專利名稱：一種從銀杏葉提取物中制備山奈酚-3-o-蕓香糖苷的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，具體地說，涉及一種從銀杏葉提取物中制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷的方法。
背景技術：
山奈酚-3-0-蕓香糖苷是黃酮類化合物，存在于菊科植物紅花屬、鳳仙花科、銀杏葉科等植物中。山奈酚-3-0-蕓香糖苷具有降低收縮壓和舒張壓，平均動脈血壓和心率的作用，同時具有抗過敏，鎮(zhèn)痛和降低血糖的作用，對治療心腦血管疾病和糖尿病具有很大的應用潛力。目前，對于山奈酚-3-0-蕓香糖苷的制備，主要是植物經(jīng)過醇提，然后經(jīng)大孔樹脂或葡聚糖凝膠等多次柱層析步驟進行分離純化，操作步驟繁瑣，過程復雜，同時需要消耗大量的有機溶劑，耗時費力。從銀杏葉提取物中用二維液相色譜一質(zhì)譜方法制備山奈酹-3-0-蕓香糖苷的方法還未見報道。二維液相色譜技術是通過用兩根性質(zhì)相同或不同的色譜柱對復雜樣品進行分離。作為一種分析復雜樣品的理想工具，它已被廣泛應用于醫(yī)藥衛(wèi)生、食品科學、環(huán)境和農(nóng)業(yè)科學等各個領域。與單維制備色譜相比，二維液相色譜不但具有更高的峰容量，而且兩維具有不同的選擇性。經(jīng)過第一維簡化的組分可以在第二維上根據(jù)不同的選擇性而實現(xiàn)互補分離，結構相似的化合物可能在第二維可到有效分離，從而提高制備的效率和化合物純度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種從銀杏葉提取物中制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷的方法。該方法是以銀杏葉提取物為原料，采用二維液相色譜一質(zhì)譜技術制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷的方法，山奈酚-3-0-蕓香糖苷的純度可以達到80%以上。為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術方案是:一種從銀杏葉提取物中制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷的方法，其特征在于:以銀杏葉提取物為原料，經(jīng)甲醇-水溶液溶解后，得到銀杏葉提取物溶液，再經(jīng)過二維液相色譜分離純化技術，得到山奈酚-3-0-蕓香糖苷。進一步地說:所述銀杏葉提取物溶于40-80%的甲醇-水溶液，制得銀杏葉提取物溶液，銀杏葉提取物濃度為10 - 1000mg/mL。所述銀杏葉提取物最佳溶于50 - 60%的甲醇一水溶液，銀杏葉提取物濃度最佳為250 — 550mg/mL。更進一步地說:所述二維液相色譜分離純化技術為二維液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用進行銀杏葉提取物制備山奈酚-3-0-蕓香糖 苷；采用液相色譜進行一維制備的色譜柱為反相C18，二維制備的色譜柱為親水型TECys色譜柱；一維液相色譜制備采用的流動相為有機相和水相的混合，洗脫條件按照有機相15 - 65%等度或O — 30分鐘有機相由5%提高到60%梯度進行；其中有機相為甲醇或乙腈，水相為水；對一維收集濃縮后的樣品，進行二維液相色譜制備，二維液相色譜制備采用的流動相為有機相與水相混合，洗脫條件按照有機相70 - 90%等度或經(jīng)O — 20分鐘有機相由95%降低到55%梯度進行，二維液相色譜制備根據(jù)質(zhì)譜選擇離子指導組分收集；其中有機相為甲醇或乙腈，水相為水；將二維液相色譜制備收集到的山奈酚-3-0-蕓香糖苷餾分進行旋轉蒸發(fā)濃縮至干，得到山奈酚-3-0-蕓香糖苷化合物。更進一步地說:所述對保留時間10 - 30分鐘主成分為山奈酚-3-0-蕓香糖苷的組分進行收集，旋轉蒸發(fā)至干，作為一維制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品。將一維制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品用40% - 80%的甲醇一水溶液溶解，至濃度為20 - 200mg/mL。更進一步地說:所述制備時流動相流速為60 - 120mL/min，制備時柱溫為室溫或25 — 40°C，制備時進樣量為200 - 3000 μ L/針，檢測器為DAD紫外檢測器和質(zhì)譜檢測器。更進一步地說:
所述一維制備最佳流動相為乙腈與水，采用梯度方式，乙腈比例由10%經(jīng)15 - 20分鐘增加到15% - 25%。所述一維制備收集15 - 20分鐘為主要含山奈酚-3-0-蕓香糖苷的組分，一維制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品用50% - 60%的甲醇一水溶液制成濃度為60 - 100mg/mL的山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品溶液。所述二維制備最佳流動相為乙腈(或含0.1%甲酸)與水(或含0.1%甲酸)，采用等度條件，乙腈(或含0.1%甲酸)濃度為75 - 85%，二維制備質(zhì)譜選擇離子為m/z = 303和287，收集m/z=287的餾分。更進一步地說:所述制備時流動相最佳流速為80 — 100mL/min,制備時柱溫為室溫,制備時進樣量為2000 - 2500 μ L/針，紫外檢測器為360nm。由于采用了上述技術方案，與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下特
占-
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I)、山奈酚-3-0-蕓香糖苷純度高。本發(fā)明采用二維液相色譜一質(zhì)譜方法，具有分離制備的正交性而達到互補分離，因此得到的山奈酚-3-0-蕓香糖苷純度高，可以達到80%以上。2)、方法簡單易行，操作簡便。本發(fā)明所涉及的制備高純度山奈酚-3-0-蕓香糖苷的方法，儀器自動化程度高，操作方便、簡單，常溫常壓下就可進行，適合大規(guī)模生產(chǎn)的需要。3)、藥材來源廣，易獲得，價格便宜。銀杏是我國特有的珍貴樹種，占全世界資源的70%，銀杏葉的總產(chǎn)量每年在2 X 107kg以上，資源極大豐富。三九牌舒血寧注射液、銀杏葉酊劑作為應用時間久、療效明確、使用安全的中藥注射劑，有著廣泛的應用，而本發(fā)明制得的山奈酚-3-0-蕓香糖苷是三九牌舒血寧注射液、銀杏葉酊劑中一種重要的原料。而本發(fā)明提供的制備方法，過程重復性高，可操作性好，同時銀杏葉資源豐富，容易獲取，適合大規(guī)模生產(chǎn)的要求，可用于舒血寧注射液、銀杏葉酊劑原料山奈酚-3-0-蕓香糖苷的制備。
具體實施例方式實施例:本發(fā)明是以銀杏葉提取物為原料，采用二維液相色譜一質(zhì)譜技術制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷的方法，山奈酚-3-0-蕓香糖苷的純度可以達到80%以上。本發(fā)明為從銀杏葉提取物中制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷的方法，步驟如下:I)、銀杏葉提取物溶于40% - 80%的甲醇一水溶液，制得銀杏葉提取物溶液，銀杏葉提取物濃度為10 - 1000mg/mL，最佳銀杏葉提取物溶于50 — 60%的甲醇一水溶液，銀杏葉提取物濃度最佳為250 - 550mg/mL。2)、采用液相色譜進行一維制備的色譜柱為反相C18，二維制備的色譜柱為親水型TECys色譜柱。3)、一維液相色譜制備采用的流動相為甲醇或乙腈(有機相)與水(水相)混合，洗脫條件按照有機相15 - 65%等度或O — 30分鐘有機相由5%提高到60%梯度進行。一維制備最佳流動相為乙腈(或含0.1%甲酸)與水(或含0.1%甲酸)，采用梯度方式，有機相比例由10%經(jīng)15 — 20分鐘增加至Ij 15 — 25%。4)、對保留時 間10 - 30分鐘主成分為山奈酚-3-0-蕓香糖苷的組分進行收集，旋轉蒸發(fā)至干，作為一維制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品。將一維制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品用甲醇一水溶解，至濃度為20 - 200mg/mL。一維制備最佳收集時間為15 — 20分鐘，為主要含山奈酚-3-0-蕓香糖苷的組分，濃縮至濃度為60 - 100mg/mL。5)、對一維收集濃縮后的樣品，進行二維液相色譜制備。采用的流動相為甲醇或乙腈與水混合，洗脫條件按照有機相70 - 90%等度或經(jīng)O — 20分鐘有機相由95%降低到55%梯度進行。二維制備最佳流動相為乙腈與水，采用等度條件，乙腈濃度為75 - 85% ;二維制備根據(jù)質(zhì)譜選擇離子指導組分收集，質(zhì)譜選擇離子為m/z = 303和287，收集m/z=287的餾分。6)、制備時流動相流速為60 - 120mL/min，制備時柱溫為室溫或25 — 40°C，制備時進樣量為200 - 3000 μ L/針，檢測器為DAD紫外檢測器和質(zhì)譜檢測器，質(zhì)譜選擇離子指導組分收集；最佳流速為80 - lOOmL/min,柱溫為室溫，進樣量為2000 — 2500 μ L/針，紫外檢測器為360nm。7)、將二維液相色譜制備收集到的山奈酚-3-0-蕓香糖苷餾分旋轉蒸發(fā)濃縮至干，得到高純度的山奈酚-3-0-蕓香糖苷化合物。以下是根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容，給出的三種實施例。實施例1:稱取銀杏葉提取物10g，溶于50mL40%的甲醇一水溶液，制得銀杏葉提取物溶液，濃度為200mg/mL,過0.45 μ m微孔濾膜,進行一維液相色譜制備。一維液相色譜采用)(terraC18，流動相采用乙腈為有機相，水為水相，梯度洗脫方式:有機相濃度由10%經(jīng)20分鐘提高到25%。采用DAD紫外檢測器360nm選擇吸收波長，制備溫度為室溫，進樣量為500 μ L/針，流動相流速為90mL/min,收集28 — 30分鐘的懼分,進行旋轉蒸發(fā)濃縮至干，為一維制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品。用50%的甲醇一水溶液溶解山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品，濃度為80mg/mL，經(jīng)微孔濾膜過濾，進行二維液相色譜制備，色譜柱為TECys流動相選擇乙腈為有機相，水為水相，采用70%有機相等度洗脫。采用DAD紫外檢測器360nm選擇吸收波長，質(zhì)譜選擇離子m/z為303和287，制備溫度為室溫，進樣量為1000 μ L/針，流動相流速為90mL/min,收集m/z為287的餾分，旋轉蒸發(fā)至干，得到山奈酚-3-0-蕓香糖苷化合物，經(jīng)液相色譜分析，純度為99.5%，一維制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品中山奈酚-3-0-蕓香糖苷的含量為30%。實施例2:稱取銀杏葉提取物lg，溶于100mL80%的甲醇一水溶液，制得銀杏葉提取物溶液，濃度為10mg/mL,過0.45 μ m微孔濾膜,進行一維液相色譜制備。一維液相色譜采用XterraC18，流動相采用甲醇為有機相，水為水相，有機相濃度為65%等度，采用DAD紫外檢測器360nm選擇吸收波長，制備溫度為40°C，進樣量為200 μ L/針，流動相流速為60mL/min，收集10 — 11分鐘的餾分，進行旋轉蒸發(fā)濃縮至干，為一維制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品。用40%的甲醇一水溶液溶解山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品，濃度為20mg/mL，經(jīng)微孔濾膜過濾，進行二維液相色譜制備，色譜柱為TECys，流動相選擇甲醇為有機相，水為水相，采用梯度洗脫方式，有機相濃度由95%經(jīng)20分鐘降低到55%。采用DAD紫外檢測器360nm選擇吸收波長，質(zhì)譜選擇離子m/z為303和287，制備溫度為室溫，進樣量為1000 μ L/針，流動相流速為lOOmL/min,收集m/z為28·7的餾分，旋轉蒸發(fā)至干，得到山奈酚-3-0-蕓香糖苷化合物，經(jīng)液相色譜分析，純度為85%，一維制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品中山奈酚-3-0-蕓香糖苷的含量為10%。實施例3:稱取銀杏葉提取物100g，溶于200mL 50%的甲醇一水溶液，制得銀杏葉提取物溶液，濃度為500mg/mL，過0.45 μ m微孔濾膜，進行一維液相色譜制備。一維液相色譜采用Xterra C18，流動相采用甲醇為有機相，水為水相，采用15%有機相等度方式洗脫。采用DAD紫外檢測器360nm選擇吸收波長，制備溫度為30°C，進樣量為3000 μ L/針，流動相流速為120mL/min，收集22 — 25分鐘的餾分，進行旋轉蒸發(fā)濃縮至干，為一維制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品。用60%的甲醇一水溶液溶解山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品，濃度為80mg/mL，經(jīng)微孔濾膜過濾，進行二維液相色譜制備，色譜柱為TECys，流動相選擇甲醇為有機相，水為水相，采用90%有機相等度洗脫。采用DAD紫外檢測器360nm選擇吸收波長，質(zhì)譜選擇離子m/z為303和287，制備溫度為25°C，進樣量為3000 μ L/針，流動相流速為120mL/min，收集m/z為287的餾分，旋轉蒸發(fā)至干，得到山奈酚-3-0-蕓香糖苷化合物，經(jīng)液相色譜分析，純度為80%，一維制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品中山奈酚-3-0-蕓香糖苷的含量為9%。實施例4:稱取銀杏葉提取物100g，溶于100mL40%的甲醇一水溶液，制得銀杏葉提取物溶液，濃度為1000mg/mL，過0.45 μ m微孔濾膜，進行一維液相色譜制備。一維液相色譜采用Xterra C18，流動相采用甲醇為有機相，水(含0.1%甲酸)為水相，采用梯度:有機相濃度由5%經(jīng)30分鐘提高到60%，采用DAD紫外檢測器360nm選擇吸收波長，制備溫度為25°C，進樣量為2000 μ L/針，流動相流速為80mL/min，收集15 — 18分鐘的餾分，進行旋轉蒸發(fā)濃縮至干，為一維制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品。用80%的甲醇一水溶液溶解山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品，濃度為50mg/mL，經(jīng)微孔濾膜過濾，進行二維液相色譜制備，色譜柱為TECys，流動相選擇甲醇為有機相，水為水相，采用5%有機相濃度洗脫。采用DAD紫外檢測器360nm選擇吸收波長，質(zhì)譜選擇離子m/z為303和287，制備溫度為40°C，進樣量為200 μ L/針，流動相流速為60mL/min，收集m/z為287的餾分，旋轉蒸發(fā)至干，得到山奈酚-3-0-蕓香糖苷化合物，經(jīng)液相色譜分析，純度為92%，一維制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品中山奈酚-3-0-蕓香糖苷的含量為15%。所屬技術領域的技術人員應該悉知，本發(fā)明的技術方法不僅僅限于從銀杏葉提取物中制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷，還可以應用于其它藥材山奈酚-3-0-蕓香糖苷的提取。三九牌舒血寧注射液、銀杏葉酊劑作為應用時間久、療效明確、使用安全的中藥注射劑，有著廣泛的應用，而本發(fā)明制得的山奈酚-3-0-蕓香糖苷是三九牌舒血寧注射液、銀杏葉酊劑中一種重要的原料。而本發(fā)明提供的制備方法，過程重復性高，可操作性好，同時銀杏葉資源豐富，容易獲取，適合大規(guī)模生產(chǎn)的要求，可用于舒血寧注射液、銀杏葉酊劑原料山奈酚-3-0-蕓香糖苷的制備。申請人:聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細工藝流程，單本發(fā)明并不局限于上述詳細工藝流程，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細工藝流程才能實施。對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加，具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護 范圍和公開范圍之內(nèi)。
權利要求
1.一種從銀杏葉提取物中制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷的方法，其特征在于:以銀杏葉提取物為原料，經(jīng)甲醇-水溶液溶解后，得到銀杏葉提取物溶液，再經(jīng)過二維液相色譜分離純化技術，得到山奈酚-3-0-蕓香糖苷。
2.根據(jù)權利要求1所述的從銀杏葉提取物中制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷的方法，其特征在于:所述銀杏葉提取物溶于40-80%的甲醇-水溶液，制得銀杏葉提取物溶液，銀杏葉提取物濃度為10 - 1000mg/mL。
3.根據(jù)權利要求2所述的從銀杏葉提取物中制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷的方法，其特征在于:所述銀杏葉提取物最佳溶于50 - 60%的甲醇一水溶液，銀杏葉提取物濃度最佳為250 — 550mg/mL。
4.根據(jù)權利要求1所述的從銀杏葉提取物中制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷的方法，其特征在于:所述二維液相色譜分離純化技術為二維液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用進行銀杏葉提取物制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷；采用液相色譜進行一維制備的色譜柱為反相C18，二維制備的色譜柱為親水型TECys色譜柱； 一維液相色譜制備采用的流動相為有機相和水相的混合，洗脫條件按照有機相15 -65%等度或O — 30分鐘有機相由5%提高到60%梯度進行；其中有機相為甲醇或乙腈，水相為水； 對一維收集濃縮后的樣品，進行二維液相色譜制備，二維液相色譜制備采用的流動相為有機相與水相混合，洗脫條件按照有機相70 - 90%等度或經(jīng)O — 20分鐘有機相由95%降低到55%梯度進行，二維液相色譜制備根據(jù)質(zhì)譜選擇離子指導組分收集；其中有機相為甲醇或乙腈，水相為水； 將二維液相色譜制備收集到的山奈酚-3-0-蕓香糖苷餾分進行旋轉蒸發(fā)濃縮至干，得到山奈酚-3-0-蕓香糖苷化合物。
5.根據(jù)權利要求4所述的從銀杏葉提取物中制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷的方法，其特征在于:所述對保留時間10 — 30分鐘主成分為山奈酚-3-0-蕓香糖苷的組分進行收集，旋轉蒸發(fā)至干，作為一維制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品。將一維制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品用40% - 80%的甲醇一水溶液溶解，至濃度為20 - 200mg/mL。
6.根據(jù)權利要求4所述的從銀杏葉提取物中制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷的方法，其特征在于:所述制備時流動相流速為60 - 120mL/min，制備時柱溫為室溫或25 — 40°C，制備時進樣量為200 - 3000 μ L/針，檢測器為DAD紫外檢測器和質(zhì)譜檢測器。
7.根據(jù)權利要求4所述的從銀杏葉提取物中制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷的方法，其特征在于:所述一維制備最佳流動相為乙腈與水，采用梯度方式，乙腈比例由10%經(jīng)15 - 20分鐘增加到15% - 25%。
8.根據(jù)權利要求7所述的從銀杏葉提取物中制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷的方法，其特征在于:所述一維制備收集15 - 20分鐘為主要含山奈酚-3-0-蕓香糖苷的組分，一維制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品用50% - 60%的甲醇一水溶液制成濃度為60 - 100mg/mL的山奈酚-3-0-蕓香糖苷粗品溶液。
9.根據(jù)權利要求8所 述的從銀杏葉提取物中制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷的方法，其特征在于:所述二維制備最佳流動相為乙腈(或含0.1%甲酸)與水(或含0.1%甲酸)，采用等度條件，乙腈(或含0.1%甲酸)濃度為75 - 85%，二維制備質(zhì)譜選擇離子為m/z = 303和287，收集m/z=287的餾分。
10.根據(jù)權利要求8或9所述的從銀杏葉提取物中制備山奈酚-3-0-蕓香糖苷的方法，其特征在于:所述制備時流動相最佳流速為80 - 100mL/min，制備時柱溫為室溫，制備時進樣量為2000 - 2500 μ L/針， 紫外檢測器為360nm。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從銀杏葉提取物中制備山奈酚-3-O-蕓香糖苷的方法，該方法采用二維液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術，以甲醇－水或乙腈－水為流動相，以反相C18色譜柱為一維制備色譜柱，對銀杏葉提取物進行組分切割，收集目標組分為山奈酚-3-O-蕓香糖苷粗品。再以親水型TECys為二維制備色譜柱，對山奈酚-3-O-蕓香糖苷粗品進行組分切割，收集，旋轉蒸發(fā)濃縮，得到高純度的山奈酚-3-O-蕓香糖苷，純度可以達到80%以上。本發(fā)明制備過程重復性高，可操作性好，同時銀杏葉資源豐富，容易獲取，適合大規(guī)模生產(chǎn)的要求，可用于舒血寧注射液原料制備。
文檔編號C07H17/07GK103113436SQ20121040751
公開日2013年5月22日 申請日期2012年10月23日 優(yōu)先權日2012年10月23日
發(fā)明者豐加濤, 付冬梅, 王海濤, 馮志瓊 申請人:北京華潤高科天然藥物有限公司