銀環(huán)毒素抗原表位基因及其在基因疫苗及抗原制備中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本申請涉及銀環(huán)毒素抗原表位基因及其在基因疫苗及抗原制備中的應(yīng)用，本發(fā)明從銀環(huán)毒素cDNA序列的α-BGT的長鏈，β-BGT的A、B鏈、κ-BGT中分別取出2條代表序列，去除其信號肽、前肽部分，只留取成熟肽部分，用生物信息學(xué)方法分析得到10個抗原位點(diǎn)，人工合成含有這10個位點(diǎn)的一條基因序列，該序列連接真核表達(dá)載體pIRESneo中，作為基因基因疫苗免疫動物獲得抗銀環(huán)毒素的中和抗體；該序列也可連接原核表達(dá)載體PET-28a后，轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌BL21誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，并分離目的蛋白后作為免疫原免疫動物來獲得抗銀環(huán)毒素中核抗體。
【專利說明】銀環(huán)毒素抗原表位基因及其在基因疫苗及抗原制備中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基因及其疫苗的制備，特別是涉及一種從a、β和K銀環(huán)毒素中的多個抗原表位的人工合成多肽序列、基因及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0002]毒蛇咬傷在亞洲和非洲國家農(nóng)村地區(qū)一直以來是一個非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。蛇毒毒素按其性質(zhì)可分為神經(jīng)毒、血循毒、混合毒三大類。針對毒蛇咬傷最有效的治療藥物主要是抗蛇毒血清，但由于蛇毒本身成分復(fù)雜，含有數(shù)十甚至上百種功能各異的蛋白質(zhì)，用全毒免疫馬生產(chǎn)的抗蛇毒血清中，不僅含有能中和毒素成分的抗體，同時也含有大量針對蛇毒中其它非毒素成分的抗體，這不僅使得抗血清效價降低，也增加了使用抗血清的不良反應(yīng)率。蛇毒毒素按其性質(zhì)可分為神經(jīng)毒、血循毒、混合毒三大類。蛇毒神經(jīng)毒素(neurotoxin, N T)是毒蛇毒液中毒性最大的成分，它能使動物產(chǎn)生遲緩性麻痹和呼吸衰竭，導(dǎo)致動物死亡。蛇毒的神經(jīng)毒素主要存在于眼鏡蛇科的眼鏡蛇屬，環(huán)蛇屬和曼巴屬毒蛇中。金環(huán)蛇、銀環(huán)蛇、海蛇等主要含神經(jīng)毒。尖吻蝮蛇、蝰蛇、烙鐵頭蛇、竹葉青等主要含血循毒。中國常見陸生毒蛇中毒性最強(qiáng)的就是含有神經(jīng)毒的銀環(huán)蛇，而銀環(huán)蛇毒的主要致死性毒素是a和β銀環(huán)毒素，因而通過生物信息學(xué)和分子生物學(xué)獲得廣譜的、只含有銀環(huán)蛇毒中主要毒素成分關(guān)鍵抗原位點(diǎn)的新型抗原，對實(shí)現(xiàn)銀環(huán)蛇傷高危人群的基因免疫或制備新型免疫原以獲得高效、廣譜的新型抗蛇毒抗體提供了一種新的抗原和基因，也為利用基因工程實(shí)現(xiàn)抗蛇毒抗體的人源化奠定了基礎(chǔ)。目前抗蛇毒血清的制備主要是采用傳統(tǒng)的蛇毒全毒免疫馬獲得，隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，發(fā)展了一些特異性和效價更高的抗蛇毒血清提的新技術(shù)和新方法。國際上主要有采用生化和毒素學(xué)手段首先分析鑒定出 蛇毒中最主要的毒性成分，再利用這些成分的cDNA進(jìn)行動物免疫。相關(guān)報道如下:
[0003]1.Azofeifa-Cordero Gj Arce-Estrada V, Flores-Diaz M，et al.1mmunizationwith cDNA of a novel P-1II type metalloproteinase from the rattlesnake Crotalusdurissus durissus elicits antibodies which neutralize69%of the hemorrhageinduced by the whole venom[J].Toxicon2008，52:302-308.[0004]2.Harrison RA, Moura-Da-Silva AM, Laing GD，et al.Antibody from miceimmunized with DNA encoding the carboxyldisintegrin and cysteine-richdomain(JD9)of the haemorrhagic metalloprotease，Jararhagin，inhibits the mainlethal component of viper venom[J].Clin.Exp.1mmunol., 2000, 121:358 - 363.[0005]這些新的蛇毒抗血清的制備方法需首先從復(fù)雜的蛇毒中分離純化出單一的毒素成分并進(jìn)行鑒定后方能設(shè)計相應(yīng)引物，再從毒腺中反轉(zhuǎn)錄出cDNA，而且由于針對的只是蛇毒中的單一一個毒素成分，因此對于含有多種致死性毒素成分的蛇毒往往不能達(dá)到良好療效，同時對于不同蛇種的毒素由于存在種間差異，因此不能起到交叉中和作用。[0006]利用含有多個毒素抗原表位進(jìn)行基因免疫或新型抗原制備獲得抗毒素血清的研究報道有:英國利物浦大學(xué)的Wagstaff教授利用非洲鋸鱗蜂(Echis ocellatus)cDNA文庫的表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫,得到了 7個SVMP抗原位點(diǎn)，串聯(lián)后人工合成這7個抗原位點(diǎn)序列并免疫小鼠，免疫后的小鼠對多種非洲鋸鱗蝰的SVMP都具有中和作用，并且能夠中和數(shù)種其它非洲蝰科蛇毒；發(fā)明人小組利用金屬蛋白酶基因數(shù)據(jù)庫，得到了 6個抗原位點(diǎn)，串聯(lián)后合成的序列免疫小鼠，能夠使免疫小鼠抵抗致死性尖吻蝮蛇毒的攻擊。除此之外目前未見其它相關(guān)報道。相關(guān)文獻(xiàn)見下:
[0007]1.Wagstaff SC, Laing GD，Theakston RD, et al.Bioinformatics andmultiepitope DNA immunization to design rational snake antivenom[J].PLoS Med,2006，3 (6):el84.[0008]2.張志曉，鄭穎，楊彥等.尖吻蝮蛇蛇毒金屬蛋白酶cDNA序列抗原位點(diǎn)分析及免疫保護(hù)效果觀察[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2010，31(4):364-368.[0009]3.吳夢，葉鋒平，張志曉，崔慶華，胡挺松，張富強(qiáng)，邱薇，郭平，范泉水，鄭穎.蛇毒金屬蛋白酶多表位抗原肽的原核表達(dá)和免疫原性研究[J].免疫學(xué)雜志，2013，29(9):809-814.[0010]以上研究利用的是非洲鋸鱗蝰和尖吻蝮蛇的出血毒素序列進(jìn)行分析，得到抗多種出血毒素的抗原位點(diǎn)，再串聯(lián)這些位點(diǎn)獲得免疫原。由于該方法只針對金屬蛋白酶，只能產(chǎn)生中和出血毒素的抗體，獲得的序列也是金屬蛋白酶的序列。對于眼鏡蛇科的毒蛇，由于其主要致死性毒素為神經(jīng)毒，因此，針對出血毒素的序列對眼鏡蛇科毒蛇毒液中的致死性毒素完全無效(包括銀環(huán)蛇、金環(huán)蛇)。
[0011]本發(fā)明采用Jameson-Wolf 方法和 Clustal X 從 α -銀環(huán)毒素(BGT)，β -BGT,K -BGT中分別取出2條代表序列，共6條序列。去除其信號肽、前肽部分，只留取成熟肽部分，用生物信息學(xué)方法分析得到10個抗原位點(diǎn)，人工合成含有這10個位點(diǎn)的一條序列，并將其連接到真核表達(dá)載體獲得免疫質(zhì)粒以供動物進(jìn)行基因免疫制備抗血清用；另將獲得的該序列連接原核表達(dá)載體PET-28a后，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，并分離純化表達(dá)的目的蛋白，供后期作為免疫源免疫動物制備抗神經(jīng)毒的廣譜蛇毒抗血清。`
【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]為此，本發(fā)明提供一種SEQ ID NO:1的DNA序列，該序列含有多個銀環(huán)毒素抗原位點(diǎn)。
[0013]gtgcggccgc atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg 60
[0014]ttccactggt gacgcggccc agccggccag gcgcgcgcgc cgtaagaagc ctcctggtga 120
[0015]gaacctgtgt taccgcaaaa agaaacctca ccccaagcag agaccaggga agaaaggcgg 180
[0016]atcagggagg cccattgacg ctctcgaccg atgctgttat aaaaaggtgt gcgattgtga 240
[0017]caggaccaag aagcacaaga acatcgacac aaaaaaggac tgcgataaac ccccagataa 300
[0018]gaaaggaaac ggcaatcatt ttaaaaagaa gtctagtacc ccacagacct gtccaaaaaa 360
[0019]gttcaggagc aactaccgga aaaagactac ggataattgc aatcataaga agctggagtc 420
[0020]ccgcggcccc gtcggatccg c441
[0021]其中，gtgcggccgc和 ggatccgc 為 Not I 和 BamH I 酶切位點(diǎn)，atg gag aca gacaca ctcctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca ggt tcc act ggt gac gcg gcc cagccg gcc agg cgc gcg cgc cgt 部分為 Invitrogen 公司 pSexTag2 表達(dá)載體的 Ig-κ 分泌前導(dǎo)序列。下劃線部分為多個抗原位點(diǎn)DNA序列間的連接序列。上述DNA序列是人工合成的，其來源和設(shè)計如下:
[0022]通過NCBI Blast中的genbank從α -銀環(huán)毒素(BGT)的長鏈，β -BGT的A鏈、β -BGT的B鏈、K -BGT中分別取出的2條代表序列，它們在Genbank中的ID號分別為:AF056407、AF056407、AJ242012、AJ242011、Υ12100、Υ12101、Υ12265、Υ12266。這些序列在NCBI的genbank中是公開的，輸入ID號即可獲得詳細(xì)序列去除其信號肽、前肽部分，只留取成熟肽部分進(jìn)行分析。通過Jamson-Wolf方法和Clustal X軟件的綜合分析其保守位點(diǎn)、疏水性、抗原性，結(jié)果得到10個位點(diǎn)，這10個位點(diǎn)的氨基酸殘基分別為:PPGENLCYK，長度為9個氨基酸殘基，來自于α銀環(huán)毒素；PHPKQRPG，長度為8個氨基酸殘基，來自于α銀環(huán)毒素；GGSGRPIDALDRCCY，長度為15個氨基酸殘基，來自于β銀環(huán)毒素；V⑶⑶RT，長度為7個氨基酸殘基，來自于β銀環(huán)毒素；HKNIDT，長度為6個氨基酸殘基，來自于β銀環(huán)毒素；D⑶KPF1D,長度為7個氨基酸殘基,來自于β銀環(huán)毒素；GNGNHFK,來自于β銀環(huán)毒素；長度為7個氨基酸殘基，SSTPQTCP，長度為8個氨基酸殘基，來自于K銀環(huán)毒素；FRSNYR，長度為6個氨基酸殘基，來自于K銀環(huán)毒素；TTDNCNH，長度為7個氨基酸殘基，LESRGPV，長度為7個氨基酸殘基，來自于K銀環(huán)毒素。
[0023]將這10個位點(diǎn)串聯(lián)，每個位點(diǎn)之間用KK間隔。經(jīng)過密碼子優(yōu)化后的序列即為SEQID NO:1。
[0024]其合成可以使用現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)進(jìn)行或交由專業(yè)合成公司進(jìn)行(如華大基因公司)本發(fā)明還提供按用SEQ ID N0:1DNA序列編碼的蛋白，其含143個氨基酸殘基，其氨基酸序列為 SEQ ID NO:2，
[0025]其中MET DTL LLff VLL LffV PGS TGD AAQ PAR RAR RTK L 部分為 Invitrogen 公司pSexTag2表達(dá) 載體的Ig-κ分泌肽序列。
[0026]所述蛋白，可以使用現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)進(jìn)行或通過專業(yè)公司進(jìn)行蛋白合成，也可通過原核或真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行基因工程表達(dá)獲得。
[0027]本發(fā)明還包括，用本發(fā)明的DNA序列SEQ ID NO:1在基因免疫中的應(yīng)用，該應(yīng)用是通過將其連接到真核表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒作為免疫原可以用作疫苗預(yù)防和治療銀環(huán)蛇毒中毒。
[0028]如可以采用以下方法制備本發(fā)明疫苗:
[0029]1.將上述基因交由專業(yè)公司進(jìn)行合成，并可根據(jù)表達(dá)質(zhì)粒特點(diǎn)進(jìn)行密碼子優(yōu)化。將含有合成基因的質(zhì)粒及真核表達(dá)載體分別進(jìn)行Not I/BamH I雙酶切，酶切條件按照對應(yīng)酶的說明書進(jìn)行。
[0030]2.酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳確認(rèn)大小后，切下目的片段，隨后按膠回收試劑盒使用說明進(jìn)行回收，并對回收產(chǎn)物再次電泳鑒定。
[0031]3.鑒定大小無誤的回收產(chǎn)物與線性的真核表達(dá)載體按照相應(yīng)的連接說明書進(jìn)行連接。
[0032]4.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定后含有陽性重組質(zhì)粒的菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并按質(zhì)粒提取說明書進(jìn)行質(zhì)粒提取。
[0033]5.將提取純化后的質(zhì)粒與等體積的Al (OH) 3佐劑進(jìn)行充分混勻后，按照5ug~lOug/Kg進(jìn)行肌肉注射免疫動物，間隔兩周后再次免疫，免疫劑量每次遞增5ug~10ug/Kg，至最后劑量為50ug/Kg。完成最后一次免疫后2周進(jìn)行采血。并進(jìn)行ELISA效價檢測。
[0034]6.經(jīng)過三次免疫的動物免疫血清對銀環(huán)蛇毒的效價為IO3以上陽性，對金環(huán)蛇毒的效價為IO2以上陽性，對馬來環(huán)蛇的效價為IO3以上陽性，對印度環(huán)蛇的效價為IO3陽性以上。
[0035]為此，本發(fā)明還包括，包含本發(fā)明的DNA序列SEQ ID NO:1的載體，轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以及質(zhì)粒。
[0036]另外，為優(yōu)化本發(fā)明，本發(fā)明還提供一種含有多個銀環(huán)毒素抗原位點(diǎn)的DNA原核表達(dá)序列，序列為SEQ ID NO:3，
[0037]gtaggatcca tgcctcctgg tgagaacctg tgttaccgca aaaagaaacc tcaccccaag 60
[0038]cagagaccag ggaagaaagg cggatcaggg aggcccattg acgctctcga ccgatgctgt120
[0039]tataaaaagg tgtgcgattg tgacaggacc aagaagcaca agaacatcga cacaaaaaag 180
[0040]gactgcgata aacccccaga taagaaagga aacggcaatc attttaaaaa gaagtctagt 240
[0041]accccacaga cctgtccaaa aaagttcagg agcaactacc ggaaaaagac tacggataat 300
[0042]tgcaatcata agaagctgga gtcccgcggc cccgtctaag tcgacgta348 [0043]其中，gtaggatcc和taagtcgacgta為BamH I和Sal I酶切位點(diǎn)。下劃線部分為多個抗原位點(diǎn)DNA序列間的連接序列。
[0044]該序列的來源與設(shè)計和SEQ ID NO:1相同，只是將SEQ ID NO:1上的Not I和BamH I酶切位點(diǎn)序列置換為BamH I和SalI酶切位點(diǎn)序列。
[0045]其合成可以使用現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)進(jìn)行或交由專業(yè)合成公司進(jìn)行(如上海生工或北京華大基因公司等)
[0046]該序列可用于原核表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0047]按SEQ ID NO:3序列編碼的蛋白含107個氨基酸殘基，其氨基酸序列為SEQ IDNO:4 ；
[0048]所述蛋白，可以使用現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)進(jìn)行或可以交由專業(yè)公司進(jìn)行全蛋白合成，也可利用下述方法利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)來獲得。
[0049]用本發(fā)明的DNA序列SEQ ID NO:3在基因免疫中的應(yīng)用，該應(yīng)用是通過將其連接到原核表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化BL21DE3或其它表達(dá)菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)，提取蛋白，該蛋白作為免疫原可以用作疫苗預(yù)防和治療銀環(huán)蛇毒中毒。
[0050]用序列SEQ ID NO:3制備免疫源的方法可以采用以下方法:
[0051]1.將SEQ ID NO:3交由專業(yè)公司進(jìn)行合成，也可通過相應(yīng)引物設(shè)計從SEQ ID NO:1獲得，將含有SEQ ID NO:3序列的質(zhì)粒和原核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行Sal I /BamH I雙酶切，酶切條件按照對應(yīng)酶的說明書進(jìn)行。
[0052]2.酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳確認(rèn)大小后，按膠回收試劑盒使用說明對目的片段(大小為350bp左右)進(jìn)行回收，并對回收產(chǎn)物再次電泳鑒定。
[0053]3.鑒定無誤的回收目的片段與線性的原核表達(dá)載體按照相應(yīng)的連接說明書進(jìn)行連接。
[0054]4.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21DE3或其它表達(dá)菌感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定后含有陽性重組質(zhì)粒的菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。[0055]5.陽性菌的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物純化:陽性菌培養(yǎng)至0D600在0.6~0.8時加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后離心收集菌體，菌體凍融3~5次。然后將得到的菌體懸于TE緩沖液，冰浴超聲破碎。離心沉淀1:300 (w/v)加入到洗滌液中，洗滌2h。離心，棄去上清。將洗滌后的包涵體加入到含8~10mol/L尿素的裂解液中，過夜。離心，取上清，用Ni2+親和層析柱進(jìn)行純化。純化后的蛋白即為表達(dá)的含有多個銀環(huán)神經(jīng)毒素抗原表位的新型抗原。
[0056]6.動物免疫:取純化后的蛋白溶液測定蛋白濃度后，加入適量弗氏不完全佐劑，利用無菌注射器進(jìn)行乳化，首次免疫蛋白劑量為0.5~1.0mg/Kg，取0.3~0.5mL左右乳化后的免疫原等量分4點(diǎn)進(jìn)行動物皮內(nèi)注射，2點(diǎn)位于背部，2點(diǎn)位于后肢。間隔2周后進(jìn)行再次免疫，免疫劑量每次遞增0.5~lmg/Kg，劑量最終增至10mg/Kg或動物抗體效價不再升高時的劑量為最終免疫劑量。
[0057]7.免疫動物的血清經(jīng)ELISA方法檢測對銀環(huán)蛇毒的效價在10_4以上陽性即可采血用于進(jìn)一步純化制備抗環(huán)蛇毒血清制品，
[0058]8.該方法獲得的免疫血清酶聯(lián)免疫法(ELISA)方法檢測對銀環(huán)蛇毒的效價在IO4以上，對金環(huán)蛇毒的效價為IO2以上陽性，對馬來環(huán)蛇的效價為IO4以上陽性，對印度環(huán)蛇的效價為IO4陽性以上。
[0059]本發(fā)明進(jìn)一步提供疫苗制劑，所述制劑包括本發(fā)明的基因。所述疫苗還可包括本發(fā)明方法獲得的質(zhì)粒，以及本發(fā)明方法獲得的蛋白。
[0060]本發(fā)明的疫苗，其優(yōu)點(diǎn)在于:質(zhì)粒DNA非常穩(wěn)定，易于貯存和運(yùn)輸，使用方便。而且制備簡單，容易大量生產(chǎn)，成本低；質(zhì)粒DNA在宿主體內(nèi)可較長時間存在，抗原基因在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)產(chǎn)生抗原蛋白，不斷刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生長程免疫，免疫效果可靠；本疫苗本身無免疫原性，不會像重組疫苗那樣誘發(fā)針對載體的自身免疫反應(yīng)；同時由于本發(fā)明的疫苗只含有刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原表位，本身不再具有神經(jīng)毒性，因此對機(jī)體無毒；同時只刺激機(jī)體產(chǎn)生針對銀環(huán)蛇毒中的致死性的銀環(huán)毒素的中和抗體，從而比全蛇毒免疫的抗體效價更高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0061]圖1 a -BGT的長鏈抗原位點(diǎn)
[0062]圖2.β -BGT的A鏈抗原位點(diǎn)
[0063]圖3.β -BGT的B鏈抗原位點(diǎn)
[0064]圖4.酶切電泳圖譜，其中
[0065]1. 含有 SEQ ID NO:1 的 Puc57 質(zhì)粒雙酶切后；2.DL5000DNA Marker; 3.pIRESneo空質(zhì)粒單酶切后；4.pIRESneo空質(zhì)粒雙酶切后；5.含有SEQ ID NO:1的pIRESneo質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后；
【具體實(shí)施方式】
[0066]以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍包括但不限于以下實(shí)施例。
[0067]實(shí)施例1[0068](一)SEQ ID NO:1 的獲得
[0069](I)生物信息學(xué)方法分析得到的抗原位點(diǎn)
[0070]從α -銀環(huán)毒素(BGT)的長鏈，β -BGT的Α、B鏈、κ -BGT類中分別取出的2條代表序列:AF056407、AF056407、AJ242012、AJ242011、Y12100、Y12101、Y12265、Y12266 (以上為 NCBI Genbank 中的 ID 號)。
[0071]禾!I用 SignalP (http:1Iwm.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/) j#/fT分木斤以上8條序列的信號肽、前肽序列，去除信號肽和前肽序列留取成熟肽序列進(jìn)行分析。通過Jameson-Wolf方法結(jié)合Gamier-Robson和Chou-Fasman方法預(yù)測氛基酸序列的二級結(jié)構(gòu)，通過Kyte-Doolittle方法分析疏水性,通過Karplus-Schulz法分析柔韌性,通過Emini法分析位點(diǎn)表面可能性，最后采用Jameson-Wolf方法和Clustal X軟件結(jié)合進(jìn)行以上四個方面綜合分析以上8條序列中的抗原位點(diǎn)序列。結(jié)果得到10個位點(diǎn)，如圖1-3所示。
[0072]這10個位點(diǎn)的氨基酸殘基分別為:PPGENLCYK，長度為9個氨基酸殘基，PHPKQRPG，長度為8個氨基酸殘基，GGSGRPIDALDRCCY，長度為15個氨基酸殘基，V⑶⑶RT，長度為7個氨基酸殘基，HKNIDT，長度為6個氨基酸殘基，D⑶KPH)，長度為7個氨基酸殘基，GNGNHFK，長度為7個氨基酸殘基，SSTPQTCP，長度為8個氨基酸殘基，F(xiàn)RSNYR,長度為6個氨基酸殘基，TTDNCNH,長度為7個氨基酸殘基，LESRGPV，長度為7個氨基酸殘基。
[0073](2)將這10個位點(diǎn)串聯(lián)，每個位點(diǎn)之間用KK間隔。經(jīng)過密碼子優(yōu)化后的序列即為 SEQ ID NO:1。斜體部分為 Not I 和 BamH I 酶切位點(diǎn)，atg gag aca gac aca ctc ctgcta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca ggt tcc act ggt gac gcg gcc cag ccg gcc aggcgc gcg cgc cgt部分為Invitrogen公司pSexTag2表達(dá)載體的Ig-κ分泌前導(dǎo)序列。
[0074](二)SEQ ID NO:1在基因免疫中的應(yīng)用
[0075](I)將含有通過公司合成序列SEQ ID NO:1的pUC57質(zhì)粒和真核表達(dá)pIRESneo空質(zhì)粒分別進(jìn)行Not I/BamH I雙酶切，體系為
[0076]表1載體雙酶切
【權(quán)利要求】
1.一種DNA序列，該序列為SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3，其含有多個銀環(huán)毒素抗原位點(diǎn)。
2.—種氣基酸序列，該序列為SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4，其為權(quán)利要求1的DNA序列編碼表達(dá)的。
3.權(quán)利要求1的DNA序列在制備預(yù)防和治療毒蛇咬傷的疫苗中的應(yīng)用。
4.一種真核表達(dá)載體，含有SEQ ID NO:1的DNA序列。
5.一種質(zhì)粒,含有權(quán)利要求4的真核表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求5所述質(zhì)粒的疫苗制劑。
7.一種原核表達(dá)載體，含有SEQ ID NO:3的DNA序列。
8.一種質(zhì)粒,含有權(quán)利要求7的原核表達(dá)載體。
9.一種抗原，含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求9的 抗原在制備銀環(huán)蛇抗體中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K16/18GK103865934SQ201410116200
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月26日
【發(fā)明者】鄭穎, 范泉水, 崔慶華, 張志曉, 葉鋒平, 郭平, 馮子良, 周衛(wèi)國 申請人:中國人民解放軍成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心