專利名稱：一種曲普瑞林及其固相合成制備方法
技術領域：
本發明涉及曲普瑞林原料藥的生產工藝，尤其是固相合成工藝以及純化方法。本發明還涉及一種曲普瑞林。
背景技術：
曲普瑞林，已以其醋酸鹽或者巴莫酸鹽的形式應用于臨床，臨床適應癥包括前列腺癌、性早熟、輔助生殖技術(ART)例如體外受精術(IVF)、子宮內膜異位癥和子宮肌瘤等，已上市產品例如有達菲林 。曲普瑞林英文名為=Triptorelin,別名有垂普托雷林、色氨瑞林、Decapeptyl 等，其 CAS 登記號為 57773-63-4，分子式，C64H82N18013，分子量 1311. 45。曲普瑞林的妝序為Pyr_Hi S-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH20 曲普瑞林系合成的促性腺激素釋放激素(GnRH)的類似物。其結構的改良是將天然分子結構中的第六個左旋氨基酸(甘氨酸)，以右旋色氨酸取代以使其促效作用更為顯著。曲普瑞林作用與GnRH相同，但其血漿半衰期延長且對GnRH受體的親和力更強，因此曲普瑞林成為GnRH受體的強力激動劑。曲普瑞林注射后,最初會刺激垂體分泌促性腺激素(Gn)，即黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)。當垂體經過長期的刺激后會進入不應期，促性腺激素的釋放會減少，因而使性類固醇(睪丸酮或雌激素)降低至去勢水平。上述作用是可逆轉的。1974年日本武天化工的Fujino Masahiko等人首先發明促黃體急速釋放激素的十肽酰胺類似物的合成工藝。并在日本，德國，美國等國家申請專利，專利號分別為JP19740027442、DE2446005、US4008209 (液相法)。此后，美國US4010125公開了曲普瑞林及其中間體以及它們的制備方法。該文獻所記載的方法包括使用Boc-保護氨基酸為原料,使用二苯甲基胺(Benzhydrylamine)樹脂進行固相合成。在每一輪脫帽須用三氟醋酸，并且在最終將十肽從樹脂上切除時使用氫氟酸和苯甲醚。以Fmoc-保護氨基酸為原料制備曲普瑞林亦有相關報道。例如孫永強等(孫永強、錢明霞、嚴益民、馮曉暉、蔣偉，曲普瑞林的液相合成，中國醫藥工業雜志，2012，43 (7):532)公開了使用Fmoc-保護氨基酸為原料通過液相合成法來制備曲普瑞林，在該方法中使用HBTU為偶聯劑，據報道該工藝中每一次肽鏈延長步驟的收率僅在77°/Γ86%之間，純化收率為74%，總收率僅為12. 4%。因此提高產品收率以及獲得具有良好品質的產品，仍然是本領域技術人員極其期待的。

發明內容
本發明的目的在于提供一種制備曲普瑞林的方法，期待該方法可以得到高收率的曲普瑞林，并且期待所得曲普瑞林具有良好的品質。本發明人令人驚奇地發現，使用特定的工藝條件制備曲普瑞林，不但產率高，而且產品品質優良。本發明因此而得以完成。
為此，根據本發明的第一方面，提供了一種固相合成曲普瑞林的方法，其包括以下步驟(I)向經浸泡處理的固相合成用樹脂中加入溶解于溶劑中的Fmoc-Gly-OH、肽偶聯劑、酰胺鍵形成促進劑和有機堿，使物料進行偶聯反應，以形成Fmoc-Gly-樹脂；(2)向上一步驟所得的肽偶合樹脂(即步驟(I)所得Fmoc-Gly-樹脂)中加入脫帽試劑，使物料進行反應以脫帽(即脫除Fmoc-保護基)；接著加入溶解于溶劑中的保護氨基酸F moc-Pro-OH、肽偶聯劑、酰胺鍵形成促進劑和有機堿，使物料進行偶聯反應，以形成Fmoc-Pro-Gly-樹脂；(3)循環重復步驟(2)，并在每一循環操作的偶聯反應中依次使用下列氨基酸以替換保護氨基酸Fmoc-Pro-OH Fmoc-L-Arg (pbf) -0H、Fmoc-L-Leu_0H、Fmoc-D-trp (bo c) _0H、Fmoc-L-Tyr(tBu)-0H>Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L_trp(boc)-0H>Fmoc-L-His(trt)-OH和 H-Pyr-OH,以最終形成十妝樹脂H-Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂；(4)向步驟(3)所得十肽樹脂中加入切割液進行切肽反應，以使十肽從樹脂上切割下來，得到曲普瑞林。根據本發明第一方面的方法,其中步驟(I)中，所述樹脂選自rink amide MBHA樹脂、rink amide am樹脂、knorr樹脂、或其組合。這類樹脂是可以從商業途徑獲得的,例如可以從阿拉丁試劑公司(http://www.aladdin_reagent.com)商業公司購得。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(I)中，所述樹脂浸泡處理是照如下方式進行的取樹脂置于反應器中，加入溶劑(例如二氯甲烷、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DMF、或其組合)振蕩并充分浸泡(例如浸泡l(T200min)，抽除溶劑(必要時，可再用上述溶劑重復清洗，并除去溶劑)。在一個實施方案中，所述樹脂浸泡處理是照如下方式進行的稱取一定量樹脂于反應器中，然后加入二氯甲烷，振蕩并浸泡60分鐘，用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分別交替清洗兩次，抽濾以除去溶劑。在一個實施方案中，所述樹脂浸泡處理是照CN101357936A說明書第8頁第2_3行所述方式進行的。在一個實施方案中，所述樹脂浸泡處理是照US4010125說明書第10欄第35-43行所述方式進行的。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(I)中，所述樹脂在經浸泡處理后、進行偶聯反應之前，還包括對該樹脂進行脫帽處理的步驟。增加該脫帽處理步驟，使樹脂得以進一步地活化，有助于增加Fmoc-Gly-樹脂的收率。該脫帽處理的步驟可以參照步驟(2)中的方式進行。此外，在該脫帽處理期間或者脫帽處理后，可以使用茚三酮檢測法檢測脫帽完全程度，如果脫帽不完全，可重得進行脫帽處理。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(I)中，所述肽偶聯劑例如但不限于DCC(N, N' - 二環己基碳二亞胺，N, N' -Dicyclohexylcarbodiimide)、DIC(N, N’- 二異丙基碳二亞胺，N, N，-Diisopropylcarbodiimide)、HATU (英文全稱 2- (ΙΗ-7-Azabenzotriazol-l-yl)-l, I, 3, 3-tetramethyl uronium hexafluorophosphate Methanaminium)、HBTU (英文全稱 O-Be nzotriazole-N, N, N’ , N’ -tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate)、HCTU (英文全稱 IH-Benzotriazoliuml-[bis (dimethylamino)methylene] -5chloro-, hexaf luorophosphate (1-), 3-oxide)、TATU (英文全稱 0_ (7-Azabenzotriazole-l-yl) _N, N, N，,N’-tetramethyluroniu m tetrafluoroborate) > TBTU (英文全稱 0-(Benzotriazol-l-yl)-N, N, N’, N’ -tetramethylur onium tetraf luoroborate)、或其組合。妝偶聯劑可以容易地從商業途徑獲得的，例如可以從吉爾生化公司、阿拉丁試劑公司、上海庭園生化科技有限公司等商業途徑購得。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(I)中，所述酰胺鍵形成促進劑例如但不限于HOAT、HOBT、6-C1 -HOBt、或其組合。這些試劑可以容易地從商業途徑獲得的，例如可以從吉爾生化公司、阿拉丁試劑公司、上海庭園生化科技有限公司等商業途徑購得。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(I)中，所述有機堿例如但不限于NMM、DIEA、三甲基吡啶、或其組合。這些試劑可以容易地從一般的商業途徑獲得特別是一般的化學試劑公司購得，例如可以從北京化學試劑公司購得。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(I)中，用于進行偶聯反應的所述溶劑例如但不限于二氯甲烷、二甲基甲酰胺等。溶劑的用量以根據現有技術公開的方法或者經驗容易地確定，例如用足以溶解各種物料的盡量少的溶劑；或者，例如在步驟(I)中進行偶聯 反應時,通常可以是每摩爾樹脂使用5-25L溶劑，例如可以是每摩爾樹脂使用10-20L溶劑。在其它偶聯反應步驟中亦可使用此比率范圍。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(I)中，所述樹脂與所述Fmoc-Gly-OH的投料比為1:2.5 5(摩爾比)，優選1:3 5。進一步地，在后續的各個肽偶聯反應中，添加的該步驟的氨基酸(Fmoc保護的或未保護的)的量為步驟(I)中樹脂量的2 7倍(摩爾倍)，優選:Γ6倍。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(I)中，所述Fmoc-Gly-OH、肽偶聯劑、酰胺鍵形成促進劑和有機堿四者的投料比為1:1_3 1-3 :2-6(摩爾比)，例如四者的投料比為1:1-2:1-2:2-4。需要說明的是，當某類物料(例如酰胺鍵形成促進劑)以兩種或兩種以上組合使用時，其在上述投料比中的用量是以投入的全部該類物料計的，例如使用兩種酰胺鍵形成促進劑時，它們的總摩爾數是Fmoc-Gly-OH摩爾數的1_3倍，優選1_2倍；其它物料種表示它們的量時，亦有同樣含義，除非另有說明。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(I)中，還包括在偶聯反應期間或者反應后采用茚三酮檢測法檢測偶聯反應進行程度。如果發現偶聯反應不夠完全，可以重復進行偶聯反應。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(I)中，還包括在完成偶聯反應后對獲得的F moc-Gly-樹脂進行清洗的操作，所述清洗是使用選自下列的溶劑清洗處理f 3次、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DMF、或其組合，特別是使用DMF、甲醇、二氯甲烷，三者交替清洗2次。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(2)中，所述脫帽試劑選自哌啶(亦稱為六氫吡唳，PIP)、二乙胺、三乙胺、三氟乙酸。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(2)中，所述脫帽反應是在選自下列的溶劑中進行的二氯甲烷、二甲基甲酰胺等，優選二甲基甲酰胺。溶劑的用量以根據現有技術公開的方法或者經驗容易地確定，例如用足以溶解各種物料的盡量少的溶劑。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(2)中，所述脫帽反應是在15 25%的哌啶/二甲基甲酰胺溶液中進行的，優選是在20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺溶液中進行的。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(2)中，所述脫帽反應是在1(T30° C溫度下進行的，反應時間為l(T200min，例如3(T90min，例如約60min。在一個實施方案中，所述脫帽反應是在室溫下進行的。在一個實施方案中，所述脫帽反應是在室溫下進行的反應時間為l(T200min，例如30 90min,例如約60min。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(2)中，還包括在完成脫帽反應后對獲得的Gly-樹脂進行清洗的操作，所述清洗是使用選自下列的溶劑清洗處理f 3次、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DMF、或其組合，特別是使用DMF、甲醇、二氯甲烷，三者交替清洗2次。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(2)中，還包括在脫帽反應期間或者脫帽反應后采用茚三酮檢測法檢測脫帽反應進行程度。如果發現脫帽反應不夠完全，可以重復進行脫帽反應。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(2)中，所述偶聯反應是參照步驟(I)中的偶聯反應進行的。根據本發明第一方面的方法，其中步驟⑶中，第一循環操作使用 Fmoc-L-Arg (pbf) -OH 作為保護氨基酸,得到 H-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(3)中，第二循環操作使用Fmoc-L-Leu-OH作為保護氨基酸，得到H-Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂。根據本發明第一方面的方法，其中步驟⑶中，第三循環操作使用Fmoc-D-trp (boc) -OH 作為保護氨基酸，得到 H-D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂。根據本發明第一方面的方法，其中步驟⑶中，第四循環操作使用Fmoc-L-Tyr (tBu) -OH 作為保護氨基酸，得到 H-Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂。根據本發明第一方面的方法，其中步驟⑶中，第五循環操作使用Fmoc-L-Ser (tBu) -OH 作為保護氨基酸，得到 H-Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂。根據本發明第一方面的方法，其中步驟⑶中，第六循環操作使用Fmoc-L-trp (boc) -OH 作為保護氨基酸，得到 H-Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc)-Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂。根據本發明第一方面的方法，其中步驟⑶中，第七循環操作使用Fmoc-L-His (trt) -OH 作為保護氨基酸，得到 H-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(3)中，第八循環操作使用H-Pyr-OH作為保護氨基酸，得到 H-Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pb f) -Pro-Gly-樹脂。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(I)中進行偶聯反應時，酰胺鍵形成促進劑是HOAT和HOBT兩者組合使用。在一個實施方案中，HOAT和HOBT 二者的用量比為1:1-4 (摩爾比)，優選1:2-3(摩爾比)。發明人已經出人意料地發現，組合使用酰胺鍵形成促進劑對于提高第一步驟偶聯率進而提高產品品質是非常有益的。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(2)和步驟(3)中進行偶聯反應時，使用的酰胺鍵形成促進劑是HOAT。根據本發明第一方面的方法，其中步驟⑶中，在第一循環操作使用Fmoc-L-Arg (p bf) -OH作為保護氨基酸進行偶聯反應的過程中，與Fmoc-L-Arg (pbf)-OH —起加入適量乳酸進行反應。在一個實施方案中，所述Fmoc-L-Arg (pbf) -OH與乳酸的摩爾比為I 0. 1-0. 5，優選I 0. 2-0. 3。所述的乳酸例如是符合2010年版二部480頁收載的“乳酸”的標準的產品。發明人已經出人意料地發現，在該步驟中加入適量乳酸時，所得曲普瑞林氨基酸光學純檢測時D-Arg的含量低于約O. 10%，這對于提高產品品質是非常有益的。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(I)、步驟(2)、和步驟(3)中的所述偶聯反應是在10 30° C溫度下進行的，反應時間為l(T200min，例如3(T90min，例如約60min。在一個實施方案中，所述偶聯反應是在室溫下進行的。在一個實施方案中，所述偶聯反應是在室溫下進行的反應時間為l(T200min，例如3(T90min，例如約60min。根據本發明第一方面的方法，其中在各步驟中進行脫帽反應和/或偶聯反應時，是在室溫進行的，優選是在20±5° C下進行的，雖然本發明描述了一些優選的反應時間， 然而反應時間可根據茚三酮檢測結果而隨時作適當調整，例如如果經檢測發現反應尚不完全的情況下可適當延長反應，這些操作是本領域技術人員容易控制的。根據本發明第一方面的方法，其中步驟⑷所述切割液中包含TFA、TIS、EDT、H 20。在一個實施方案中，所述切割液中四種組分的體積比為TFA:TIS:EDT:H20=50-98:1-10:1-10:0. 1-5。在一個實施方案中，所述切割液中四種組分的體積比為TFA:TIS:EDT: H20=90-98:1-5:1-5:0. 5-2。在一個實施方案中，所述切割液中四種組分的體積比為TFA:TIS:EDT:H20=95:2:2:1。在一個實施方案中，所述切割液是預先冷卻到_20 ° C至10° C，優選預先冷卻至0° C至10° C，優選預先冷卻至約5° C。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(4)中，所述切肽反應是在室溫進行的，優選是在20±5° C下進行的。反應時間為1-10小時，優選1-5小時，優選2-3小時。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(4)中，所述切肽反應是將氨基酸的側鏈保護基及十肽從樹脂上同時切割下來從而獲得十肽曲普瑞林。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(4)中，在完成切肽反應后，除去切割液(例如通過減壓的方式)，然后加入乙醚進行沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗滌數次，真空干燥，獲得曲普瑞林。根據本發明第一方面的方法，在經步驟(4)切肽反應獲得曲普瑞林干燥品后，還進一步包括對該曲普瑞林干燥品進行純化的步驟。該純化步驟在本發明中亦可稱為步驟
(5)，純化前的曲普瑞林干燥品可以稱為曲普瑞林粗品。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(5)的純化步驟是照如下方式進行的將曲普瑞林粗品用醋酸水溶液溶解，過濾，濾液過離子交換柱并用該醋酸水溶液洗脫，收集流出主峰，然后再經過C18柱純化，收集主峰流出液，冷凍干燥，即得曲普瑞林精制品，其可以作為曲普瑞林的原料藥。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(5)中，所述的離子交換柱為陽離子交換柱(例如但不限于Shodex IEC CM-825,Shodex IEC SP-825,Shodex IEC SP_420N、S hodexAsahipak ES-502C7C)或陰離子交換柱(例如國產D201、D231、DK251、731、或290型陰離子交換樹脂，美國Amberlite IRA-900型陰離子交換樹脂，德國Lewatit MP-500型陰離子交換樹脂，日本 Diaion PA308 型陰離子交換樹脂，TOSOH TSK-GEL DEAE-5PW、ChrompackIonoSpher A)或其組合使用；優選的離子交換柱為陰離子交換柱。優選的離子交換柱是基質為聚羥基甲基丙烯酸酯的陽離子交換柱，例如S hodex IEC CM-825,Shodex IEC SP-825、Shodex IEC SP-420N，它們可以容易地從商業途徑獲得，例如得自北京譜朋科技有限公司。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(5)中，所述的醋酸水溶液濃度為2%-20%(v/v)，例如 5%ο根據本發明第一方面的方法，其中步驟(5)中，所說的反向柱純化所用流動相為含有與含有15%-50%乙腈或甲醇的水溶液；在一個實施方案中，所說的反向柱純化所用流動相為含20%乙腈的水溶液。在一個實施方案中，所述反向柱是LichiOspher RP-18色譜柱(德國產)。在一個實施方案中，所述反向柱純化的流速為10ml/min。在一個實施方案中，由于最終純化步驟中使用到乙腈，因此本發明終產物中可能殘余有微量的乙腈，控制乙腈的量是有必要的，通過減壓干燥或 真空干燥或者冷凍干燥是可以容易地除去乙腈的，或者可以容易地除去乙腈以使乙腈量降低到O. 04%以下(可照氣相色譜法測定)。本發明后文各實施例所得精制醋酸曲普瑞林中中，乙腈含量均低于O. 03%。因此，在本發明的一個實施方案中，本發明提供了一種曲普瑞林，其中乙腈含量低于O. 03%。進一步地，本發明第二方面提供了本發明第一方面任一項所述方法獲得的曲普瑞林。在一個實施方案中，本發明曲普瑞林經氨基酸光學純檢測，除了 Try以外，其它7個氨基酸的D-型對映體比例相對于其相應氨基酸酸而言均小于O. 2%。在一個實施方案中，本發明曲普瑞林經氨基酸光學純檢測，除了 Try以外，其它7個氨基酸的D-型對映體比例相對于其相應氨基酸酸而言均小于O. 15%。在一個實施方案中，本發明曲普瑞林經氨基酸光學純檢測，其中D-Arg相對于全部精氨酸而言均小于O. 2%，優選小于O. 15。在本發明的一個實施方案中，本發明提供了一種曲普瑞林，其中乙腈含量低于O. 03%。下面對本發明作進一步的描述。在本發明中，使用的氨基酸如未特別標示其構型時，均指-L型氨基酸。在本發明中，使用到如下的一些Fmoc保護或未保護的氨基酸作為起始原料Fmo c-L-Gly-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Arg (pbf) -0H> Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-D-trp (boc)-OH、Fmoc-L-Tyr (tBu) -0H> Fmoc-L-Ser (tBu) -0H> Fmoc-L-trp (boc) -0H> Fmoc-L-His (trt)-0H、H_Pyr-0H。在本發明中還使用到Rink-amide MBHA樹脂作為載體,其取代量為O. 84mmol/g，在標示樹脂投料量時均有類似含義；如果直接以摩爾量標示樹脂投料量，表示所加入的樹脂的取代量，以摩爾(mol)或者毫摩爾(mmol)計。固相多肽合成中一般需要將α-氨基以及側鏈活性基團保護起來。目前使用比較多的α-氨基保護基為叔丁氧羰基(Boc)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)兩種。Boc基團需要反復采用50%的三氟乙酸(TFA)來脫除，肽樹脂切割一般采用氫氟酸(HF)，對環境以及實驗設備都有較高的要求，而Fmoc基團可以使用哌啶輕易地脫除，切割采用TFA，與Bo c法相t匕，具有反應條件溫和、合成效率高以及切割條件溫和等優點，逐漸取代了 Boc基團而成為目前固相多肽合成的首選α-氨基保護基。在本發明中使用經Fmoc保護的氨基酸。酰胺鍵形成促進劑例如但不限于H0AT (CAS No. 39968-33-7)、HOBT (1-Hydroxybenzotriazole)、6-Cl-H0Bt (6-Chloro-l-Hydroxy-lH-Benzotriazole)、或其組合。有機堿例如但不限于NMM、DIEA、三甲基吡啶、或其組合。本發明需要解決的技術問題是公開一種固相合成曲普瑞林的合成方法以及純化工藝，解決目前現有的技術存在的上述缺陷。本發明固相合成曲普瑞林的方法大體上包括如下步驟(I)以rink amide MBHA樹脂、rink amide am樹脂或knorr樹脂(這些樹脂是容易從商業途徑購得的)為起始原料，用固相合成的方法按照曲普瑞林氨基酸序列依次連接保護氨基酸，最后得到氨基酸側鏈被保護的多肽；(2)用切割液將氨基酸的側鏈保護基及多肽從樹脂上同時切割下來，用乙醚沉淀洗滌后，獲得粗品；(3)將粗品用醋酸水溶液溶解，依次經過離子交換柱和C18反相柱，凍干后，得到曲普瑞林(其為符合國家藥典標準的曲普瑞林原料藥產品)。
在本發明的上下文中，對脫帽反應或者肽偶聯反應進行反應程度檢測時，如未另外說明，均是采用如下方式的茚三酮檢測法進行1、脫帽反應程度檢測法每次用小試管取大約O. 5-lmg樹脂，用乙醇洗滌后，往試管中依次加入4滴緩沖液(20mg苯酚溶于50ml乙醇+25ml吡啶)，I滴Vc-乙醇溶液(4X 10_5mOl/L)，2滴茚三酮溶液(500mg茚三酮溶于IOml乙醇，50g/L)，用超聲波進行脫氨處理。然后在沸水浴中加熱5min，觀察樹脂及試管中溶液的顏色，進而判斷反應的進行程度；若顯藍色則反應完全，若不顯藍色則反應不完全需重新進行此步。2、肽偶聯反應程度檢測試劑(I) Ig茚三酮，溶于10_50ml無水乙醇；(2) 3. 2g苯酚，溶于l-20ml無水乙醇；(3)0. 4ml KCN儲液(O. OlM KCN)，溶于19. 6ml吡啶。3、肽偶聯反應程度檢測方法在待檢測的經肽偶聯反應的樹脂中，將上述三種試劑按1:1 1比例依次各滴加2滴，通過顏色觀察來判斷反應是否完全，此法靈敏度達到99%以上。若溶液及樹脂為黃色，則表明樹脂上無殘留一 NH2;若溶液及樹脂為紫色、淡藍色或藍色，則表明樹脂上仍有殘留的一 NH2，顏色越深，表明殘留的-NH2越多，肽的耦聯反應越不完全，需延長反應時間。按照本發明，所說的依次連接具有保護基團的氨基酸，獲得保護十肽樹脂，其間依次脫去Fmoc保護基團的方法,包括如下步驟Fmoc-Gly-樹脂的制備、Fmoc-Pro-Gly-樹脂的制備、Fmoc-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂的制備、Fmoc-Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂的制備、Fmoc-D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂的制備、Fmoc-Tyr (Tbu) -D-Trp (Boc)-Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂的制備、Fmoc-Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf)-Pro-Gly-樹脂的制備、Fmoc-Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf)-Pro-Gly-樹脂的制備、Fmoc-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂的制備、H-Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂的制備。在本發明方法的一個實施方案中，Fmoc-Gly-樹脂的制備包括以下步驟稱取一定量樹脂(O. 3-1. 2mmol/g)于反應柱中，然后加入二氯甲烷，振蕩并浸泡20-90分鐘，用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分別交替清洗兩次，抽濾以除去溶劑。加入脫帽試劑室溫下振蕩反應5-50分鐘，去掉氮端Fmoc保護基。抽濾除去溶劑后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，并抽濾除去溶劑。取少量樹脂利用茚三酮檢測法進行檢測，顯藍色。若不顯藍色，則需重新進行此步。稱取Fmoc-Gly-OH適量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU適量、Η0ΒΤ/Η0ΑΤ適量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入適量DIEA/NMM，攪拌混勻后，倒入反應器中，一定溫度下振蕩反應O. 5-2. 5小時。抽濾除去反應液，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。茚三酮檢測法進行檢測，顯黃色。若不是黃色，則需延長反應時間。上述DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU表示一種或者多種組合使用作為肽偶聯劑；HOBT/HOAT表示一種或者兩種作為酰胺鍵形成促進劑，即其中“/”如未另外特別說明，表示“和或者或”的關系。在上述反應中，所添加的保護氨基酸與樹脂的摩爾比為2. 5飛1，優選Γ5 :1。上述脫帽試劑可以為哌唳，可以溶于DMF中(濃度1:1_5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(濃度1:1-0. 5);上述反應溫度可以為5-70°C;上述肽偶聯反應加入試劑的摩爾數比例為保護氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU HOBT/HOAT DIE A/NMM=1 1-3 l-3 :2-6。在本發明方法的一個實施方案中，Fmoc-Pro-Gly-樹脂的制備包括以下步驟向上一肽偶聯反應步驟獲得的Fmoc保護氨基酸樹脂中加入脫帽試劑，在一定溫度下振蕩反應5-50分鐘，去掉氮端Fmoc保護基。抽濾除去溶劑后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，并抽濾除去溶劑。取少量樹脂利用茚三酮檢測法進行檢測，顯藍 色。若不顯藍色，則需重新進行此步。稱取Fmoc-Pro-OH適量、DCC/DI C/HATU/HCTU/HBTU適量、Η0ΒΤ/Η0ΑΤ適量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入適量DIEA/NMM，攪拌混勻后，倒入反應器中，一定溫度下振蕩反應O. 5-2. 5小時。抽濾除去反應液，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。茚三酮檢測法進行檢測，顯黃色。若不是黃色，則需延長反應時間。在上述反應中，所添加的保護氨基酸與樹脂的摩爾比為
2.5 5 :1，優選:Γ5 :1。上述脫帽試劑可以為哌唳，可以溶于DMF中(濃度1:1_5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(濃度1:1-0. 5);上述反應溫度可以為5-70°C;上述肽偶聯反應加入試劑的摩爾數比例為保護氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU H0BT/H0AT DIEA/NMM=1 :1_3 1-3 :2-6。在本發明方法的一個實施方案中,Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的制備包括以下步驟向上一肽偶聯反應步驟獲得的Fmoc保護氨基酸樹脂中加入脫帽試劑，在一定溫度下振蕩反應5-50分鐘，去掉氮端Fmoc保護基。抽濾除去溶劑后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，并抽濾除去溶劑。取少量樹脂利用茚三酮檢測法進行檢測，顯藍色。若不顯藍色，則需重新進行此步。稱取Fmoc-Arg (Pbf) -OH適量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU適量、Η0ΒΤ/Η0ΑΤ適量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入適量DIEA/NMM，攪拌混勻后，倒入反應器中，一定溫度下振蕩反應O. 5-2. 5小時。抽濾除去反應液，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。茚三酮檢測法進行檢測，顯黃色。若不是黃色，則需延長反應時間。在上述反應中，所添加的保護氨基酸與樹脂的摩爾比為2. 5 5 :1，優選:Γ5 :1。上述脫帽試劑可以為哌啶，可以溶于DMF中(濃度1:1_5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(濃度1:1-0. 5);上述反應溫度可以為5-70°C ;上述肽偶聯反應加入試劑的摩爾數比例為保護氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU H0BT/H0AT DIEA/NMM=I 1-3 1-3 :2-6。在本發明方法的一個實施方案中,Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的制備包括以下步驟向上一肽偶聯反應步驟獲得的Fmoc保護氨基酸樹脂中加入脫帽試劑，在一定溫度下振蕩反應5-50分鐘，去掉氮端Fmoc保護基。抽濾除去溶劑后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，并抽濾除去溶劑。取少量樹脂利用茚三酮檢測法進行檢測，顯藍色。若不顯藍色，則需重新進行此步。稱取Fmoc-Leu-OH適量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU適量、Η0ΒΤ/Η0ΑΤ適量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入適量DIEA/NMM，攪拌混勻后，倒入反應器中，一定溫度下振蕩反應O. 5-2. 5小時。抽濾除去反應液，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。茚三酮檢測法進行檢測，顯黃色。若不是黃色，則需延長反應時間。在上述反應中，所添加的保護氨基酸與樹脂的摩爾比為2. 5 5 :1，優選:Γ5 :1。上述脫帽試劑可以為哌啶，可以溶于DMF中(濃度1:1_5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(濃度1:1-0. 5);上述反應溫度可以為5-70°C ;上述肽偶聯反應加入試劑的摩爾數比例為保護氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU H0BT/H0AT DIEA/NMM=I 1-3 1-3 :2-6。在本發明方法的一個實施方案中，Fmoc-D-Trp(Boc) -Leu-Arg(Pbf) -Pro-Gly-樹脂的制備包括以下步驟向上一肽偶聯反應步驟獲得的Fmoc保護氨基酸樹脂中加入脫帽試劑，在一定溫度下振蕩反應5-50分鐘，去掉氮端Fmoc保護基。抽濾除去溶劑后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，并抽濾除去溶劑。取少量樹脂利用茚三 酮檢測法進行檢測，顯藍色。若不顯藍色，則需重新進行此步。稱取Fmoc-D-Trp (Boc)-OH適量、DCC/DI C/HATU/HCTU/HBTU適量、Η0ΒΤ/Η0ΑΤ適量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入適量DIEA/NMM，攪拌混勻后，倒入反應器中，一定溫度下振蕩反應O. 5-2. 5小時。抽濾除去反應液，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。茚三酮檢測法進行檢測，顯黃色。若不是黃色，則需延長反應時間。在上述反應中，所添加的保護氨基酸與樹脂的摩爾比為2. 5飛1，優選3飛1。上述脫帽試劑可以為哌啶，可以溶于DMF中(濃度1:1_5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(濃度1:1-0. 5);上述反應溫度可以為5-70°C;上述肽偶聯反應加入試劑的摩爾數比例為保護氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU =HOBT/HOAT DIEA/NMM=1 :1_3 :1_3 :2_6。在本發明方法的一個實施方案中，Fmoc-Tyr(Tbu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg(Pbf)-PiO-Gly-樹脂的制備包括以下步驟向上一肽偶聯反應步驟獲得的Fmoc保護氨基酸樹脂中加入脫帽試劑，在一定溫度下振蕩反應5-50分鐘，去掉氮端Fmoc保護基。抽濾除去溶劑后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，并抽濾除去溶劑。取少量樹脂利用茚三酮檢測法進行檢測，顯藍色。若不顯藍色，則需重新進行此步。稱取Fmoc-Tyr (Tbu) -OH 適量、DCC/DI C/HATU/HCTU/HBTU 適量、Η0ΒΤ/Η0ΑΤ 適量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入適量DIEA/NMM，攪拌混勻后，倒入反應器中，一定溫度下振蕩反應O. 5-2. 5小時。抽濾除去反應液，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。茚三酮檢測法進行檢測，顯黃色。若不是黃色，則需延長反應時間。在上述反應中，所添加的保護氨基酸與樹脂的摩爾比為2. 5飛1，優選3 5 :1。上述脫帽試劑可以為哌啶，可以溶于DMF中(濃度1:1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(濃度1:1-0. 5);上述反應溫度可以為5-70°C ;上述肽偶聯反應加入試劑的摩爾數比例為保護氨基酸DCC/DI C/HATU/HCTU/HBTU H0BT/H OAT DIEA/NMM=1 :1_3 :1_3 :2_6。在本發明方法的一個實施方案中，Fmoc-Ser(tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂的制備包括以下步驟向上一肽偶聯反應步驟獲得的Fmoc保護氨基酸樹脂中加入脫帽試劑，在一定溫度下振蕩反應5-50分鐘，去掉氮端Fmoc保護基。抽濾除去溶劑后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，并抽濾除去溶齊 。取少量樹脂利用茚三酮檢測法進行檢測，顯藍色。若不顯藍色，則需重新進行此步。稱取 Fmoc-Ser (Tbu) -OH 適量、DCC/DI C/HATU/HCTU/HBTU 適量、Η0ΒΤ/Η0 AT 適量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入適量DIEA/NMM，攪拌混勻后，倒入反應器中，一定溫度下振蕩反應O. 5-2. 5小時。抽濾除去反應液，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。茚三酮檢測法進行檢測，顯黃色。若不是黃色，則需延長反應時間。在上述反應中，所添加的保護氨基酸與樹脂的摩爾比為2. 5飛1，優選3飛1。上述脫帽試劑可以為哌啶，可以溶于DMF中(濃度1:1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(濃度1:1-0. 5);上述反應溫度可以為5-70°C ;上述肽偶聯反應加入試劑的摩爾數比例為保護氨基酸DCC/DI C/HATU/HCTU/HBTU Η 0ΒΤ/Η0ΑΤ DIEA/NMM=1 :1_3 :1_3 :2_6。在本發明方法的一個實施方案中，Fmoc-Trp(Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的制備包括以下步驟向上一肽偶聯反應步驟獲得的Fmoc保護氨基酸樹脂中加入脫帽試劑，在一定溫度下振蕩反應5-50分鐘，去掉氮端Fmoc保護 基。抽濾除去溶劑后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，并抽濾除去溶劑。取少量樹脂利用茚三酮檢測法進行檢測，顯藍色。若不顯藍色，則需重新進行此步。稱取 Fmoc-Trp (Boc) -OH 適量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU 適量、Η0ΒΤ/Η0ΑΤ 適量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入適量DIEA/NMM，攪拌混勻后，倒入反應器中，一定溫度下振蕩反應O. 5-2. 5小時。抽濾除去反應液，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。茚三酮檢測法進行檢測，顯黃色。若不是黃色，則需延長反應時間。在上述反應中，所添加的保護氨基酸與樹脂的摩爾比為2. 5飛1，優選:Γ5 :1。上述脫帽試劑可以為哌啶，可以溶于DMF中(濃度1:1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(濃度1:1-0. 5);上述反應溫度可以為5-70°C ;上述肽偶聯反應加入試劑的摩爾數比例為保護氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBT U H0BT/H0AT DIEA/NMM=1 :1_3 :1_3 :2_6。在本發明方法的一個實施方案中，Fmoc-His(Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu)-D-Tr P (Boc)-Leu-Arg (Pbf)-Pro-Gly-樹脂的制備包括以下步驟向上一肽偶聯反應步驟獲得的Fmoc保護氨基酸樹脂中加入脫帽試劑，在一定溫度下振蕩反應5-50分鐘，去掉氮端F moc保護基。抽濾除去溶劑后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，并抽濾除去溶劑。取少量樹脂利用茚三酮檢測法進行檢測，顯藍色。若不顯藍色，則需重新進行此步。稱取 Fmoc-His (Trt) -OH 適量、DCC/DI C/HATU/HCTU/HBTU 適量、Η0ΒΤ/Η0ΑΤ 適量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入適量DIEA/NMM，攪拌混勻后，倒入反應器中，一定溫度下振蕩反應O. 5-2. 5小時。抽濾除去反應液，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。茚三酮檢測法進行檢測，顯黃色。若不是黃色，則需延長反應時間。在上述反應中，所添加的保護氨基酸與樹脂的摩爾比為2. 5飛1，優選:Γ5 :1。上述脫帽試劑可以為哌唳，可以溶于DMF中(濃度1:1_5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(濃度1:1-0. 5);上述反應溫度可以為5-70°C ;上述肽偶聯反應加入試劑的摩爾數比例為保護氨基酸DCC/DIC/HATU/HC TU/HBTU H0BT/H0AT DIEA/NMM=1 :1_3 :1_3 :2_6。在本發明方法的一個實施方案中，H-Pyr-His(Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu)-D-T rp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂的制備包括以下步驟向上一肽偶聯反應步驟獲得的Fmoc保護氨基酸樹脂中加入脫帽試劑，在一定溫度下振蕩反應5-50分鐘，去掉氮端Fmoc保護基。抽濾除去溶劑后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，并抽濾除去溶劑。取少量樹脂利用茚三酮檢測法進行檢測，顯藍色。若不顯藍色，則需重新進行此步。稱取H-Pyr-OH適量、DCC/DI C/HATU/HCTU/HBTU適量、Η0ΒΤ/Η0ΑΤ適量，加入二甲基甲酰胺待其溶解后再加入適量DIEA/NMM，攪拌混勻后，倒入反應器中，一定溫度下振蕩反應O. 5-2. 5小時。抽濾除去反應液，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷交替清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。茚三酮檢測法進行檢測，顯黃色。若不是黃色，則需延長反應時間。在上述反應中，所添加的保護氨基酸與樹脂的摩爾比為2. 5 5 :1，優選:Γ5:1。上述脫帽試劑可以為哌唳，可以溶于DMF中(濃度1:1-5)或者溶于二氯甲烷(DCM)中(濃度1:1-0. 5);上述反應溫度可以為5-70°C ;上述肽偶聯反應加入試劑的摩爾數比例為保護氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBT U H0BT/H0AT DIEA/NMM=1 :1_3 :1_3 :2_6。在本發明方法的一個實施方案中，用切割液將氨基酸的側鏈保護基及十肽從樹脂上同時切割下來包括如下步驟將上述步驟中獲得的H-Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu)-Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂加入預冷的切割液(零下 20°C至零上10°C )，在一定溫度下反應1-10小時(例如1-5小時，例如約3小時)。減壓除去切割液，加入大量乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗滌數次(例如4-10次)，真空干燥，獲得曲普瑞林粗品。所述切割液中包含TFA、TIS、EDT、H20。在一個實施方案中，所述切割液中四種組 分的體積比為TFA:TIS:EDT:H20=50-98:1-10:1-10:0. 1-5。在一個實施方案中，所述切割液中四種組分的體積比為TFA: TIS:EDT:H20=90-98:1-5:1-5:0. 5-2。在一個實施方案中，所述切割液中四種組分的體積比為TFA: TIS: EDT: H20=95:2:2:1。在本發明方法的一個實施方案中，對獲得的曲普瑞林粗品進行純化的過程包括如下步驟將切肽步驟中得到的干燥的曲普瑞林粗品用醋酸水溶液溶解，過濾，濾液經過離子交換柱，收集流出主峰,然后再經過C18 (例如5 μ m)反相柱純化，收集主峰，合并合格溶液，凍干。獲得曲普瑞林精制品，可作為曲普瑞林的原料藥。純化的工藝細節如本發明上、下文所述。在本發明中，測定氨基酸與樹脂之間的偶聯率可以采用重量法和比色法兩種方法測定。特別是，如未另外說明，本發明上下文中測定氨基酸(特別是第一個氨基酸甘氨酸)與樹脂之間的偶聯率采用如下步驟所示比色法進行采用比色法的根據是脫保護的氨基酸暴露出來的氨基基團可以和專門的檢測試劑發生顏色反應，這個反應是定量的，顏色的深淺和氨基基團的數量成正比。顏色的深淺可以用分光光度計測量，據此可以計算出來偶聯率的數值。準確稱取2-4毫克的連接了第一個氨基酸的樹脂，放入EP管中，加入2-3滴冰乙酸和I毫升甲醇，洗滌后用I毫升甲醇洗滌3次。然后凍干，準確稱重。加入偶聯率檢驗專用試劑250微升，同時制空白。沸水浴反應5min，其間振蕩2-3次。取出來后立即加入2. 8毫升乙醇至總體積為3毫升。充分搖勻，然后用乙醇掃基線，在570nm處測定樣品和空白的吸光度。按照下列公式計算(-NH2mmoI/g)=[(樣品-空白)X 體積(ml) XlO6]/ (15000 X 樣品重量)偶聯率=l-[(-NH2mmol/g)/(1000X理論交換當量)]在本發明中，可以通過測定曲普瑞林的氨基酸光學純來考察產品的品質。曲普瑞林肽鏈中的十個肽中，有兩個Trp氨基酸，其中一個是D-構型，而另一個Trp以及其它8個氨基酸均為L-型。在本發明中，如未另外說明，曲普瑞林氨基酸光學純檢測方法如下對經純化的曲普瑞林水解后，經 CAT GmbH&Co. Chromatographie Und A nalysentechnik KG 光學純檢測各手性氨基酸的光學純。測定本發明實施例1所得曲普瑞林精制品，結果顯示除Trp外，其它8個L-氨基酸光學純度均大于99. 5%，這8個氨基酸的D-型對映體的比例均小于O. 2%(D-Pro和D-His在O. 14^0. 18%之間，其它6個氨基酸的D-型對映體的比例均小于O. 13%)% ;并且對于精氨酸而言，其中D-型對映體的比例小于O. 1%。本發明設計的技術路線具有以下特點操作簡單 化，適合大規模生產，原料得到方便，收率高，成本低，生產周期短，質量穩定，所得樣品符合國家藥典中規定的曲普瑞林原料藥的各項檢測標準。極具有市場競爭力。在本發明中，使用到的一些試劑或原材料，它們的名稱、來源等信息列舉如下實施例與前述過程中所采用的原料列表如下

原料供應商純度(5;)
Fmoc-D-trp(boc)-OH百事興科技98%
Fmoc-L-Arg(pbf)-OH吉爾生化98%
F moc-L-trp(boc)-OH吉爾生化98%
Pmoc-L-Gly-OH吉爾生化98%
Fmoc-L-Leu-OH吉爾生化98%
Fmoc-L-Pro-OH吉爾生化98%
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH吉爾生化98%
Fmoc-L-Tyr{tBu)-OH吉爾生化98%
Fmoc-L-His(trt)-OH吉爾生化98%
H-Pyr-OH吉爾生化98%
Rink-amidMBHA resin(0.84mmol/g) 吉爾生化未檢測
HBTU(苯并三氮唑四甲基吉爾生化98%
脲六氟嶙酸鹽)
ΗΟΒΤ(1-羥基苯并三唑)吉爾生化98'Λ
DIEA上海達瑞精細化學品有限公司 98%
茚三酮天津市大茂化學試劑廠分析純
吡啶成都市科龍化工試劑廠分析純
醋酐上海晶純試劑有限公司分析純
DCM無錫化工試劑廠工業級

權利要求
1.固相合成曲普瑞林的方法，其包括以下步驟(1)向經浸泡處理的固相合成用樹脂中加入溶解于溶劑中的Fmoc-Gly-OH、肽偶聯劑、 酰胺鍵形成促進劑和有機堿，使物料進行偶聯反應，以形成Fmoc-Gly-樹脂；(2)向上一步驟所得的肽偶合樹脂中加入脫帽試劑，使物料進行反應以脫帽；接著加入溶解于溶劑中的保護氨基酸Fmoc-Ρ -ΟΗ、肽偶聯劑、酰胺鍵形成促進劑和有機堿，使物料進行偶聯反應，以形成Fmoc-Pro-Gly-樹脂；(3)循環重復步驟(2)，并在每一循環操作的偶聯反應中依次使用下列氨基酸以替換保護氨基酸 Fmoc-Pro-OH Fmoc-L-Arg (pbf) -OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-D-trp (bo c) -OH、 Fmoc-L-Tyr(tBu)-0H>Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L_trp(boc)-0H>Fmoc-L-His(trt)-OH和 H-Pyr-OH,以最終形成十妝樹脂H-Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (B oc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂；(4)向步驟(3)所得十肽樹脂中加入切割液進行切肽反應，以使十肽從樹脂上切割下來，得到曲普瑞林。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于，其中步驟(I)中所述樹脂選自rink amide MBHA樹脂、rink amide am樹脂、knorr樹脂、或其組合； 所述肽偶聯劑選自DCC、DIC、HATU, HBTU, HCTU, TATU, TBTU、或其組合；所述酰胺鍵形成促進劑選自H0AT、H0BT、6-Cl-H0Bt、或其組合；所述有機堿選自NMM、DIEA、三甲基吡啶、或其組合；用于進行偶聯反應的所述溶劑選自二氯甲烷、二甲基甲酰胺；所述樹脂浸泡處理是照如下方式進行的取樹脂置于反應器中，加入溶劑振蕩并充分浸泡，抽除溶劑；所述樹脂在經浸泡處理后、進行偶聯反應之前，還包括對該樹脂進行脫帽處理的步驟；所述樹脂與所述Fmoc-Gly-OH的投料比為1:2. 5 5 (摩爾比)；進一步地，在后續的各個肽偶聯反應中，添加的該步驟的氨基酸(Fmoc保護的或未保護的)的量為步驟(I)中樹脂量的2 7倍(摩爾倍)；所述Fmoc-Gly-OH、肽偶聯劑、酰胺鍵形成促進劑和有機堿四者的投料比為1:1_3 1-3 :2-6(摩爾比)；和/或步驟(I)中，還包括在完成偶聯反應后對獲得的Fmoc-Gly-樹脂進行清洗的操作，所述清洗是使用選自下列的溶劑清洗處理廣3次、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DM F、或其組合， 特別是使用DMF、甲醇、二氯甲烷，三者交替清洗2次。
3.根據權利要求1的方法，其特征在于，其中步驟(2)中所述脫帽試劑選自哌啶、二乙胺、三乙胺、三氟乙酸。所述脫帽反應是在選自下列的溶劑中進行的二氯甲烷、二甲基甲酰胺等，優選二甲基甲酰胺；所述脫帽反應是在15 25%的哌啶/ 二甲基甲酰胺溶液中進行的，優選是在20%的哌啶 /二甲基甲酰胺溶液中進行的；步驟(2)中，還包括在完成脫帽反應后對獲得的Gly-樹脂進行清洗的操作，所述清洗是使用選自下列的溶劑清洗處理廣3次、甲醇、乙醇、氯仿、三氟乙酸、DMF、或其組合，特別是使用DMF、甲醇、二氯甲烷，三者交替清洗2次；和/或所述偶聯反應是參照步驟(I)中的偶聯反應進行的。
4.根據權利要求1的方法，其特征在于，其中步驟(3)中第一循環操作使用Fmoc-L-Arg(pbf)-OH作為保護氨基酸，得到 H-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂；第二循環操作使用Fmoc-L-Leu-OH作為保護氨基酸，得到 H-Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂；第三循環操作使用Fmoc-D-trp (boc) -OH作為保護氨基酸，得到H-D-Trp (Boc) -Le u-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂；第四循環操作使用Fmoc-L-Tyr (tBu) -OH作為保護氨基酸，得到H-Tyr (tBu) -D-Tr P (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂；第五循環操作使用Fmoc-L-Ser (tBu) -OH作為保護氨基酸,得到H-Ser (tBu) -Tyyr (t B u) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂；第六循環操作使用Fmoc-L-trp (boc) -OH作為保護氨基酸,得到H-Trp (Boc) -Ser (t Bu )-Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂；第七循環操作使用Fmoc-L-His (trt) -OH作為保護氨基酸,得到H-His (Trt) -Trp (Bo c )-Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂；第八循環操作使用H-Pyr-OH作為保護氨基酸,得到H-Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (t Bu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-樹脂。
5.根據權利要求1的方法，其特征在于，步驟(I)中進行偶聯反應時，酰胺鍵形成促進劑是HOAT和HOBT兩者組合使用；優選地，HOAT和HOBT 二者的用量比為1:1-4(摩爾比)，優選1:2_3(摩爾比)；和/或步驟(2)和步驟(3)中進行偶聯反應時，使用的酰胺鍵形成促進劑是H0AT。
6.根據權利要求1的方法，其中步驟(3)中，在第一循環操作使用Fmoc-L-Arg(pb f) -OH作為保護氨基酸進行偶聯反應的過程中，與Fmoc-L-Arg (pbf) -OH 一起加入適量乳酸進行反應；在一個實施方案中，所述Fmoc-L-Arg(pbf)-OH與乳酸的摩爾比為1:0. 1-0. 5，優選 I 0. 2-0. 3。
7.根據權利要求1的方法，其中步驟(I)、步驟(2)、和步驟(3)中的所述偶聯反應是在 10 30° C溫度下進行的，反應時間為l(T200min，例如3(T90min，例如約60min。
8.根據權利要求1的方法，其特征在于，其中步驟(4)中所述切割液中包含TFA、TIS、EDT、H20 ;在一個實施方案中，所述切割液中四種組分的體積比為TFA:TIS:EDT:H20=50-98:1-10:1-10:0. 1-5 ；所述切肽反應是在室溫進行的，優選是在20±5° C下進行的；反應時間為1-10小時； 所述切肽反應是將氨基酸的側鏈保護基及十肽從樹脂上同時切割下來從而獲得十肽曲普瑞林；和/或在完成切肽反應后，除去切割液(例如通過減壓的方式)，然后加入乙醚進行沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗滌數次，真空干燥，獲得曲普瑞林。
9.根據權利要求1的方法，其特征在于，在經步驟(4)切肽反應獲得曲普瑞林干燥品后，還進一步包括對該曲普瑞林干燥品進行純化的步驟；所述純化步驟是照如下方式進行的將曲普瑞林粗品用醋酸水溶液溶解，過濾，濾液過離子交換柱并用該醋酸水溶液洗脫，收集流出主峰,然后再經過C18柱純化，收集主峰流出液，冷凍干燥，即得曲普瑞林精制品；所述過離子交換柱并用該醋酸水溶液洗脫，所述的醋酸水溶液濃度為2%-20%(v/v)； 所說的反向C18柱純化所用流動相為含O. 3%乙酸和18%乙腈的水溶液。
10.一種曲普瑞林，其特征在于其經氨基酸光學純檢測，除了 Try以外，其它7個氨基酸的D-型對映體比例相對于其相應氨基酸酸而言均小于O. 2% ；其經氨基酸光學純檢測，除了 Try以外，其它7個氨基酸的D-型對映體比例相對于其相應氨基酸酸而言均小于O. 15% ；其經氨基酸光學純檢測，其中D-Arg相對于全部精氨酸而言均小于O. 2%，優選小于 O. 15 ；其中乙腈含量低于O. 03% ;和/或其是通過權利要求1-9任一項所述方法制備得到的。
全文摘要
本發明涉及一種優良的曲普瑞林及其固相合成制備方法。本發明曲普瑞林氨基酸光學純度高，殘余溶劑量少，其制法包括步驟向樹脂中加入Fmoc-Gly-OH、肽偶聯劑、酰胺鍵形成促進劑和有機堿進行偶聯反應，形成Fmoc-Gly-樹脂；加入脫帽試劑進行反應；接著加入保護氨基酸Fmoc-Pro-OH、肽偶聯劑、酰胺鍵形成促進劑和有機堿，進行偶聯反應形成Fmoc-Pro-Gly-樹脂；循環重復步驟(2)，并在每一循環操作的偶聯反應中依次使用曲另外9個氨基酸以替換Fmoc-Pro-OH；向所得十肽樹脂中加入切割液進行切肽，使十肽切離樹脂，任選地對曲普瑞林進行純化。本發明可得到符合國家藥典標準的曲普瑞林原料藥產品。生產工藝穩定，原料來源方便，收率高，產品質量穩定，生產成本低，操作簡單，適合大生產。
文檔編號C07K7/23GK103012565SQ20131001488
公開日2013年4月3日 申請日期2013年1月15日 優先權日2013年1月15日
發明者趙東明, 張明義, 張 林, 董國明, 王虎 申請人:成都天臺山制藥有限公司