專利名稱：一種用于促進細胞黏附生長的多糖材料及制備方法
技術領域：
本發明涉及一種生物制品，特別涉及一種用于促進細胞黏附生長的多糖材料的提取及制備方法。
背景技術：
近二十年來，人們一直研究應用于組織工程的生物材料。通常是將體外培養的高濃度的種子細胞種植于天然或人工合成的細胞外基質載體上，并復合誘導因子，然后移植于體內，達到形成新的有功能的組織的目的[Noshi，T等人，“Artif Organs”，第25卷3期，第201-208頁(2001)]。常用的組織工程材料按照來源可分為人工合成材料和天然材料兩大類。人工合成材料包括目前已被廣泛應用的羥基磷灰石(HA)，生物活性玻璃陶瓷(BGC)，聚乳酸(PLA)，聚羥基乙酸(PGA)等，它們也常被復合運用而發揮更佳的效果。人工材料的優點是結構牢固，有適宜的生物力學強度，優良的骨傳導性和較好的生物相容性。然而，與天然生物材料相比較，人工材料存在著成本較高，表面活性較差，不利于細胞黏附、分布與增殖，并有誘發免疫反應可能的缺陷。顧名思義，天然材料即是指天然存在的，從人體或動植物中獲取的材料，如膠原(collagen)、松質骨等，這類材料抗原性弱，組織親和性和結合力良好，其天然的孔隙結構為細胞的黏附、生長提供了最佳的三維空間。不過，當前得到應用的天然材料也有其缺點，如膠原獲取困難，機械強度范圍較窄，誘導細胞分化能力單一而且不足等等。因此，尋找一款既廉價易得，還具有促進細胞黏附與生長能力，同時又來自于天然產物的材料，是當前組織工程學的熱點方向。
細胞外基質(extracellular matrix，ECM)由多種復雜的成份構成，包括各型膠原、可溶性細胞因子、化學介質、蛋白多糖、糖蛋白、肽類、脂肪酸和各種小分子物質等。ECM可影響細胞的分化、增殖、黏附、形態發生和表型表達等生物學過程[崔云華，“國外醫學分子生物學分冊”，第24卷第1期，第47-49頁(2002)]。作為生物界重要組成成份的各種多糖(polysaccharides)，既是細胞外基質的成分之一，也被認為可以與細胞外基質發生密切作用，如促進膠原蛋白分泌，誘導細胞因子表達等等。正基于此，國內外大量實驗已經證明，來自于動植物的各種多糖物質，的確具有促進多種細胞分化與增殖的作用。此外，不同分子量大小和殘基修飾的多糖，還具有調節免疫，降低血脂，抗癌，抗病毒等多方面功效[Hurtley，S等人，“Science”，第291卷，第2337-2343頁(2001)]。
然而，盡管多糖物質擁有極佳的生物相容性和綜合多樣的生物效應，但由于其存在著較強的親水性及較難的可塑性的缺點，至今沒有被廣泛地運用于組織工程和其他的生物材料領域。

發明內容
本發明的目的就在于克服上述現有技術存在的缺陷，研制一種從天然藥物白芨中提取多糖材料及制備方法。
本發明的技術方案是一種用于促進細胞黏附生長的多糖材料，其主要技術特征在于從天然藥物白芨塊莖中提取得到多糖材料。
本發明的另一技術方案是一種用于促進細胞黏附生長的多糖材料的制備方法，其主要技術特征在于步驟如下(1)取天然藥物白芨塊莖進行多糖組份初步提取，再經小分子脂溶性物質去除蛋白，再經離子交換層析、凝膠過濾層析，得純品提取物白芨多糖材料，呈固體粉末狀；(2)將白芨多糖提取物經下述方法處理(2-1)將固體粉末狀多糖材料滅菌處理；或(2-2)將固體粉末狀多糖材料溶解于溶劑，形成一定黏度的溶液，滅菌處理；或(2-3)將固體粉末狀多糖材料溶解于溶劑，形成一定黏度的溶液，在細胞培養皿表面鋪成均勻薄層，風干后經化學處理后交聯，得不溶于水的膜狀材料，滅菌處理。
本發明的優點和效果在于從天然藥物白芨中分離、提取得到的白芨多糖作為一種多糖，能與細胞外基質成分作用，促進細胞黏附與貼壁生長；同時，白芨多糖作為天然藥物成分，其交聯所得的膜，成型良好，具有很強的韌性，良好的生物相容性和可降解性，是組織工程材料的良好選擇。
本發明所采取的濃度范圍在在每10毫升水，磷酸緩沖液，無機鹽溶液或其他有機溶液中，含天然藥物白芨的多糖提取物100-300毫克。
本發明采用了多種貼壁生長的細胞，實驗證明(1)對于鼠肺成纖維L929細胞，人肝L-02細胞，鼠單核巨噬細胞Raw264.7，人胚胎腎細胞293T，人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC，人骨髓基質干細胞hMSC等數種細胞，白芨多糖材料可以明顯促進它們的黏附與生長速度；(2)對于人肝癌HepG2細胞，白芨多糖材料可以促進它的黏附速度，但不能誘導其增殖；(3)對于非洲綠猴腎COS-7細胞與人宮頸癌細胞HeLa，白芨多糖材料不具有促進它黏附生長的作用。
本發明通過對天然藥物白芨塊莖提取多糖成分，經處理得到了白芨多糖材料。它具有促進多種細胞黏附生長的作用，并具有極好的生物相容性和可降解性，是一款具有良好應用前景的生物材料。


圖1——為白芨多糖半純品經凝膠過濾層析得單一洗脫糖峰。
圖2——為白芨多糖純品紅外光譜圖。
圖3——為白芨多糖交聯成膜后，試鋪L929成纖維細胞，于0.5小時拍攝照片圖。
圖4——為白芨多糖膜上L929成纖維細胞黏附生長趨勢圖。
圖5——為白芨多糖膜上非洲綠猴腎COS-7細胞黏附生長趨勢圖。
圖6——為白芨多糖膜上人肝L-02細胞黏附生長趨勢圖。
圖7——為白芨多糖膜上人肝癌HepG2細胞黏附生長趨勢圖。
圖8——為白芨多糖膜上鼠單核巨噬細胞Raw264.7黏附生長趨勢圖。
圖9——為白芨多糖水溶液作用下人宮頸癌細胞HeLa黏附生長趨勢圖。
圖10——為白芨多糖水溶液作用下人胚胎腎細胞293T黏附生長趨勢圖。
圖11——為對照組人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC黏附生長形態照片圖。
圖12——為白芨多糖水溶液作用下人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC黏附生長形態照片圖。
圖13——為白芨多糖水溶液作用下人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC黏附生長趨勢圖。
圖14——為白芨多糖膜上人骨髓基質干細胞hMSC黏附生長趨勢圖。
具體實施例方式
第一步白芨多糖純品的提取及溶液配制取市售中藥蘭科植物白芨塊莖，充分碾碎后水煮3小時，沸騰8-10次，三層紗布過濾取濾液，加入兩倍體積無水乙醇，沉淀過夜；離心棄去上清，反復三次后取沉淀抽濾，溶于雙蒸水，Sevag法沉淀蛋白雜質，反復多次至考馬斯亮藍法檢測無蛋白；無水乙醚萃取，取水相凍干得白芨多糖粗品；粗品經DE-52離子交換柱(Whatman產品)層析，蒽酮—硫酸法檢測得單一洗脫峰，凍干得白芨多糖半純品；半純品經Sephadex G-200凝膠過濾柱(Pharmacia產品)層析，蒽酮—硫酸法檢測得單一洗脫峰，見圖1。凍干得白芨多糖純品，紅外光譜檢測多糖組成為葡萄糖與甘露糖，見圖2。
將20毫克多糖純品的固體粉末溶解于1毫升雙蒸水，形成具有黏度的溶液，濾膜過濾除菌備用。
第二步白芨多糖膜的制備(一)按照第一步所述方法配制白芨多糖純品溶液，并按每孔250微升滴加于24孔細胞培養皿并敞放于超凈工作臺中，待其完全風干后取出。接著進行60Co-γ射線照射20分鐘，即得不溶于水的膜狀材料，滅菌后備用。
膜形態觀察肉眼觀察質地均一，透光性佳，基本呈透明狀；光學顯微鏡觀察表面有微粒狀紋路；水溶性觀察在三塊膜上分別滴加500微升蒸餾水，0.5摩爾/升醋酸溶液，RPMI-1640細胞培養液，放置72小時，未見膜形態變化；試鋪L929成纖維細胞(培養方法和接種方法見后面第四步)觀察，細胞分散良好，見圖3。
或者采用第三步白芨多糖膜的制備(二)按照第一步所述方法配制白芨多糖純品溶液，并按每孔250微升滴加于24孔細胞培養皿并敞放于超凈工作臺中，待其完全風干后取出。接著進行強紫外光照射60分鐘，即得不溶于水的膜狀材料，滅菌后備用。
按照第二步所述方法進行膜形態觀察與檢驗。
第四步白芨多糖膜培養細胞實驗(一)按照第二步所述方法制備白芨多糖膜。
鼠肺成纖維L929細胞購自中國科學院細胞庫，常規保存于含10％胎牛血清，100單位/毫升青霉素和100微克/毫升鏈霉素的RPMI-1640(Gibco產品)培液中，細胞培養箱溫度37℃，含5％二氧化碳。取生長良好的細胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度為3×104個/毫升，0.5毫升每孔接種于樣品(白芨多糖膜)孔與空白對照孔。在1.5小時，4小時和24小時用光學顯微鏡觀察細胞生長狀態；并用MTT法檢測貼壁細胞數量，具體操作步驟如下在各時間段，吸出各孔培液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕柔沖洗兩遍，棄去，加入100微升事先配制好的MTT液(Sigma產品，濃度5毫克/毫升，溶劑為PBS)及400微升細胞培液，細胞培養箱中孵育5小時，取出吸去各孔反應液，再次用PBS輕柔沖洗兩遍，加入500微升二甲亞砜(DMSO，Sigma產品)反應半小時后，轉移至酶標板(Costar產品)，酶聯檢測儀(BioRad產品)于575納米讀數。
形態觀察結果證明，白芨多糖膜上L929細胞黏附速度比空白對照組快；MTT實驗結果證明24小時，白芨多糖膜上貼壁生長的細胞數量多于空白對照，見圖4。
或者采用第五步白芨多糖膜培養細胞實驗(二)按照第二步所述方法制備白芨多糖膜。
SV40轉化的非洲綠猴腎COS-7細胞購自中國科學院細胞庫，常規保存于含10％胎牛血清，100單位/毫升青霉素和100微克/毫升鏈霉素的DMEM培液(Gibco產品)中，細胞培養箱溫度37℃，含5％二氧化碳。取生長良好的細胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度為3×104個/毫升，0.5毫升每孔接種于樣品(白芨多糖膜)孔與空白對照孔。在1.5小時，4小時和24小時用光學顯微鏡觀察細胞生長狀態；并用MTT法檢測貼壁細胞數量，具體操作步驟同第四步。
形態觀察結果證明，白芨多糖膜上COS-7細胞黏附速度不及空白對照組；MTT實驗結果證明24小時，白芨多糖膜上貼壁生長的細胞數量不及空白對照組，見圖5。
或者采用第六步白芨多糖膜培養細胞實驗(三)按照第二步所述方法制備白芨多糖膜。
人肝L-02細胞購自中國科學院細胞庫，常規保存于含10％胎牛血清，100單位/毫升青霉素和100微克/毫升鏈霉素的RPMI-1640培液中，細胞培養箱溫度37℃，含5％二氧化碳。取生長良好的細胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度為5×104個/毫升，0.5毫升每孔接種于樣品(白芨多糖膜)孔與空白對照孔。在1.5小時，4小時和24小時用光學顯微鏡觀察細胞生長狀態；并用MTT法檢測貼壁細胞數量，具體操作步驟同第四步。
形態觀察結果證明，白芨多糖膜上L-02細胞黏附速度比空白對照組快；MTT實驗結果證明24小時，白芨多糖膜上貼壁生長的細胞數量多于空白對照，見圖6。
或者采用第七步白芨多糖膜培養細胞實驗(四)按照第三步所述方法制備白芨多糖膜。
人肝癌HepG2細胞購自中國科學院細胞庫，常規保存于含10％胎牛血清，100單位/毫升青霉素和100微克/毫升鏈霉素的DMEM培液中，細胞培養箱溫度37℃，含5％二氧化碳。取生長良好的細胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度為5×104個/毫升，0.5毫升每孔接種于樣品(白芨多糖膜)孔與空白對照孔。在1.5小時，4小時和24小時用光學顯微鏡觀察細胞生長狀態；并用MTT法檢測貼壁細胞數量，具體操作步驟同第四步。
形態觀察結果證明，白芨多糖膜上HepG2細胞黏附速度比空白對照組快；然而，MTT實驗結果證明24小時，白芨多糖膜上貼壁生長的細胞數量與空白對照相似，見圖7。
或者采用第八步白芨多糖膜培養細胞實驗(五)按照第三步所述方法制備白芨多糖膜。
鼠單核巨噬細胞Raw264.7購自美國模式菌種收藏中心(ATCC)，常規保存于含10％胎牛血清，100單位/毫升青霉素和100微克/毫升鏈霉素的DMEM培液中，細胞培養箱溫度37℃，含5％二氧化碳。取生長良好的細胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度為4×104個/毫升，0.5毫升每孔接種于樣品(白芨多糖膜)孔與空白對照孔。在1.5小時，4小時和24小時用光學顯微鏡觀察細胞生長狀態；并用MTT法檢測貼壁細胞數量，具體操作步驟同第四步。
形態觀察結果證明，白芨多糖膜上Raw264.7細胞黏附速度比空白對照組快；MTT實驗結果證明24小時，白芨多糖膜上貼壁生長的細胞數量多于空白對照，見圖8。
或者采用第九步白芨多糖膜培養細胞實驗(六)按照第一步所述方法制備白芨多糖水溶液。
人宮頸癌細胞HeLa購自美國模式菌種收藏中心(ATCC)，常規保存于含10％胎牛血清，100單位/毫升青霉素和100微克/毫升鏈霉素的DMEM培液中，細胞培養箱溫度37℃，含5％二氧化碳。取生長良好的細胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度為4×104個/毫升，0.5毫升每孔接種于預設樣品孔與空白對照孔。預設樣品孔在接種細胞后滴加白芨多糖水溶液，保證白芨多糖濃度在80微克/毫升。在1.5小時，4小時和24小時用光學顯微鏡觀察細胞生長狀態；并用MTT法檢測貼壁細胞數量，具體操作步驟同第四步。
形態觀察結果證明，添加白芨多糖組HeLa細胞黏附速度不及空白對照組；MTT實驗結果證明24小時，添加白芨多糖組貼壁生長的細胞數量不及空白對照組，見圖9。
或者采用第十步白芨多糖膜培養細胞實驗(七)按照第一步所述方法制備白芨多糖水溶液。
人胚胎腎細胞293T購自美國模式菌種收藏中心(ATCC)，常規保存于含10％胎牛血清，100單位/毫升青霉素和100微克/毫升鏈霉素的DMEM培液中，細胞培養箱溫度37℃，含5％二氧化碳。取生長良好的細胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度為4×104個/毫升，0.5毫升每孔接種于預設樣品孔與空白對照孔。預設樣品孔在接種細胞后滴加白芨多糖水溶液，保證白芨多糖濃度在80微克/毫升。在1.5小時，4小時和24小時用光學顯微鏡觀察細胞生長狀態；并用MTT法檢測貼壁細胞數量，具體操作步驟同第四步。
形態觀察結果證明，添加白芨多糖組293T細胞黏附速度比空白對照組快；MTT實驗結果證明24小時，添加白芨多糖組貼壁生長的細胞數量多于空白對照，見圖10。
或者采用第十一步白芨多糖膜培養細胞實驗(八)按照第一步所述方法制備白芨多糖水溶液。
人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC從臍帶中分離，具體方法為取新鮮健康的胎兒臍帶，灌入5％膠原酶，37℃水浴15-20分鐘，用PBS沖洗臍靜脈，離心，棄上清，用培養液懸浮細胞，置含10％胎牛血清，10納克/毫升血管內皮生長因子(VEGF，R&D產品)，100單位/毫升青霉素和100微克/毫升鏈霉素的DMEM培液中，細胞培養箱溫度37℃，含5％二氧化碳，用兔抗人第八因子抗體進行免疫組化鑒定。
用胰蛋白酶和EDTA消化，取第4-7代生長良好的細胞，按照密度為4×104個/毫升，0.5毫升每孔接種于預設樣品孔與空白對照孔。預設樣品孔在接種細胞后滴加白芨多糖水溶液，保證白芨多糖濃度在80微克/毫升。在1.5小時，4小時和24小時用光學顯微鏡觀察細胞生長狀態；并用MTT法檢測貼壁細胞數量，具體操作步驟同第四步。
形態觀察結果證明，添加白芨多糖組HUVEC細胞黏附速度比空白對照組快；MTT實驗結果證明24小時，添加白芨多糖組貼壁生長的細胞數量多于空白對照，見圖11、圖12和圖13。
或者采用第十二步白芨多糖膜培養細胞實驗(九)按照第二步所述方法制備白芨多糖膜。
人骨髓基質干細胞hMSC從正常人骨髓血中分離，具體方法為抽取骨髓血約5毫升，注入含肝素培養液中，加入等量PBS中，1500轉/分離心5分鐘，洗滌2-3次，再以PBS重新混懸細胞。用PBS配制25％-60％的percoll(Amersham產品)密度梯度溶液，再將混勻的骨髓細胞小心加在其上，4℃下15000轉/分離心20分鐘，吸取中間分帶清楚的單個核細胞層，以PBS稀釋洗滌3次，最終保存于含10％胎牛血清，0.5％成纖維生長因子(FGF，R&D產品)，100單位/毫升青霉素和100微克/毫升鏈霉素的DMEM培液中，細胞培養箱溫度37℃，含5％二氧化碳。以胰蛋白酶和EDTA消化傳代，至得到較純骨髓基質干細胞。
再取生長良好的細胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度為1×105個/毫升，0.5毫升每孔接種于樣品(白芨多糖膜)孔與空白對照孔。在1.5小時，4小時和24小時用光學顯微鏡觀察細胞生長狀態；并用MTT法檢測貼壁細胞數量，具體操作步驟同第四步。
形態觀察結果證明，白芨多糖膜上hMSC細胞黏附速度比空白對照組快；MTT實驗結果證明24小時，白芨多糖膜上貼壁生長的細胞數量多于空白對照，見圖14。
本發明的保護范圍并不僅局限于本實施例的描述。
權利要求
1.一種用于促進細胞黏附生長的多糖材料，其特征在于從天然藥物白芨塊莖中提取得到多糖材料。
2.一種用于促進細胞黏附生長的多糖材料的制備方法，其特征在于步驟如下(1)取天然藥物白芨塊莖進行多糖組份初步提取，再經小分子脂溶性物質去除蛋白，再經離子交換層析、凝膠過濾層析，得純品提取物白芨多糖材料，呈固體粉末狀；(2)將白芨多糖提取物經下述方法處理(2-1)將固體粉末狀多糖材料滅菌處理；或(2-2)將固體粉末狀多糖材料溶解于溶劑，形成一定黏度的溶液，滅菌處理；或(2-3)將固體粉末狀多糖材料溶解于溶劑，形成一定黏度的溶液，在細胞培養皿表面鋪成均勻薄層，風干后經化學處理后交聯，得不溶于水的膜狀材料，滅菌處理。
3.根據權利要求2所述的一種用于促進細胞黏附生長的多糖材料的制備方法，其特征在于步驟(1)將白芨塊莖碾碎后水煮至沸騰，過濾取濾液，加入無水乙醇沉淀，離心棄去上清，取沉淀抽濾，溶于雙蒸水，Sevag法沉淀蛋白雜質，無水乙醚萃取，水相凍干得白芨多糖粗品，將粗品經DE-52離子交換柱層析，蒽酮-硫酸法檢測得單一洗脫峰，凍干得白芨多糖半成品，半成品經Sephadex G-200凝膠過濾柱層析，蒽酮-硫酸法檢測得單一洗脫峰，凍干得白芨多糖純品。
4.根據權利要求2所述的一種用于促進細胞黏附生長的多糖材料的制備方法，其特征在于步驟(2-3)的化學處理步驟(1)強紫外線照射待細胞培養皿中的多糖材料溶液薄層完全風干后置放于紫外交聯儀下照射；或(2)60Co-γ射線照射待細胞培養皿中的多糖材料溶液薄層完全風干后進行60Co-γ射線照射。
5.根據權利要求2所述的一種用于促進細胞黏附生長的多糖材料的制備方法，其特征在于步驟(2-1)、(2-2)、(2-3)可組合應用。
6.根據權利要求4所述的一種用于促進細胞黏附生長的多糖材料的制備方法，其特征在于步驟(1)、(2)可組合應用。
7.根據權利要求4所述的一種用于促進細胞黏附生長的多糖材料的制備方法，其特征在于步驟(2-2)、(2-3)所使用的溶劑包括水、磷酸緩沖液、無機鹽溶劑、有機溶劑的一種。
全文摘要
本發明涉及一種用于促進細胞黏附生長的多糖材料的提取及制備方法。本發明取天然藥物白芨塊莖進行多糖組份初步提取，經小分子脂溶性物質去除蛋白，再經離子交換層析、凝膠過濾層析，得純品提取物白芨多糖材料，呈固體粉末狀，再滅菌處理等。本發明從天然藥物白芨中分離、提取得到的白芨多糖作為一種多糖，能與細胞外基質成分作用，促進細胞黏附與貼壁生長；同時，白芨多糖作為天然藥物成分，其交聯所得的膜，成型良好，具有很強的韌性，良好的生物相容性和可降解性，是組織工程材料的良好選擇。解決了現有技術無法克服的多糖物質具有較強的親水性及較難的可塑性的缺陷。本發明制備方法簡單，易于控制，費用低。
文檔編號C08B37/00GK1709915SQ20051004066
公開日2005年12月21日 申請日期2005年6月23日 優先權日2005年6月23日
發明者孫劍濤, 張峻峰, 王春明, 刁華佳 申請人:南京大學醫學院附屬鼓樓醫院