FGFR2c胞外段類似物及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種FGFR2c胞外段類似物及其編碼基因與應(yīng)用。該類似物選自氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的野生型wsFGFR2c；或是與野生型wsFGFR2c的氨基酸序列至少有80％同源性的序列；氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示S252W突變型msFGFR2c；或是與S252W突變型msFGFR2c的氨基酸序列至少有80％同源性的序列。將編碼類似物的基因和表達載體重組，得到表達重組載體；將重組載體導(dǎo)入宿主細胞中，得到轉(zhuǎn)基因細胞株。發(fā)酵該轉(zhuǎn)基因細胞株，得到FGFR2c胞外段類似物。該FGFR2c胞外段類似物、編碼基因、重組載體和轉(zhuǎn)基因細胞株均可用于制備用于抑制EGF信號通路的藥物。
【專利說明】FGFR2c胞外段類似物及其編碼基因與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種FGFR2C胞外段類似物及其編碼基因與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]FGF信號具有促進細胞增殖，誘導(dǎo)新生血管形成等重要生理作用。腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程與FGF信號通路也有十分密切的關(guān)系。典型的FGF受體由細胞外區(qū)、跨膜區(qū)和細胞內(nèi)區(qū)組成，它們都為單鏈的糖蛋白分子。細胞外區(qū)為3個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(I~III)，分別命名為Dl，D2和D3 ，在Dl和D2之間有一個由4~8個酸性氨基酸組成的酸盒；跨膜區(qū)是一個穿膜螺旋；細胞內(nèi)區(qū)是酪氨酸激酶區(qū)(PTK)。FGF受體胞外段(如D1-D3區(qū))可用于抑制FGF信號，并用于治療腫瘤、皮膚炎癥等。文獻報道的FGFR2C亞型胞外段其序列有米用自第 147 至第 366 個氨基酸(Ju Wang, Xue-ting Liu, Hui Huang, et al.Anti tumorActivity of a Recombinant Soluble Ectodomain of Mutant Human Fibroblast GrowthFac tor Receptor-2IIIc.Mol Cancer Ther2011 ;10:1656-1666.)，也有采用自第 151 至第377個氨基酸(何穎，汪炬等.FGFR2IIIC胞外段的原核表達及其對前列腺癌細胞增殖的抑制作用.中國生物工程雜志.2009，29(7):7~11.文中指出是150~366aa，實際上通過引物擴增出來的是151~377aa)具有抑制腫瘤細胞增殖作用，但存在著溶解性不太好、較不穩(wěn)定等問題。
[0003]EGFR是原癌基因c-erbBl的表達產(chǎn)物，是表皮生長因子受體(HER)家族成員之一。該家族包括 HERl (erbBl, EGFR)、HER2 (erbB2, NEU)、HER3 (erbB3)及 HER4 (erbB4)。HER 家族在細胞生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。EGFR信號通路對細胞的生長、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要的作用。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相關(guān)信號通路中關(guān)鍵因子的活性或細胞定位異常，均會引起腫瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的發(fā)生。也是腫瘤治療中重要的分子靶點。對EGF信號的抑制往往導(dǎo)致其他酪氨酸激酶信號的激活，如FGF信號，并產(chǎn)生耐藥。因此，有必要尋找能夠同時抑制EGF以及FGF信號的分子，對腫瘤的治療效果更好。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種FGFR2C胞外段類似物，使其蛋白穩(wěn)定性更好。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供所述的FGFR2C胞外段類似物的編碼基因。
[0006]本發(fā)明的再一目的在于提供所述的FGFR2C胞外段類似物及其編碼基因的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):一種FGFR2C胞外段類似物(sFGFR2c)，選自如下多肽:
[0008](I)野生型wsFGFR2c:氨基酸序列如下所示；或是與野生型wsFGFR2c的氨基酸序列至少有80%同源性的序列；
[0009]所述的野生型wsFGFR2c的氨基酸序列:
[0010]NKRAPYWTNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPAGGNPMPTMRWLKNGKEFKQEHRIGGYKVRNQHWSLIMESWPSDKGNYTCVVENEYGSINHTYHLDVVERSPHRPILQAGLPANASTVVG⑶VEFVCKVYSDAQPHIQWIKHVEKNGSKYGPDGLPYLKVLKAAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFHSAWLTVL ；
[0011](2) S252W突變型msFGFR2c:氨基酸序列如下所示；或是與S252W突變型msFGFR2c的氨基酸序列至少有80%同源性的序列；
[0012]所述的S252W突變型msFGFR2c的氨基酸序列為:
[0013]NKRAPYWTNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPAGGNPMPTMRWLKNGKEFKQEHRIGGYKVRNQHWSLIMESVVPSDKGNYTCVVENEYGSINHTYHLDVVERWPHRPILQAGLPANASTVVGGDVEFVCKVYSDAQPHIQWIKHVEKNGSKYGPDGLPYLKVLKAAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFHSAWLTVL ；
[0014]所述FGFR2C胞外段類似物的編碼基因，選自如下核苷酸序列:
[0015](I)①編碼野生型wsFGFR2c的核苷酸序列，如下所示；或
[0016]②因遺傳密碼的簡并性而與⑴①的核苷酸序列不同的序列；或
[0017]③與(I)①或(I)②的核苷酸序列至少有80%同源性的序列；
[0018]所述的編碼野生型wsFGFR2c的核苷酸序列為:
[0019]AACAAGAGAGCACCATACTGGACCAACACAGAAAAGATGGAAAAGCGGCTCCATGCTGTGCCTGCGGCCAACACTGTCAAGTTTCGCTGCCCAGCCGGGGGGAACCCAATGCCAACCATGCGGTGGCTGAAAAACGGGAAGGAGTTTAAGCAGGAGCATCGCATTGGAGGCTACAAGGTACGAAACCAGCACTGGAGCCTCATTATGGAAAGTGTGGTCCCATCTGACAAGGGAAATTATACCTGTGTGGTGGAGAATGAATACGGGTCCATCAATCACACGTACCACCTGGATGTTGTGGAGCGATCGCCTCACCGGCCCATCCTCCAAGCCGGACTGCCGGCAAATGCCTCCACAGTGGTCGGAGGAGACGTAGAGTTTGTCTGCAAGGTTTACAGTGATGCCCAGCCCCACATCCAGTGGATCAAGCACGTGGAAAAGAACGGCAGTAAATACGGGCCCGACGGGCTGCCCTACCTCAAGGTTCTCAAGGCCGCCGGTGTTAACACCACGGACAAAGAGATTGAGGTTCTCTATATTCGGAATGTAACTTTTGAGGACGCTGGGGAATATACGTGCTTGGCGGGTAATTCTATTGGGATATCCTTTCACTCTGCATGGTTGACAGTTCTG ；
[0020](2)①編碼S252W突變型msFGFR2c的核苷酸序列，如SEQ ID N0.4所示；或
[0021]②因遺傳密碼的簡并性而與(2)①的核苷酸序列不同的序列；或
[0022]③與(2)①或(2)②的核苷酸序列至少有80%同源性的序列；
[0023]所述的編碼S252W突變型msFGFR2c的核苷酸序列為:
[0024]AACAAGAGAGCACCATACTGGACCAACACAGAAAAGATGGAAAAGCGGCTCCATGCTGTGCCTGCGGCCAACACTGTCAAGTTTCGCTGCCCAGCCGGGGGGAACCCAATGCCAACCATGCGGTGGCTGAAAAACGGGAAGGAGTTTAAGCAGGAGCATCGCATTGGAGGCTACAAGGTACGAAACCAGCACTGGAGCCTCATTATGGAAAGTGTGGTCCCATCTGACAAGGGAAATTATACCTGTGTGGTGGAGAATGAATACGGGTCCATCAATCACACGTACCACCTGGATGTTGTGGAGCGATGGCCTCACCGGCCCATCCTCCAAGCCGGACTGCCGGCAAATGCCTCCACAGTGGTCGGAGGAGACGTAGAGTTTGTCTGCAAGGTTTACAGTGATGCCCAGCCCCACATCCAGTGGATCAAGCACGTGGAAAAGAACGGCAGTAAATACGGGCCCGACGGGCTGCCCTACCTCAAGGTTCTCAAGGCCGCCGGTGTTAACACCACGGACAAAGAGATTGAGGTTCTCTATATTCGGAATGTAACTTTTGAGGACGCTGGGGAATATACGTGCTTGGCGGGTAATTCTATTGGGATATCCTTTCACTCTGCATGGTTGACAGTTCTG ；
[0025]一種表達重組載體，含有所述FGFR2C胞外段類似物的編碼基因；
[0026]所述的表達重組載體優(yōu)選為將所述FGFR2C胞外段類似物的編碼基因克隆至表達載體得到，或是將所述FGFR2C胞外段類似物的編碼基因和其他基因重組，再克隆至表達載體得到；
[0027]所述的表達載體包括原核表達載體和真核表達載體；優(yōu)選為pET3c載體、ρΟ)ΝΑ3.I 載體、pIRESneo3 載體、pPICZ a A 載體或 pFastBac 載體；
[0028]所述的其他基因優(yōu)選為編碼免疫球蛋白表位標(biāo)記序列的基因或編碼Fe區(qū)的基因；
[0029]一種轉(zhuǎn)基因細胞株，是將上述表達重組載體轉(zhuǎn)染到宿主細胞中得到；
[0030]所述的宿主細胞優(yōu)選為CHO細胞、大腸桿菌、昆蟲細胞和酵母細胞中的任一種；
[0031]一種融合蛋白，含有上述FGFR2c胞外段類似物的氨基酸序列；
[0032]所述的融合蛋白優(yōu)選為免疫球蛋白表位標(biāo)記序列或Fe區(qū)與上述FGFR2C胞外段類似物連接得到；
[0033]上述任一項多肽或上述任一項核苷酸序列用于抑制EGF信號通路,從而抑制腫瘤細胞的增殖；
[0034]上述表達重組載體、上述宿主細胞和上述融合蛋白中的任一項用于抑制EGF信號通路，從而抑制腫瘤細胞的增殖；
[0035]一種用于抑制EGF信號通路和抗腫瘤的藥物，其活性成分包括上述任一項核苷酸序列、上述任一項多肽、 上述載體、上述宿主細胞或上述融合蛋白。
[0036]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果:本發(fā)明在于利用FGFR2C胞外段類似物或其藥用組合物阻斷如EGF信號通路，阻止其激活，從而抑制腫瘤及其他以EGFR為靶點的疾病。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1是實施例1中FGFR2c胞外段類似物(sFGFR2c)的SDS-PAGE圖；其中，泳道M為蛋白Marker，泳道I為誘導(dǎo)的野生型wsFGFR2c，泳道2為未誘導(dǎo)的野生型wsFGFR2c，泳道3為誘導(dǎo)的S252W突變型msFGFR2c，泳道4為未誘導(dǎo)的S252W突變型msFGFR2c。
[0038]圖2是實施例1中sFGFR2c的蛋白雜交圖；其中，泳道I為野生型wsFGFR2c，泳道2 為 S252W 突變型 msFGFR2c。
[0039]圖3 是實施例 7 中 sFGFR2c、sFGFR2c (147_366aa)和 sFGFR2c (151_377aa)穩(wěn)定性比較圖和腫瘤細胞抑制效果比較圖；其中圖A是sFGFR2 c穩(wěn)定性的電泳圖，圖B是sFGFR2c(147-366aa)穩(wěn)定性的電泳圖，圖C是sFGFR2c (151_377aa)穩(wěn)定性的電泳圖。
[0040]圖4是實施例8中sFGFR2c與EGFR的結(jié)合能力的co_IP圖；其中，wsFGFR2c為野生型FGFR2c胞外段類似物，msFGFR2c為S252W突變型msFGFR2cFGFR2c胞外段類似物。
[0041]圖5是實施例8中sFGFR2c對DU145細胞增殖影響的CCK8結(jié)果圖；其中，wsFGFR2c為野生型FGFR2c胞外段類似物，msFGFR2c為S252W突變型FGFR2c胞外段類似物，▲代表與空白對照組相比，P < 0.01 ;★代表與EGF單獨誘導(dǎo)組相比，P < 0.01。
[0042]圖6是實施例8中FGFR2c胞外段類似物對EGFR/ERK信號通路影響的蛋白雜交鑒定圖；其中，wsFGFR2c為野生型FGFR2c胞外段類似物，msFGFR2c為S252W突變型FGFR2c胞外段類似物。

【具體實施方式】
[0043]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0044]下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。所用到的細胞株和載體均為商業(yè)化產(chǎn)品。F開頭的引物一般為上游引物，R開頭的引物一般為下游引物。
[0045]實施例1野生型及突變型FGFR2c胞外段類似物多肽基因在大腸桿菌中的表達
[0046]本實施例描述野生型wsFGFR2c和S252W突變型msFGFR2c的制備過程。
[0047]一、FGFR2c胞外段類似物多肽基因的制備:
[0048]1、用Trizol法從人胎盤組織(從廣東某醫(yī)院經(jīng)產(chǎn)婦同意獲得新鮮胎盤組織)提取野生型FGFR2c胞外段總RNA，并建立cDNA文庫；
[0049](I)用Trizol法抽提mRNA:使用Trizol試劑進行抽提，具體步驟見文獻“張志成.突變型i3FGFR2IIIc胞外段的原核表達、體外復(fù)性及活性研究.暨南大學(xué)碩士論文，2007:46-47”。
[0050](2)進行 RT-PCR 以獲得 cDNA:
[0051]計算好整個逆轉(zhuǎn)錄PCR各成分的用量，先在PCR管內(nèi)加入步驟(1)制備的樣品總RNA和DEPC處理水，在PCR儀上進行RNA預(yù)變性，條件為65°C，1min0預(yù)變性后立即插入冰中。然后再添加逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的其他成分，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA。具體如下:
[0052]

【權(quán)利要求】
1.一種FGFR2C胞外段類似物，其特征在于選自如下多肽: (1)野生型wsFGFR2c:氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示；或是與野生型wsFGFR2c的氨基酸序列至少有80%同源性的序列； (2)S252W突變型msFGFR2c:氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示；或是與S252W突變型msFGFR2c的氨基酸序列至少有80%同源性的序列。
2.權(quán)利要求1所述的FGFR2C胞外段類似物的編碼基因，其特征在于選自如下核苷酸序列: (1)①編碼野生型wsFGFR2c的核苷酸序列，如SEQID N0.3所示；或 ②因遺傳密碼的簡并性而與(I)①的核苷酸序列不同的序列；或 ③與(I)①或(I)②的核苷酸序列至少有80%同源性的序列； (2)①編碼S252W突變型msFGFR2c的核苷酸序列，如SEQID N0.4所示；或 ②因遺傳密碼的簡并性而與(2)①的核苷酸序列不同的序列；或 ③與(2)①或(2)②的核苷酸序列至少有80%同源性的序列。
3.—種表達重組載體，其特征在于:含有權(quán)利要求2所述的FGFR2c胞外段類似物的編碼基因。
4.一種轉(zhuǎn)基因細胞株，其特征在于:是將權(quán)利要求3所述的表達重組載體轉(zhuǎn)染到宿主細胞中得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因細胞株，其特征在于:所述的宿主細胞為CHO細胞、大腸桿菌、昆蟲細胞和酵母細胞中的一種。
6.一種融合蛋白，其特征在于:含有權(quán)利要求1所述的FGFR2C胞外段類似物的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的融合蛋白，其特征在于:所述的融合蛋白為免疫球蛋白表位標(biāo)記序列或Fe區(qū)與權(quán)利要求1所述的FGFR2C胞外段類似物連接得到。
8.權(quán)利要求1所述的FGFR2c胞外段類似物的應(yīng)用，其特征在于:將其用于抑制EGF信號通路。
9.權(quán)利要求2所述的FGFR2c胞外段類似物的編碼基因的應(yīng)用，其特征在于:將其用于抑制EGF信號通路。
10.一種用于抑制EGF信號通路和抗腫瘤的藥物，其特征在于:其活性成分包括權(quán)利要求I所述的FGFR2C胞外段類似物、權(quán)利要求2所述的FGFR2c胞外段類似物的編碼基因、權(quán)利要求3所述的表達重組載體、權(quán)利要求4或5所述的轉(zhuǎn)基因細胞株和權(quán)利要求6或7所述的融合蛋白。
【文檔編號】C07K19/00GK104177492SQ201410347938
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月21日
【發(fā)明者】汪炬, 陳安安 申請人:暨南大學(xué)