專利名稱：用于調節淋巴細胞活化的組合物及方法
1．介紹本發明涉及對淋巴細胞活化的調節。特別地，本發明涉及通過選擇性地結合由相同的淋巴細胞表達的多細胞表面抗原來調節淋巴細胞活化的組合物和方法。通過與對目標抗原特異的固定化配體或者抗體或抗體片段一起培養淋巴細胞，可以在體外實現抗原的聚集。另外，在單一可溶分子中含有多種結合特異性的多特異性分子在體內導致淋巴細胞活化的聚集多個抗原的過程中是特別有用的。通過阻斷活化信號向細胞的傳遞，也可以構建出多特異性分子以抑制淋巴細胞的活化。因此，本發明在體外和體內調節T細胞和B細胞的免疫應答中是有用的。
2．發明背景2.1.T細胞受體/CD3復合物成熟的T淋巴細胞(T細胞)通過T細胞抗原受體(TCR)復合物識別抗原。一般說來，各種TCR/CD3復合物都由6個亞基組成，其中包括克隆型(clonotypic)二硫鍵連接的TCRα/β或TCRγ/δ雜二聚體和不變的CD3復合物(M.M.Davis，《生物化學年鑒》59:475；A.C.Chan等人《免疫學年鑒》10:555)。TCR的α、β、γ和δ鏈為由含有類似于抗體可變區(V)、連接區(J)和恒定區(C)的T細胞特異性基因編碼的40-50kDa的糖蛋白(S.M.Hedrick等人《自然》308:149；S.M.Hedrick等人《自然》308:153)。TCR雜二聚體為抗原結合亞基，它們決定了單個T細胞的特異性。α/β異源表達細胞在人和小鼠兩者中構成了90％以上的外周T細胞，它們負責典型的輔助性或細胞毒性T細胞的應答(M.M.Davis，《生物化學年鑒》59:475；A.C.Chan等人《免疫學年鑒》10:555)。在大多數情況下，TCRα/β配體為由主要組織相容性復合體(MHC)Ⅰ類或Ⅱ類分子呈遞的肽抗原?？墒牵琓CRγ/δ配體的性質沒有進行清楚的定義，并且可能不參與MHC蛋白的呈遞(Y.-H.Chien等人《免疫學年鑒》15:511)。
不變的CD3復合物是由4個相對小的多肽CD3δ(20kDa)、CD3ε(20kDa)、CD3γ(25kDa)和CD3ζ(16kDa)組成的。CD3δ、ε和γ鏈在其氨基酸序列彼此之間顯示出顯著的相似性。它們是免疫球蛋白(Ig)超基因家族的成員，它們之中的每一個都擁有單一的類似Ig的胞外域。可是，當與CD3δ、ε和γ相比時，CD3ζ僅僅具有1個含9個氨基酸的胞外域和1個較長的胞質域。CD3鏈的胞質域含有稱作基于酪氨酸的免疫受體活化基元(ITAM)的可以介導細胞活化的1個至3個拷貝的保守基元。通過肽-MHC配體進行的TCR/CD3復合物連接的一個結果為給CD3鏈的ITAM募集了大量的信號因子。這引發了多信號轉導途徑的活化，最終導致基因的表達、細胞的增殖以及效應T細胞功能的產生(A.Weiss與D.R.Littman《細胞》76:263；R.Wange與L.E.Samelson《免疫》5:197)。
TCR復合物的裝配和表達是復雜的并且是經嚴格調節的過程；受體復合物的不同鏈對這些確切地作出了何種貢獻仍有待完全地闡明。但是，完全確定的是TCR復合物的表面表達需要TCRα/β或TCRγ/δ加上CD3δ、CD3ε、CD3γ和CD3ζ鏈的存在(Y.Minami等人《美國國家科學院院報》84:2688；B.Alaracon等人《生物化學雜志》263:2953)。任意一條鏈的缺少都使復合物被細胞質所捕獲并使它們迅速地進行蛋白水解(C.Chen等人《細胞生物學雜志》107:2149；J.s.Bonifacino等人《細胞生物學雜志》109:73)。TCR/CD3復合物精確的化學計量是未知的。幾條線索的證據已經表明一種TCR/CD3復合物可能含有2個拷貝的TCR雜二聚體、CD3ε/δ雜二聚體、CD3ε/γ雜二聚體和CD3ζζ均二聚體，以便構成一種十聚體復合物(R.S.Blumberg等人《美國國家科學院院報》87:7220；M.Exley等人《分子免疫學》32:829)。在該復合物中，TCR雜二聚體和CD3ζ均二聚體是通過二硫鍵共價連接的，而CD3ε/δ和CD3ε/γ雜二聚體不是共價連接的。此外，已經表明CD3ε/δ、CD3ε/γ、CD3ζζ與TCRα/β或TCRγ/δ鏈之間的相互作用是非共價的。
TCR/CD3復合物的裝配起始于在內質網(ER)中單個的TCRα、TCRβ鏈與CD3鏈之間成對的相互作用，從而導致形成了由單一的TCR鏈與CD3鏈一同組成的中間體(B.Alarcon等人《生物化學雜志》263:2953；N.Manolios等人《EMBO J.》10:1643)。在非淋巴細胞中進行的轉染研究表明TCRα可以與CD3δ和CD3ε締合，但卻不與CD3ζ締合，而TCRβ可以與CD3δ、ε和γ締合，但卻不與CD3ζ締合(N.Manolios等人《EMBO J.》10:1643；T.Wileman等人《細胞生物學雜志》122:67)。CD3ζ鏈的摻入似乎是成熟TCR/CD3復合物形成的速率限制步驟。在CD3ζ可以與部分TCR/CD3復合物裝配以形成用于表面表達的最終產物之前，在ER中嚴格地需要存在有TCRα/β、CD3δ、ε和γ鏈(Y.Minami等人《美國國家科學院院報》84:26880)。TCR與CD3鏈之間的締合似乎在很大程度上取決于在其跨膜結構域中帶電的氨基酸殘基。帶正電的氨基酸殘基存在于TCRα/β鏈的跨膜結構域中，其中對TCRα來說為精氨酸和賴氨酸，對來說TCRβ為賴氨酸。在CD3鏈的跨膜結構域中發現了帶負電的氨基酸，其中對CD3γ來說為谷氨酸，而對CD3ε、δ和ζ的每一種來說為天冬氨酸。據認為由這些帶電氨基酸形成的鹽橋是驅動TCRα/β鏈和CD3鏈之間締合的主要力量(C.Hall等人《國際免疫學》3:359；P.Cosson等人《自然》351:414)。已經提出了一種與上述轉染和生物化學數據相適應的成熟TCR/CD3復合物的模型。在該模型中，CD3ε/δ、CD3ε/γ和CD3ζ/ζ中每種的1個拷貝與位于外部的2個拷貝的TCRα/β一起形成受體復合物的核心。TCRα和TCRβ鏈可以與CD3δ、ε或γ配對。二硫鍵連接的CD3ζζ可以優先與TCRα配對，這是由于在TCRα的跨膜結構域中有額外的帶負電的氨基酸。
盡管已經廣泛地研究了TCR/CD3復合物的裝配和表達，但是有關CD3δ、ε或γ鏈胞外域的潛在功能卻知之甚少。近來有關TCR-抗-TCR復合物晶體結構的研究已經為在TCRβ鏈中存在一個大的足以容納CD3ε胞外域的結合口袋提供了證據(J.-H.Wang等人《EMBO J.》17:10；Y.Ghendler等人《實驗醫學雜志》187:1529)。另一方面，采用缺失分析已經暗示出鄰近CD3δ、ε或γ鏈跨膜結構域的具有保守的Cys-X-X-Cys基元的區域介導了CD3鏈的異源二聚作用(A.Borroto等人《生物化學雜志》273:12807)。對于起到粘著分子的作用來說，Ig超基因家族的成員是眾所周知的。因此，并不令人吃驚的是對類似Ig區的CD3胞外域而言，可能存在著配體。于是，CD3鏈與其潛在配體之間的相互作用可能在調節T淋巴細胞活化方面起到了至關重要的作用。
對使有關CD3鏈胞外域的功能滯后的信息而言，產生呈其天然構象的可溶性CD3復合物的系統的缺乏是一個著重強調的原因。已經產生了大量抗TCR/CD3復合物的單克隆抗體(mAbs)；它們中的許多都特異性地識別CD3復合物。此外，反應性最強的抗-CD3的mAbs分為兩類僅可以識別CD3ε鏈的抗-CD3mAbs；以及僅僅識別構象表位的抗-CD3mAbs，據認為所述表位是由CD3ε鏈與CD3δ或CD3γ鏈之間天然的相互作用產生的(A.Salmeron等人《免疫學雜志》147:3047)。已將后者應用到用眼睛觀測在用相應cDNA克隆鏈轉染的非淋巴細胞的細胞質中天然CD3ε/δ和CD3ε/γ雜二聚體的形成(A.Salmeron等人《免疫學雜志》147:3047)。
2．2．通過觸發表面受體活化淋巴細胞抗淋巴細胞的mAbs的生產已經導致鑒定出大量的淋巴細胞表面抗原。已將通過淋巴細胞的亞型表達這些抗原用于將T細胞和B細胞分為特異性功能亞群和不同的分化階段。最近，已經認識到這些表面抗原的某些能夠介導活化信號。最為突出的是已經把抗CD3的抗體在缺少抗原的情況下用來活化T細胞(Leo等人，1987《美國國家科學院院報》84:1374)。另外，對T細胞活化的研究已經表明與特異性共同受體結合的配體改變了由刺激TCR/CD3復合物引發的T細胞的增殖和細胞因子的產生。
已經觀察到作為共同受體的某些表面抗原的群集造成了T細胞活化的增強。已經開發了幾種使用配體來介導受體群集的方法。例如，已將配體固定化在珠?；蛩芰媳砻嫔?，從而導致結合的受體在細胞與人造表面之間接觸的位置處群集。采用呈雙特異性分子形式的可溶性配體或者在已被結合到其各自受體以介導群集之后采用與兩種或多種單特異性配體反應的第二步試劑，也已經使得配體群集在一起。采用這些方法進行的信號轉導實驗和體外細胞活化實驗已經為功能性受體-共同受體的相互作用提供了證據。但是，尚未產生用于體內治療的可接受的組合物。
已經表明CD2與CD3的聚集或者CD4與CD3的聚集要比單獨的CD3的聚集更有力地活化T細胞(Ledbetter等人，1988，《歐洲免疫學雜志》18:525-532；Wee等人，1993，《實驗醫學雜志》177:219)。類似地，當與單獨的CD3的聚集相比時，包括CD18或CD8與CD3在內的其它受體的聚集增強了信號轉導和活化。
當已經鑒定出多個共同刺激受體時，有關其彼此之間的關系以及共同刺激對CD3活化的影響的空間和時間要求方面的知識是有限的。在一項研究中，研究了針對CD18、CD28和TCR的配體的共同固定化(Damle等人，1992《免疫學雜志》149:2541)。采用涂覆在塑料板上的抗-Ig間接地固定化ICAM1-Ig、B7-Ig和抗-TCR要比單獨地固定化ICAM1-Ig或B7-Ig增進了依賴抗-TCR的增殖。但是，ICAM1-Ig對于使T細胞休眠來說更為有效，而B7-Ig對前述活化T細胞來說更為有效，這暗示出這些共同受體之間的相互作用可能是時間上的而非物理的。
盡管多個共同受體通過TCR復合物改變活化應答，但是有關這些共同受體如何聚集在一起共同工作的信息仍是有限的。尚未充分地研究其中的每個都對活化信號和整個細胞應答在功能上作出貢獻的三個或多個受體的群集。
對B細胞活化的研究已經揭示出多個共同受體的存在改變了通過與B細胞抗原受體復合物結合引發的活化信號和應答。這些受體突出的例子包括CD19,CD20,CD21,CD22,CD40和表面免疫球蛋白(Ig)。通過采用在細胞表面上與第二步試劑交聯在一起的可溶性配體、可溶性雙特異性分子(如異源綴合抗體)或者采用在固體表面上固定化的配體的組合，已經證明了受體-共同受體的相互作用。盡管多個共同受體是已知的，但是尚未報道B細胞上三個或多個受體在功能上的相互作用。
3．發明概述本發明涉及用于調節淋巴細胞活化的組合物和方法。特別地，本發明涉及通過聚集三個或多個細胞表面抗原來活化T和/或B細胞的組合物和方法?；罨盘柨赡茉斐擅庖咴鰪娀蛎庖咭种啤?br> 本發明還涉及通過同時與多個表面受體結合并阻斷或抑制其傳遞活化信號的能力和/或通過防止其結合并活化其它細胞上的受體的能力來抑制淋巴細胞的活化。
本發明的一個目的在于通過聚集三個或多個表面抗原來擴充體外和體內T和/或B細胞的數量。擴充的T細胞和B細胞用于癌癥和傳染病(比如獲得性免疫缺損綜合征(AIDS))的過繼免疫治療。一種用于在體外聚集多個細胞表面抗原的優選方法為把結合細胞表面抗原的配體和/或對所述抗原具有特異性的抗體或其抗原-結合衍生物(諸如可變區以及可變區的互補性決定區(CDRs))吸附到固體基質(諸如培養皿或可懸浮珠)上。
當把配體、抗體或其抗原-結合衍生物吸附到對體內給藥來說是生物可降解的基質上的時候，優選通過化學綴合或重組表達的方法結合這些分子以生成單一可溶的多價分子。因此，本發明的另一目的在于構建同時與多個細胞表面抗原結合的多特異性分子。可以固定化這種多特異性分子以用于體外淋巴細胞的活化，或者可以將其作為藥物組合物向受試者給藥來調節體內淋巴細胞的活化。多特異性分子可以通過聚集多個表面受體來活化淋巴細胞，或者通過干擾T細胞和B細胞之間或者淋巴細胞和抗原呈遞細胞之間的配體/受體相互作用來抑制淋巴細胞的活化。本發明的這一方面涉及了很多的用途，其中包括、但不限于免疫缺損、傳染病和癌癥的治療以及自身免疫、超敏反應、血管病和移植排斥的抑制。
本發明一部分基于申請人發現了當與用兩種固定化抗體刺激相比時，用對三種T細胞表面抗原具有特異性的固定化抗體刺激人的T細胞導致增殖的增強。因此，三種T細胞表面抗原的聚集增強了T細胞的增殖。本發明一部分還基于申請人發現了用人T細胞表面抗原免疫接種的美洲駝產生了不含與所述抗原結合的輕鏈的抗體。由于在美洲駝中可以產生抗人細胞表面抗原的這些僅有重鏈的抗體，因此在多特異性分子的構建中這些抗體及其抗原-結合衍生物是優選的，這是因為參與抗原結合的輕鏈的缺乏取消了必須包括輕鏈或輕鏈可變區。因此，在多特異性分子的構建中僅有重鏈的抗體的使用使得生成了結合部位較少的復合物。此外，這樣的抗體比由重鏈和輕鏈組成的抗體含有更長的CDRs(尤其是CDR3)，這表明對用于構建多特異性分子來說，來源于僅有重鏈的抗體的CDR肽可能具有更高的親和力和穩定性。
本發明的一個目的在于采用由駱駝科得到的僅有重鏈的抗體、其稱作VHH的可變區或從中得到的抗原-結合CDRs來構建多特異性分子。基于刺激或抑制淋巴細胞的活化，這樣的多特異性分子對免疫調節是有用的。在致力于富集產生這類含VHH抗體的B細胞的過程中，申請人還發現美洲駝的B細胞表達了與抗-人CD40抗體具有交叉反應性的人CD40表位，并且CD40+美洲駝細胞的亞群表達僅有重鏈的抗體。此外，CD40+細胞可以被抗-CD40抗體活化以增殖。因此，本發明的一個目的在于在CD40和不含輕鏈的免疫球蛋白共表達的基礎上富集表達僅有重鏈的抗體的美洲駝B細胞，以及通過CD40的刺激擴充其數量。作為用于構建VHH區的文庫和選擇抗原-結合特異性的mRNA的來源，擴充的細胞特別有用。當缺少CH1區時，在實施例中顯示出來自L.llama的這種VHH的新亞類，并且其CDR1、CDR2和CDR3不是由二硫鍵連接的。
本發明的一個目的還在于在稱作美洲駝源化(llamalization)的過程中將傳統的抗體(諸如鼠抗體)轉化為僅有重鏈的抗體。美洲駝源化的抗體保留了其原始的抗體結合特異性、卻不與輕鏈配對。
本發明的另一個目的在于在抗體可變區或人抗原與美洲駝恒定區之間構建融合蛋白。這種融合蛋白在對美洲駝免疫接種以產生抗非美洲駝表位的VHH中特別有用。
本發明的再一個目的為生產可溶性人CD3雜二聚體。
4．附圖的簡要描述

圖1． 分離與細胞表面抗原結合的美洲駝VHH多肽的示意2． 對三種T細胞表面抗原具有特異性的固定化mAbs誘導人血T細胞增殖的增強圖3． 固定化的抗-CD3、抗-CD28和抗-CD40mAbs誘導T細胞增殖的增強圖4． 與活化CD8+T細胞相比，CD2、CD3和CD28之間活化純化的CD4+T細胞的協同作用圖5A&5B． 用固定化的抗-CD2、抗-CD3和抗-CD28抗體刺激T細胞導致細胞的生長(5B)與3H-胸苷摻入測量(5A)成正比圖6． 共同固定化在“DYNAL”珠上的抗CD3、CD2和CD28的mAbs的協同作用圖7A&7B． 共同固定化的和分開固定化的mAbs對T細胞增殖的比較。CD3×CD28=共同固定化在同一珠粒上的抗-CD3和抗-CD28mAbs；CD3×CD2=共同固定化在同一珠粒上的抗-CD3和抗-CD2mAbs；CD3+CD28=用抗-CD3或抗-CD28mAb涂覆的珠粒的混合物；CD3+CD2=用抗-CD3或抗-CD2mAb涂覆的珠粒的混合物圖8． 溶液中的或涂覆在分開珠粒上的抗-CD2在T細胞活化中抑制共同固定化的抗-CD3和抗-CD28。圖9A-9F． T細胞表達的VβTCR鏈的選擇性生長。圖10A-10F．美洲駝B細胞表達CD40和表面免疫球蛋白(Ig)，某些CD40+細胞表達不含輕鏈的Ig。美洲駝外周血淋巴細胞不被染色(10A)、或者用下列抗體染色抗-CD40(10B)、抗-CD40和抗-輕鏈(10C)、抗-輕鏈(10D)、抗-CD40和抗-Ig(10E)以及抗-Ig(10F)。圖11． 在對用抗-CD40抗體和表達CD86(或B7.2)的轉染CHO細胞外加PMA刺激響應的過程中美洲駝B細胞增殖。顯示出來自兩種不同的美洲駝的結果。圖12． 對分級分離的美洲駝抗體進行的SDS-PAGE分析。泳道1含有IgG1 D(DEAE流過)、泳道2含有IgG1 G(在pH2.7下洗脫的結合蛋白G的抗體)、泳道3含有IgG2和IgG3(在pH3.5下洗脫的結合蛋白G的抗體)、泳道4含有IgG3(蛋白G流過)。泳道3和4顯示出不含輕鏈的抗體重鏈。圖13A-13H．僅有重鏈的美洲駝抗體(IgG2和IgG3)結合人T細胞表面抗原。用IgG1 G(13A)、IgG1 D(13C)、IgG2+IgG3(13E)或IgG3(13G)對Jurkat T細胞染色，接下來再用第二步抗-Ig試劑染色。也用相同的抗體部分(13B,13D,13F和13H)對Jurkat T細胞染色，接下來再用第二步抗-輕鏈試劑染色。圖14． 駱駝科VHH噬菌體展示載體。圖15． 噬菌體克隆L10和L11與在CHO細胞表面上表達的高分子量的蛋白反應。圖16A-16B．美洲駝VHH多肽氨基酸序列的對比。16A顯示出幾個特有的雜種序列(SEQ ID NOS:1-9)的對比。16B顯示出幾個與先前報道的駱駝可變區類似的全序列的(SEQ ID NOS:10-15)對比。圖17． 美洲駝恒定區的序列(SEQ ID NOS:16-21)。圖18． 抗體9.3美洲駝源化的寡核苷酸(SEQ ID NOS:22-46)。將重疊的寡核苷酸用于重新合成9.3VH遠緣(wide)型以及美洲駝源化1型(LV1)和2型(LV2)。對美洲駝源化的寡核苷酸而言，空白處與遠緣型是相同的，因此僅列出了改變的殘基。圖19．由美洲駝源化9.3VH染色的Jurkat T細胞的FACS分析。圖20．各種CD3-Ig融合蛋白與抗-CD3mAbs、G19-4的結合活性。
5．發明的詳細描述由淋巴細胞表達的多個抗原(或受體)共同起作用以調節細胞的活化。在許多情況下，受體通過集結到鄰近位置來共同起作用或者彼此接觸以便集體地介導活化信號。在生理條件下，該過程可能受到細胞與細胞接觸的控制，其中由一個細胞表達的配體接觸由第二個細胞表達的受體，并且在細胞與細胞接觸的部位交聯和群集受體。受體接觸精確的排列和順序可能是由配體的空間取向以及由受體固有的在特定部位并以特定順序彼此接觸的能力來控制的。由群集的受體介導的活化信號依賴于所述受體或者與各受體直接或間接(通過連接分子)有關的分子固有的酶活性。群集的受體使得信號復合物在細胞膜上形成，這導致生成了依賴于群集受體的精確組成和取向的復合信號。受體群集模式的改變造成了停留細胞活化狀態的改變。
下面的部分描述了通過聚集淋巴細胞抗原以生成活化信號來模擬受體群集的組合物和方法。盡管采用對三種T細胞抗原具有特異性的固定化抗體來舉例說明了本文所述的具體步驟和方法，但它們對實施本發明來說僅僅是說明性的。在本文提供的詳細的公開內容的基礎上，類似的步驟和技術以及在功能上等同的組合物對本領域的普通技術人員來說是顯而易見的，并且它們也包括在本發明之內。
5．1．淋巴細胞表面抗原對T細胞和B細胞活化的研究已經鑒定出直接或間接介導活化信號的大量的細胞表面抗原。本文所用的“活化信號”是指以可測量的細胞活性表明的分子事件，諸如增殖、分化、細胞毒性和編程性細胞死亡以及細胞因子的分泌、細胞因子分布的改變、細胞表面受體的表達水平或分布的更改、抗體的產生以及抗體類別轉換。另外，“活化信號”可以通過檢測胞內鈣的代謝和受體的酪氨酸磷酸化作用來測定(Ledbetter等人，1991《血液》77:1271)。
除了TCR/CD3以外，由T細胞表達的介導活化信號的其它分子包括、但卻不限于CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD18、CD25、CD27、CD28、CD40、CD43、CD45、CD45RA、CD45RO、CDw150、CD152(CTLA-4)、CD154、MHC-Ⅰ類、MHC-Ⅱ類、CDw137(4-1BB)(《白細胞抗原真相手冊》1993,Barclay等人，學術出版社；《白細胞分型》1984,Bernard等人編輯，Springer-Verlag；《白細胞分型Ⅱ》1986,Reinherz等人編輯，Springer-Verlag；《白細胞分型Ⅲ》1987,McMichael編輯，牛津大學出版社；《白細胞分型Ⅳ》1989,Knapp等人編輯，牛津大學出版社；《CD抗原》1996，第六屆有關人白細胞分化抗原國際研討會．http://www.ncbi.nlm.nih.gov/prow)、ICOS(Hutloff等人，1999，《自然》397:263-266)、細胞因子受體等。在本領域中，與TCR/CD3共同起作用的細胞表面抗原常常稱作共同受體。
已經生產出抗所有前述T細胞表面抗原的特異性抗體，并且它們可以通過商業途徑得到。與前述T表面抗原結合的其它分子包括與抗原結合的抗體衍生物(諸如可變區、肽、超級抗原)及其天然的配體或配體融合蛋白(諸如抗CD2的CD58(LFA-3)、抗CD4的HIV gp120、抗CD27的CD27L、抗CD28或CD152的CD80或CD86、抗CD11a/CD18的ICAM1、ICAM2和ICAM3、抗CDw137的4-1BBL)?？梢詫⑦@種在本文中集體稱作表面抗原“結合配偶體”的分子用于傳遞或抑制對T細胞的活化信號。對某些抗原的活化來說，可以采用多個配體來實現相同的結果。例如，可以采用B7.1(CD80)、B7.2(CD86)和B7.3來活化CD28。B7.3是近來鑒定的CD80/CD86家族的成員(GenBank數據庫的登記號為Y07827)。B7.3的氨基酸序列與那些其它的家族成員的序列對比表明它類似于B7.1和B7.2，而B7.1類似于B7.2。
由B細胞表達的活化分子包括、但卻不限于表面Ig、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD40、CD45、CD80、CD86和ICAM1。類似地，可以采用這些分子的天然配體、抗這些分子的抗體以及抗體衍生物來傳遞或抑制對B細胞的活化。
在由下文第6部分實施例舉例說明的具體實施方案中，本發明證明了CD2和CD3加上CD28或CD4或CD5的聚集增強了T細胞的增殖。根據本發明的這一方面，任意的三個或多達十個的前述T細胞和B細胞抗原可以被結合并聚集以誘導T和B細胞的活化。對T細胞活化來說，優選的抗原組合包括CD2和CD3與可變的第三抗原(包括CD4,CD5,CD6,CD8,CD18,CD27,CD28,CD45RA,CD45RO,CD45,CDw137,CDw150,CD152或CD154)的組合。另外，使CD2和CD3與任意組合的兩種或三種這些表面抗原聚集也是優選的。這些組合的例子包括CD2和CD3加上CD4和CD5、或者加上CD4和CD28、或者加上CD5和CD28、或者加上CD8和CD28、或者加上CDw137和CD28、或者加上CD4和CD5和CD28。對B細胞的活化來說，優選的組合包括CD80和CD86與可變的第三抗原(包括CD40或CD56)的組合。另外，可以使CD40與CD45和CD86聚集，或使其與CD19和CD20聚集。在另一優選的實施方案中，抗原的組合包括CD3或TCR與CD28加上上述第三抗原。
5．2．用于聚集多個淋巴細胞表面抗原的方法本發明一方面涉及使具體的三個或多個抗原組合聚集以誘導淋巴細胞活化的方法。一種用于聚集多細胞表面抗原的常規方法為在固體基質上固定化抗原的“結合配偶體”，諸如通過共價鍵或非共價鍵吸附在培養皿上、吸附在珠粒上或者吸附在生物可降解的基質上。在一個優選的實施方案中，將結合配偶體涂覆在珠粒上，其中珠粒通過尺寸過濾或磁場可以容易地與細胞分離。當這種“結合配偶體”包括天然的配體、配體的結合區以及配體融合蛋白時，用于實施本發明這一方面的優選實施方案為抗體及其與抗原結合的衍生物，諸如Fab、(Fab’)2、Fv、單鏈抗體、僅有重鏈的抗體、VHH以及CDRs(Harlow與Lane,1988《抗體》冷泉港出版社；WO94/04678)。這些分子可以通過重組的方法、化學合成的方法或者通過從天然來源中純化來生產。另一種固定化的方法為使三種或多種抗體或其與抗原結合的衍生物與結合通常被共享的表位的第二種抗體交聯。在所述分子被生物素化的情況下，可以采用抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白作為第二步的交聯劑。
為了在固體基質上吸附合適的抗體或其與抗原結合的衍生物，把所述分子以1-100μg/ml的濃度懸浮在鹽水(如PBS)中。優選的是把濃度調節到10μg/ml。在4-37℃下在固體表面上培養1-24小時后，在加入細胞前進行充分的洗滌以除去游離的分子。另一方面，可以把抗體共價綴合到珠粒上。
近來，Delamarche等人(1997《科學》276:779)描述了采用微觀流體網絡在多種基質上仿造對比?？梢圆捎眠@種網絡限定抗體在所述基質的特定面積上，從而當在其上添加的細胞移動穿過基質時，它們依次暴露給不同的抗體。結果，以為了實現最佳活化的順序，通過抗體聚集了細胞表面抗原。例如，可以按照CD2→CD3→CD4的順序將T細胞暴露給抗體，以實現表面抗原的聚集。由于CD2和CD4位于CD3的附近，因此這一聚集順序造成了最佳的T細胞的活化?？墒?，預計CD2→CD4→CD3或CD4→CD2→CD3的聚集順序不是太好的，這是因為按照這些順序CD2和CD4的聚集會阻礙它們與CD3發生相互作用。根據所希望的結果，可以調整結合配偶體的比例、順序以及空間取向。
本發明的這一方面對于在培養中擴充淋巴細胞而言是特別有用的。為了制備淋巴細胞，根據標準的步驟分離出外周血單核細胞并將其添加到含有固定化抗體的培養皿中。另外在刺激之前，可以采用本領域眾所周知的方法富集T細胞或B細胞制品，其中包括、但卻不限于親和方法，如細胞分選和淘選，補體細胞毒性和可塑性粘著。類似地，可以采用這些步驟純化不同的T細胞和B細胞亞型。一般說來，刺激所述細胞幾天到一周的時間，接下來簡短地停留一段時間并且重新進行刺激。另一方面，可以每3至14天重新刺激擴充的細胞。為了促進細胞數量的擴充，可以把生長因子(如IL-2和IL-4)添加到培養物中。當mAbs附著到固體表面或珠粒上時，也可以將刺激性細胞因子類似地附著在相同的固體載體上。
為了在體內聚集多個淋巴細胞抗原，可以把抗體及其結合抗原的衍生物吸附到由天然材料(如貓腸縫線)或合成材料(如聚乙醇酸)制成的生物可降解的基質上。但是，優選的是采用具有多種抗原結合特異性的單一可溶分子進行體內給藥。事實上，當進行了固定化時，這種可溶的多特異性分子對于體外淋巴細胞的活化也是優選的。下面的部分描述了這種分子的構建。
5.3.聚集多個淋巴細胞表面抗原的多特異性分子對于在體內調節免疫系統而言，與多個細胞靶抗原結合的可溶分子具有優于在顆?；|上固定化的分子的優點。這些優點包括可溶分子迅速擴散到免疫系統中的能力，以及不含固定化基質的藥物組合物的配制?？扇艿亩嗵禺愋苑肿釉谔禺愋院涂贵w親抗原性方面具有優于單特異性分子組合的優點，從而導致效價和功效的提高。多特異性分子還擁有增加的靶細胞特異性，盡管單獨的組分缺乏對特定細胞類型的特異性。可以將幾種對不同靶抗原具有特異性的低親和力(＜50nm)結合部位一前一后地融合起來，以便形成對表達所有靶抗原的細胞而言具有增加了結合的抗體親抗原性的多特異性蛋白。例如，盡管CD18是由所有的淋巴細胞表達的，但是由結合CD18的配偶體組成的多特異性分子可能仍顯示出淋巴細胞亞型的特異性，這是因為表達CD18而非多特異性分子的其它靶抗原的淋巴細胞亞型將不結合具有高度抗體親抗原性的分子。
免疫系統的調節包括淋巴細胞的活化、不導致完全活化的不完全刺激信號，從而導致淋巴細胞的編程性細胞死亡或無反應性并同時阻斷了多個受體-配體的相互作用。另外，分泌抑制性細胞因子的細胞的活化可能造成對特異性應答的活性抑制。在該方面，T細胞可以被活化以變成“TH2”類細胞并且可以被誘導以分泌TGFβ和IL-10，其中它們是通過IL-4的產生加上對TCR/CD3的信號來抑制免疫應答的?？梢园鸭毎蜃?如IL-4)共價附著到固體載體上或者另外與抗體或配體一同固定化以誘導TH2T細胞的分化?？梢栽诘陀H和力(＜100nm)的CD3結合部位以及針對該目的的CD2和CD4結合部位之間構建多特異性分子。對T細胞的活化而言，一種優選的多特異性分子是由聚集CD2、CD3和CD28的結合配偶體組成的。其它T細胞活化的多特異性分子是由聚集CD2和CD3或者CD3和CD28以及第三個可變抗原(諸如那些以上在第5．1．部分中所述的)的結合配偶體組成的。
在本發明范圍之內的還有抑制T細胞和B細胞活化的可溶的多特異性分子。這類抑制分子可以同時結合位于同一表面上的兩個、三個并且多達十個抗原，并且通過這些抗原抑制活化信號的傳遞。這類多特異性分子的一個例子與抗原呈遞細胞和B細胞上的CD80、CD86和CD40結合，并且同時干擾CD28途徑和CD40途徑的活化。CD28和CD40途徑的雙特異性抑制劑與T細胞上的CD28和CD154(CD40配體)結合，這阻斷了CD28的活化并防止了CD154活化CD40。其它的T細胞抑制性雙特異性分子定向于CD20和CD40、或者CD2和CD4、或者CD28和CD45、或者CD2和CD154。三特異性抑制分子定向于CD2和CD28和CD45、或者CD2和CD4和CD45、或者CD2和CD4和CD28、或者CD2和CD27和CD28。
與多個B細胞受體結合并增強活化信號的可溶性多特異性分子對于誘導惡性B細胞的編程性細胞死亡來說是特別有利的。這類多特異性分子在特異性定向方面同樣具有優點，這是因為預計它們更牢固地結合到表達所有受體的細胞上，并且不太好地結合到表達由多特異性分子識別的僅僅一種受體或其一種亞型的任何細胞上。一種優選的多特異性分子同時結合CD19、CD20和CD40受體，并通過這些受體產生活化信號以造成惡性B細胞的編程性細胞死亡。雙特異性和多特異性B細胞抑制分子可以定向于位于B細胞或抗原呈遞細胞上的CD80和CD40、或者CD86和CD40、或者CD80和CD86、或者CD80和CD86和B7-3。
通過結合細胞表面抗原的多個結合配偶體的化學綴合或者通過編碼這些多肽的多核苷酸的重組表達，可以生產出多特異性分子。在致力于降低連接多個多肽鏈(諸如那些在抗體或其編碼序列中觀察到的)的復雜性的過程中，優選采用低分子量的單鏈多肽作為結合配偶體來構建多特異性分子。就此而論，據WO94/04678報道駱駝分泌出沒有輕鏈的抗體。把這種稱作VHH的僅有重鏈的抗體的可變區直接融合到與CH2和CH3區相連的鉸鏈區。重鏈中CH1區的缺少防止與輕鏈形成二硫鍵。
僅有重鏈的抗體特別適用于構建多特異性分子，這是因為沒有輕鏈參與抗原的結合。這些抗體的VHH區是更加合適的，這是因為其恒定區的去除減少了與Fc受體的非特異性結合。以下第8部分證明了L.llama的VHH區含有比傳統抗體中的CDRs要長的CDR3，并且這些VHH序列特殊亞類(雜交亞類)的CDRs不與同一可變區中的其它CDRs形成二硫鍵。因此，這些CDRs可能更加穩定并且不依賴于抗原的結合，并且可以容易地表達以進行適當的折疊。這類CDRs特有的特征使得它們特別適用于多特異性分子的構建。通過本領域眾所周知的方法(美國專利5,637,677)可以測定這些抗體中的CDRs，并使用它們來生產多特異性分子。
來自L.llama的可變區序列類似于可變區的人VH3家族中的序列(Schroeder等人，1989《國際免疫學》2:41-50)。為了降低在人接受者中使用的VHH分子的免疫原性，可以根據其與人VH3殘基的不同來改變非CDR或暴露的構架部位中的氨基酸?；诒┞兜某潭龋梢园疡橊刅HH的晶體結構用作優先考慮殘基變化的指導(Desmyter等人，1996《Nat.Struct.Biol.》3:803-811)。也可以采用另一種預測殘基免疫原性的方法(即親水性或MHC結合基元)，以便指導殘基取代的選擇。為了避免結合的抗體親抗原性的下降，應當保護CDRs之中或靠近CDRs的對抗原結合至關重要的殘基。類似地，對VHH分子的最佳折疊和表達來說，應當保護在去除疏水的VL-VH界面中被認為重要的構架殘基。
在由以下第7部分的實施例說明的具體實施方案中，由用人T細胞免疫接種的美洲駝純化的僅有重鏈的抗體與T細胞表面抗原結合。圖1提供了用于迅速篩選和選擇具有細胞表面抗原結合特異性的VHH區的示意圖。對于VHH區的產生來說，將屬于駱駝科的動物用作以純化的抗原、在人細胞表面抗原和美洲駝抗體恒定區之間生成的融合蛋白或者表達感興趣抗原的細胞免疫接種的宿主。這些宿主包括、但卻不限于東半球的駱駝科動物(如雙峰駝和單峰駝)，以及西半球的駱駝科動物(如Llama paccos,L.glama,L.vicugna和L.llama)。在免疫接種后，通過密度梯度離心分離出來自其它淋巴組織(如淋巴結和脾臟)的外周血白細胞或單核細胞，并且通過以下第8．1．2．部分中所述的逆轉錄/聚合酶鏈式反應獲得其cDNA?？梢圆捎檬删w展示技術來表達分離的VHH片段，從而選出與抗原特異性結合的VHH(美國專利5,223,409；5,403,484和5,571,698)。在以下第8部分中顯示出從美洲駝分離的大量VHH序列的例子。
僅有重鏈的抗體也可以通過最初由Koehler與Milstein(1975，《自然》256:495-497)所述的常規的雜交瘤技術生產?？梢酝ㄟ^蛋白水解切割僅有重鏈的單克隆抗體以產生VHH區。
可以將分離的VHH區或者由VHH區組成的多特異性分子與僅有生物效應物功能的第二種分子融合。例如，為了特異地傳遞以殺死不想要的細胞(如癌細胞或自身反應性T細胞)，可以將它們與毒素(諸如假單胞菌外毒素40(PE40))融合。也可以將它們與細胞因子融合以便傳遞信號給特異的細胞類型，或與受體的胞外域或受體結合域融合以便把受體的特異性和VHH的特異性結合起來。另外，可以將它們與Ig Fc區、含有特異性突變的Ig Fc區(美國專利5,624,821)或Fc區的部分融合，以便構建嵌合的抗體衍生物?？梢詫⑺鼈兣c胞內引導信號融合，以便使得特異性地結合到位于細胞內部的抗原上?？梢詫⑺鼈兣c起到酶的作用或催化酶反應的蛋白融合。另外，可以將多特異性分子表達為基因，以改善和/或簡化基因治療的載體。
5．3．1．構建多特異性分子一種制備可溶性多特異性分子的優選方法為融合多個駱駝科的VHH可變區，其中每一個都對選出的細胞靶抗原具有特異性。作為所述可變區的來源，美洲駝是一種優選的駱駝科物種，這是因為它們易于得到。多特異性分子的功能活性依賴于可變區結合部位的組成、間隔和排序。結合部位的組成將依賴于所用的單個VHH的特異性和該分子中每個VHH的數量。VHH定向特異性可能包括抗單一受體的一個或多個VHH結合區，其中所述的受體被融合到定向于第二或第三受體的其它VHH區上。定向于僅僅一個受體上的兩個或多個表位的分子包括在本發明的范圍內。對于通過與多個表位的結合在細胞表面上定向和交聯單一受體而言，這些分子具有增加的結合的抗體親抗原性。VHH區和受體表位的順序對于驅動受體內或受體間的結合模式可能是重要的。結合部位的間隔將依賴于VHH區之間所用接頭的選擇。接頭的長度和柔性是控制結合區之間的間隔的兩個因素。結合部位的排序將由排列融合蛋白構建體內部VHH區的順序來控制。
對淋巴細胞抗原或來源于所述抗原的CDRs具有結合特異性的駱駝科VHH區會以遺傳的方法或以化學的方法、以一前一后的排列被連接在一起。如果排列是以遺傳的方式連接的，那么產生了在單分子中具有多種抗原結合特異性的融合蛋白。在優選的多特異性結構中，相連的分子應當產生相同的活性譜，從而連接阻斷的、抑制的分子以產生更具潛力的免疫抑制劑。類似地，對于用可溶的或固定化的分子進行潛在的來自體內的細胞治療應用來說，為了實現通過其受體結合的淋巴細胞更有力的活化，將連接聚集并刺激結合受體的激動劑。
在抑制或活化分子中所用的接頭可能采取幾種形式中的一種，其中優選含有重復排列的甘氨酸和絲氨酸的接頭。作為一個例子，(gly4ser)3或(gly3ser2)3為在抗原結合區之間兩種優選的接頭。為了實現VHH區兩側的最佳結合，必須使該接頭延長，而這取決于細胞表面上靶抗原的大小和間隔。
可以在連續的實施方案中改變VHH區的構型，以測定何種結構產生了最佳的生物學效應。在一種三特異性分子中，位于所述分子中心的VHH區可能受到了最大的限制，因而對于其相對兩個側翼區的目標來說，它可能在抗體親抗原性方面具有明顯的下降。類似地，相比于羧基端的融合，一些VHH區可能對氨基端的融合更加敏感。因此，CD80-CD86-CD40結構的抑制作用可能不同于CD80-CD40-CD86、CD40-CD80-CD86、CD40-CD86-CD80或CD86-CD40-CD80類型的分子。
5．3．2．通過化學綴合方法生產多特異性分子通過三種或多種單個分子的化學綴合可以構建出多特異性分子。Glennie & Trutt(1990《雙特異性抗體及定向細胞的細胞毒性》第185頁，Romet-Lemonne編輯)描述了一種采用化學方法構建三特異性抗體的方法。簡而言之，通過首先制備出含有兩個Fab’臂的雙特異性F(ab’)2衍生物并將其連接到第三個Fab’臂上便可以構建出三特異性的F(ab’)3。來自兩種抗體的F(ab’)2首先被還原以生成Fab’(SH)，并且位于一個抗體Fab’(SH)上的所有可利用的巰基都被雙功能交聯劑鄰-苯二馬來酰亞胺(o-PDM)馬來酰亞胺化，接下來在使巰基的重新氧化降至最低程度的同時，在有利于巰基和馬來酰亞胺基團之間反應的條件下使Fab’(mal)和Fab’(SH)反應。在通過柱層析分離出雙特異性的F(ab)2之后，F(ab)2被還原并連接到來自第三抗體的Fab’(mal)上。所有的衍生物都被還原并且進行了烷基化以防止產生任何較少的難以對付的產物，其中所述的產物可能是在過夜培養的過程中通過二硫化物的交換或巰基的氧化生成的。使所有的多特異性Fab’衍生物都通過一種具有高度特異性的抗-鼠Fcγ免疫吸附劑，以便除去任何痕量的親代單克隆igG，其中隨著消化混合物的分級分離，所述的IgG可能與親代的F(ab’)2片段一起已經離開了。
最初設計出前面提到的方案用來采用交聯劑o-PDM通過鉸鏈區巰基一前一后的硫醚鍵連接來自鼠IgG的Fab片段以生成三特異性的F(ab’)3。但是，可以對該方法加以調整來連接任意的用于構建多特異性分子的三種或多種分子，其中包括、但卻不限于配體、配體結合區、抗體、Fv、VHH以及CDR。
5．3．3．通過重組方法生產多特異性分子含VHH區的多特異性分子將顯示出在許多細胞系統中表達水平的提高，所述細胞系統包括細菌表達系統、酵母表達系統、昆蟲表達系統和哺乳動物表達系統。VHH區中的特征性變化使得通過強烈疏水的相互作用在不需要與輕鏈可變區配對的情況下進行表達。在不與第二可變區配對以掩蔽疏水可變區界面的情況下，在細胞表面上并不分泌或表達常規的可變區。因此，將可變區的表達連接到委托與第二可變區配對的疏水界面上。VHH區被獨立地表達，并且由于限制表達的疏水殘基的改變應當以更高的水平進行表達。
含VHH區的多特異性分子還將更好地表達，這是因為可以將它們更容易地折疊成其活性構象。在細菌的表達中這將具有顯著的優勢，其中在表達變性蛋白后，在無需在體外重新折疊的步驟的情況下可以表達出活性分子。得到改善的折疊也可以協助改善哺乳動物細胞中的表達。
表達水平的改善將滿足對生產基于抗體的治療的重要需求。對基于抗體結合部位的產品的商業化來說，高成本的物質已經成為一種突出的限制，其中所述產品中的分子在體內可能是有活性的，但是對治療功效而言卻需要高水平的蛋白(有時每個病人超過1克)。事實上，有可能目前與表達有關的高成本成為對用基于抗體的產物獲得成功的最大障礙。
對重組生產而言，將含有多種結合配偶體編碼序列的緊接的多核苷酸序列插入到合適的表達載體中，即含有對插入的編碼序列的轉錄和翻譯而言必須的元件的載體，或者在RNA病毒載體的情況下含有對復制和翻譯來說必須的元件。然后，將表達載體轉染到將要表達編碼的產物的合適靶細胞中。取決于所使用的表達系統，然后通過本領域中完全確定下來的步驟來分離表達產物。用于重組蛋白和肽的生產的方法是本領域眾所周知的(參見例如Maniatis等人，1989《分子克隆實驗室指南》冷泉港實驗室，紐約；以及Ausubel等人，1989《現行分子生物學中的方案》Greene出版協會與Wiley Interscience，紐約)。
出版的駱駝科VHH分子的晶體結構(Desmyter等人，1996《Nat.Struet.Biol.》3:803-811)表明將VHH分子的氨基端和羧基端根據所述分子的不同側面、對構建多特異性融合蛋白所需的構型來暴露到溶劑中。通過經由編碼氨基酸接頭分子的間隔cDNA把編碼一種VHH的cDNAs連接到編碼第二種VHH的cDNAs上來構建多特異性VHH分子。向這種雙特異性分子中添加另一種VHH和接頭并且繼續該過程以逐漸地建造一系列的結合部位便生成了多特異性分子。通過在VHH和接頭盒的每一端包括合適的特有的限制位點，可以在任何質粒載體中用適合于這種順序插入的限制位點多接頭裝配該分子。另一方面，可以在現有的編碼幾個限制位點的質粒中構建一種新的多接頭，其中所述的限制位點被編碼在VHH分子之間至少有兩處連接的氨基酸接頭的DNA分散開。一些這樣的接頭包括(gly4ser)3、(gly3ser2)3、甘氨酸和絲氨酸的其它類型的組合(glyxsery)z、類似于那些附著到美洲駝VHH區上的(包括第146-170位氨基酸之間區域的一些或全部)鉸鏈類接頭(其中包括編碼可變長度的交替PQ基元(通常為4-6個)的序列作為接頭的一部分)、具有帶更多電荷的殘基以改善多特異性分子親水性的接頭、或者編碼小的表位(如用于檢測、鑒定和純化所述分子的分子標記)的接頭。
本發明的一個優選實施方案包括定向于CD80、CD86和CD40的VHH分子的PCR擴增，其中的每一個在cDNAs的末端上都具有特有的、稀有的限制位點。采用多接頭產生表達質粒，其中向該多接頭中已經插入了編碼上述兩種或多種氨基酸接頭的互補寡核苷酸并已使所述的寡核苷酸退火。在插入的寡核苷酸的每一端上，限制位點與在VHH盒之一的氨基末端或羧基末端(5’或3’端)上發現的相匹配。然后，可以通過連續地消化和連接帶有單個VHH盒的寡核苷酸-多接頭質粒來裝配多特異性分子。
可以利用多種宿主表達載體系統來表達多特異性分子。這些包括、但卻不限于用含有合適編碼序列的重組噬菌體DNA或質粒DNA表達載體轉化的微生物(如細菌)；用含有合適編碼序列的重組酵母或真菌表達載體轉化的酵母或絲狀真菌；用含有合適編碼序列的重組病毒表達載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；用含有合適編碼序列的重組病毒表達載體(例如花椰菜花葉病毒或煙草花葉病毒)感染的或用含有合適編碼序列的重組質粒表達載體(例如Ti質粒)轉化的植物細胞系統；或動物細胞系統。
表達系統的表達元件在其長度和特異性方面有所不同。取決于所使用的宿主/載體系統，在表達載體中可以使用許多合適的轉錄和翻譯元件(包括組成型和誘導型啟動子)中的任意一種。例如，當在細菌系統中克隆時，可以使用誘導型啟動子，諸如噬菌體λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac雜合啟動子)等；當在昆蟲細胞系統中克隆時，可以使用如桿狀病毒多角體啟動子這樣的啟動子；當在植物細胞系統中克隆時，可以使用來源于植物細胞基因組的啟動子(例如熱激啟動子；針對RUBISCO的小亞基的啟動子；針對葉綠素a/b結合蛋白的啟動子)或者來源于植物病毒的啟動子(例如CaMV的35S RNA啟動子；TMV的外被蛋白啟動子)；當在哺乳動物細胞系統中克隆時，可以使用來源于哺乳動物細胞基因組的啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或者來源于哺乳動物病毒的啟動子(例如腺病毒晚期啟動子；痘苗病毒7.5K啟動子；巨細胞病毒(CMV)啟動子)；當生成含有多拷貝表達產物的細胞系時，可以使用帶有合適的選擇性標記的基于SV40、BPV和EBV的載體。
在使用植物表達載體的情況下，可以通過許多啟動子中的任意一種驅動編碼多特異性分子的序列的表達。例如，可以使用病毒啟動子，諸如CaMV的35S RNA和19S RNA啟動子(Brisson等人，1984《自然》310:511-514)、或者TMV的外被蛋白啟動子(Takamatsu等人，1987《EMBO J.》6:307-311)；另一方面，可以使用植物啟動子，諸如RUBISCO的小亞基啟動子(Coruzzi等人，1984《EMBO J.》3:1671-1680；Broglie等人，1984《科學》224:838-843)或熱激啟動子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurley等人，1986 《分子細胞生物學》6:559-565)。采用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微量注射、電穿孔等，可以將這些構建體引入植物細胞中。對這類技術的綜述參見例如Weissbach & Weissbach,1988《植物分子生物學方法》學術出版社，紐約，第Ⅷ部分，第421-463頁；以及Grierson & Corey,1988《植物分子生物學》第2版Blackie，倫敦，第7-9章。
在一種可以用于生產本發明所述分子的昆蟲表達系統中，將苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)用作載體以表達外源基因。該病毒在草地夜蛾的細胞中生長?？梢詫⒕幋a序列克隆到所述病毒的非必需區(例如多角體基因)并將其置于AcNPV啟動子(例如多角體啟動子)的控制下。編碼序列的成功插入將導致多角體基因的失活并且產生了非包含體型重組病毒(即缺少由多角體基因編碼的蛋白質外殼的病毒)。然后使用這些重組病毒來感染在其中表達插入基因的草地夜蛾的細胞(例如參見Smith等人，1983《病毒學雜志》46:584；Smith，美國專利4,215,051)。這種表達系統進一步的例子可以在下列文獻中找到《現行分子生物學中的方案》第2卷，Ausubel等人編輯，Greene出版協會與Wiley Interscience。
在哺乳動物宿主細胞中，可以使用許多基于病毒的表達系統。在把腺病毒用作表達載體的情況下，可以把編碼序列連接到腺病毒轉錄/翻譯控制復合體上(例如晚期啟動子和三聯前導序列)。然后可以通過體外或體內重組將這種嵌合基因插入腺病毒基因組中。在病毒基因組的非必需區(例如E1區或E3區)中的插入將產生在感染的宿主中可變的并且能夠表達肽的重組病毒(例如參見Logan & Shenk,1984《美國國家科學院院報》81:3655-3659)。另一方面，可以使用痘苗7.5K啟動子(參見例如Mackett等人，1982《美國國家科學院院報》79:7415-7419；Mackett等人，1984《病毒學雜志》49:857-864；Panicali等人，1982《美國國家科學院院報》79:4927-4931)。
多特異性分子可以通過本領域公知的技術來純化，諸如高效液相層析、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析等。用于純化特殊分子的實際的條件將一部分取決于諸如凈電荷、疏水性、親水性等因素并且這些對本領域的普通技術人員來說是顯而易見的。
對親和層析的純化來說，可以使用與所述分子特異性結合的任何抗體。對抗體的生產來說，可以通過用多特異性分子或其部分注射來免疫接種各種宿主動物，其中包括、但卻不限于兔子、小鼠、大鼠等。通過側鏈官能團或者與側鏈官能團相連的接頭，可以將所述分子或其肽連接到合適的載體(如BSA)上。取決于宿主的物種，可以使用各種佐劑來提高免疫應答，其中包括、但卻不限于弗氏(完全和不完全)佐劑、無機凝膠(如氫氧化鋁)、表面活性物質(如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油狀乳液、匙孔血藍蛋白、二硝基苯酚)以及可能有用的人的佐劑(如BCG(卡介菌)和小棒桿菌)。
5．4．在多個表面抗原聚集之后活化的淋巴細胞的用途根據本發明的方法，通過聚集多個表面抗原在培養中活化淋巴細胞?；罨募毎梢杂糜趥魅静?特別是病毒性傳染病、比如艾滋病)和癌癥的過繼治療。活化的細胞可以分泌細胞因子或者具有其它效應物抑制對自身抗原或移植體應答的機理，因而可能對自身免疫疾病的治療和移植排斥是有用的。另外，可以將聚集多個抗原的多特異性分子直接向受試者給藥，以便增加對感染劑(如病毒)或對腫瘤細胞的免疫應答。此外，這類分子可以將編程性細胞死亡的信號傳遞給T細胞和B細胞腫瘤，以便直接誘導腫瘤的毀滅。另一方面，通過干擾抗原的呈遞或T細胞/B細胞的相互作用，可以將多特異性分子用作免疫應答的抑制劑。這些分子對于自身免疫的治療和超敏反應以及移植排斥的預防都是有用的。
5．4．1．制劑和給藥途徑可以將本發明的多特異性分子本身或以藥物組合物的形式向受藥者給藥。通過常規的混合、溶解、造粒、制糖衣丸、研磨、乳化、制膠囊、包封或冷凍干燥的方法，可以制造出含有本發明多特異性分子的藥物組合物。可以以常規的方式采用一種或多種生理可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或輔藥來配制藥物組合物，其中上述物質有利于將所述活性成分加工成可以在藥物上使用的制劑。合適的制劑取決于所選擇的給藥途徑。
正如本領域眾所周知的那樣，對局部給藥來說，可以將本發明的多特異性分子配制成溶液、凝膠、軟膏、乳膏、懸浮液等。
全身性制劑包括那些為通過注射(例如皮下、靜脈內、肌內、鞘內或腹膜內注射)給藥而設計的制劑，以及那些為經皮、經粘膜、口服或肺部給藥而設計的制劑(諸如氣霧劑、吸入劑和噴霧劑)。
對注射而言，可以在水溶液中配制本發明的多特異性分子，其中優選生理上相容的緩沖液(如漢克溶液、林格溶液)或生理鹽水緩沖液。所述溶液可以含有配制劑，諸如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。
另一方面，多特異性分子可以以粉末的形式存在，在使用前與合適的載體(例如不含熱原的無菌水)一起配制。
對于經粘膜給藥來說，在制劑中使用適合于穿透障礙的滲透劑。這種滲透劑通常是本領域公知的。
對于口服給藥來說，通過與本領域眾所周知的藥物可接受的載體結合，可以容易地配制多特異性分子。這類載體可以使本發明的多特異性分子被配制成為片劑、丸劑糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液等，以便接受治療的病人口頭攝入。對于口服固體制劑(諸如粉劑、膠囊和片劑)來說，合適的賦形劑包括填充劑，比如糖(如乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨醇)；纖維素制劑(如玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉)和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；造粒劑；和粘合劑。如果想要的話，可以添加崩解劑，諸如交聯的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、或者海藻酸或其鹽(如海藻酸鈉)。
如果想要的話，固體劑量形式可以是采用標準的技術用糖包衣的或者用腸包衣的。
對于口服液體制劑(比如懸浮液、酏劑和溶液)來說，合適的載體、賦形劑或稀釋劑包括水、乙二醇、油、醇等。另外，可以加入增香劑、防腐劑、著色劑等。
對于頰給藥來說，多特異性分子可以采用以常規方式配制的片劑、錠劑等形式。
對于通過吸入法給藥來說，通過采用合適的推進劑(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體)，以由加壓的包裝或噴霧器噴出氣霧劑的形式來常規地將本發明所用的多特異性分子給藥。在加壓的氣霧劑的情況下，可以通過設置一個閥門以送出經計量的數量來確定劑量單位?？梢耘渲瞥隼缭谖雱┗虼等雱┲惺褂玫拿髂z的膠囊和藥筒，其中含有所述化合物和合適的粉末基質(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
也可以以直腸或鞘組合物(如栓劑或停滯灌腸劑(例如含有常規的栓劑基質，比如椰子油或其它甘油酯))的形式配制多特異性分子。
除了前面描述的制劑以外，還可以將多特異性分子配制成儲存制劑?？梢詫⑦@類長期起作用的制劑通過埋入法(例如經皮下或肌內)或者通過肌內注射給藥。因此，例如可以用合適的聚合物或疏水材料(例如以在可接受的油中的乳劑乳液的形式)或離子交換樹脂來配制多特異性分子，或者配制成微溶性衍生物(例如微溶性鹽)。
另一方面，可以采用其它的藥物送遞系統。脂質體和乳液是眾所周知可以用來送遞本發明多特異性分子的送遞載體的例子。也可以采用某些有機溶劑(比如二甲亞砜)，盡管這通常是以較高的毒性為代價的。另外，可以采用緩釋系統(諸如含有治療劑的固體聚合物的半透性基質)來送遞多特異性分子。已經明確了各種緩釋材料并且它們是本領域普通技術人員眾所周知的。取決于其化學性質，緩釋膠囊可以在幾周乃至多達100天以上的時間里釋放出多特異性分子。依賴于治療劑的化學性質和生物學的穩定性，可以采用其它用于穩定蛋白質的策略。
由于本發明的多特異性分子可以含有帶電的側鏈或末端，因此在上述制劑的任意一種制劑中可以包括作為游離酸或堿或者作為藥物可接受的鹽的形式。藥物可接受的鹽為那些基本上保留了游離堿的生物活性并且通過與無機酸反應制得的鹽。比起相應的游離堿的形式，藥用鹽傾向于在水溶液和其它極性溶劑中更易于溶解。
5．4．2．有效劑量本發明的多特異性分子通常是以有效地實現預期目的的量來使用的。為了用于活化或抑制免疫應答介導的T細胞和/或B細胞，以治療有效的量來給藥或施用本發明的多特異性分子或其藥物組合物。治療有效量意指有效地改善或預防待治療病人的癥狀或者延長其生命的量。治療有效量的確定完全在本領域普通技術人員的能力范圍之內(其中尤其是參照本文提供的詳細的公開內容)。
對于全身給藥來說，最初可以由體外測定來估計治療有效劑量。例如，可以在動物模型中制定一個劑量，以便得到包括在細胞培養中測定的IC50在內的循環濃度范圍?？梢园堰@類信息用來在人當中更精確地確定有用的劑量。
也可以采用本領域眾所周知的技術，由體內數據(例如動物模型)估計出初始劑量。在動物數據的基礎上，一位具有本領域普通技能的技術人員能夠容易地使得向人給藥最優化。
可以獨立地調節劑量和間隔，以便提供足以維持治療效果的多特異性分子的血漿水平。通過注射給藥的病人常用劑量在大約0.1-5mg/kg/天的范圍內，其中優選在大約0.5-1mg/kg/天的范圍內。治療有效的血漿水平可以通過每天多劑量給藥來實現。
在局部給藥或選擇性攝取的情況下，多特異性分子有效的局部濃度可能與血漿濃度無關。在無需過度實驗的情況下，一位具有本領域普通技能的技術人員將能夠使得治療有效的局部劑量最優化。
給藥分子的量當然將取決于接受治療的受試者、受試者的體重、痛苦的嚴重性、給藥的方式以及開處方醫師的判斷。
當癥狀可以檢查出來或者甚至當癥狀沒有檢查出來時，可以間歇性地重復所述的治療?？梢詥为毜鼗蚺c其它藥物結合來提供治療。
5．4．3．毒性優選地，本文所述的治療有效劑量的多特異性分子將提供治療的益處，而基本上不帶來毒性。
本文所述的多特異性分子的毒性可以通過在細胞培養或實驗動物中的標準藥學步驟來確定，例如通過測定LD50(使群體的50％致死的劑量)或LD100(使群體的100％致死的劑量)。在毒性與治療作用之間的劑量之比為治療指數。顯示出具有高治療指數的分子是優選的。由這些細胞培養測定和動物研究中獲得的數據可以用來制定對在人當中使用來說無毒的劑量范圍。本文所述的多特異性分子的劑量優選處于有極少的毒性或者無毒的循環濃度的范圍內，其中包括有效劑量。取決于所采用的劑量形式以及所采用的給藥途徑，所述劑量可以在該范圍內變化。考慮到病人的條件，確切的制劑、給藥的途徑以及劑量可以由每個醫師來選擇(參見例如Fingl等人，1975《治療的藥理學基礎》第1章，第1頁)。
5．5．表達美洲駝VHH的轉基因動物通過轉基因技術可以在動物中表達由本文公開的方法分離的VHH基因序列，以新生出表達美洲駝VHH的生成(founder)動物(美國專利5,545,806；WO98/24893)。可以采用任何物種的動物，其中包括、但卻不限于小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、豬、小豬(micro-pig)、山羊、綿羊以及非人的靈長類動物(例如狒狒、猴子和黑猩猩)，以便生成表達美洲駝VHH的轉基因動物。本文所用的術語“轉基因”是指表達來自不同物種的編碼序列的動物(例如表達美洲駝基因序列的小鼠)。
可以采用本領域公知的任何技術把VHH轉基因引入到動物中，以便生產出轉基因動物的生成系。這類技術包括、但卻不限于原核微量注射(Hoppe與Wagner,1989，美國專利4,873,191)；進入種系的逆轉錄病毒介導的基因轉移(Van der Putten等人，1985《美國國家科學院院報》82:6148-6152)；胚胎干細胞中的基因尋靶(Thompson等人，1989《細胞》56:313-321)；胚胎的電穿孔(Lo,1983《分子細胞生物學》3:1803-1814)；以及精子介導的基因轉移(Lavitrano等人，1989《細胞》57:717-723)(參見Gordon,1989，轉基因動物，Intl.Rev.Cytol.115,171-229)。任何本領域公知的技術都可以用來產生含有VHH轉基因轉基因動物的克隆，例如由培養的誘導至休眠的胚胎、胎兒或成熟細胞核移植到去核的卵母細胞中(Campbell等人，1996《自然》380:64-66；Wilmut等人《自然》385:810-813)。
本發明提供了在其所有細胞中都攜帶有VHH轉基因的轉基因動物，以及在一些細胞中、而非其所有細胞中攜帶有轉基因的動物(即鑲嵌動物)。可以以單個基因區段或以多聯體(例如頭對頭的串聯或者頭對尾的串聯)的形式來整合VHH。例如通過遵照Lasko等人的教導(1992,《美國國家科學院院報》89:6232-6236)，也可以將VHH轉基因選擇性地引入到特殊的細胞類型(如淋巴細胞)中。為這種細胞類型特異性活化所需的調節序列將依賴于特殊的感興趣的細胞類型，并且對本領域的普通技術人員來說是顯而易見的。當希望將轉基因整合到內源可變區基因的染色體位點上時，基因尋靶是優選的。簡而言之，當將要采用這種技術時，通過與染色體序列進行同源重組，為了整合到內源基因的核苷酸序列中并破壞所述核苷酸序列的功能，設計出含有一些與內源基因同源的核苷酸序列的載體。例如通過按照Gu等人的教導(1994《科學》265:103-106)，也可以將轉基因選擇性地引入到特殊的細胞類型中，從而使僅在所述細胞類型中的內源基因失活。對這種細胞類型特異性失活而言所需的調節序列將依賴于感興趣的特殊的細胞類型，并且對于本領域普通技術人員來說是顯而易見的。
一旦已經生成了轉基因動物，可以采用標準的技術來測定美洲駝VHH的表達?？梢酝ㄟ^Southern印跡分析或PCR技術來完成最初的篩選以分析動物組織，從而測定VHH的整合是否已經發生。采用下列技術也可以評價免疫接種抗原后轉基因動物組織中VHH的mRNA表達水平，其中所述技術包括、但卻不限于由動物獲得的組織樣品的Northern印跡分析、原位雜交分析和RT-PCR。采用對美洲駝可變區表位具有特異性的抗體，也可以通過免疫細胞化學法評價VHH表達組織的樣品。
通過用抗原免疫接種轉基因動物，可以采用本領域公知的各種步驟來生產抗任何抗原的VHH。由于試劑的處理和得到很容易，因此小鼠是優選的。這樣的抗體包括、但卻不限于多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體、抗-獨特型抗體、與抗原結合的抗體片段以及由可變區表達文庫生產的片段。
可以使用不同的佐劑來增加免疫應答，取決于宿主的物種，其中包括、但卻不限于弗氏(完全和不完全)佐劑、無機凝膠(如氫氧化鋁)、表面活性物質(如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油狀乳液、匙孔血藍蛋白、二硝基苯酚)以及可能有用的人的佐劑(如BCG(卡介菌)和小棒桿菌)。
可以通過采用由培養中的連續細胞系提供產生抗體分子的任何技術來制備mAbs。這些技術包括、但卻不限于最初由Kohler與Milstein所述的雜交瘤技術(《自然》1975,256:495-497)。這樣的抗體可以是僅有重鏈的抗體以及任何種類的免疫球蛋白(其中包括、但卻不限于IgG,IgM,IgE,IgA,IgD)及其任意的亞類。
現已描述了本發明，下面通過舉例說明而并非限制的方式提供了下列實施例。6．實施例對三種T細胞表面抗原具有特異性的固定化抗體增強了人T細胞的增殖6．1．材料與方法6．1．1．刺激人T細胞的增殖通過在“FICOLL”上離心從人的外周血中分離出單核的細胞。通過兩輪粘附到塑料上來除去單核細胞。然后，在含有固定化抗體的以每孔50,000個細胞的量在96孔Costar平底微量滴定板中刺激單核細胞。通過于37℃下以100μl/孔的量在孔中的磷酸緩沖鹽水(PBS)中培養純化的抗體混合物3小時、隨后在加入細胞前從孔中洗掉未結合的抗體來固定化所述的抗體?？贵w濃度為10μg/ml的抗-CD3、10μg/ml的抗-CD2以及所指示的改變濃度的第三抗體。在培養了4天的最后18個小時中，通過摻入3H-胸苷在孔中以一式四份測量增殖。顯示出平均值，并且標準誤差在每個點值處小于平均值的15％。
6.1.2.抗T細胞抗體MAb抗-CD3、OKT3是從ATCC獲得的(ATCC CRL-8001)。MAb抗-CD28、B-T3是由Diaclone(Besancon，法國)購買的。MAb抗-CD2,9.6，和抗-CD28抗體，9.3是由John Hansen(FHCRC，西雅圖，WA)提供的?？?CD4、OKT4是從ATCC獲得的(ATCC CRL-8002)。MAb抗-CD5,10.2是由John Hansen(FHCRC，西雅圖，WA)提供的。對照的mAb為L6。抗-CD40 mAb是由Clark與Ledbetter描述的(1986《美國國家科學院院報》83:4494-4498)。抗-CD18 mAb是由Beatly等人描述的(1983《免疫學雜志》131:2913-2918)。
6．1．3．T細胞亞型的制備通過在“FICOLL”上離心，接下來通過去除單核細胞、B細胞、NK細胞和CD4細胞或CD8細胞分離出CD4+或CD8+亞型，從外周血中分離出T細胞。采用抗CD14、CD20、CD11b以及CD8或CD4的mAbs，接下來采用以抗-小鼠IgG涂覆的磁性珠除去結合抗體的細胞來去除細胞。在去除步驟之后，當用流式細胞儀分析時，CD4+或CD8+T細胞的純度大于95％。在涂覆抗體的微量滴定板中以5×104的量培養細胞4天，并且在培養的最后12個小時期間通過摻入3H-胸苷來測量增殖。微量滴定板含有所述的固定化抗體，其中在一些孔中含有對照物、非結合的L20抗體，以便使用于固定化的總蛋白濃度相等。通過在37℃下以每份10μg/ml的量培養18小時、接下來通過充分的洗滌除去未結合的蛋白來固定化抗體。
6．1．4．抗-TCR可變區的抗體采用兩步法，將特異于TCR Vβ8(Pharmingen 3313 1A)、Vβ9(Pharmingen 3313 1B)、Vβ14(Coulter Im.1557)以及Vβ20(CoulterIm.1561)的mAbs固定化在培養平板上。將純化的山羊抗-小鼠(Capel)抗體首先固定化，隨后在加入抗-VβmAb和抗-CD28之前進行洗滌和封閉。觀察細胞的生長，在9天后，將增殖的細胞轉移到含有5U/mL白細胞介素-2(R&D,Inc.,Minneapolis,MN)的新的培養平板上。5天后，在第14天時，通過流式細胞儀采用第二熒光素綴合的抗-小鼠IgG試劑(Biosource)分析細胞中TCR Vβ特異性的表達。
6．1．5．為了細胞的刺激，抗體偶聯到珠粒上把用M-450甲苯磺酰基活化的2.8ml“DYNAL”珠(奧斯陸，挪威)的懸浮液以4×108個珠粒/ml的量洗滌三次，每次都采用4ml 0.1M的硼酸鈉溶液(pH9.5)并采用磁體去除緩沖液。然后把珠粒懸浮在1.5ml的硼酸緩沖液中。向200μl(1.8×108個珠粒)的珠粒懸浮液中添加140μl硼酸緩沖液、30μg指定待偶聯的抗體和PBS的混合物。調整加入的PBS的體積，以便反應混合物的最終體積為400μl。偶聯出抗CD3(OKT-3)、CD28(9.3)和CD2(9.6)的抗體所有可能的組合。在37℃下，在旋轉器上使抗體與珠粒反應大約20小時。接下來，用磁體除去未反應的抗體。然后，用含有0.1％(重量∶體積)疊氮化鈉的1ml PBS洗滌珠粒制品三次，并用含有3％(體積∶體積)人血清、5mM EDTA和0.1％(重量∶體積)疊氮化鈉的PBS(儲存緩沖液)洗滌三次。在室溫下，在旋轉器上于儲存緩沖液中進行三次洗滌的最后一次洗滌共30分鐘。然后在4℃下在旋轉器上，將所有的珠粒制品與儲存緩沖液一起培養大約31個小時。接下來，將各種制品重新懸浮在1.0ml的儲存緩沖液中。
通過密度離心分離出外周血淋巴細胞。將淋巴細胞粘附到含2％FCS的RPMI中的塑料上。使細胞形成片狀沉淀并以2.5×105/ml的密度平板接種到96孔平底平板上。然后，將與mAbs綴合的dynal珠粒與細胞一起以3個珠粒比1個細胞的比例進行平板接種。在37℃和5％CO2的條件下培養細胞5天。然后，將1μCi/孔的3H-胸苷添加到孔中并培養過夜。在玻璃濾墊上收獲培養物并且進行細胞增殖的測量(cpm)。
6．2．結果人的T細胞是從正常供體的外周血中分離出來的，并且在體外用抗三種T細胞表面抗原的固定化mAbs刺激。通過吸附在培養平板的表面上、隨后在培養基中與T細胞一起培養來共同固定化對CD2和CD3具有特異性的抗體以及第三抗體(比如抗-CD28、抗-CD4或抗-CD5)。將T細胞的增殖測定為T細胞活化的測量指標。當與固定化的抗-CD2、抗-CD3抗體以及第三對照抗體L6(對并非由T細胞表達的抗原具有特異性)的組合使用相比時，前述三種固定化抗體的組合增強了T細胞的增殖(圖2)。特別地，在所有測試濃度下，抗-CD2、抗-CD3和抗-CD28的組合產生了最高水平的T細胞的增殖。比起溶液中存在的相同抗體或者兩種固定化抗體加上溶液中的第三抗體，三種固定化抗體誘導出更多的細胞增殖。共同固定化的抗-CD3和抗-CD28加上抗-CD18mAbs也要比所述三種抗體中兩種的組合誘導出更多的T細胞增殖。另外，共同固定化的抗-CD3、抗-CD28和抗-CD40mAbs增強了純化的T細胞的增殖(圖3)。注意的是CD40是由活化的T細胞以及抗原呈遞細胞表達的。因此，由共同固定化的抗體聚集三種T細胞表面抗原增強了T細胞的活化。固定化抗體可以用來擴充培養中T細胞和B細胞的數量并誘導細胞的分化。比起從在溶液中添加的抗體中進行的分離，活化的細胞可以更容易地從固定化抗體中分離出來，從而當收獲細胞用于過繼治療時，可以使注射與細胞結合的抗體進入受藥者體內的量降低到最小。
當將純化的CD4+或CD8+T細胞與固定化的抗-CD3抗體一起培養時，無論該抗體是以30μg/ml的濃度單獨固定化還是與對照抗體L20一起以10μg/ml抗-CD3加上20μg/ml L20的濃度固定化，細胞的增殖都是最少的(圖4)。但是，當把抗-CD28mAb與抗-CD3一起固定化時，觀察到CD4+和CD8+T細胞兩者增殖的增加，并且通過加入更多的抗-CD28mAb并不進一步增強這種作用(圖4)。類似地，在單由抗-CD3誘導的水平之上，共同固定化的抗-CD2mAb和抗-CD3mAb增加了CD4+和CD8+T細胞的增殖。當在抗體固定化步驟中抗-CD2和抗-CD28兩者都被添加到抗-CD3中時，在CD4+T細胞的增殖方面存在著進一步顯著的增加，而在由抗-CD3加上抗-CD28誘導的或者由抗-CD3加上抗-CD2誘導的水平之上卻沒有增強CD8+細胞的增殖。這些結果表明比起共同固定化的抗-CD3和抗-CD28的組合或者抗-CD3和抗-CD2的組合，共同固定化的抗-CD3、抗-CD28和抗-CD2抗體的組合增強了CD4+T細胞的增殖。在總的T細胞刺激中，預計抗-CD3、抗-CD28和抗-CD2的組合通過CD4+T細胞誘導了更大量的淋巴因子的產生，這繼而又刺激了更為強烈的CD8+T細胞的活化。就此而論，共同固定化的抗體通過活化的T細胞刺激了不同的細胞因子的分布，這取決于采用三種或多種抗體的哪一種特異性結合。可以將這種活化的T細胞與其它的細胞類型(諸如單核細胞或樹突細胞)在體外協同培養，以便在缺少外源細胞因子的情況下促進其生長或分化。
另外，圖5A和5B顯示出在用固定化抗體刺激后，T細胞增殖的3H-胸苷摻入測量結果與細胞的生長成正比。在第7天時采用12小時的3H-胸苷的脈沖來測量純化的CD4+T細胞的增殖，而細胞的數目則是在第8天時通過用血細胞計數器直接進行細胞計數來測量的。這樣的發現表明通過3H-胸苷的攝取對T細胞增殖的測量直接反映出共同固定化的抗-CD2、抗-CD3和抗-CD28抗體在培養中擴充T細胞數量的能力。
為了測試在另一種形式的固體載體上固定化的抗體活化T細胞的能力，將mAbs共同固定化在“DYNAL”珠粒上并與人的T細胞一起培養。圖6顯示出與單獨的抗-CD3或者兩種抗體的組合相比，從所有試驗的病人來看，共同固定化在珠粒上的抗-CD3、抗-CD2和抗-CD28抗體的組合始終誘導最高水平的T細胞的增殖。因此，在珠粒上抗體的共同固定化產生了突出的T細胞的活化。此外，圖7A和7B證明了比起帶有單獨固定化抗體的珠粒的混合物，抗體在同一珠粒上的共同固定化產生了更高水平的T細胞增殖，這表明通過使所述抗體定位在彼此鄰近的位置上來最佳地實現多個表面分子在T細胞上的聚集。就此而論，圖8顯示出固定化在單個珠粒上的或在溶液中添加的抗-CD2抑制了T細胞的增殖，而所述的增殖是由共同固定化在同一珠粒上的抗-CD3和抗-CD28刺激的。
在另一項實驗中，通過與抗-CD28一起共同固定化在培養平板上的抗-TCR可變區抗體來選擇性地刺激T細胞，隨后分析培養細胞的Vβ特異性。用共同固定化的抗-TCR Vβ8和抗-CD28刺激的細胞對于Vβ8的表達來說有72％是呈陽性的，但是在單由對照的抗-小鼠IgG第二步試劑檢測的水平之上卻并不表達Vβ9、Vβ14或Vβ20(圖9B,9D和9F)。可是，用來自同一供體樣品的共同固定化抗-TCRVβ9和抗-CD28刺激的細胞不與抗-Vβ8、抗-Vβ14或抗-Vβ20抗體反應，但卻與抗-Vβ9 mAb明顯地反應(有65％呈陽性)(圖9A,9C和9E)。在抗體刺激前分析的來自該供體的細胞顯示出這些Vβ特異性分子的每一種的表達少于5％。
這些數據表明采用對單個TCR Vβ表位具有特異性的mAbs以及在固體表面上共同固定化的抗-CD28mAb，可以選擇性地擴充非常少量的T細胞亞群。由于TCR Vβ的使用表明與T細胞的抗原特異反應性明顯相關，并且在患有自身免疫疾病和癌癥的病人中可能非常歪曲TCR Vβ的使用，因此有可能采用與抗-CD28 mAb一起固定化的合適的VβmAb，可以選擇性地擴充抗原特異性T細胞或者對于特異性抗原識別來說高度富集的T細胞。此外，將第三種mAb固定化到其它的T細胞抗原(如CD2,CD150,CD5或ICOS)上將會進一步增強表達特異性Vβ的T細胞的選擇性擴充。也可以與抗-CD28和其它的mAbs一起使用抗兩種或多種Vβ鏈的抗體，以便在不擴充其它的T細胞亞型的情況下擴充表達所需Vβ多肽鏈的T細胞。再者，通過抗與其它抗體共同固定化的γδ雜二聚體的mAb，也可以選擇性地擴充表達γδTCR的T細胞。任何與TCR/CD3復合體的組成部分(包括任意的CD3多肽鏈或者TCRα/β或γ/δ二聚體的表位，比如CDRs)具有反應性的抗體都可以用來實施本發明。
7．實施例美洲駝B細胞表達的CD40以及所生產的結合人細胞表面抗原的僅有重鏈的抗體7．1．材料與方法7．1．1．免疫接種美洲駝Llama llama是從JJJ農場(Redmond,WA)獲得的，并且用溶于PBS和弗氏完全佐劑的人的細胞經腹膜內免疫接種，隨后用溶于弗氏不完全佐劑的相同細胞加強免疫至少3次。用于免疫接種的細胞類型包括正常未受刺激的或者活化的人外周血淋巴細胞(PBL)、T細胞系(諸如Jurkat和HPB-ALL)、B細胞系(諸如Daudi和Ramos或EBV-轉化系CESS)。也用100-500μg純化的融合蛋白免疫接種美洲駝，其中的融合蛋白溶于與適合于所述細胞的上述佐劑混合的PBS中。在每次加強免疫后第4-7天時給動物放血，以確定血清中是否含有與靶細胞之間具有反應性的抗體。取決于動物的抗體應答，在第三次加強免疫之后或者在隨后的加強免疫之后進行大量的放血(200ml)。通過頸靜脈的靜脈穿刺給動物放血，并且用檸檬酸鹽抗凝劑處理全血。
7．1．2．制備美洲駝的外周血將美洲駝的全血(200ml)在900rpm下離心20分鐘，并將含有外周血單核細胞的細胞的上層吸到第二個試管中。然后將該部分以1∶1的比例在PBS中稀釋，并把30ml裝載到15ml的淋巴細胞分離介質(LSM,Organon Teknika)的墊子上。通過在Sorvall臺式離心機中在2000rpm下離心20分鐘來分級分離出暗黃色的(buffy)膜，并且通過從血清/LSM界面中吸入來分離。在PBS或者不含血清的RPMI中洗滌細胞三次，在1200-1400rpm下旋轉10分鐘，并且在最后的旋轉后進行計數。將適當數量的細胞等分到新的離心管中以進行最后的旋轉。在干冰-乙醇浴中以108個細胞/試管的量將最后的細胞沉淀速凍至不含液體，并在-70℃下放置直至mRNA分離。另一方面，為了在體外的結合測定或者功能研究中使用，將細胞以106個細胞/ml的密度重新懸浮在RPMI/10％胎牛血清中并且培養過夜。為了在將來的功能測定中使用，還以2×107個細胞的等分試樣將細胞在血清/10％DMSO中冷凍。
7．1．3．細胞染色與流式細胞計量術來自L.llama的PBL是通過在LSM上離心分離出來的，并且用抗-CD40mAb、G28-5(美國專利5,182,368)、抗-美洲駝免疫球蛋白(Ig)和抗-輕鏈抗體給細胞染色。用生物素標記了抗-CD40抗體(G28-5)，并用綴合藻紅蛋白的鏈霉抗生物素蛋白檢測其結合。用熒光素直接標記抗-美洲駝Ig。使用購自Caltag(Burlingame,CA)的綴合熒光素的抗-人κ試劑加上抗-人λ試劑進行抗輕鏈的染色。通過FACSCAN流式細胞儀分析細胞的染色。
7．1．4．美洲駝淋巴細胞的增殖通過在LSM上離心分離出來自L.llama的PBL。用佛波醇-12-豆蔻酸(PMA)(10ng/ml)、抗-CD40 mAb(1μg/ml的G28-5)、表達CD86的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、對照的CHO細胞或上述試劑的組合來刺激淋巴細胞。在測定前照射CHO細胞以防止CHO細胞增殖。在三天培養的最后12個小時中，通過摻入3H-胸苷，在每個含有50,000個淋巴細胞的微量滴定板的孔中以一式四份的方式測量淋巴細胞的增殖。顯示出來自兩種不同美洲駝的淋巴細胞增殖的平均值。
7．1．5．純化美洲駝抗體通過多個步驟將來自用多次注射Jurkat T細胞免疫接種的美洲駝的細胞分級分離成常規的并且僅有重鏈的IgG同型。首先使血清與A蛋白結合、洗脫、然后再通過DEAE離子交換層析分離。通過與G蛋白結合、接下來在pH2.7下或在pH3.5下洗脫來獨立地分級分離A蛋白的洗脫物。
7．2．結果使分離的美洲駝PBL與抗-CD40和抗-Ig或抗-輕鏈抗體反應，并通過流式細胞儀分析。圖10A和10B顯示出與抗-人CD40抗體反應的美洲駝外周血細胞的群體。兩種顏色的染色進一步證明了所有的CD40+細胞都表達表面Ig，這說明這些細胞為產生抗體的B細胞(圖10E和10F)。但是，僅有一部分CD40+細胞表達可檢測出的輕鏈(圖10C和10D)。這些結果表明美洲駝B細胞表達常規的由重鏈和輕鏈組成的抗體，以及僅有重鏈沒有輕鏈的抗體。因此，通過其與抗-CD40之間的反應性并缺乏與抗-輕鏈試劑的反應性，可以使表達僅有重鏈的抗體的美洲駝B細胞與其它的B細胞分離開。
分離出來自兩種美洲駝的PBL并用不同的試劑刺激，接下來再測量細胞的增殖?？?CD40抗體刺激美洲駝B細胞的增殖，而所述的增殖由PMA進一步強化(圖11)。當表達CD86(或B7.2)的CHO細胞單獨地并不誘導L.llama的B細胞增殖時，其與PMA的組合使用誘導了顯著的增殖(圖11)。CD40刺激也可以在培養中誘導美洲駝B細胞的分化和Ig的親和力成熟。因此，可以利用CD40刺激來選擇性地擴充產生僅有重鏈的抗體的美洲駝B細胞，以便有利于這些抗體以及其特異性VHH區的分離。另外，為了增加產生VHH的B細胞的數量，可以把抗-CD40抗體注射到美洲駝體內以便在體內刺激B細胞。通過多種方法可以分離出表達特異性可變區的細胞，其中的方法包括與紅細胞結合的特異性抗原形成的玫瑰花結。
用人的T細胞免疫接種美洲駝，并且將其血清分級分離以便使僅有重鏈的抗體與常規的由重鏈和輕鏈組成的抗體分離開。通過SDS-PAGE分析純化的抗體部分。圖12顯示出純化的Ig同型，其中包括IgG1 D(在泳道1中DEAE流過)、IgG1 G(G蛋白，在泳道2中在pH2.7下洗脫)、IgG2+IgG3(G蛋白，在泳道3中在pH3.5下洗脫)和IgG3(在泳道4中G蛋白流過)。IgG2和IgG3同型(泳道3和4)含有重鏈條帶、而沒有可檢測到的輕鏈。
為了檢測與細胞表面抗原結合的抗體，將僅有重鏈的抗體(IgG2+IgG3，和IgG3部分)與Jurkat T細胞一起培養。采用綴合了熒光素的抗-美洲駝Ig或抗-輕鏈的第二步試劑、接下來用流式細胞儀分析來檢測特異性的結合(圖13A-13H)。從未經免疫接種的美洲駝中從相同濃度的IgG同型中純化出陰性對照物。當抗-輕鏈試劑檢測到IgG1部分結合到Jurkat細胞上時(圖13B和13D)，用抗-輕鏈試劑卻檢測不到不含輕鏈的IgG2和IgG3部分(圖13F和13H)。但是，當用僅有重鏈的部分給Jurkat細胞染色并用抗-Ig第二步試劑檢測時，觀察到與Jurkat細胞表面抗原結合的抗體(圖13E和13G)?？梢詳喽ㄉ闪丝谷思毎砻婵乖牟缓p鏈的美洲駝抗體。
8．實施例構建L.llama VHH文庫并確定美洲駝VHH序列的特征8．1．材料與方法8．1．1．分離美洲駝的mRNA通過改進Chomczynski與Sacchi的硫氰酸胍-苯酚方法(1987《Anal.Biochem.》162:156-159)來制備美洲駝PBL mRNA。對于108個細胞而言，加入5-10ml的變性/裂解溶液以制備RNA。采用寡脫氧胸苷酸纖維素分離出PolyA RNA，在75％乙醇/DEPC處理的水中洗滌，將其重新離心并重新懸浮在DEPC處理的水中。
8．1．2．逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)使用SuperscriptⅡ逆轉錄酶(GIBCO-BRL)通過隨機六聯體引發的逆轉錄反應來產生cDNA。采用下列引物組進行PCR反應正向引物為LVH5’-1，所述引物為由VHH蛋白的氨基端測序設計出的一組20聚體之一，其具有序列5’CTC GTG GAR TCT GGA GGA GG3’(SEQID No:47)；而所用的反向引物為LVH3RS，所述引物為由先前測定的現存的駱駝和人VH序列設計的一種44聚體。序列5’CGT CAT GTCGAC GGA TCC AAG CTT TGA GGA GAC GGT GACYTGGG3’(SEQ ID No:48)在VH區的3’端退火。在6％丙烯酰胺/0.5×TBE凝膠上將PCR產物進行電泳，并且在溴化乙錠染色后用肉眼觀察條帶。根據制造商的說明，從2％的NuSieve GTG凝膠(FMC)中分離出DNA條帶，并采用Qiaex珠(QIAGEN)進行純化。將PCR后純化的DNA連接到pT-Adv質粒載體(Clonetech,Palo Alto,CA)上，并轉化到大腸桿菌TOP10F’(Clonetech)中。一旦測定出VH和VHH序列具有代表性的樣品后，便設計出新的引物以選出用于擴增含VHH的片段，其中基于缺少VHH片段中的CH1區，所述的片段具有不同于含VH的片段的長度。然后純化這些片段，將其克隆到噬菌體展示載體XPDNT中并且在產生含大部分VHH序列的美洲駝可變區的文庫中用作模板。
其它用于克隆美洲駝VHH區序列的方法如下。從由美洲駝PBL制備的cDNA中克隆出美洲駝IgG2特異性VHH區，并使用人Vh1家族-特異性5’引物和3’美洲駝IgG2鉸鏈區引物通過PCR進行擴增。這些引物的序列分別為AGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG(SEQ ID NO:49)和GGTTGTGGTTTTGGTGTCTTG(SEQ ID NO:50)。
另外，從由美洲駝PBL制備的cDNA克隆出美洲駝IgG2特異性VHH區，并使用人Vh2家族-特異性5’引物和3’美洲駝IgG2鉸鏈區引物通過PCR進行擴增。這些引物的序列分別為CAGGTCAACTTAAAGGGAGTCTGG(SEQ ID NO:51)和GGTTGTGGTTTTGGTGTCTTG(SEQ ID NO:50)。
也從由美洲駝PBL制備的cDNA克隆出美洲駝IgG2特異性VHH區，并使用人Vh4家族-特異性5’引物和3’美洲駝IgG2鉸鏈區引物通過PCR進行擴增。這些引物的序列分別為AGGTGCAGCTGCAGGAGTCGG(SEQ ID NO:52)和GGTTGTGGTTTTGGTGTCTTG(SEQ ID NO:50)。
匯集由擴增得到的美洲駝VHH序列，并用SacⅠ和BamHⅠ消化，然后將其插入到修飾的噬菌體展示載體XPDNT中，從而產生了基因Ⅲ融合盒。通過電穿孔將VHH文庫轉化到大腸桿菌XL1BLUE中，并平板接種到含有SB/amp/tet培養基的大的NUNC生物測定皿中。在該步驟中還進行連續稀釋樣品的平板接種以估計轉化效率。刮掉文庫放入含20％甘油的SB/amp/tet中，并在-70℃下以1-2ml的等分試樣加以冷凍。在37℃下，在添加了葡萄糖的液體2XYT/amp/tet培養基中擴增文庫幾個小時，然后用輔助噬菌體感染，將其平板接種以測定噬菌體的滴度，并且于30℃下在選擇性條件下在缺少葡萄糖的培養基中培養過夜。通過離心以沉淀細菌、隨后用PEG沉淀培養上清液并且進行第二次離心以回收噬菌體沉淀來從這些培養物中分離出擴增的噬菌體。在加入PEG/NaCl之前，還收獲未沉淀的培養上清液的小等分試樣。把沉淀重新懸浮在1/100體積的PBS/1％BSA中，并在2000-5000RCF下旋轉幾分鐘以沉淀不溶的物質。在相對于預封閉的人的抗原或細胞進行淘選之前，通過在冰上在10％脫脂奶粉/PBS中培養1小時來預封閉噬菌體儲備液或上清液。用未轉染的或普通的人細胞或者用無關的Ig融合蛋白預清除許多輪的淘選，以便降低非特異性結合的頻率。通過在冰上將封閉的噬菌體和抗原或細胞共同培養1小時并且離心以沉淀出結合的噬菌體來進行預清除和淘選。對于用Ig融合蛋白抗原淘選來說，在離心之前，使用A蛋白瓊脂糖凝膠來捕獲噬菌體-抗原復合物。在洗脫前，在10％牛奶/PBS、PBS/1％BSA或PBS/封閉劑/0.05％Tween中洗滌結合的細胞或A蛋白瓊脂糖凝膠至少6次并且多達12次。通過在幾種不同緩沖液中的一種之中培養并且在室溫下培養10分鐘，進行結合的噬菌體的洗脫。洗脫緩沖液包括溶于PBS的0.1NHCl(pH2.5),0.1M檸檬酸(pH2.8)，溶于PBS的0.5％NP-40或100MM三乙胺。使細胞/瓊脂糖凝膠沉淀，并將含有洗脫的噬菌體的上清液平均等分放入新的試管中。在用對數期的XL1BLUE細胞感染之前，在1M Tris(pH 9.5)中中和洗脫物。感染之后，取出等分試樣以測定洗脫的噬菌體的滴度。然后在每一輪的淘選中，擴增來自這些平板接種的隨機克隆以確定插入頻率和DNA序列。從最初的文庫以及在每一輪從隨機克隆淘選后測定美洲駝的VHH序列。
8．1．3．噬菌體展示載體構建出噬菌體展示載體，其中創建了編碼對人的抗原具有特異性的美洲駝免疫球蛋白VHH區的雜合融合蛋白，而所述的融合蛋白與截短型的噬菌體M13外被蛋白Ⅲ相連(圖14)。噬菌粒載體含有pUC載體骨架，幾種M13噬菌體衍生出用于表達基因Ⅲ融合蛋白以及在用輔助噬菌體共感染后包裝噬菌粒的序列。以兩種方式構建載體，其區別在于實現兩種蛋白區域之間融合的方式。第一種形式包括兩個區域間作為用于純化和檢測功能性融合蛋白的潛在工具的his6標記。第二種形式缺乏該標記并且在兩個盒之間僅僅含有單一的(gly4ser)亞基。除非在前導肽區域和基因Ⅲ區域之間插入VHH，構建出攜帶有來自讀框和非功能區的基因Ⅲ融合片段的兩種型式的載體。通過PCR擴增所有的VHH分子，該分子具有SacⅠ-BamHⅠ末端以便在ompA前導肽(EcoRⅠ-SacⅠ)和在SpeⅠ處開始的基因Ⅲ融合片段之間插入。一旦檢測并分離出對人的抗原或細胞具有結合活性的VHH盒的話，那么可以將SacⅠ-BamHⅠ片段直接轉移到具有匹配的位點的哺乳動物表達載體中。所述的哺乳動物載體含有HindⅢ-SacⅠ前導肽以及用于表達人、美洲駝或小鼠Ig融合蛋白的BamHⅠ-XbaⅠ免疫球蛋白區。這種改變的載體允許推定的結合抗原的VHH迅速地穿梭進入更適合于進行功能分析的系統中。
在用靶抗原進行3-5輪淘選后分離出單個的噬菌體克隆。采用來自每輪淘選的洗脫物來感染宿主細菌，并將等分試樣平板接種到適合于分離的克隆的LB/amp/tet平板中。將單個的克隆接種到2XYT/amp/tet液體培養基中若干小時，用輔助噬菌體感染，并在30℃下在選擇性的條件下培養過夜。然后通過離心沉淀細胞來制備噬菌體的上清液，并將培養上清液等分放入新的試管中。通過用PEG沉淀培養上清液來制備沉淀的濃縮的噬菌體(100X)，并將其重新懸浮在PBS/1％BSA中。
在冰上用10％脫脂奶粉/PBS以1∶1的比例預封閉實驗的噬菌體上清液、沉淀或輔助噬菌體30分鐘。對人的PBL或單核細胞計數并重新懸浮在5％脫脂奶粉/PBS中，在冰上預封閉30分鐘。之后，沉淀細胞并重新懸浮在5％脫脂奶粉/PBS中，以每個樣品25μl的量將其加入到預封閉的噬菌體中，并且在冰上培養1小時。在結合后，用5％牛奶/PBS和1％BSA/PBS交替地洗滌細胞3次。將染色培養基(2％FBS/RPMI+0.1％疊氮化鈉)中10μg/ml的小鼠抗-M13抗體以每個樣品100μl的量添加到細胞中，并在冰上培養1小時。如上洗滌細胞3次。將染色培養基中1∶100的綴合了FITC的山羊F(ab’)2抗-小鼠Ig(γ鏈和輕鏈，AMI4408 BioSource Int.)以每個樣品100μl的量添加到細胞中，并在冰上培養30分鐘。然后洗滌染色的樣品并通過流式細胞儀進行分析。
8．1．4．測定DNA片段的序列采用具有96℃變性分布的25次循環的程序，在PE2400循環變溫加熱器上使亞克隆的DNA片段進行循環測序10秒鐘，在50℃下退火30秒鐘，并在72℃下延伸4分鐘。所用的測序引物為T7啟動子引物5’TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA3’(SEQ ID NO:53)和M13反向測序引物5’AAC AGC TAT GAC CAT G3’(SEQ ID NO:54)(Genosys Biotechnologies,The Woodlands，德克薩斯州)。根據制造商的說明，采用巨大染料終止劑備用測序混合物(PE應用生物系統公司，Foster市，加利福尼亞州)進行反應。將樣品用乙醇沉淀、變性，并通過在ABI 310遺傳分析儀(PE應用生物系統公司)上進行毛細管電泳來分析。使用測序儀3.0(Genecodes)編輯和翻譯序列。
8．2．結果如以上第7．1．1．部分所述，用人的淋巴細胞或融合蛋白免疫接種美洲駝，以便產生對淋巴細胞表面抗原的抗體應答。在免疫接種后，制備出美洲駝的PBL，并通過RT/PCR獲得含VHH的DNA片段以構建出VHH文庫。
為了從用人的淋巴細胞免疫接種的美洲駝中克隆出與細胞結合的VHH序列，構建出噬菌體展示載體(圖14和以上第8．1．3．部分)。表Ⅰ顯示出幾種分離的噬菌體克隆，其中的每一種都顯示出與不同的人細胞類型結合的特有模式。隨后的序列分析驗證了每種克隆都編碼特有的VHH。另外，分離出兩種VHH克隆L10和L11，其中所述的克隆與在CHO細胞上表達的150-200kDa抗原的高分子量糖蛋白反應(圖15)。當用胰蛋白酶預處理CHO細胞時，完全消除了這些克隆與靶抗原的結合。在用神經氨酸酶或其它內切糖苷酶處理細胞后，僅僅部分地減少了VHH的結合。因此，VHH克隆與在CHO細胞表面上表達的糖蛋白反應。
表Ⅰ．VHH的噬菌體克隆與不同細胞類型的結合模式
分離出大量的美洲駝VHHDNA克隆，對其測序并翻譯。由于在含有抗原或抗原表達細胞的平皿上通過幾輪淘選選出了噬菌體的克隆，因此在五輪淘選后減少了克隆的序列多樣性。對比得到的VHH的蛋白序列，以便從美洲駝中鑒定出存在于該抗體可變區家族中的序列基元。序列對比揭示出L.llama中兩個亞類的VHH序列，在本文中將它們稱作雜合的(SEQ ID NOS:1-9)和完全的(SEQ ID NOS:10-15)VHH序列。這兩個亞類都不含常規重鏈的CH1區，因此兩者都被表達為直接與抗體的鉸鏈-CH2-CH3區融合的VHH區。在兩種類型的VHH分子中都觀察到存在于大多數抗體可變區中的高變區CDR1、CDR2和CDR3(圖16A和16B)。L.llama VHH區中的CDR3序列平均要比由重鏈和輕鏈組成的常規抗體的大多數CDR3區長，其中在圖16B中所示的最長的CDR3含有26個氨基酸殘基。以前據報道駱駝中的CDR3和CDR2區(或者偶爾還有CDR1區)通常含有半胱氨酸殘基，其中假定半胱氨酸殘基參與了兩個CDR區之間二硫鍵的形成(Muyldermans等人，1994《Prot.Engin.》7:1129-1135)。當該殘基存在于被分類為完全VHH的分子的CDRs中時(圖16B)，雜合亞類的序列不含CDR1、CDR2或CDR3區中的半胱氨酸(圖16A)。因此，這類來自L.llama的VHH分子是特有的并且有別于單峰駱駝。來源于該亞類的CDRs在穩定性方面可能是突出的，這是因為在它們之間沒有二硫鍵的情況下仍獨立地發揮作用。
基于前面提到的序列信息，鑒定出可變區中的幾個氨基酸殘基在VL-VH界面的形成中是重要的，其中包括殘基11,37,44,45和47(表Ⅱ)。據報道在四個位置上的氨基酸殘基在駱駝的抗體中為親水性殘基。在美洲駝VHH區中也發現了這些殘基的變化，并且它們可以改變不成對多肽的溶解性。但是，盡管在駱駝中通常用絲氨酸取代第11位殘基上的亮氨酸，但是大多數L.llama的序列在該位置上含有亮氨酸。隨后的克隆表明美洲駝的序列在該位置上偶爾含有賴氨酸、絲氨酸、纈氨酸、蘇氨酸或谷氨酸。
已經報道了在駱駝抗體的第44、45和47位上的氨基酸含有親水性氨基酸的取代以代替在常規VH區中觀察到的通常的疏水性殘基(分別為44-甘氨酸，45-亮氨酸和47-色氨酸)。目前有些期望在VHH區的雜合亞類中通常觀察到這種親水性的取代。對所有的駱駝和美洲駝物種來說，殘基45是僅有的這樣的一個位置，該位置含有不變的親水性精氨酸殘基的取代以代替在常規的VH區中發現的亮氨酸殘基。已經觀察到在該位置處某些含異亮氨酸的稀有的序列。殘基47(色氨酸)是更加可變的，其中在L.llama完全VHH序列中有編碼甘氨酸或精氨酸的，但也有在雜合的VHH序列中編碼疏水性殘基亮氨酸或苯丙氨酸的。已經發現隨后的克隆含有色氨酸、異亮氨酸、絲氨酸或丙氨酸等。殘基44(甘氨酸)也是更加可變的，其中在完全的VHH亞類中以谷氨酸或天冬氨酸取代甘氨酸，而在雜合組中在該位置處發生了谷氨酸、賴氨酸和谷氨酰胺的取代。也已經分離出在第44位上含有蘇氨酸的克隆。
總而言之，VHH序列的雜合亞類家族具有下列特征1．這些可變區多肽來源于不含輕鏈的抗體，其不含CH1區。
2．它們在CDRs之間不含二硫鍵。
3．第11位上的氨基酸殘基通常為亮氨酸、而不是絲氨酸。
表Ⅱ．美洲駝抗體可變區中特有的氨基酸殘基氨基酸的位置11 37 44 45 47小鼠LVGQCLVGLW以前報道的駱駝 SYERFSFERG以前報道的美洲駝SFERGLFERG新的VHH美洲駝克隆 SFERGSFDRGKFERGLFERGLFERFLFERSLFERALFDRGLFDRFLFKRFLFKRPLFQRLLYERLLYTRLLYQRLLYARFLYERILYERGLLERGLVERGLYKRRLVGLWLVELWLVEIWLIERRLIDRRLIDRLLIEIGLAPLWSIERFSYQRWSYQRFVFERFTFERYEYLRM
9．實施例克隆美洲駝免疫球蛋白恒定區的編碼序列9．1．美洲駝血清的測定為了測試抗以美洲駝IgG融合蛋白的形式表達的抗原的血清反應性，將抗原-美洲駝IgG融合蛋白偶聯到“DYNAL”珠上，并與來自免疫接種的美洲駝的血清樣品一起培養。然后進行旋轉使抗原-珠粒復合體與溶液分離開，洗滌所述的復合體并且在冰上在0.1M檸檬酸(pH2.3)中培養，以便除去在血清培養過程中結合的任何與抗原反應的蛋白。再次進行旋轉使抗原-珠粒復合體與溶液分離開，并且以一半體積的0.1M Tris(pH9.5)來中和上清液。將含有2-巰基乙醇(作為還原劑)的等體積的SDS-PAGE樣品緩沖液添加到中和過的蛋白中，并在100℃下加熱5分鐘。然后將樣品在10％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠上電泳，并轉移到硝酸纖維素濾膜上。在PBS+5％無脂干牛奶+0.01％NP40中封閉濾膜，然后在封閉緩沖液+1∶5000稀釋的山羊抗-駱駝科IgG-HRP綴合物中培養。然后在PBS+0.01％NP 40中洗滌濾膜，并在ECL試劑中培養。通過放射自顯影目測蛋白質。
9．2．結果采用一系列寡核苷酸引物克隆美洲駝恒定區的編碼序列。從美洲駝PBL中分離出RNA，并采用隨機引物或寡脫氧胸苷酸制備cDNA。然后使用特異性引物進行PCR以獲得不同的美洲駝同型，其中將所述的引物設計成用來擴增抗體重鏈的恒定區。
在圖17中顯示出由美洲駝重鏈基因獲得的克隆恒定區序列的對比。僅僅比較了由鉸鏈區到CH3區的序列，這是因為IgG2和IgG3缺少CH1區。鉸鏈區在長度和序列方面變化得最大。其它序列的變異被限制到在整個分子中散布的幾個殘基上。
為了表達融合蛋白，將美洲駝恒定區編碼序列與各種人的白細胞抗原編碼序列相連。表Ⅲ顯示出在美洲駝恒定區與保留了表面抗原結合活性的人白細胞表面抗原之間形成的大量的重組融合蛋白。依賴于天然存在的分子是否是單聚體或是二聚體，美洲駝IgG1、IgG2和IgG3不同的鉸鏈區使得設計出了不同類型的融合蛋白。作為用于免疫接種美洲駝的免疫原，具有美洲駝恒定區的融合蛋白是特別有用的，這是因為它們并不刺激抗-恒定區的免疫應答，從而使得抗所述分子非免疫球蛋白部分的抗體應答達到最大。
表Ⅲ美洲駝Ig恒定區與人的白細胞抗原之間形成的重組融合蛋白
在一項實驗中，用溶于PBS的250μg的人CD40/美洲駝IgG1融合蛋白免疫接種美洲駝。在免疫接種前收集免疫前血清。在首次免疫接種后的兩周再從美洲駝中收集血清，接下來進行第二次免疫接種。然后在兩周后再次收集血清。當通過SDS-PAGE分析了在不同時間收集的美洲駝血清時，在首次免疫接種后觀察抗-CD40 IgG1的應答。在第二次免疫接種后，在IgG1和IgG2兩部分中都檢測到抗-CD40的活性。因此，CD40/Ig融合蛋白是美洲駝中一種有效的免疫原；并且在免疫接種的過程中可以用作一種檢測宿主的血清反應性的工具。
10．實施例小鼠抗體可變區的美洲駝源化10．1．材料與方法10．1．1．用于美洲駝源化的寡核苷酸在抗體可變區編碼序列的大約中點處設計出一對互補的寡核苷酸。由這些退火的寡核苷酸形成的DNA雙螺旋是使用重疊的單鏈引物構建V區其余部分的起始點，其中在兩端延伸起始寡核苷酸的長度18-24個堿基。由于在該階段DNA是非常短的，因此在PCR的過程中保持循環時間也非常短(對于首先的六次反應來說退火10秒鐘并延伸20秒鐘，而對其余的反應來說增加延伸反應到30秒鐘)，并且也使重疊引物的摩爾量很低。制備出濃度范圍在1μM-32μM的各種引物對的儲備溶液。然后將這些儲備液以1∶20的比例稀釋成PCR混合物并添加到現有的反應之中以便每份都繼續10個循環步驟。在每個連續的擴增步驟中，增加了新添加引物的摩爾濃度，并針對稍微延長的延伸反應調節循環時間。通過這種方式，所需編碼序列的從新構建在兩個方向上進行，并且通過添加特有的限制位點到有利于克隆的DNA每一端上的最后的PCR來終止反應。
把該方法應用到小鼠抗體9.3上，通過TE中稀釋所有的引物至最終濃度為64μM來重新合成9.3VH分子。然后通過將互補的引物對以等摩爾的量混合在一起作為起始對來制備引物組。將所有其它的引物組合成成對的組，其重疊了5’和3’兩個方向上以前的組。然后稀釋這些引物對，從而引物在TE中的最終濃度在1μM-32μM的范圍內。如下制備出首次PCR循環的反應產物根據制造商的說明，將12ng的引物對H31-47(SEQ ID NO:28)和HAS47-31(SEQ ID NO:31)添加到反應混合物中以便使最終濃度為0.6ng/μl，接下來加入含有引物H22-36(SEQ ID NO:27)和H54-40(SEQ ID NO:34)的1μl 1μM的引物對2的儲備液(最終濃度為50nM)以及含有ExTaq(TaKaRa Biomedicals,Siga,日本)稀釋緩沖液、dNTPs、蒸餾水和ExTaq DNA聚合酶(1單位)的17μl PCR混合物。在94℃下變性的情況下培養反應物10個循環30秒鐘，在55℃下退火10秒鐘，并在72℃下延伸20秒鐘。另一方面，對于VH的美洲駝源化而言，首先使用的引物對為(LV1和L1HAS)(SEQID NOS:29和32)或(LV2和L2HAS)(SEQ ID NOS:30和33)，并且將1μl1μM的引物對H22-36(SEQ ID NO:27)和L1H54-40(SEQ ID NO:35)(或L2H54-40；SEQ ID NO:36)的儲備液添加到第一次反應之中。在添加了19μl的PCR混合物和1μl的引物對H22-36(SEQ ID NO:27)和H62-49(SEQ ID NO:37)(2μM的儲備液)之后，在相同的循環條件下進行第二次10輪循環的反應。在添加了19μl的PCR混合物和1μl的引物對H13-27(SEQ ID NO:26)和H70-57(SEQ ID NO:38)(4μM的儲備液)之后進行第三次10輪循環的PCR。采用相同的條件和1μl的引物對H4-18(SEQ ID NO:25)和H78-65(SEQ ID NO:39)(8μM的儲備液)進行第四輪的PCR。在添加了19μl的PCR混合物和1μl的引物對HRS1-10(SEQ ID NO:24)和H84-73(SEQ ID NO:40)(16μM的儲備液)之后，第五輪的PCR采用了相同的條件。在添加了1μl的引物對HRS 1-10和H92-81(SEQ ID NO:41)(32μM的儲備液)之后，在相同的條件下進行20輪循環的反應。將8μl的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳以檢查擴增的情況。根據制造商的說明，使用PCR快速柱(QIAGEN)純化其余的PCR產物并以50μl的TE洗脫。
然后進行新的PCR，從增加引物的濃度和延伸時間的角度開始一系列的反應布置。向18μl的PCR混合物中加入1μl的PCR產物洗脫物以及1μl的引物對HRS1-10和H100-87(SEQ ID NO:42)(1μM)。在94℃下使反應變性1分鐘，接下來采用在94℃下變性30秒鐘的步驟、在55℃下退火10秒鐘的步驟以及在72℃下延伸25秒鐘的步驟進行新的10輪循環的程序。在相同的條件下，但使用了19μl的PCR混合物加上1μl的引物對HRS1-10和H104-95(SEQ ID NO:43)(2μM)進行接下來的PCR。除了增加了72℃下的延伸時間到30秒鐘、并添加了19μl的PCR混合物以及1μl的引物對HRS1-10和H111-100(SEQ IDNO:44)(4μM)之外，采用其它均相同的10輪循環程序進行第三輪的PCR。在添加了19μl的PCR混合物以及1μl的引物對HRS1-10和H3RS-104(SEQ ID NO:46)(8μM)之后進行第四輪的PCR。對于美洲駝源化來說，所用的引物對為HRS1-10和93VH3’-BAM(SEQ IDNO:45)(8μM)。通過PCR-Quick純化80μl的PCR反應產物并在30μl的TE中洗脫。使用0.5μl的PCR洗脫物、5μl的10×ExTaq緩沖液、4μl 2.5μM的dNTPs、40μl的dH2O、1μl的引物對HRS1-10和H3RS-104(或93VH3-BAM)進行最后的PCR反應。反應條件包括在94℃下變性60秒鐘的步驟，在94℃下變性30秒鐘、在55℃下退火10秒鐘以及在72℃下延伸40秒鐘的30輪循環的程序，接下來在72℃下最后延伸2分鐘，并在4℃下保存直至回收。通過采用上述亞克隆的PCR產物作模板重復兩個PCR循環，最終連接前導肽。在頭10輪循環的反應中包括引物對OKT3/9.3HYB(SEQ ID NO:23)和93VH3-BAM(或H3RS-104)，其中在72℃下的延伸時間為30秒鐘。在與對初次PCRs所述的類似、但卻延長了延伸時間的反應條件下，通過添加引物對OKT3VHLP-S(SEQ ID NO:22)和93VH3-BAM(或H3RS-104)來進行第二次10輪循環的PCR。最后，在以經過PCR快速純化的產物作模板并采用最后的引物對OKT3VHLP-S和93VH3-BAM(或H3RS-104)作引物的條件下進行30輪循環的PCR，以產生含有來自相連的OKT3VH的前導肽的新VH。
10．1．2．美洲駝源化的抗體的產生以及FACS分析使用在成熟VH序列的殘基37、44、45和47位置上發生了變化的寡核苷酸對，如上所述構建出美洲駝源化的9.3VH分子LV1和LV2以便重新衍生出9.3VH(圖18)。用HindⅢ和BamHⅠ消化這些PCR產物，并將其亞克隆到pXD表達載體中。所述載體還含有編碼美洲駝IgG2恒定區的BamHⅠ-XbaⅠ融合蛋白盒。利用美洲駝的IgG1和IgG3恒定區也制備出了類似的構建體。然后在不含血清的培養基中將融合蛋白表達盒瞬時地轉染到COS細胞中，并在48小時后收獲上清液。采用AMICON過濾裝置將培養上清液濃縮十倍，并將100μl的所述上清液與106個Jurkat T細胞一起在冰上培養2小時。在1300rpm下使細胞旋轉5分鐘，吸出上清液，并在冰上將細胞重新懸浮在100μl的染色緩沖液(PBS,2％FBS)中1小時，其中所述的染色緩沖液含有1∶40的FITC抗-美洲駝試劑(Kents實驗室)或FITC-抗小鼠試劑(國際生物資源公司)。再在1300rpm下使細胞旋轉5分鐘，吸出上清液，并在200μl的染色緩沖液中洗滌細胞。將最后的細胞沉淀重新懸浮在400μl的染色緩沖液中，并用FACSCAN細胞分選儀進行分析。
10．2．結果基于觀察到的美洲駝VHH區的特征，開發了一種方法以轉化非美洲駝的抗體重鏈成為在本文中稱作美洲駝源化的過程中不需要與輕鏈配對的分子。采用可以從Genbank DNA序列數據庫中得到的序列數據，測定或鑒定出來自分離的mAbs的VH序列。采用這些序列來設計編碼VH區短肽的短的、重疊的寡核苷酸。開發了一種伴隨的PCR循環方法，該方法采用這些寡核苷酸的適當組合允許從新合成VH區。將序列的變化摻入到寡核苷酸中，其跨越了在美洲駝VHH的結構穩定性上被鑒定為是重要的殘基-11,37,44,45和47(表Ⅱ)。就此而論，可以將任何抗體的第11位改變為S,K,V,T或E；可以將第37位改變為Y,F,L,V,A或I；可以將第44位改變為E,D,K,T,Q,P,A或L；可以將第45位改變為R,L或I；并且可以將第47位改變為F,G,S,A,L,I,R,Y,M或W。
可以將美洲駝源化的VH區以HindⅢ+XbaⅠ片段的形式亞克隆到pUC19中以進行序列分析。一旦證實了序列改變后，使所述的盒穿梭進入編碼前導肽和Ig融合區的哺乳動物表達載體中以進行表達的研究。然后針對可溶性Ig融合蛋白的表達和抗原的結合能力來篩選來自瞬時轉染實驗的培養上清液。
采用圖18所示的重疊的寡核苷酸，將前面提到的方法應用到抗-CD28抗體9.3中。在所述抗體V區編碼序列的大約中點處設計出一對互補的寡核苷酸。由這些退火的寡核苷酸形成的DNA雙螺旋是使用重疊的單鏈引物構建V區其余部分的起始點，其中在兩端延伸起始寡核苷酸的長度24個堿基。由于在該階段DNA是非常短的，因此在PCR的過程中保持循環時間也非常短，并且也使重疊引物的摩爾量很低。在每個連續的擴增步驟中，增加了新添加引物的摩爾濃度，并針對稍微延長的延伸反應調節循環時間。通過這種方式，所需DNA序列的從新構建在兩個方向上進行，并且通過添加特有的限制位點到有利于克隆的DNA每一端上的最后的PCR來終止反應。
圖19顯示出這樣的一幅直方圖，其中展示了與僅僅用第二步綴合了FITC的抗-美洲駝抗體染色相比，用美洲駝源化的Ⅱ型9.3抗體培養上清液(10x)染色的Jurkat細胞。這些結果表明作為一種僅有重鏈的抗體，美洲駝源化的小鼠抗-CD28抗體能夠結合其位于細胞上的靶抗原。
11．實施例衍生于抗-CD3和抗-CD28抗體結合靶抗原的CDR肽該部分描述了含有CD3δ,ε或γ亞基胞外域的可溶性重組融合蛋白的產生。CD3ε與CD3γ或CD3δ的共表達產生了這樣一種融合蛋白，所述的融合蛋白以高度的親和力與包括僅僅和天然構象的表位結合的抗體在內的許多抗-CD3 mAbs相互作用。因此，這代表著一種用于生產天然CD3ε/δ或CD3ε/γ雜二聚體的方法。該系統適合于限定為CD3雜二聚體的形成所需的條件，適合于提供一些工具以鑒定出CD3雜二聚體的可能配體，適合于篩選出可能能夠干擾CD3復合體與T細胞上的TCR之間相互作用的分子。
11．1．材料與方法11．1．1．肽的合成合成出對應于抗-CD3和抗-CD298mAbs的完整的CDR3區的肽，并將酪氨酸/苯丙氨酸-半胱氨酸殘基添加到氨基末端和羧基末端。通過同時從所述末端去掉CDR3區的一個氨基酸進行肽的修飾。通過采用Fmoc化學方法(HBTU/DIEA活化和TFA切割)在固相上進行肽的合成。每批以3-5個肽的數量來結合粗肽，并在pH8.5下通過空氣氧化進行環化。通過反相HPLC純化粗的環肽，將其冷凍干燥并通過分析型HPLC和質譜分析確定其特征。
11．1．2．BIACOREBIACORE采用了表面胞質基因共振(SPR)法，其中當在金屬/液體界面上激發了表面胞質基因波時產生該現象。由于被分析物(溶液中)和配體(固定化的)之間的雙分子相互作用，光被定向并且被反射。采用EDC/NHS化學方法將CD3εδhuIg、CD3εεhuIg和CD28huIg共價地固定化在羧甲基葡聚糖薄片上，隨后用乙醇胺封閉。把肽溶解到含有或者不含1％DMSO的HBS緩沖液(pH7.2)中，并使其穿過固定化這些融合蛋白的表面。通過使這些肽穿過對照表面來減去非特異性的結合，其中對照表面是通過僅僅固定化EDC/NHS、接下來通過用乙醇胺來制備的。
11．1．3．構建CD3二聚體為了生成CD3ε-Ig融合構建體(phCD3ε-Ig)，通過RT-PCR采用下列引物對正向引物5’GCG[CTC GAG] CCC ACC ATG CAG TCGGGC ACT CAT TGG(SEQ ID NO:55)和反向引物5’GGC C[GG ATCC]GG ATC CAT CTC CAT GCA GTT CTC ACA(SEQ ID NO:56)，由抗-CD3和抗-CD28活化的T細胞的總RNA擴增出包括天然起始密碼子和前導序列在內的編碼CD3ε胞外域的cDNA(72小時)。括號內的核苷酸為設計用來克隆的XhoⅠ(CTC GAG)和BamHⅠ(GGA TCC)位點。用XhoⅠ和BamHⅠ消化PCR產物。純化切下的片段。用XhoⅠ和BamHⅠ切割攜帶有編碼人IgG1鉸鏈-CH2-CH3的基因組片段的CDM8表達載體。切割的載體和PCR產物的連接使得編碼CD3ε胞外域的cDNA位于編碼IgG1鉸鏈-CH2-CH3的基因組片段之前并符合其讀框。該載體中的CMV啟動子控制著CD3-Ig融合蛋白在哺乳動物細胞中的表達。
將編碼人IgG1鉸鏈-CH2-CH3的cDNA片段、而非基因組片段用作CD3δ-(phCD3δ0Ig)和CD3γ-Ig(phCD3γ-Ig)構建體的融合配偶體。把該片段克隆到pD18表達載體的BamHⅠ和XbaⅠ位點中，其中所述的表達載體也含有用于蛋白質表達的CMV啟動子。通過RT-PCR，從與上述相同的總RNA中分離出包括天然起始密碼子和前導序列在內的編碼CD3δ和CD3γ胞外域的cDNA片段。所用的引物如下:
CD3δ正向引物5’GCG ATA[AAG CTT]GCC ACC ATG GAACAT AGC ACG TTT CTC(SEQ ID NO:57),CD3δ反向引物5’GCG[GGA TCC]ATC CAG CTC CAC ACAGCT CTG(SEQ ID NO:58),CD3γ正向引物5’GCG ATA[AAG CTT]GCC ACC ATG GAACAG GGG AAG GGC CTG(SEQ ID NO:59),CD3γ反向引物5’GCG[GGA TCC]ATT TAG TTC AAT GCAGTT CTG AGA C(SEQ ID NO:60)。括號內的核苷酸為用來克隆的HindⅢ(AAG CTT)和BamHⅠ(GAATTC)位點。用HindⅢ和BamHⅠ切割PCR產物。然后將純化的切割的PCR片段克隆到以HindⅢ和BamHⅠ切割的含有鉸鏈-CH2-CH3的pD18載體中。使編碼CD3δ和CD3γ胞外域的cDNA位于編碼IgG1鉸鏈-CH2-CD3的片段之前并符合其讀框。
由于在可能形成二硫鍵的IgG1鉸鏈-CH2-CH3片段的鉸鏈區中存在兩個半胱氨酸殘基，因此通常將融合蛋白表達為二聚體。
采用在COS-7細胞中的瞬時表達來生成不同的CD3-Ig融合蛋白。通過DEAE-葡聚糖方法，將質粒phCD3ε-Ig和phCD3γ-Ig獨立地轉染或者以phCD3ε-Ig+phCD3δ-Ig的組合以及phCD3ε-Ig+phCD3γ-Ig的組合的形式轉染到COS-7細胞中。在補充有低濃度(0.5％)FBS和胰島素的培養基中維持轉染的細胞。在轉染后間隔了3天、乃至多達3周的時間里收集舊培養基。然后通過A蛋白-瓊脂糖凝膠層析從舊培養基中純化融合蛋白。通過SDS-PAGE以及采用抗-CD3mAb的ELISA來驗證融合蛋白的表達。
11．2．結果采用包括G19-4、OKT3、BC3和64.1在內的許多抗-CD3mAbs，通過ELISA確定CD3-Ig融合蛋白的特征。將抗-CD3mAbs固定化以捕獲CD3-Ig。使用對人IgG鉸鏈-CD2-CD3具有特異性的抗體-辣根過氧化物酶綴合物來檢測CD3-Ig與抗-CD3 mAbs的結合。與對照物CD4-Ig相仿，即使在100μg/ml融合蛋白的情況下仍檢測不到CD3δ-Ig與G19-4的結合(圖20)。盡管可以檢測到CD3ε-Ig和CD3γ-Ig與G19-4的結合，但是即使在高達100μg/ml的濃度下，所述的結合仍然沒有達到飽和。另一方面，CD3εδ-Ig和CD3εγ-Ig雜二聚體則以更高的親和力與G19-4結合(圖20)。在該測定中，CD3εδ-Ig和CD3εγ-Ig分別在4μg/ml和20μg/ml下達到飽和。類似地，OKT3、BC3以及64.1抗-CD3 mAbs也顯示出與CD3εδ-Ig雜二聚體的結合要比與CD3εγ-Ig結合得更好。這些數據表明在COS細胞中CD3ε-Ig與CD3δ-Ig的共表達、或者在一定程度上CD3ε-Ig與CD3γ-Ig的共表達產生了異源二聚的CD3-Ig融合蛋白，而所述的融合蛋白被折疊成如抗-CD3mAbs所限定的天然構象。另外，通過BIACORE測量了CD3-Ig融合蛋白與不同的抗-CD3抗體的結合親和力，并將結果示于表Ⅳ中。因此，可以使用CD3εδ和CD3εγ雜二聚體在涂覆了抗體的平板或珠粒上檢測抗-CD3抗體的活性，以及篩選與CD3特異性結合的小的分子或肽。表Ⅳ．通過BIACORE測量的抗-CD3抗體與CD3-Ig融合蛋白的結合親和力
μM*=在微摩爾水平或者更低水平上的結合確定了抗-CD3mAb和抗-CD28mAb的CDR3區，并且合成出對應于該區域的肽。將半胱氨酸殘基添加到所述肽的末端，接下來再添加芳族殘基酪氨酸或色氨酸(Greene,WO95/34312)。在空氣氧化的過程中，由于在半胱氨酸之間形成了二硫鍵使得肽發生了環化。結果，芳族殘基位于環化的CDR肽的外環部分上。
通過BIACORE測量各種肽與其呈Ig融合蛋白形式的靶抗原的結合親和力。表Ⅴ顯示出許多對CD3εδ-Ig呈現出高度結合親和力的肽，同時幾種肽呈現出與CD28-Ig的結合親和力。因此，在淋巴細胞的活化中可以采用小的CDR肽來代替抗體。表Ⅴ．來源于兩種mAbs的CDR3區的肽的結合親和力
*=肽是獨立地制備的，以每批3-5個肽的形式集中在一起，并且集中起來進行環化、純化和特征的確定。**=用于結合親和力測定的CD3εδhuIg是不純的并且為幾種尚未完全確定其特征的組分形成的混合物。nd=不可檢測性結合本發明并不限于由舉例說明的實施方案所限定的范圍，其中這些實施方案的目的在于說明本發明的一個方面，并且任何在功能上相當的序列都在本發明的范圍之內。的確，除了那些在本文中所示的和所述的內容之外，根據前面的描述以及所附的附圖，對本發明的各種改動對于本領域的普通技術人員來說都會變得顯而易見。預計這樣的改動也在所附權利要求書的范圍之內。
本文所引用的所有出版物都以其全文插入本文、僅供參考。
序列表<110>Ledbetter,JeffreyHayden Ledbetter,MarthaBrady,BillGrosmaire,LauraLaw,Che-LeungDua,Raj<120>用于調節淋巴細胞活化的組合物及方法<130>9113-0019-999<160>80<170>FastSEQ for Windows 3.0版<210>1<211>225<212>PRT<213>Llama llama<400>1Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Gln Glu Gly Leu Asp20 25 30Gly Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Pro Glu Leu Val35 40 45Ala Gly Ile Ser Ser Thr Asn Ile Pro Asn Tyr Ser Lys Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn85 90 95Ala Asp Lys Arg Gly Pro Val Ile Thr Val Tyr Trp Gly Lys Gly Thr100 105 110Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln115 120 125Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Asn Pro Thr Thr Glu Ser Lys Cys Pro130 135 140Lys Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe145 150 155 160Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro Glu Val165 170 175Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Glu Asp Pro Glu Val Ser Phe180 185 190Asn Gly Thr Leu Met Ala Arg Gly Val Trp Arg Gly Leu Val Gln Pro195 200 205Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Val Asn Leu Asp Leu Leu Arg Leu Tyr210 215 220Ser225
<210>2<211>183<212>PRT<213>Llama llama<400>2Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Ala Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Asn Tyr20 25 30Thr Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Phe Val35 40 45Ala Asp Ile Ser Gly Ser Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly50 55 60Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Tyr Leu Gln65 70 75 80Met Asn Leu Leu Lys Phe Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala85 90 95Ser Glu Asp Arg Arg Thr Glu Leu Lys Lys Glu Arg Ala Asn Ser Trp100 105 110Phe Pro Ala Arg Lys Phe Met Gln Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr115 120 125Gln Val Ala Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln130 135 140Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Asn Pro Thr Thr Glu Ser Lys Cys Pro145 150 155 160Lys Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Leu Ser Ser165 170 175Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val180<210>3<211>204<212>PRT<213>Llama llama<400>3Ile Arg Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly1 5 10 15Ser 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<223>引物<400>22tgtaagcttg ccaccatgga ttgggtgtgg accttgctat tcctgttgtc agtaactgca 60ggtgtccact cccaggtgca g 81<210>23<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>23gcaggtgtcc actcccaggt gcagctgaag gagtcagg 38<210>24<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>24tcttctaagc ttagttgtct tgagctccag ctgaaggagt caggacct 48
<210>25<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>25ctgaaggagt caggacctgg cctggtgacg ccctcacaga gcctg45<210>26<211>45<212> DNA<213>人工序列<400>26acgccctcac agagcctgtc catcacttgt actgtctctg ggttt45<210>27<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>27tgtactgtct ctgggttttc attaagcgac tatggtgttc attgg45<210>28<211>51<212>DNA<213>人工序列<400>28gactatggtg ttcattgggt tcgccagtct ccaggacagg gactggagtg c 51<210>29<211>51<212>DNA<213>人工序列<400>29gactatggtg ttcattggtt ccgccagtct ccaggacagg agcgcgaggg t 51<210>30<211>51<212>DNA<213>人工序列<400>30gactatggtg ttcattggta ccgccagtct ccaggacagg agcgcgagtt c 51<210>31<211>51<212>DNA<213>人工序列<400>31gcactccagt ccctgtcctg gagactggcg aacccaatga acaccatagt c 51
<210> 32<211> 51<212>DNA<213>人工序列<400>32accctcgcgc tcctgtcctg gagactggcg gaaccaatga acaccatagt c 51<210>33<211>51<212>DNA<213>人工序列<400>33gaactcgcgc tcctgtcctg gagactggcg gtaccaatga acaccatagt c 51<210>34<211>44<212> DNA<213>人工序列<400> 34ccagcccata ttactcccag gcactccagt ccctgtcctg gaga 44<210>35<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>35ccagcccata ttactcccag accctcgcgc tcctgtcctg gaga 44<210>36<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>36ccagcccata ttactcccag gaactcgcgc tcctgtcctg gaga 44<210>37<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>37gagagccgaa ttataattcg tgcctccacc agcccatatt ac 42<210>38<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>38tttgctgatg ctctttctgg acatgagagc cgaattataa tt 42
<210>39<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>39gaaaacttgg cccttggagt tgtctttgct gatgctcttt ct 42<210>40<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>40agcttgcaga ctcttcattt ttaagaaaac ttggcccttg ga 42<210>41<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>41acagtaatac acggctgtgt catcagcttg cagactcttc at 42<210>42<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>42ataggagtat cccttatctc tggcacagta atacacggct gt 42<210>43<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>43accccagtag tccatagaat agtaatagga gtatccctta tc 42<210>44<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>44gacggtgact gaggttcctt gaccccagta gtccatagaa ta 42<210>45<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>45tcttctggat ccagaggaga cggtgactga ggttcc36
<210>46<211>57<212>DNA<213>人工序列<400>46ctgtctagac ctgctagcag aggagacggt gactgaggtt ccttgacccg agtagtc 57<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>47ctcgtggart ctggaggagg 20<210>48<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>48cgtcatgtcg acggatccaa gctttgagga gacggtgacy tggg 44<210>49<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>49caggtgcagc tggtgcagtc tgg 23<210>50<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>50ggttgtggtt ttggtgtctt g21<210>51<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>51caggtcaact taaagggagt ctgg24<210>52<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>52aggtgcagc tgcaggagtc gg 22<210>53<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>53taatacgact cactataggg aga 23<210>54<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>54aacagctatg accatg 16<210>55<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>55gcgctcgagc ccaccatgca gtcgggcact cactgg 36<210>56<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>56ggccggatcc ggatccatct ccatgcagtt ctcaca 36<210>57<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>57gcgataaagc tgccaccatg gaacatagca cgtttctc 38<210>58<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>58gcgggatcca tccagctcca cacagctctg 30<210>59<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>59gcgataaagc ttgccaccat ggaacagggg aagggcctg 39<210>60<211>34<212>DNA<213>人工序列<400>60gcgggatcca tttagttcaa tgcagttctg agac34<210>61<211>16<212>PRT<213>小家鼠<400>61Tyr Cys Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Ile Ala Tyr Cys Trp1 5 10 15<210>62<211>15<212>PRT<213>小家鼠<400>62Tyr Cys Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Ile Ala Tyr Cys Trp1 5 10 15<210>63<211>14<212>PRT<213>小家鼠<400>63Tyr Cys Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Ile Ala Tyr Cys Trp1 5 10<210>64<211>15<212>PRT<213>小家鼠<400>64Tyr Cys Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Cys Trp1 5 10 15<210>65
<211>14<212>PRT<213>小家鼠<400>65Tyr Cys Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Cys Trp1 5 10<210>66<211>13<212>PRT<213>小家鼠<400> 66Tyr Cys Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Cys Trp1 5 10<210>67<211>12<212>PRT<213>小家鼠<400>67Tyr Cys Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Cys Trp1 5 10<210>68<211>11<212>PRT<213>小家鼠<400>68Tyr Cys Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Cys Trp1 5 10<210>69<211>14<212>PRT<213>小家鼠<400>69Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Cys Trp1 5 10<210>70<211>13<212>PRT<213>小家鼠<400>70Tyr Cys Ala Arg Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Cys Trp1 5 10<210>71<211>12<212>PRT
<213>小家鼠<400>71Tyr Cys Ala Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val Cys Trp1 5 10<210>72<211>14<212>PRT<213>小家鼠<400>72Tyr Cys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Cys Trp1 5 10<210>73<211>13<212>PRT<213>小家鼠<400>73Tyr Cys Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Cys Trp1 5 10<210>74<211>12<212>PRT<213>小家鼠<400>74Tyr Cys Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Cys Trp1 5 10<210>75<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>75Tyr Cys Tyr Asp Tyr Asp Gly Cys Tyr1 5<210>76<211>9<212>PRT<2L3>小家鼠<400>76Tyr Cys Tyr Asp Tyr Asp Tyr Cys Tyr1 5<210>77<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>77Tyr Cys Tyr Asp Tyr Asp Phe Cys Tyr1 5<210>78<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>78Tyr Cys Tyr Asp Asp His Thr Cys Tyr1 5<210>79<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>79Tyr Cys Tyr Asp Asp His Gln Cys Tyr1 5<210>80<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>80Tyr Cys Phe Asp Trp Lys Asn Cys Tyr1 權利要求
1．一種用于活化淋巴細胞的方法，該方法包括聚集由所述淋巴細胞表達的三種或多種抗原，并且活化所述的淋巴細胞。
2．權利要求1的方法，其中所述的淋巴細胞為T細胞。
3．權利要求2的方法，其中所述的T細胞表達CD4。
4．權利要求2的方法，其中所述的三種或多種抗原選自CD2,CD3,CD4,CD5,CD6,CD8,CD18,CD25,CD27,CD28,CD40,CD43,CD45,CD45RA,CD45RO,CDw137,CDW150,CD152,CD154,ICOS,TCRα,TCRβ,TCRδ,TCRγ和細胞因子受體的組合。
5．權利要求4的方法，其中所述的抗原是由單一的多特異性分子聚集的。
6．權利要求4的方法，其中所述的抗原是由一種或多種抗體或其結合抗原的衍生物聚集的。
7．權利要求6的方法，其中所述的抗體僅僅含有重鏈或其結合抗原的衍生物。
8．權利要求7的方法，其中所述的結合抗原的衍生物為VHH。
9．權利要求4的方法，其中所述的抗原是由肽聚集的。
10．權利要求9的方法，其中所述的肽來源于抗體互補性決定區。
11．權利要求4的方法，其中所述的抗原是由其相應的配體聚集的。
12．權利要求6的方法，其中所述的抗體或結合抗原的衍生物被固定化在固體表面上。
13．權利要求12的方法，其中所述的抗體或結合抗原的衍生物被綴合到顆?；|上。
14．權利要求12的方法，其中所述的抗體或結合抗原的衍生物是依次進行排列的。
15．權利要求2的方法，其中使所述的T細胞活化以便增殖。
16．權利要求2的方法，其中使所述的T細胞活化以產生細胞因子。
17．權利要求2的方法，其中使所述的T細胞活化以改變其細胞表面抗原的表達。
18．權利要求2的方法，其中使所述的T細胞活化以改變其細胞因子的表達。
19．權利要求2的方法，其中使所述的T細胞活化以便進行編程性細胞死亡。
20．權利要求2的方法，其中所述的淋巴細胞為B細胞。
21．權利要求20的方法，其中所述的三種或多種抗原選自表面Ig,CD18,CD19,CD20,CD21,CD22,CD23,CD40,CD45,CD80,CD86,B7.3和ICAM1的組合。
22．權利要求20的方法，其中使所述的B細胞活化以便增殖。
23．權利要求20的方法，其中使所述的B細胞活化以便進行編程性細胞死亡。
24．一種多特異性蛋白，所述的蛋白含有對在淋巴細胞表面上表達的三種或多種抗原具有特異性的結合部位。
25．權利要求24的多特異性蛋白，所述的蛋白活化T細胞。
26．權利要求24的多特異性蛋白，所述的蛋白抑制T細胞的活化。
27．權利要求24的多特異性蛋白，所述的蛋白活化B細胞。
28．權利要求24的多特異性蛋白，所述的蛋白抑制B細胞的活化。
29．權利要求24的多特異性蛋白，所述的蛋白含有VHH區。
30．權利要求24的多特異性蛋白，所述的蛋白含有互補性決定區。
31．一種藥物組合物，所述的組合物含有權利要求24的多特異性蛋白。
32．一種雙特異性蛋白，所述的蛋白含有對在淋巴細胞表面上表達的兩種抗原具有特異性的結合部位并且抑制所述淋巴細胞的活化。
33．權利要求32的雙特異性蛋白，其中所述的淋巴細胞為T細胞。
34．權利要求32的雙特異性蛋白，其中所述的淋巴細胞為B細胞。
35．權利要求32的雙特異性蛋白，所述的蛋白含有VHH區。
36．權利要求32的雙特異性蛋白，所述的蛋白含有互補性決定區。
37．一種藥物組合物，所述的組合物含有權利要求32的雙特異性蛋白。
38．一種與細胞表面抗原結合的分離的僅有重鏈的抗體或其結合抗原的衍生物。
39．權利要求38的結合抗原的衍生物，所述的衍生物為VHH。
40．一種用于分離表達僅有重鏈的抗體之B細胞的方法，該方法包括從細胞混合物中分離出B細胞，所說的B細胞表達CD40并且不表達免疫球蛋白的輕鏈。
41．一種cDNA文庫，所述的cDNA文庫含有編碼美洲駝VHH區的多核苷酸。
42．權利要求41的cDNA文庫，其中所述的多核苷酸編碼僅有重鏈的抗體。
43．一種分離的多肽，所述的多肽含有選自由SEQ ID NOS:1-9組成的組中的氨基酸序列。
44．一種修飾的噬菌體展示載體，所述的載體如圖8所示。
45．一種采用權利要求44的載體克隆和表達美洲駝VHH的方法，其中所述的美洲駝VHH結合人的淋巴細胞表面抗原。
46．一種使重鏈可變區的編碼序列美洲駝源化的方法，該方法包括(a)在所說重鏈可變區編碼序列的大約中點處使兩個互補的寡核苷酸退火；并且(b)經過聚合酶鏈式反應通過使單鏈引物重疊延伸所述退火的寡核苷酸；其中所述的寡核苷酸編碼在所說重鏈可變區編碼序列中不存在的第11,37,44,45或47位上的氨基酸殘基。
47．一種融合蛋白，所述的融合蛋白含有美洲駝的CH1的恒定區、鉸鏈區、CH2、CH3或其組合以及異源的非美洲駝的多肽。
48．一種肽，所述的肽含有選自由SEQ ID NOS:61-63,69-71,72-74,75和80組成的組中的氨基酸序列。
49．一種可溶的人CD3異源二聚多肽。
全文摘要
本發明涉及對淋巴細胞活化的調節。特別地，本發明涉及通過選擇性地結合由相同的淋巴細胞表達的多細胞表面抗原來調節淋巴細胞活化的組合物和方法。
文檔編號C07K19/00GK1316910SQ99804546
公開日2001年10月10日 申請日期1999年2月18日 優先權日1998年2月19日
發明者J·A·萊德柏特, M·海旦萊德柏特, W·A·布萊迪, L·S·戈羅斯邁爾, C－L·勞, R·杜阿 申請人:?？怂刮魈刂委煿?br>