160
S 度'C~65~65一6570
Fh~7.0 ~7.0 —6.56.8
韋取率|%丨98.24 \92. 35 丨88.94 丨94.87實施例5
(I)將低溫菜籽柏粉碎過篩，石油醚脫脂，得脫脂菜籽柏粉；(2)將脫脂菜籽柏粉與pH=9. 0硼酸緩沖液混合后加入a -淀粉酶、纖維素酶和果膠酶制成混合液，將混合液在50 60 °C條件下酶解3 5h后,4000 r mirT1離心20 min,得到酶解液和沉淀。所述脫脂菜籽柏粉與硼酸緩沖液的料液質(zhì)量比為1:10 ;所述混合液中a -淀粉酶、纖維素酶和果膠酶的酶活力分別為100 U.g-\70U.g―1和50U g '總酶活力為220U g ―1。(3)將步驟⑵沉淀加入10倍量的水中，用0. 5 mol L—1 NaOH調(diào)至pH= 10進行堿溶反應(yīng)，2h后，4000 r mirT1離心20min，將分離得到的上清液與步驟(2)酶解液合并，加0. 5 mol I/1鹽酸調(diào)pH 4. 2 4. 8進行酸沉，4000 r mirT1離心20min,蒸懼水洗漆沉淀
5次后，冷凍干燥，得到粗菜籽蛋白；(4)將粗菜籽蛋白加到[Bmim]ClA2HPO4雙水相體系中，在一定的溫度和pH條件下200 r mirT1恒溫震蕩30 min,再靜置30min,取上層離子液體相；菜籽蛋白濃度、[Bmim]Cl、K2HPO4的濃度以及萃取溫度和萃取pH取不同的值，見表2。(5)離子液體相用膜分離法分離蛋白質(zhì)，并且用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和真空干燥后除去水分回收離子液體，將蛋白質(zhì)冷凍干燥得到高純度菜籽蛋白粉，萃取率見表2。表2蛋白濃度、[Bmim]Cl濃度、K2HPO4濃度、溫度和pH對蛋白質(zhì)萃取率的影響
權(quán)利要求
1.一種利用離子液體及酶法提取分離餅柏中蛋白質(zhì)的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)將原料餅柏粉碎過篩后用有機溶劑脫脂，得到脫脂餅柏粉； (2)將步驟(I)所述的脫脂餅柏粉與pH值為7 10的緩沖溶液混合后加入復(fù)合酶制成混合液，將混合液在4(T65 °C條件下酶解疒5 h后，離心分離，得到酶解液和沉淀；所述脫脂餅柏粉與緩沖溶液的料液質(zhì)量比為1:7 1:15，所述混合液中的總酶活為90 250 U.g-1 ； (3)然后將步驟(2)所述的沉淀堿溶后離心分離，將分離得到的上清液與步驟(2)所述的酶解液合并后，進行酸沉并離心分離，將沉淀水洗后冷凍干燥，得到粗蛋白； (4)將步驟(3)得到的粗蛋白加到離子液體/鹽雙水相體系中，在溫度4(T70°C、PH4、的條件下震蕩后再靜置，取上層離子液體相； (5)最后將步驟(4)的離子液體相用膜分離法分離蛋白質(zhì)，并回收離子液體，將蛋白質(zhì)冷凍干燥得到高純度蛋白粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用離子液體及酶法提取分離餅柏中蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，所述復(fù)合酶中的酶為a-淀粉酶和纖維素酶，或者a-淀粉酶、纖維素酶和果膠酶，且a-淀粉酶和纖維素酶的酶活力比為5: f 2:3。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用離子液體及酶法提取分離餅柏中蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，混合液中，a -淀粉酶和纖維素酶的酶活力分別為6(T150 U g ―1和3(T90 U g '
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用離子液體及酶法提取分離餅柏中蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，所述的緩沖溶液為磷酸緩沖液或硼酸緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用離子液體及酶法提取分離餅柏中蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，所述的步驟(4)中所述粗蛋白的濃度為2(T100 mg 所述離子液體的濃度為200^600 mg mL—1，所述鹽的濃度為90 220 mg mL—1 ;優(yōu)選為所述粗蛋白的濃度為50 80mg L—1，所述離子液體的濃度為300 400 mg mL—1，所述鹽的濃度為130 180 mg mL—1。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或5所述的利用離子液體及酶法提取分離餅柏中蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，所述的離子液體/鹽雙水相體系為親水性離子液體/鹽雙水相體系，所述的離子液體為親水性咪唑類離子液體、吡啶類離子液體或胍類離子液體，所述的鹽為磷酸鹽、碳酸鹽或硫酸鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用離子液體及酶法提取分離餅柏中蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，所述的親水性咪唑類離子液體為[Amim]Cl、[Bmim]Cl或[Bmim]BF4,所述的卩比唳類離子液體為[Epy]Br或[BPy]BF4,所述的磷酸鹽為K2HP04、KH2PO4或K3PO4,所述的碳酸鹽為NaHC03、Na2CO3，所述的硫酸鹽為(NH4)2SO4 ;優(yōu)選的所述的離子液體/鹽雙水相體系為[Bmim]Cl/K2HP04、[Amim] C1/K2HP04、[Epy] BrA2HPO4、[Bmim] BF4A2HPO4。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用離子液體及酶法提取分離餅柏中蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，步驟(2)和步驟(3)中所述離心分離的離心速度為3000 5000 r mirT1。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用離子液體及酶法提取分離餅柏中蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，步驟(3)中沉淀水洗的次數(shù)為3飛次；步驟(4)中，所述震蕩的時間為2(T50min，震蕩速度為100 300 r mirT1，所述靜置的時間為3(T60min。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用離子液體及酶法提取分離餅柏中蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的有機溶劑為石油醚、環(huán)已烷、正已烷或四號溶劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的分離純化領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種用離子液體及酶法提取分離餅粕中蛋白質(zhì)的新方法。根據(jù)本發(fā)明所述的用離子液體及酶法提取分離餅粕中蛋白質(zhì)的方法包括以下步驟1)將原料餅粕粉碎過篩，脫脂，得到脫脂餅粕粉；2) pH7~10，溫度40~65 ℃，料液比1:7~1:15條件下將脫脂餅粕粉進行酶解，總酶活為90~250 U·g -1，酶解2~5 h后離心分離；3)步驟2) 所得的沉淀和酶解液進行堿溶酸沉，冷凍干燥，得到粗蛋白品；4)將步驟3)中的粗蛋白加到離子液體/鹽雙水相體系中，在溫度40~70 ℃，pH 4~9下分離純化蛋白；5)將步驟4)中的離子液體相用膜分離法分離蛋白質(zhì)并且回收離子液體，冷凍干燥得到高純度蛋白粉。本發(fā)明的操作簡單、無污染，蛋白質(zhì)純度高且保持其生物活性，是一種綠色節(jié)能且高效的蛋白質(zhì)分離純化新方法。
文檔編號C07K1/14GK102796163SQ20121032878
公開日2012年11月28日 申請日期2012年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月6日
發(fā)明者劉曉庚, 劉琴, 陳梅梅, 潘春淋, 高梅, 萬忠民, 曹崇江, 彭冬梅, 王立峰, 吳珂 申請人:南京財經(jīng)大學