專(zhuān)利名稱(chēng)：桑黃菌中一種苯二酚的分離技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
桑黃，子實(shí)體無(wú)柄，菌蓋扁半球形或馬蹄形，2-12*3-21厘米，厚1. 5-10厘米，木質(zhì)，淺肝褐色至暗灰色或黒色，老時(shí)常龜裂，無(wú)皮売，初期有細(xì)微絨毛，后變無(wú)毛，有同心環(huán)棱.邊緣鈍，深肉桂色至淺咖啡色，下側(cè)無(wú)子實(shí)層.菌肉深咖啡色，硬，木質(zhì).菌管與菌肉近同色，多層，但層次不明顯，年老的菌管層充滿白色菌絲.管ロ銹褐色至醬色，圓形，每毫米4-5個(gè).孢子近球形，光滑，無(wú)色，5-6*3-4微米.剛毛頂端尖鋭，基部膨大，10-25*5-7微米.菌絲不分枝，無(wú)橫隔，直徑3-5微米。目前，真菌產(chǎn)物的純化方法較多，主要有分級(jí)沉淀法、制備性高效液相層析、柱層析法、超濾法、離心沉淀色譜法、等幾種方法。而其中應(yīng)用最多的當(dāng)屬柱層析法，分為兩類(lèi)一是只有分子篩作用的凝膠柱層祈，常用的凝膠有葡聚糖凝膠及瓊脂糖凝膠。ニ是離子交換層祈。但，主要用于分離多糖，透明質(zhì)酸等，多數(shù)分離后得到的產(chǎn)物為混合物。本發(fā)明使用多種層析技術(shù)相結(jié)合，分離度高，應(yīng)用此發(fā)明可以精致到純品
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)了一種桑黃菌(火木層孔菌/7AeBizw1S igniarius (L ex Fr) Quel、裂蹄木層孔菌phellinus linteus (Berk et Curt) Teng、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌Phellinus hartigii (Allesch et Schnabl) Imaz)中 1，2_ 苯ニ酌 的分離技術(shù)。首先制備桑黃粗提物，然后是正相硅膠層祈，使用氯仿與甲醇梯度洗脫，重復(fù)一次正相硅膠層祈，接著進(jìn)行氯仿甲醇凝膠層析，再次進(jìn)行正相硅膠層析，最后減壓蒸干得到1，2-苯ニ酚。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
桑黃粗提物，由下述方法制得
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸鎂 0. 1-0. 5%磷酸ニ氫鉀0. 01-0. 05%
(2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)，以20 35°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80 280r/min，pH 3 8條件下，震動(dòng)培養(yǎng)7 15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2. 5 4時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20 35°C，發(fā)酵罐壓カ0.1 0. 2公斤/平方厘米，pH 3 8，通氣量0. 5 1.1vvm,攪拌速度100 280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7 15天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2 1/5 ；
(4)用體積百分比為60 95%的こ醇對(duì)上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入こ醇的量是濃縮液體積的2 5倍，能夠使提取液中こ醇濃度達(dá)到60 90% ；
(5)對(duì)步驟(4)所得提取液在50 70°C條件下，加熱I 2小吋；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過(guò)ニ級(jí)過(guò)濾除去雜質(zhì)，分離獲得こ醇提取液；將上述こ醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 1/10 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得桑黃粗提物。分離苯ニ酚的方法桑黃菌粗提物一こ醇沉淀一正相硅膠層祈一氯仿與甲醇梯度洗脫一TLC檢測(cè)一正相硅膠層析一氯仿甲醇凝膠層析一TLC檢測(cè)一正相硅膠層祈一TLC檢測(cè)一減壓蒸干一無(wú)色油狀物(苯ニ酚)。具體方法為
(1)制備桑黃菌粗提物；
(2)將步驟(I)所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，干燥后進(jìn)行硅膠正相柱層析，使用洗脫劑洗脫2-5次，得到洗脫液；
(3)將步驟(2)中的最后一次洗脫液蒸干，等體積硅膠拌樣，進(jìn)行正相硅膠層析，使用洗脫劑洗脫；
(4)收集步驟(3)中的洗脫液，減壓濃縮，使用氯仿甲醇=1:1溶解，進(jìn)行甲醇凝膠柱層析，使用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測(cè)收集的洗脫液，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥；
(5)用步驟(4)中得到的產(chǎn)物再次進(jìn)行正相硅膠層析，使用洗脫劑洗脫；
(6)收集步驟(5)中得到的洗脫液，使用TLC檢測(cè)各洗脫液，適度合并洗脫液，減壓干燥，即為1,2-苯ニ酚。

圖1為1，2-苯ニ酚的結(jié)構(gòu)式；
圖2為1，2-苯ニ酚的一維核磁共振H譜。
具體實(shí)施方式
實(shí)例1:
桑黃粗提物，由下述方法制得
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 0. 1%酵母膏 0. 1%
硫酸鎂 0. 1%磷酸ニ氫鉀0. 01%
(2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)，以25°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為110r/min，pH 7條件下，震動(dòng)培養(yǎng)7天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到3時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度25°C，發(fā)酵罐壓カ0.1公斤/平方厘米，pH 3，通氣量
0.5-1. lvvm，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/3 ；
(4)用體積百分比為70%的こ醇對(duì)上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入こ醇的量是濃縮液體積的5倍，能夠使提取液中こ醇濃度達(dá)到55% ；
(5)對(duì)步驟(4)所得提取液在70°C條件下，加熱I小時(shí)；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過(guò)ニ級(jí)過(guò)濾除去雜質(zhì)，分離獲得こ醇提取液；將上述こ醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得桑黃粗提物。將上述粗提物稱(chēng)取200g與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，進(jìn)行硅膠正相柱層析。層析固定相為200-300目正相硅膠，柱高0.8m，直徑15cm，洗脫劑為分別為氯仿、甲醇，氯仿甲醇=100:1，分別洗脫2，3個(gè)柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-1，F(xiàn)r-2。將Fr-2等體積硅膠拌樣，使用硅膠為100目正相硅膠，五倍體積硅膠層析，使用的硅膠為200— 300目正相硅膠。洗脫劑為石油醚與丙酮。減壓濃縮洗脫液，使用甲醇氯仿=1:1溶解，氯仿甲醇凝膠柱層析。使用TLC檢測(cè)收集的洗脫液適當(dāng)合并，減壓蒸干，再次使用正相硅膠層祈，洗脫液為氯仿甲醇，收集洗脫液，使用TLC檢測(cè)各洗脫液，展開(kāi)劑為石油醚丙酮=20 :1，合并收集出現(xiàn)斑點(diǎn)的洗脫液。減壓干燥，進(jìn)行ID-HNMR核磁共振分析，頻率為400MHZ，分析結(jié)果為 8 8. 78 (s, 1H)，6. 68 (dt, J = 40. 7，20. 4 Hz, 1H)，6. 58 (dd,J = 5. 7，3. 5 Hz, 1H)，證明是為 1,2-苯ニ酚。實(shí)例2:
桑黃粗提物，由下述方法制得
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是
玉米淀粉 3%葡萄糖 2%
蛋白胨 0.5%酵母膏 0.5%
硫酸鎂 0.5%磷酸ニ氫鉀0.05%
(2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接 種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)，以30°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為180r/min，pH6條件下，震動(dòng)培養(yǎng)15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2. 5時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度30°C，發(fā)酵罐壓カ0.2公斤/平方厘米，pH 3，通氣量0. 5-1.1vvm,攪拌速度180轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)15天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物；
(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(4)用體積百分比為90%的こ醇對(duì)上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入こ醇的量是濃縮液體積的4倍，能夠使提取液中こ醇濃度達(dá)到70% ；
(5)對(duì)步驟(4)所得提取液在55°C條件下，加熱2.5小吋；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過(guò)ニ級(jí)過(guò)濾除去雜質(zhì)，分離獲得こ醇提取液；將上述こ醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/10 ;
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得桑黃粗提物。將上述粗提物稱(chēng)取300g與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，進(jìn)行硅膠正相柱層祈。層析固定相為200-300目正相硅膠，柱高lm，直徑20cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿甲醇=100:1，分別洗脫3，4個(gè)柱體積。并將所得洗脫液分別命名為Fr-1，F(xiàn)r-2。將Fr_2等體積硅膠拌樣，使用硅膠為100目正相硅膠，五倍體積硅膠層析，使用的硅膠為200—300目正相硅膠。洗脫劑為石油醚與丙酮。減壓濃縮洗脫液，使用甲醇氯仿=1:1溶解，氯仿甲醇凝膠柱層祈。使用TLC檢測(cè)收集的洗脫液適當(dāng)合并，減壓蒸干，再次使用正相硅膠層析，洗脫液為氯仿甲醇，收集洗脫液，使用TLC檢測(cè)各洗脫液，展開(kāi)劑為石油醚丙酮=35: 1，合并收集出現(xiàn)斑點(diǎn)的洗脫液。減壓干燥，進(jìn)行ID-HNMR核磁共振分析，頻率為400MHZ，分析結(jié)果為8 8. 78 (s, 1H), 6.68 (dt, J = 40. 7, 20.4 Hz, 1H)，6. 58 (dd, J = 5. 7, 3.5 Hz,1H)，證明是為1，2 -苯ニ酚。
權(quán)利要求
1.桑黃菌中苯二酚的分離方法，其步驟順序如下 (1)制備桑黃粗提物； (2)將步驟(I)所得的乙醇沉淀物與正相硅膠混勻攪拌，干燥后進(jìn)行硅膠正相柱層析，使用洗脫劑洗脫2-5次，得到洗脫液； (3)將步驟(2)中的最后一次洗脫液蒸干，等體積硅膠拌樣，進(jìn)行正相硅膠層析，使用洗脫劑洗脫； (4)收集步驟(3)中的洗脫液，減壓濃縮，使用氯仿甲醇=1:1溶解，進(jìn)行甲醇凝膠柱層析，使用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測(cè)收集的洗脫液，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥； (5)用步驟(4)中得到的產(chǎn)物再次進(jìn)行正相硅膠層析，使用洗脫劑洗脫； (6)收集步驟(5)中得到的洗脫液，使用TLC檢測(cè)各洗脫液，適度合并洗脫液，減壓干燥，即為1,2-苯二酚。
2.如權(quán)利要求1所述的一種從桑黃菌中分離苯乙醇的方法，其特征在于所述桑黃粗提物，由下述方法制得 (1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是
3.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中苯二酚的分離方法，其特征在于所述的苯二酚為1,2-苯二酚。
4.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中苯二酚的分離方法，其特征在于，步驟(2)中所述的拌樣硅膠為100-200目正相硅膠。
5.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中苯二酚的分離方法，其特征在于，步驟(2)中所述的層析硅膠為正相200-300目，洗脫劑為氯仿或甲醇。
6.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中苯二酚的分離方法，其特征在于，步驟(3)中所述的硅膠用量為等體積，洗脫劑為石油醚丙酮=20:1-35:1。
7.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中苯二酚的分離方法，其特征在于，步驟(4)中所述的凝膠為Sephadex LH-20,洗脫劑為氯仿甲醇=1:1。
8.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中苯二酚的分離方法，其特征在于，步驟(5)所述的層析硅膠為200-300目，洗脫劑為氯仿甲醇=200:1-50:1。
9.如權(quán)利要求1所述的桑黃菌中苯二酚的分離方法，其特征在于，步驟(6)所述的檢測(cè)要點(diǎn)是出現(xiàn)斑點(diǎn)，展開(kāi)劑為石油醚丙酮=20 :1-35:1。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種桑黃菌(火木層孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel、裂蹄木層孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz)中苯二酚的分離技術(shù)。首先制備桑黃菌粗提物，然后是正相硅膠層析，使用氯仿與甲醇梯度洗脫，重復(fù)一次正相硅膠層析，接著進(jìn)行氯仿甲醇凝膠層析，再次進(jìn)行正相硅膠層析，最后減壓蒸干得到苯二酚。
文檔編號(hào)C07C39/08GK103044206SQ201210546200
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月15日
發(fā)明者宋愛(ài)榮, 趙晨, 孫效樂(lè), 黃芳, 王光遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)