專利名稱：超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法
技術領域：
本發明屬于病毒學和免疫學的領域，是利用分離到的超強毒制備傳染性法氏囊高免蛋黃抗體，尤其涉及一種超強毒傳染性法氏囊病毒(vvIBDV)高免蛋黃抗體制備方法。
背景技術：
傳染性法氏囊病毒是由雙鏈RNA病毒科的傳染性法氏囊病病毒(IBDV)所引起的一種雞的急性暴發性傳染病。表現為法氏囊淋巴組織和淋巴細胞壞死，發病率及死亡率均高。而高免蛋黃液是防治IBDV的有效措施。(王志杰，雞傳染性法氏囊病高免卵黃抗體液的研制，西昌農業高等專科學校學報2004年，18卷，2期51-54)針對目前發病情況，大多是由于超超強毒株感染引起的，而變異株的抗原性和經典疫苗株間有差異，主要引起免疫抑制。因此，傳統的疫苗不足以對超超強毒株造成的感染提供很好的保護(蔣靜，孫建和等傳染性法氏囊病毒上海超超強毒株VP2-4-3基因真核表達質粒的構建與表達，華中農業大學學報，2004年4月23卷第2期:179-182)，因此很多養殖場免疫過兩次傳染性法氏囊疫苗，后又發生傳染性法氏囊病，這與我們從發病雞場分離到的超超強毒株的情況相吻合，證明了超超強毒株能引起雞群免疫抑制，大量死亡(張存，范坤曉等，雞傳染性法氏囊病超超強毒的感染與防制，畜牧與獸醫1996，28 (3) =130-132 ;韋平，龍進學等，傳染性法氏囊病病毒快速檢測與分型技術的研究，中國獸醫學報，2004，24 (4):313-316)，而高免蛋黃液是防治其的有效措施，雖然目前世界不同地區也有過研究傳染性法氏囊病的高免蛋黃抗體的報道。(王志杰，雞傳染性法氏囊病高免卵黃抗體液的研制，西昌農業高等專科學校學報2004年，18卷，2期51-54 ;鄭素琴，李翠云等。雞法氏囊病和法氏囊-新城疫二聯高免卵黃液制備與應用研究吉林畜牧獸醫3-7 ;俞炳梅。法氏囊高免卵黃抗體在制作和使用中應注意的幾個問題，山東家禽1998年，5期:16)。但由于傳染性法氏囊病毒超強毒株的出現造成疫苗控制不力，發病急，死亡率高等情況，而技術相對落后的監測鑒定方法以及制備高免蛋黃液的方法對防治超 超強毒株傳染性法氏囊病造成很大的困難，而且山西省處于高原多山地帶，養雞戶分散，給采集病料造成一定的困難，因此分離鑒定工作繁瑣復雜，工作量較大，難于分離。現有技術生產高免蛋黃抗體主要是用從發病養殖場中分離到的傳染性法氏囊病毒經過滅活，接種產蛋雞后取蛋黃來制作，在制作過程中并沒有確定所分離到病原的致病力。這種種傳統方法不能保證制作出來的高免蛋黃抗體的通用性，只能針對單個的養殖場。不能確定其他養殖場的雞群在發病期的治療效果。

發明內容
針對上述問題，本發明實施例的目的在于提供一種超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法及應用。本發明實施例是這樣實現的，一種超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法，其特征在于，采集不同地區、不同雞場疑似傳染性法氏囊病雞病料，進行病原的分離培養、設計一對引物擴增傳染性法氏囊病毒vp2基因序列、由于vp2屬于其特征性保守序列，能擴增出這段序列即能對其鑒定，利用擴增出來的產物經過電泳、觀察，確保擴增出與設計的目的條帶大小相符的條帶，對含有擴增產物的瓊脂糖凝膠回收，測序，同國際和國內已發表的已知序列比對，即可對其分型，分為超強毒毒株、強毒毒株、普通毒株等，最終確定本次分離到的傳染性法氏囊病毒毒株屬于超強毒株。進一步，該超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法具體包括病料采集處理及病毒純化繁殖，vvIBDV-PCR鑒定，步驟如下:病料的采集處理:從不同地區疑似法氏囊病雞中采集法氏囊病料；主要選擇法氏囊外觀水腫呈膠凍樣、出血呈紫葡萄狀。將法氏囊反復凍融三次，充分釋放病毒粒子，增加病毒粒子含量，無菌研磨，再加等體積加入4000IU青霉素、2000IU鏈霉素/ml的雙抗，放入-20°C保存，備用；用瓊脂擴散試驗檢測病毒效價，被檢病毒與標準法氏囊陽性血清出現明顯的沉淀線，證明法氏囊病毒的存在；病毒純化繁殖:法氏囊病毒乳液在雞胚中繁殖:購買60枚PFS雞蛋，分三批孵育，每批20枚。將第一批20枚雞蛋放入溫箱中，每日翻蛋2-3次，注意保持濕度。4日后放入第二批，再4日后放入第三批。當第一批雞胚10日齡時，雞胚絨毛膜接種法氏囊病毒，0.2ml/枚，接種完畢用熔化石蠟封閉兩孔，逐日觀察，24h內死亡胚棄去，48h死胚保留，120h死活胚從孵化器中取出，放入4°C冰箱靜置，收獲內死、活雞胚絨毛膜和尿囊液；采用瓊脂擴散試驗方式測法氏囊病毒效價，絨毛膜和尿囊液與標準法氏囊陽性血清都出現明顯的沉淀線，效價為21。將胚體和絨毛膜無菌取出加PBS緩沖液充分研磨，反復凍融3次后，進行第二次接毒，方法同上，絨毛膜和尿囊液與標準法氏囊陽性血清都出現明顯的沉淀線，病毒效價為23 ;同樣進行第三次接病毒，絨毛膜和尿囊液與標準法氏囊陽性血清都出現明顯的沉淀線，病毒效價為26;進一步，該超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法包括wIBDV-PCR鑒定，步驟如下:引物的設計與合成:根據genbank登錄IBDV vp2基因參考序列和表達載質粒PFastBacHTA表達閱讀框設計vp2基因擴增引物:Pl:5/ -CGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACC-3'；P2:5/ ~CCCTCGAGCACCGGCACAGCTATCCTCCTTAT~3/ ；兩頭分別引入EcoRI和XhoI酶切位點；病毒RNA的提取:用Trizol法提取RNA，取250ul病毒液于一普通的1.5mlEP管中，加入750ulTrizol，震 蕩混勻，靜置5min ;加入150ul氯仿，震蕩混勻，4°C離心，12000r/min, 5min ;取上清加入450ul異丙醇,顛倒混勻,4°C離心，12000r/min, 12min ;棄液體,加Iml 75% DEPC乙醇洗漆，4°C離心，12000r/min, 5min ;棄液體,虹吸,干燥沉淀。加9ulDEPC水、，50°C水浴lOmin，開始反轉錄。反轉錄步驟為:10ulRNA、lul隨機引物和4ul dNTP混勻，65°C水浴8min后迅速冰浴5min。再加入4ulBuffer、Iul反轉錄酶和lullul RNaseinhibitor，37°C水浴2_3h ;以反轉錄產物為模板，，Pl和P2為引物進行PCR反應。PCR反應體系:5XStar Buffer5ul, dNTP2ul，4ul 模板，Pl 和 P2 各 0.5ul, Primestar0.25ul,ddH2012.75ul ;PCR 反應條件:98 °C 預變性 IOs ;98°C 變性 10s，55 °C 退火 15s，72 °C 延伸100s共30個循環，72 °C終延伸IOmin ;凝膠電泳以鑒定分子量大小；將PCR產物按照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒說明書進行回收；取4.5ul回收產物加入5ul Sollution I和
0.5ulVenter，混勻，4°C過夜。將連接產物轉化入E.coli DH5 α感受態細菌，涂布在用LB配制的1.5%瓊脂平皿上，含氨芐青霉素100mg/L，37°C培養14h ;挑單菌落接種入含氨芐青霉素100mg/L的LB()，振搖培養12h ;按Plasmid Mini kit I(IOO)說明書提取質粒。質粒用EcoR I和Xho I雙酶切鑒定，陽性重組質粒命名為T-VP2 ；分離株VP2序列分析及推導氨基酸序列分析:測序結果表明，分離株VP2基因核苷酸長度為1389bp，推導氨基酸序列含有347個氨基酸，采用DNAstar軟件對測序結果進行分析，對照IBDV經典強、弱毒株及超超強毒株高變區氨基酸序列分析分離株VP2分子特征；分離株符合強度株的特征:分離株VP2第328-334位氨基酸序列為S-W-S-A-S-G-S，這與IBDV經典超強毒株VP2七肽區序列相同，超超強毒分子特征為222 A、256 1,294 I和299 S本分離株符合256 1,294 I和299 S三個特征，證明本毒株為vvIBDV經典超強毒株。進一步，該超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法具體包括超強毒傳染性法氏囊病毒(vvIBDV)滅活苗的制備，步驟為:取分離鑒定的vvIBDV絨毛膜和尿囊液加4%吐溫為水相；白油加司盤再加硬脂酸招為油相，水相與油相按一定比例進行乳化即為vvIBDV滅活苗。進一步，該超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法具體包括超強毒傳染性法氏囊病毒(vvIBDV)高免蛋黃抗體制備，步驟為:選擇產蛋20%左右的健康雞500只；用市場上賣的法氏囊弱毒苗基礎免疫；基礎免疫10天后，用我們制備的WlBDV滅活苗免疫，1ml% /只，頸部皮下注射；間隔15天后，用我們制備的vvIBDV滅活苗免疫，2ml% /只，頸部皮下注射；免疫30天后采血檢測IBD抗體，用瓊脂擴散試驗檢測IBD抗體，達到27時留蛋，即為vvIBDV高免蛋；vvIBDV高免蛋洗干凈，然后放入萬分之一的高錳酸鉀水里泡5-10分鐘，取出放入消毒好的容器里，將蛋清與蛋黃分離，蛋黃放入無菌容器里攪拌1分鐘，倒入500ml的瓶子里，冰箱凍存；用于法氏囊病毒感染的病雞；30日齡以下的雞，1-1.5ml/只；30日齡以上的雞1.5-2.0ml/只。胸部肌肉或皮下注射。進一步，采用高免技術，制備高免蛋黃抗體，接種于傳染性法氏囊病的雞群，使雞群在短時間內產生傳染性法氏病病毒抗體，在24小內中和體內的法氏囊病毒，達到治療的目的。本發明提供的超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法，采用高免技術，制備高免蛋黃抗體，接種于傳染性法氏囊病的雞群，使雞群在短時間內產生傳染性法氏病病毒抗體，在24小內中和體內的法氏囊病毒，達到治療的目的。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
采集不同地區、不同雞場疑擬傳染性法氏囊病雞病料，進行病原的分離培養、設計引物擴增vp2基因序列、以及鑒定、分型、回收、測序等基因工程的方法和技術，將擴增產物與國際上超強毒株固有特征進行比對，確定其屬于超超強毒株。利用我們分離的超強毒傳染性法氏囊病毒株，研制高免蛋黃抗體治療劑，來治療雞群感染超強毒傳染性法氏囊病。傳染性法氏囊病在我國被發現以后一直不停的變異，專家學者研究其發展趨勢是毒力變弱，但在最近幾年突然出現超超強毒株，導致養禽業的失敗和大批量雞的死亡，雖然大多數養殖戶都免疫過傳染性法氏囊病疫苗兩次，但這些疫苗產生的抗體不能抵抗超強毒株的感染，造成大量養雞場雞群的發病死亡，而本發明應用法氏囊超強毒株制作的高免蛋黃抗體能夠治療雞群感染超強毒傳染性法氏囊病。本發明實施例提供的超強毒傳染性法氏囊病毒(vvIBDV)高免蛋黃抗體制備方法，具體包括如下步驟:1.1、病料采集處理及病毒純化繁殖。1.1.1.病料的采集處理從全省不同地區疑似法氏囊病雞中采集法氏囊病料。主要選擇法氏囊外觀水腫呈膠凍樣、出血呈紫葡萄狀。將法氏囊反復凍融三次，充分釋放病毒粒子，增加病毒粒子含量，無菌研磨，再加等體積加入4000IU青霉素、2000IU鏈霉素/ml的雙抗，放入_20°C保存，備用。用瓊脂擴散試驗檢測病毒效價，被檢病毒與標準法氏囊陽性血清出現明顯的沉淀線，基本證明法氏囊病毒的存在。1.1.2、病毒純化繁殖法氏囊病毒乳液在雞胚中繁殖。購買60枚PFS雞蛋，分三批孵育，每批20枚。將第一批20枚雞蛋放入溫箱中，每日翻蛋2-3次，注意保持濕度。4日后放入第二批，再4日后放入第三批。當第一批雞胚10日齡時，雞胚絨毛膜接種法氏囊病毒，0.2ml/枚，接種完畢用熔化石蠟封閉兩孔，逐日觀察，24h內死亡胚棄去，48h死胚保留，120h死活胚從孵化器中取出，放入4°C冰箱靜置，收獲內死、活雞胚絨毛膜和尿囊液；采用瓊脂擴散試驗方式測法氏囊病毒效價，絨毛膜和尿囊液與標準法氏囊陽性血清都出現明顯的沉淀線，效價為21。將胚體和絨毛膜無菌取出加PBS緩沖液充分研磨，反復凍融3次后，進行第二次接毒，方法同上，絨毛膜和尿囊液與標準法氏囊陽性血清都出現明顯的沉淀線，病毒效價為23。同樣進行第三次接病毒，絨毛膜和尿囊液與標準法氏囊陽性血清都出現明顯的沉淀線，病毒效價為26。1.2vvIBDV-PCR 鑒定:1.2.1引物的設計與合成根據genbank登錄IBDV vp2基因參考序列和表達載質粒pFastBacHTA表達閱讀框設計vp2基因擴增引物:Pl:5/ ~CGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACC~3/ ；P2:5/ -CCCTCGAGCACCGGCACAGCTATCCTCCTTAT-3';兩頭分別弓I入 EcoRI 和 XhoI酶切位點。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2病毒RNA的提取用Trizol法提取RNA，具體步驟為:取250ul病毒液于一普通的1.5mlEP管中，加入750ulTrizol,震蕩混勻，靜置5min。加入150ul氯仿，震蕩混勻，4°C離心，12000r/min,5min。取上清加入450ul異丙醇,顛倒混勻,4°C離心，12000r/min, 12min。棄液體，力口lml75% DEPC乙醇洗漆,4°C離心，12000r/min, 5min。棄液體,虹吸,干燥沉淀。加9ulDEPC水、，50°C水浴I Omin，開始反轉錄。反轉錄步驟為:10ulRNA、lul隨機引物和4uldNTP混勻，65 °C水浴8min后迅速冰浴5min。再加入4ulBuffer、Iul反轉錄酶和IullulRNaseinhibitor，37°C水浴2-3h。以反轉錄產物為模板，，Pl和P2為引物進行PCR反應。PCR反應體系:5XStar Buffer 5ul, dNTP 2ul，4ul 模板，Pl 和 P2 各 0.5ul, Primestar 0.25ul,ddH20 12.75ul。PCR 反應條件:98 °C 預變性 IOs ;98°C 變性 10s，55 °C 退火 15s，72。。延伸100s共30個循環，72°C終延伸lOmin。凝膠電泳以鑒定分子量大小。將PCR產物按照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒說明書進行回收。取4.5ul回收產物加入5ul Sollution I和0.5ulVenter，混勻，4°C過夜。將連接產物轉化入E.coliDH5 α感受態細菌，涂布在用LB配制的1.5%瓊脂平皿上(含氨芐青霉素100mg/L)，37°C培養14h。挑單菌落接種入LB (含氨節青霉素100mg/L),振搖培養12h。按Plasmid Mini kit I (100)說明書提取質粒。質粒用EcoR I和Xho I雙酶切鑒定，陽性重組質粒命名為T-VP2。測序結果見序列表。1.2.3分離株VP2序列分析及推導氨基酸序列分析測序結果表明，分離株VP2基因核苷酸長度為1389bp，推導氨基酸序列含有347個氨基酸，采用DNAstar軟件對測序結果進行分析，對照IBDV經典強、弱毒株及超超強毒株聞變區氨基酸序列分析分尚株VP2分子特征。分尚株符合強度株的特征:分尚株VP2第328-334位氨基酸序列為S-W-S-A-S-G-S，這與IBDV經典超強毒株VP2七肽區序列相同，超超強毒分子特征為222 A、256 1,294 I和299 S本分離株符合222 A、256 1,294 I和299S四個特征。證明本 毒株為vvIBDV經典超強毒株。1.2、超強毒傳染性法氏囊病毒(vvIBDV)滅活苗的制備:取分離鑒定的wIBDV絨毛膜和尿囊液加4%吐溫為水相；優質白油加司盤再加硬脂酸鋁為油相，水相與油相按一定比例進行乳化即為wIBDV滅活苗。注射。
1.3、超強毒傳染性法氏囊病毒(vvIBDV)高免蛋黃抗體制備:
1.3.1選擇產蛋20%左右的健康雞500只。
1.3.2用市場上賣的法氏囊弱毒苗基礎免疫。
1.3.3基礎免疫10天后，用我們制備的vvIBDV滅活苗免疫，Iml % /只，頸部皮下
1.3.4間隔15天后，用我們制備的vvIBDV滅活苗免疫，2ml%/只，頸部皮下注射。1.3.5免疫30天后采血檢測IBD抗體，用瓊脂擴散試驗檢測IBD抗體，達到27時留蛋，即為vvIBDV高免蛋。1.3.6vvIBDV高免蛋洗干凈，然后放入萬分之一的高錳酸鉀水里泡5_10分鐘，取出放入消毒好的容器里，將蛋清與蛋黃分離，蛋黃放入無菌容器里攪拌I分鐘，倒入500ml的瓶子里，冰箱凍存。1.3.6用于法氏囊病毒感染的病雞。30日齡以下的雞，1_1.5ml/只；30日齡以上的雞1.5-2.0ml/只。胸部肌肉或皮下注射。2、如權利要求1所述的超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法，其特征在于，采用高免技術，制備高免蛋黃抗體，接種于傳染性法氏囊使雞群在短時間內產生傳染性法氏病病毒抗體，在2 4小內中和體內的法氏囊病毒，達到治療的目的。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均`應包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.超強毒傳染性法氏囊病毒vvIBDV高免蛋黃抗體制備方法，其特征在于，采集不同地區、不同雞場疑似傳染性法氏囊病雞病料，進行病原的分離培養、設計一對引物擴增傳染性法氏囊病毒vp2基因序列、由于vp2屬于其特征性保守序列，能擴增出這段序列即能對其鑒定，利用擴增出來的產物經過電泳、觀察，確保擴增出與設計的目的條帶大小相符的條帶，對含有擴增產物的瓊脂糖凝膠回收，測序，同國際和國內已發表的已知序列比對，即可對其分型，分為超強毒毒株、強毒毒株、普通毒株等，最終確定本次分離到的傳染性法氏囊病毒毒株屬于超超強毒株。
2.如權利要求1所述的超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法，其特征在于，該超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法具體包括病料采集處理及病毒純化繁殖，vvIBDV-PCR鑒定，步驟如下: 病料的采集處理:從不同地區疑似法氏囊病雞中采集法氏囊病料；主要選擇法氏囊外觀水腫呈膠凍樣、出血呈紫葡萄狀；將法氏囊反復凍融三次，充分釋放病毒粒子，增加病毒粒子含量，無菌研磨，再加等體積加入4000IU青霉素、2000IU鏈霉素/ml的雙抗，放入_20°C保存，備用；用瓊脂擴散試驗檢測病毒效價，被檢病毒與標準法氏囊陽性血清出現明顯的沉淀線，證明法氏囊病毒的存在； 病毒純化繁殖:法氏囊病毒乳液在雞胚中繁殖:購買60枚PFS雞蛋，分三批孵育，每批20枚；將第一批20枚雞蛋放入溫箱中，每日翻蛋2-3次，注意保持濕度；4日后放入第二批，再4日后放入第三批；當第一批雞胚10日齡時，雞胚絨毛膜接種法氏囊病毒，0.2ml/枚，接種完畢用熔化石蠟封閉兩孔，逐日觀察，24h內死亡胚棄去，48h死胚保留，120h死活胚從孵化器中取出，放入4°C冰箱靜置，收獲內死、活雞胚絨毛膜和尿囊液；采用瓊脂擴散試驗方式測法氏囊病毒效 價，絨毛膜和尿囊液與標準法氏囊陽性血清都出現明顯的沉淀線，效價為21 ;將胚體和絨毛膜無菌取出加PBS緩沖液充分研磨，反復凍融3次后，進行第二次接毒，方法同上，絨毛膜和尿囊液與標準法氏囊陽性血清都出現明顯的沉淀線，病毒效價為23 ;同樣進行第三次接病毒，絨毛膜和尿囊液與標準法氏囊陽性血清都出現明顯的沉淀線，病毒效價為26。
3.如權利要求1所述的超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法，其特征在于，該超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法包括vvIBDV-PCR鑒定，步驟如下: 引物的設計與合成:根據genbank登錄IBDV vp2基因參考序列和表達載質粒PFastBacHTA表達閱讀框設計vp2基因擴增引物:Pl:5/ ~CGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACC~3/ ；P2:5/ ~CCCTCGAGCACCGGCACAGCTATCCTCCTTAT~3/ ； 兩頭分別引入EcoRI和XhoI酶切位點； 病毒RNA的提取:用Trizol法提取RNA，取250ul病毒液于一普通的1.5ml EP管中，加入750ul Trizol，震蕩混勻，靜置5min ;加入150ul氯仿，震蕩混勻，4°C離心，12000r/min, 5min ;取上清加入450ul異丙醇，顛倒混勻,4°C離心，12000r/min, 12min ;棄液體，力口lml75 % DEPC乙醇洗漆,4°C離心，12000r/min, 5min ;棄液體，虹吸，干燥沉淀；加9ulDEPC水、，50°C水浴lOmin，開始反轉錄；反轉錄步驟為:10ulRNA、lul隨機引物和4uldNTP混勻，65°C水浴8min后迅速冰浴5min ;再加入4ul Buffer、Iul反轉錄酶和Iul IulRNaseinhibitor，37°C水浴2-3h ;以反轉錄產物為模板，，Pl和P2為引物進行PCR反應；PCR反應體系:5XStar Buffer5ul, dNTP2ul，4ul 模板，Pl 和 P2 各 0.5ul, Primestar0.25ul,ddH2012.75ul ;PCR 反應條件:98 °C 預變性 IOs ;98°C 變性 10s，55 °C 退火 15s，72 °C 延伸100s共30個循環，72 °C終延伸IOmin ;凝膠電泳以鑒定分子量大小；將PCR產物按照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒說明書進行回收；取4.5ul回收產物加入5ul Sollution I和`0.5ulVenter，混勻，4°C過夜；將連接產物轉化入E.coliDH5 α感受態細菌，涂布在用LB配制的1.5%瓊脂平皿上，含氨芐青霉素100mg/L，37°C培養14h ;挑單菌落接種入含氨芐青霉素100mg/L的LBO，振搖培養12h ;提取質粒；質粒用EcoR I和Xho I雙酶切鑒定，陽性重組質粒命名為T-VP2 ； 分離株VP2序列分析及推導氨基酸序列分析:測序結果表明，分離株VP2基因核苷酸長度為1389bp，推導氨基酸序列含有347個氨基酸，采用DNAs tar軟件對測序結果進行分析，對照IBDV經典強、弱毒株及超超強毒株高變區氨基酸序列分析分離株VP2分子特征；分離株符合強度株的特征:分離株VP2第328-334位氨基酸序列為S-W-S-A-S-G-S，這與IBDV經典超強毒株VP2七肽區序列相同，超超強毒分子特征為222A、2561、294I和299S本分離株符合2561、2941和299S三個特征，證明本毒株為vvIBDV經典超強毒株。
4.如權利要求1所述的超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法，其特征在于，該超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法具體包括超強毒傳染性法氏囊病毒(vvIBDV)滅活苗的制備，步驟為: 取分離鑒定的vvIBDV絨毛膜和尿囊液加4%吐溫為水相；白油加司盤再加硬脂酸鋁為油相，水相與油相按一定比例進行乳化即為vvIBDV滅活苗。
5.如權利要求1所述的超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法，其特征在于，該超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法具體包括超強毒傳染性法氏囊病毒(vvIBDV)高免蛋黃抗體制備，步驟為:` 選擇產蛋20%左右的健康雞500只； 用市場上賣的法氏囊弱毒苗基礎免疫； 基礎免疫10天后，用我們制備的vvIBDV滅活苗免疫，Iml% /只，頸部皮下注射； 間隔15天后，用我們制備的vvIBDV滅活苗免疫，2ml% /只，頸部皮下注射； 免疫30天后采血檢測IBD抗體，用瓊脂擴散試驗檢測IBD抗體，達到27時留蛋，即為vvIBDV高免蛋； VVIBDV高免蛋洗干凈，然后放入萬分之一的高錳酸鉀水里泡5-10分鐘，取出放入消毒好的容器里，將蛋清與蛋黃分離，蛋黃放入無菌容器里攪拌I分鐘，倒入500ml的瓶子里，冰箱凍存； 用法以:用于法氏囊病毒感染的病雞；30日齡以下的雞，1-1.5ml/只；30日齡以上的雞1.5-2.0ml/只；胸部肌肉或皮下注射。
6.如權利要求1所述的超強毒傳染`性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法，其特征在于，采用高免技術，制備高免蛋黃抗體，接種于傳染性法氏囊病的雞群，使雞群在短時間內產生傳染性法氏病病毒抗體，在24小內中和體內的法氏囊病毒，達到治療的目的。
全文摘要
本發明公開了一種超強毒傳染性法氏囊病毒(vvIBDV)高免蛋黃抗體制備方法，通過走訪不同地區養殖場，對發病雞群采樣、病原的分離培養、設計引物擴增vp2基因序列、利用鑒定、分型、回收、測序方法和技術將擴增產物與國際上超強毒株固有特征進行比對，確定其屬于超超強毒株。利用我們分離的超強毒傳染性法氏囊病毒株，研制高免蛋黃抗體治療劑，來治療雞群感染超強毒傳染性法氏囊病。本發明提供的超強毒傳染性法氏囊病毒高免蛋黃抗體制備方法，采用高免技術制備高免蛋黃抗體，接種于傳染性法氏囊病的雞群，使雞群在短時間內產生傳染性法氏病病毒抗體，在24小內中和體內的法氏囊病毒，達到治療的目的。
文檔編號C07K16/02GK103172733SQ20131004200
公開日2013年6月26日 申請日期2013年1月27日 優先權日2013年1月27日
發明者詹麗娥, 劉華棟, 陸冰洋, 王采先, 唐娟, 詹海杰 申請人:山西省農科院畜牧獸醫研究所