前膠原IIA缺乏小鼠本申請要求2004年7月26日提交的美國臨時申請?zhí)?0/591,935的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容在此通過引用結(jié)合于本申請中。在本申請的全文中引用了不同的出版物。對于這些出版物的全部引用可于權(quán)利要求書的前面看到。這些出版物的公開內(nèi)容在此通過引用結(jié)合于本申請中，以便更加全面地描述在本文描述和要求的本發(fā)明之日前的本領(lǐng)域現(xiàn)狀。發(fā)明背景心臟病猝死(SCD)是主要的公共衛(wèi)生問題，在美國35歲以上人群中因心臟病所致死亡高達63％。1而急性缺血性心臟疾病是此人群中SCD的主要病因，但是青少年和40歲以下的青壯年猝死的最常見病因之一是肥厚型心肌病(HCM)。其它較少發(fā)生的病因包括畸形的冠狀動脈、Marfan’s綜合征、致心律失常的右心室發(fā)育異常、心肌炎、主動脈瓣膜狹窄和冠狀動脈粥樣硬化性疾病。HCM是遺傳性心肌疾病，在沒有繼發(fā)病因時，存在具有非擴張的、高動力性腔室(hyperdynamicchamber)的不對稱的或?qū)ΨQ的左心室肥大。它同樣地侵襲男性和女性，以高度可變化的臨床過程、不同的病理學和復雜的遺傳表達為特點。依靠潛在的(underlying)突變，在疾病譜的一個極端方面，HCM可與正常長壽共存，但在另外一個極端方面，它是青年運動員中SCD的最常見的病因。SCD的病因被假定為源于電不穩(wěn)定性心肌基質(zhì)的復合的心室心動過速或纖維性顫動，但也提示有心動過緩和嚴重梗塞。對HCM中的SCD的預防仍然是臨床醫(yī)師的主要挑戰(zhàn)。在第三期中心(tertiarycenters)，已有報告使用可植入的心復律除顫器(cardioverterdefibrillator)(ICD)是有用的，但患者可仍然罹患伴有血栓栓塞性卒中風險的晚期心力衰竭和心房纖維性顫動。3，4HCM的病理模型對于了解HCM的發(fā)展和SCD的病因?qū)⑹潜匦璧模瑢τ陬A防和治療將是重要的。當前，已知的疾病基因占所有家族性肥厚型心肌病病例的約50-70％。5人的大多數(shù)原發(fā)性心肌病，無論是肥厚型或擴張的，都是由于收縮性蛋白質(zhì)、細胞骨架蛋白質(zhì)或間隙連接蛋白質(zhì)的突變，在大多數(shù)病例中是結(jié)構(gòu)性缺損的直接結(jié)果。心臟細胞外基質(zhì)起著多項重要的功能作用，如同基質(zhì)之于細胞粘附和支撐，如同信號之于細胞生存，如同貯主(reservoir)之于生長因子，并且作為組織機械學(mechanics)的主要決定因素。膠原是哺乳動物心臟中細胞外基質(zhì)的主要成分并表現(xiàn)為動態(tài)(dynamic)表達模式和在發(fā)育過程中和在病理條件下同種型(isoform)多樣性。5在成年心肌中，I型膠原占總膠原的80％，與III型膠原一起形成支持個體心肌細胞和平滑肌細胞的纖維狀膠原網(wǎng)絡(luò)，和組織肌肉束、傳導系統(tǒng)和冠狀脈管系統(tǒng)進入粘性的收縮性單位。相反地，III型膠原是新生大鼠心臟中的主要成分，約占總膠原含量的三分之一，并且因此其粘彈性不同于成年心肌。在右心室肥大的嚙齒動物模型中，I型和III型膠原的比率有顯著改變。9，10II型和VIII膠原在心臟發(fā)育過程中短暫表達并已涉及心臟形態(tài)發(fā)生中。盡管II型膠原通常是軟骨特有的，已經(jīng)顯示在小鼠胚胎發(fā)生過程中有非常廣泛的組織分布。小鼠αl(II)膠原基因(Col2a-1)在許多非軟骨組織中短暫表達，諸如脊索、神經(jīng)視網(wǎng)膜、尾腱、心臟、外胚層表面、顱蓋的間充質(zhì)、胎腦、內(nèi)耳的感覺上皮細胞和形成肢芽的頂外胚層脊(apicalectodermalridge)(AER)。對外顯子2的可選的剪接產(chǎn)生或者包括(IIAmRNA)或排除(IIBmRNA)此外顯子的II型前膠原mRNAs。IIA型mRNA在9.5天胚胎的心房和心室的外心膜細胞中均含量豐富，但是在10.5天即迅速減少。12.5天后，IIBmRNA水平迅速升高并最后超過IIAmRNAs。到了16.5天，IIBmRNAs是主要的Col2a-1轉(zhuǎn)錄物，主要在成熟軟骨細胞中表達。13自一家醫(yī)院的尸檢分析顯示，在2例II型膠原疾病的軟骨發(fā)育不良(hypochondrogenesis)的嬰兒心臟隔膜(septation)中發(fā)現(xiàn)缺損。至今尚未明確，IIA型膠原是如何對心臟形態(tài)發(fā)生起作用的，但近期的研究提示，它可調(diào)節(jié)生長因子。眾所周知，包含在IIAmRNA中的II型膠原基因(Col2a-1)的外顯子2，編碼在前-α1(II)膠原鏈的氨基-前肽中的富含半胱氨酸的球形域。在體外試驗中顯示，所述富含半胱氨酸的域結(jié)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白(如BMP2)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1。TGF-β1和BMP-2屬于調(diào)節(jié)生長和分化的轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族。如同TGF-β超家族的其它成員(TGF-β/活化素/結(jié)節(jié)和BMP/GDF/MIS亞家族)，它們不同的生物學作用是通過形成I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的異聚復合物，II型受體將I型受體磷酸化和隨后活化Smad蛋白而介導的。受體激活的Smads(R-Smads，Smads1-3、5、8)由I型受體激酶磷酸化，與共同的介體Smads(co-Smads，Smad4)形成異聚復合物，并易位核中，在那里它們與特定的轉(zhuǎn)錄因子和輔調(diào)節(jié)因子(co-regulators)相互作用以調(diào)節(jié)基因表達。R-Smads2和3應答于TGF-β亞家族，而R-Smads1、5和8主要應答于BMP亞家族。兩種抑制性Smads(1-Smad)，Smad6和Smad7，通過與Smad4競爭結(jié)合活化的R-Smads負性調(diào)節(jié)TGF-β/BMP信號傳導，抑制R-Smads的磷酸化，或靶向所述受體使其降解。16，17TGF-β1和BMP-2在心臟發(fā)育的多個不同方面，特別是在心肌細胞分化、瓣膜發(fā)生和流出道和隔膜的發(fā)育方面，均起重要的作用。18-21TGF-β1在出生后的心臟中發(fā)揮不同的生物學活性。它控制主要組織相容性復合物的表達，減少由心臟成纖維細胞產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞表型，導致心臟肥大和增強β-腎上腺素能的信號傳導。關(guān)于在出生后哺乳動物心臟中的BMP-2作用的信息有限。在新生大鼠心肌細胞培養(yǎng)中，BMP-2通過激活Smadi途徑發(fā)揮抗細胞凋亡作用和通過激活磷脂酰肌醇3激酶途徑增強收縮性。22，23臨床上，原發(fā)性肺動脈高壓，一種肺動脈中內(nèi)皮和平滑肌細胞的增生加強的疾病，與作用BMP(BMPR-II)的II型受體的突變相關(guān)聯(lián)。24，25近期在Marfan綜合征鼠科動物模型的研究也顯示，細胞外基質(zhì)，在本例中，微纖維蛋白，在調(diào)節(jié)TGF-β信號傳導的活性作用。26，27在人擴張的心肌病中，增強的肌束膜的纖維化與I型，III型和VI型膠原含量的增加有關(guān)，V型膠原在心肌的細胞內(nèi)基質(zhì)中增加。II型膠原在正常心臟或擴張的心肌病中不表達。28II型膠原在肥厚型心肌病人中是否異常表達還有待研究。多種心肌病和改變收縮性的小鼠模型集中在導致前述的蛋白質(zhì)、細胞周期調(diào)節(jié)蛋白、涉及鈣代謝的調(diào)節(jié)蛋白的突變上，和集中在腎上腺素能受體亞單位的信號傳導級聯(lián)上。雖然基質(zhì)缺損通常不被認為是心肌病可能的病因，細胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)組織模型和心肌細胞分化的概念并不新穎。甚至在伴有III型膠原的定向去除的小鼠中，沒有心臟異常，且猝死是由于主動脈破裂。29因此，在本申請所述的成年191-IIA突變小鼠是用于研究可突然發(fā)生的心肌病誘的導死亡的非常重要的模型。Taussig-Bing畸形(TBA)是罕見的但復雜的先天性心臟病，其包括伴肺動脈下心室隔膜缺損(VSD)的右心室雙出口(DORV)。主動脈和肺動脈干移位。TBA是僅次于法樂氏四聯(lián)癥(TetralogyofFallot)的DORV的最常見的變型。患TBA的嬰兒常常表現(xiàn)充血性心力衰竭和肺動脈高壓。其診斷是合并相關(guān)聯(lián)的血管缺損諸如冠狀動脈畸形、主動脈下狹窄、主動脈弓縮窄或中斷。目前推薦的治療是在單次手術(shù)中完全糾正，特別是包括動脈調(diào)轉(zhuǎn)手術(shù)，VSD修補，主動脈梗阻的矯正性修補和畸形的冠狀動脈的移位。因此，對于這些血管缺損的詳細繪圖對矯正性手術(shù)的成功至關(guān)重要。TOGA是最常診斷的新生兒紫紺性心臟缺損復合癥(ref)和包含心室大動脈不協(xié)調(diào)(ventriculoarterialdiscordance)。人TBA或TOGA的遺傳學集中在有關(guān)左-右不對稱或內(nèi)臟異位綜合征的候選基因上。三個人類基因的突變與TOGA相關(guān)：鋅指轉(zhuǎn)錄因子ZIC3{DigiIio，M.C.等.Completetranspositionofthegreatarteries：patternsofcongenitalheartdiseaseinfamilialprecurrence.Circulation104，2809-14(2001).}{Belmont，J.W.，Mohapatra，B.，Towbin，J.A.&Ware，S.M.Moleculargeneticsofheterotaxysyndromes.CurrOpinCardiol19，216-20(2004).}、CFC1(humanCRYPTICgene){Goldmuntz，E.等.CFC1mutationsinpatientswithtranspositionofthegreatarteriesanddouble-outletrightventricle.AmJHumGenet70，776-80(2002).}和PROSIT240{Muncke，N.等.MissensemutationsandgeneinterruptioninPROSIT240，anovelTRAP240-likegene，inpatientswithcongenitalheartdefect(transpositionofthegreatarteries).Circulation108，2843-50(2003).}。這些臨床發(fā)現(xiàn)已經(jīng)在用基因技術(shù)去除(geneticablation)Zic3的小鼠模型{Purandare，S.M.等.Acomplexsyndromeofleft-rightaxis，centralnervoussystemandaxialskeletondefectsinZic3mutantmice.Development129，2293-302(2002).}、潛在的(EGF-CFC){Gaio，U.等.Aroleofthecrypticgeneinthecorrectestablishmentoftheleft-rightaxis.CurrBiol9，1339-42(1999).}和TRAP220{Ito，M.，Yuan，C.X.，Okano，H.J.，Darnell，R.B.&Roeder，R.G.InvolvementoftheTRAP220componentoftheTRAP/SMCCcoactivatorcomplexinembryonicdevelopmentandthyroidhormoneaction.MolCell5，683-93(2000).}中得到驗證。在此，發(fā)明人描述在C57/BL6遺傳背景上帶有IIA突變的小鼠，是TBA和TOGA的新的小鼠模型。在人COL2A1基因中的突變是顯性的，導致具有從出生前致死到輕微畸形的嚴重的疾病譜的軟骨發(fā)育異常。在外顯子2中的顯性的突變已在施蒂克勒綜合征(SticklerSyndrome)和還伴有眼睛缺損的瓦格納氏綜合征(Wagner′sSyndromes)中被發(fā)現(xiàn){Richards，A.J.等.COL2A1exon2mutations：relevancetotheSticklerandWagnersyndromes。BrJOphthalmol84，364-71(2000).}{VanDerHout，A.H.等.OccurrenceofdeletionofaCOL2A1alleleasthemutationinSticklerSyndromeshowsthatacollagentypeIIdosageeffectunderliesthissyndrome.HumMutat20，236(2002).}{Donoso，L.A.等.Identificationofastopcodonmutationinexon2ofthecollagen2A1geneinalargesticklersyndromefamily.AmJOphthalmol134，720-7(2002).}{Donoso，L.A.等.ClinicalvariabilityofSticklersyndrome：roleofexon2ofthecollagenCOL2A1gene.SurvOphthalmol48，191-203(2003).}{Gupta，S.K.，Leonard，B.C.，Damji，K.F.&Bulman，D.E.Aframeshiftmutationinatissue-specificalternativelysplicedexonofcollagen2A1inWagner′svitreoretinalvitreoretinaldegeneration.AmJOphthalmol133，203-10(2002).}。然而，沒有紫紺性先天性心臟缺損的報告或與Col2a1基因突變系統(tǒng)性相關(guān)。僅有一例來自一家醫(yī)院的尸檢研究報告，2個患II型膠原疾病的軟骨發(fā)育不良的嬰兒的心臟隔膜缺損{Potocki，L，Abuelo，D.N.&Oyer，CE.Cardiacmalformationintwoinfantswithhypochondrogenesis.AmJMedGenet59，295-9(1995).}。鑒于未治療的紫紺性先天性心臟病的發(fā)病率和死亡率臨床意義重大，IIA前膠原可作為新的標記用于先天性心臟病復合癥的出生前篩查。作為在心臟形態(tài)發(fā)生中BMP依賴的Nkx2.5表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，IIA前膠原可作為用于心肌再生療法的生長因子的新的傳遞系統(tǒng)。了解這些心血管缺損在IIA無效突變體中的細胞機制，對闡明治療或預防紫紺性心臟疾病復合癥的新策略將是極為重要的。發(fā)明概述本發(fā)明提供兩個系的經(jīng)遺傳工程改造的小鼠，其中前膠原IIA基因的外顯子2與loxP序列側(cè)翼鄰接(flanked)，并且該外顯子2通過與表達Cre-重組酶的雜交小鼠而缺失。外顯子2的缺失導致IIA轉(zhuǎn)錄物的缺失。這進而導致心血管缺損的雙重表現(xiàn)，其中一個主要是C57/BL6遺傳背景的譜系死于嚴重的先天性心臟病(IIA-/-)，而在遠系繁殖的遺傳背景(C57BL6/ICR/129)下的另一個譜系發(fā)展為以心肌細胞肥大、雜亂排列(disarray)和瓣膜纖維化(191-IIA)為特征的肥厚型心肌病。本發(fā)明提供篩選用于減少肥大、雜亂排列和纖維化的藥物的方法，以及通過將所述藥物給予或者191-IIA成年小鼠或者IIA-/-突變的胚胎減少心血管形成模式結(jié)構(gòu)的缺損。這樣的藥物可以是合成的或天然發(fā)現(xiàn)的激素、生長因子、肽類或由適合用于基因轉(zhuǎn)移的載體攜帶的基因。本發(fā)明還提供從心臟或主動脈的原代細胞培養(yǎng)物和衍生于敲除小鼠的永久的細胞系。來自由191-IIA小鼠的永久的或原代細胞培養(yǎng)物的細胞，被用于篩選改善或消除肥大、增殖或纖維化過程的藥物。圖的簡述圖1191-IIA小鼠的系譜pedigree上欄的框圖概述了191-IIA小鼠中的猝死的自然史。下欄的框圖顯示在這些不同齡的小鼠中發(fā)現(xiàn)的四例心臟肥大的實例。圖2191.1心臟的H&E染色ACE-來自野生型小鼠。BDF-來自191.1雄性鼠，于2個月齡死亡的ColIIA的純合子無效突變體。AB-來自野生型(A)和突變體(B)的心臟的兩室的短軸面圖像。突變體的左心室壁較不致密，因此比野生型的左心室壁厚。CD-右心室(RV)，100x總放大率。在突變體的RV壁厚度增加。EF-側(cè)LV壁，400x總放大率。在野生型中心肌細胞為大小均勻，而在心肌中顯示平行方向排列(E)，突變體心肌以心肌細胞肥大和雜亂排列為特征(F)。圖3191.3心臟的H&E染色AC-分別為野生型小鼠的主動脈瓣(AV)和二尖瓣(MV)。BD-于3個月齡死亡的191.3雄性鼠的AV和MV。在突變體中，兩種瓣膜均出現(xiàn)纖維變性。所有的框圖用400x總放大率。比例，一格-20μm。圖4大齡191-IIA小鼠的H&E染色AB-來自于8個月齡死亡的254.66雄性小鼠的LV側(cè)壁。注意到多細胞結(jié)構(gòu)(hypercellularity)。C-254.66的RV。注意到多細胞結(jié)構(gòu)和心肌細胞肥大。D-來自于15個月齡死亡的191.29雄性小鼠的LV側(cè)壁。比較圖2F、4A和4B，此小鼠的心肌細胞并不紊亂無序。所有框圖用400x總放大率。比例，一格-20μm。圖5IIAmRNA的正常表達模式和IIA-/-小鼠的繁殖A-正常發(fā)育的心臟中IIAmRNA的不對稱分布。用IIA-特異性探針制作原位雜交的野生型胚胎的整體標本(Wholemount)(WISH)。在2-體節(jié)配對階段(E8.0)，IIAmRNA在心半月瓣(cardiaccrescent)中有很強的表達。在10-體節(jié)配對階段(E8.5)，IIAmRNA在初始心臟管道回路(loopingprimitivehearttube)中仍有很強的表達。在27-體節(jié)配對階段(E9.5)，IIAmRNA在心球(bulbouscordis)和流出道中，接著是在左心室中表達最高，在流入道(心房)中發(fā)現(xiàn)最低水平。B-Col2a1定位和目標載體的示意圖，其中外顯子2被插入由loxP位點側(cè)翼連接的Neo基因中斷(disrupted)。所述Neo基因隨后被Cre-介導的重組切除。C，D，E-靶向性缺失分別由DNA印跡法、RT-PCR和WISH證實。圖6新生鼠IIA-/-突變體中的血管缺損從左至右，顯示從胸的頭端至尾端的橫斷面。框圖(A-C)來自WT新生小鼠。框圖(D-L)來自IIA-/-突變體。A，B-在WT，肺動脈(p)起自右心室(rv)和位于主動脈(a)的前面和頭端。主動脈彎向氣管(t)的左側(cè)和產(chǎn)生右鎖骨下動脈(rs)和右頸動脈(rc)、左頸動脈(c)和左鎖骨下動脈(Is)。C-心房間隔膜將右和左心房(箭頭處)分隔開，而心室間隔膜(ivs)將左心室(Iv)與右心室(rv)分隔開。注意右心室壁比左心室壁薄。D-F-伴DORV的不完全TOGA的實例，和肺動脈下的VSD。D-在IIA-/-突變體中，產(chǎn)生頭部血管的主動脈(a)，在肺動脈(p)的前面。畸形的冠狀動脈(星號*)起自升主動脈。E-冠狀動脈離開(箭頭)之處的主動脈(a)，完全起自RV。大動脈導管未閉(pda)連接左降主動脈(da)。F-肺動脈(p)在主動脈的尾端并且均起自LV和RV。肺瓣膜(pv)正覆蓋瓣膜下心室隔膜缺損(箭頭處)。G-完全TOGA的實例，此處主動脈(a)起自RV。肺動脈(p)向尾端和后面易位(transposed)并且完全起自LV。H-...