一種從正常人血漿中提取純化前白蛋白pa的方法
【專利摘要】本發明提供一種快速從正常人血漿中提取純化前白蛋白（PA）的方法。包括以下步驟：1）人血漿中加入NaCl，充分溶解；2）用酚溶液處理，萃取富集含前白蛋白（PA）的組分；3）含前白蛋白（PA）的組分透析置換緩沖液；4)AKTA系統離子交換層析快速中度純化PA；5)AKTA系統Sephacryl系列分子篩層析后續純化PA；6）AKTA系統Superdex系列分子篩層析精細純化PA；本發明的方法能夠很好的分離PA，制備的PA具有非常高的純度和活性，純度可達98%以上，被倍比稀釋64倍后仍能與抗血清發生清晰沉淀反應，且操作安全方便，提取周期短，適于工業化生產。
【專利說明】—種從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術，具體涉及一種快速從正常人血漿中提取純化前白蛋白(PA)的方法。
【背景技術】
[0002]前白蛋白(Prealbumin, PA)是肝臟細胞合成的一種血清蛋白質，由4個相同的亞基組成，分子量約55KD，消光系數(E280nm) 13.6，半衰期1.9天，電泳時遷移在白蛋白之前，故稱為前白蛋白，主要生理功能是參與血清中甲狀腺和視黃醇的運輸，并具有胸腺激素活性，可通過促進籬淋巴細胞的成熟來增加機體免疫力。血清中前白蛋白的測定結果在臨床上是反應肝功能和機體營養狀態的重要指標，常見于營養不良者。由于前白蛋白半衰期很短，可以反映肝臟合成和分解代謝的輕微改變，其血清濃度降低的幅度與肝實質損害的程度密切相關，因此在臨床上也常見于肝功能損傷、肝硬化、外傷及感染患者。臨床上，把檢測前白蛋白含量的變化作為衡量肝功能損害和營養不良的一種敏感可靠的指標。因此前白蛋白的提取純化，在診斷中擁有良好的應用前景。對于前白蛋白已報道的分離純化方法，大多是需要大量的血漿，步驟繁瑣，操作復雜，難以用于生產用的常規操作和臨床研究。EP0711786A2、US5310878A公開了一種純化人血漿前白蛋白的方法，這一方法在特定環境下運用離子交換、免疫擴散、親和層析、分子排阻層析以及多步緩沖液置換、濃縮等共計11步提取方法。然而，改方法步驟繁瑣而復雜，從而目的蛋白得率降低，并且提取流程耗時較長，難于滿足大規模工業化生產的需要。

【發明內容】

[0003]本發明所要解決的技術問題在于克服上述不足之處，研究設計簡便、快速提取純化前白蛋白(PA)的方法。
[0004]本發明提供了一種從正常人血漿中提取純化前白蛋白(PA)的方法。該方法包括下列步驟:
[0005]I)人血漿中加入NaCl，充分溶解；
[0006]2)用酚溶液處理，萃取富集含前白蛋白(PA)的組分；
[0007]3)含前白蛋白(PA)的組分透析置換緩沖液；
[0008]4) GE AKTA?快速蛋白層析儀purifierlOO系統離子交換層析快速中度純化PA ；
[0009]5) AKTA系統Sephacryl系列分子篩層析后續純化PA ；
[0010]6) AKTA系統Superdex系列分子篩層析精細純化PA，得到高純度的PA。
[0011]所述步驟I)的人血漿為健康人群捐獻的正常人血漿，加入NaCl的濃度為5%~30% (w/v)，優選 10~25%，最適 20% ;
[0012]所述步驟2)中所使用的酚溶液包含但不限于甲酚、萘酚、氯酚、苯酚或石炭酸。
[0013]所使用的酚溶液的濃度范圍在0.5^10% (w/v)，優選2~7%，最優選5.5% ；
[0014]所述步驟2)中萃取PA的方法步驟為將待處理血漿在磁力攪拌器的持續攪拌的條件下逐滴加入酚溶液，酚溶液的滴入速度為f 10毫升/分鐘；
[0015]所述步驟2)中萃取PA的方法，血漿與酚溶液混合物在4°C下靜置0.5^2小時，用高速離心機離心取出沉淀，留上清液，離心力為300(Tl2000g ；
[0016]所述步驟3中所使用的透析液為磷酸緩沖液，濃度范圍l(Tl00mM，優選50mM;pH范圍 7-10，優選 pH7.4 ；
[0017]步驟3)的含前白蛋白PA的組分透析方法為將組分裝入截留分子量為8000-20000道爾頓的透析袋，浸入上述磷酸緩沖液中，4°C下每隔3飛小時更換緩沖液一次，更換次數5~8次；
[0018]所述步驟4中所使用的AKTA純化系統為陰離子交換層析，層析柱的選擇包含但不限于 HiTrap Q FF, HiPrep Q FF, HiPrep DEAE FF 或 HiTrap Capto Q FF，優選 HiTrapCapto Q FF ；
[0019]所述步驟4中陰離子交換層析的操作條件為:A液:50mM磷酸緩沖液，pH7.4 ;B液:50mM磷酸緩沖液、IM氯化鈉溶液，pH 7.4 ;流速為f 3毫升/分鐘；首先使用A液過3個柱床體積，得穿透峰一；后0~20% (v/v) B液過3個柱床體積得洗脫峰二 ；最后用20%~?00%Β液過3個柱床體積，得洗脫峰三；
[0020]所述步驟5中所使用的AKTA純化系統為分子篩層析，層析柱的選擇包含但不限于Sephacryl S-100、S-200、S-300 ；Sephadex G-100、G-200、G_300 ;SuperdexG-100、G-200 或G-300 ;優選 S印hacryl S-100 ；
[0021]所述步驟5中Sephacryl S-100分子篩層析的層析條件為:層析液:50mM磷酸緩沖液，pH 7.4 ;流速為1-3毫升/分鐘；洗脫體積為1-2個柱床體積；
[0022]所述步驟6中所使用的AKTA純化系統為分子篩層析，層析柱的選擇包含但不限于Sephadex G-75、G_100、；Superdex G-75、G-100 ;優選 Superdex G-75。
[0023]所述步驟6中Sephacryl S-100分子篩層析的層析條件為:層析液:50mM磷酸緩沖液，pH 7.4 ;流速為1-3毫升/分鐘；洗脫體積為1-2個柱床體積；
[0024]本發明的方法能夠很好的分離PA，制備的PA具有非常高的純度和活性，純度可達98%以上，被倍比稀釋64倍后仍能與抗血清發生清晰沉淀反應，且操作安全方便，提取周期短，適于工業化生產。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1HiTrap Capto Q FF強離子交換層析純化PA:中間主峰為含PA組分；
[0026]圖2S印hacryl S200分子篩層析純化PA圖譜:第二峰為含PA組分
[0027]圖3Superdex G75分子篩層析純化PA圖譜:中間主峰為含PA組分；
[0028]圖4純化后PA組分瓊脂糖雙擴散結果:中間孔:抗PA抗體；周圍孔:自頂端逆時針方向:lmg/ml PA依次為:原倍、1: 2、1: 4、1: 8、1:16、1:32倍稀釋；
[0029]圖5BCA法測總蛋白含量擬合直線圖譜:
[0030]X軸:標準蛋白濃度(微克/毫升)'Y軸:標準蛋白A570吸光度值；
[0031]擬合公式:y=0.0Ollx+0.1757;線性相關系數 R2=0.9928
【具體實施方式】[0032]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0033]以下原料市售得到。
[0034]實施例1:酚沉淀法富集PA
[0035]取100ml人血漿中溶解20g NaCl，充分溶解使NaCl溶解度達到20% (w/v);配置120ml的5.5% (w/v)的苯酚水溶液，通風櫥內緩慢逐滴滴入，充分混勻，靜置30min ；1000Og(8500轉/分鐘)離心15min后，棄去沉淀，保留上清液；上清液經0.8 μ m的水相濾頭過濾后，裝入透析袋，4°C透析(50mMPBS pH7.4) 48小時，每隔6~12小時更換一次透析液；
[0036]實施例2:強陰離子交換層析中度純化PA
[0037]HiTrap Capto Q FF (美國GE醫療公司產品)強陰離子交換層析:A液(50mM磷酸緩沖液(pH7.4) ；B液(50mM磷酸緩沖液、IM氯化鈉，ρΗ7.4)，待100ml待純化組分泵入層析柱后，首先在ΑΚΤΑ?快速蛋白層析儀purifierlOO系統上用50ml A液沖洗層析柱，洗掉非特異性吸附的雜蛋白，然后設定程序，洗脫50ml的A、B混合液形成總體積為5個柱床體積的0~20% (v/v) B液(100%~80%Α液)的線性洗脫，除去雜蛋白，后用50ml (5個柱床體積)20%~100% B液(80%~0%Α液)線性洗脫，洗脫峰中含PA，收集PA洗脫液約45ml ；
[0038]實施例3:分子篩 層析精度純化PA
[0039]首先用S印hacryl S200分子篩(美國GE醫療公司產品)層析柱中度純化，純化條件為:待純化樣品上樣量約12ml，洗脫流速為I毫升/分鐘，洗脫400ml(洗脫圖譜見圖2)，收集吸收峰二 30ml，棄峰一；
[0040]Superdex G75 (美國GE醫療公司產品)分子篩層析精細純化，純化條件為:待純化樣品上樣量約5ml，洗脫流速為I毫升/分鐘，洗脫250ml (洗脫圖譜見圖3)收集最大的吸收峰組分20ml，得到高純度的前白蛋白。
[0041 ] 實施例4:純化PA純度的鑒定
[0042]將用Superdex G75 (美國GE醫療公司產品)分子篩層析精細純化的蛋白組分含量用BCA法蛋白濃度定量試劑盒(ThermoFisher公司Pieirce1''BCA ProteinAssay Kit)檢測；BCA法是世界上常用的蛋白濃度監測方法之一，參考文獻:Smith，P.K.etal.Anal.Biochem.，150，76-85 (1985).擬合曲線后(見圖 5)代入公式(y=0.0011χ+0.1757)測得純化后組分總蛋白濃度為1.01mg/ml;
[0043]同時將用Superdex G75 (美國GE醫療公司產品)分子篩層析精細純化的蛋白組分用市售上海復星長征醫學科學有限公司生產的人載脂蛋白A/B定量檢測試劑盒，在全自動生化檢測分析儀(日立AU400)上檢測，在全自動生化檢測分析儀上檢測，檢測到PA含量為 0.997mg/ml;
[0044]PA 純度為(0.997/1.01) *100%=98.7%
[0045]表1BCA法測總蛋白含量標準蛋白與待測蛋白的A5700D值
【權利要求】
1.一種從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法，其特征在于，該方法包括下列步驟: O人血漿中加入NaCl，充分溶解； 2)用酚溶液處理，萃取富集含前白蛋白PA的組分； 3)含前白蛋白PA的組分透析置換緩沖液； 4)GE AKTA?快速蛋白層析儀purifierlOO系統離子交換層析快速中度純化PA ； 5)AKTA系統S^hacryl系列分子篩層析后續純化PA ； 6)AKTA系統Superdex系列分子篩層析精細純化PA，得到高純度的PA。
2.根據權利要求1所述的從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步驟1)加入NaCl的濃度為5%~30% w/v，優選10~25%，最優選20%。
3.根據權利要求1所述的從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步驟2)中所使用的酚溶液選自甲酚、萘酚、氯酚、苯酚或石炭酸；酚溶液的濃度范圍為0.5%~10% w/v，優選2%~7%，最優選5.5%。
4.根據權利要求1所述的從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步驟2)中萃取PA的方法步驟為將待處理血漿在磁力攪拌器的持續攪拌的條件下逐滴加入酚溶液，酚溶液的滴入速度為1-10毫升/分鐘；血漿與酚溶液混合物在4°C下靜置0.5^2小時，用高速離心機離心取出沉淀，留上清液，離心力為3000-l2000g。
5.根據權利要求1所述的從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步驟3)中所使用的透析液為磷酸緩沖液，濃度范圍l0-l00mM，優選50mM;pH范圍7_10，優選pH7.4。
6.根據權利要求1所述的從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步驟3)含前白蛋白PA的組分透析方法為將所述組分裝入截留分子量為8000-20000道爾頓的透析袋，浸入上述磷酸緩沖液中，4°C下每隔3飛小時更換緩沖液一次，更換次數為5、次。
7.根據權利要求1所述的從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步驟4)中所使用的AKTA純化系統為陰離子交換層析，層析柱選自HiTrap Q FF、HiPr印Q FF, HiPrep DEAE FF 或 HiTrap Capto Q FF，優選 HiTrap Capto Q FF。
8.根據權利要求7所述的從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步驟4)中陰離子交換層析的操作條件為:A液:50mM磷酸緩沖液，pH 7.4 ；B液:50mM磷酸緩沖液、IM氯化鈉溶液，pH 7.4 ;流速為f 3毫升/分鐘；首先使用A液過3個柱床體積，得穿透峰一；后0-20%Β液過3個柱床體積得洗脫峰二 ；最后用20%~?00%Β液過3個柱床體積，得洗脫峰二。
9.根據權利要求1所述的從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步驟5)中所使用的AKTA純化系統為分子篩層析，層析柱選自S^hacryl S-100、S-200、S-300 ；Sephadex G-100、G-200、G-300 ；Superdex G-100、G-200 或 G-300 ；優選Sephacryl S-1OO ;分子篩層析的層析條件為:層析液:50mM磷酸緩沖液，pH 7.4 ;流速為1-3毫升/分鐘；洗脫體積為f 2個柱床體積。
10.根據權利要求1所述的從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步驟6)使用的AKTA純化系統為分子篩層析系統，層析柱選自Sephadex G-75、G_100、Superdex G-75 或 G-100 ;優選 Superdex G-75 ;所述步驟 6 中 Sephacryl S-1OO 分子篩層析的條件為:層析 液:50mM磷酸緩沖液，pH7.4 ;流速為1~3毫升/分鐘；洗脫體積為1~2個柱床體積。
【文檔編號】C07K1/18GK103833843SQ201210489310
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月27日 優先權日:2012年11月27日
【發明者】張海濤, 張躍建, 孫衛兵, 高曉猛 申請人:上海復星醫藥（集團）股份有限公司, 上海復星長征醫學科學有限公司