專利名稱：一種力學增強型載細胞微通道水凝膠的制備方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學工程領域，具體涉及一種力學增強型載細胞微通道水凝膠的制備方法。
背景技術：
水凝膠是近些年來組織工程中應用最為廣泛的一種生物材料。它由三維交聯聚合物網絡包含大量的水構成，具有特殊的“軟”、“濕”環境，與生物體細胞外基質相似。基于水凝膠的組織工程技術已經被成功的用來構建一些較為簡單的組織結構如皮膚、膀胱和軟骨等。但是，在構建具有高細胞濃度、細胞代謝活動旺盛的三維復雜組織/器官如心臟、肝臟、 腎臟時，從表面擴散到組織內的營養物會很快被細胞耗盡，單純依靠營養物從表面擴散很難保證水凝膠內部的細胞獲得充足的營養物以及排出代謝產物。營養物的缺乏和代謝產物的積累均會影響細胞的正常代謝活動以及組織工程化組織的生理功能，如何加強營養物供應已成為組織工程中亟待解決的問題之一。近些年的研究表明，通過在水凝膠中引入微通道網絡，可以有效的提高水凝膠中營養物的輸送能力和調控細胞的化學微環境，模擬人體微血管的功能。目前，一些生物微制造技術，如模板法、生物打印技術、基于光圖形化的方法和模塊組裝法等，已經被用來在不同的載細胞水凝膠中構造微通道，通過在微通道中種內皮細胞可以形成內皮化通道。但是， 受水凝膠力學性能及細胞生長的影響，載細胞水凝膠中的微通道在結構上通常并不穩定， 容易堵塞、裂開或坍塌，內皮細胞容易脫落；另外，粘附在微通道表面的內皮細胞和微通道中的大分子異物有可能侵入水凝膠內部，影響細胞的正常生長和功能表達。

發明內容
為了克服上述現有現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種力學增強型載細胞微通道水凝膠的制備方法，通過該方法制備的載細胞微通道水凝膠中微通道結構穩定， 內皮細胞不容易脫落和侵入，在水凝膠交聯過程中能夠包裹細胞，微通道形成后注入內皮細胞培養液以形成內皮化的微通道。為了達到上述目的，本發明采取的技術方案為一種力學增強型載細胞微通道水凝膠的制備方法，包括以下步驟第一步，制備水凝膠溶膠，將光引發劑、水凝膠單體和水凝膠溶劑按質量比0 1 3 30 100混合均勻配制成水凝膠溶膠，光引發劑為2-羥基-2-甲基苯丙酮或艷固佳四59，水凝膠單體為瓊脂糖、膠原、明膠、透明質酸、殼聚糖、海藻酸納或聚乙二醇及其衍生物與透明質酸或聚乙二醇及其衍生物的混合物，混合物的質量比為1 0 20，水凝膠溶劑為去離子水、純水或PH值為5. 7 8. 0的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液；第二步，制備水凝膠溶膠與細胞培養液的混合液，將第一步中制備的水凝膠溶膠與細胞濃度為IO5 IO7ceIlsAiL的細胞培養液按體積比1 4 1混合均勻，細胞培養液中的細胞為軟骨細胞、造骨細胞、骨髓基質細胞、肝細胞、成纖維細胞、心肌細胞、間充質干細胞、胚胎干細胞、脂肪干細胞或神經前體細胞；第三步，將第二步中制備的水凝膠溶膠與細胞培養液的混合液倒入聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具中，模具中間插入一根外徑為0. 1 Imm的毛細管或纖維；第四步，改變溫度、離子濃度或紫外照射，使模具中的混合液發生一次交聯形成載細胞的水凝膠； 第五步，將毛細管或纖維抽出，在載細胞的水凝膠中形成微通道，給微通道里注入由光引發劑、水凝膠單體和水凝膠溶劑按照質量比為0.1 1 2 30 100制成的水凝膠溶膠，光引發劑為2-羥基-2-甲基苯丙酮或艷固佳四59，水凝膠單體為透明質酸或聚乙二醇及其衍生物，水凝膠溶劑為去離子水、純水或PH值為5. 7 8. 0的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液；第六步，等待0 IOmin后，重新插入毛細管或纖維，或將微通道中多余的水凝膠溶膠吸出，紫外照射使之發生二次交聯在微通道壁面區域形成帶有水凝膠密層的載細胞水凝膠，再次將毛細管或纖維抽出；第七步，在發生二次交聯形成的載細胞水凝膠的微通道中注入細胞濃度為IO5 Kfcells/mL的內皮細胞培養液0. 1 lmL，培養使內皮細胞生長鋪展以形成內皮化的微通道。由于本發明中水凝膠密層力學性能好，能夠維持微通道的穩定性，微通道不容易堵塞、裂開或坍塌；經過化學修飾的水凝膠密層有助于內皮細胞粘附，防止內皮細胞脫落和侵入；另外，通過調控水凝膠密層的結構，還可以對微通道中的培養液進行過濾和篩選。
具體實施例方式下面結合具體實施實例對本發明進行詳細說明實施例1一種力學增強型載細胞微通道水凝膠的制備方法，包括以下步驟第一步，制備水凝膠溶膠，將光引發劑、水凝膠單體和水凝膠溶劑按質量比 1 20 100混合均勻配制成水凝膠溶膠，光引發劑為2-羥基-2-甲基苯丙酮，水凝膠單體為瓊脂糖與聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEG-DMA)的混合物，混合物的質量比為1 4，水凝膠溶劑為PH值為5. 7 8. 0的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液；第二步，制備水凝膠溶膠與細胞培養液的混合液，將第一步中制備的水凝膠溶膠與細胞濃度為3X IO6ceIlsAiL的細胞培養液按體積比1 1在40°C混合均勻，細胞培養液中的細胞為成纖維細胞；第三步，將第二步中制備的水凝膠溶膠與細胞培養液的混合液倒入聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具中，模具中間插入一根外徑為0. 5mm的不銹鋼毛細管；第四步，改變溫度，使模具中的混合液發生一次交聯形成載細胞的水凝膠；第五步，將不銹鋼毛細管抽出，在載細胞的水凝膠中形成微通道，給微通道里注入由光引發劑、水凝膠單體和水凝膠溶劑按照質量比為0.5 20 100制成的水凝膠溶膠， 光引發劑為2-羥基-2-甲基苯丙酮，水凝膠單體為聚乙二醇衍生物，水凝膠溶劑為PH值為 5. 7 8. 0的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液；第六步，等待Imin后，重新插入不銹鋼毛細管，紫外照射使之發生二次交聯在微通道壁面區域形成帶有水凝膠密層的載細胞水凝膠，再次將不銹鋼毛細管抽出；第七步，在發生二次交聯形成的載細胞水凝膠的微通道中注入細胞濃度為 2X106cells/ml的內皮細胞培養液0. 7mL，培養使內皮細胞生長鋪展以形成內皮化的微通道。實施例2一種力學增強型載細胞微通道水凝膠的制備方法，包括以下步驟第一步，制備水凝膠溶膠，將光引發劑、水凝膠單體和水凝膠溶劑按質量比 0.2 4 100混合均勻配置成水凝膠溶膠，光引發劑為艷固佳四59，水凝膠單體為瓊脂糖與透明質酸的混合物，混合物的質量比為1 1，水凝膠溶劑是PH值為5. 7 8.0的磷酸鹽 (PBS)緩沖溶液；第二步，制備水凝膠溶膠與細胞培養液的混合液，將第一步中制備的水凝膠溶膠與細胞濃度為3X IO6ceIlsAiL的細胞培養液按體積比1 1在40°C混合均勻，細胞培養液中的細胞為平滑肌細胞；第三步，將第二步中制備的水凝膠溶膠與細胞培養液的混合液倒入聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具中，模具中間插入一根外徑為0. 2mm的不銹鋼毛細管；第四步，改變溫度，使模具中的混合液發生一次交聯形成載細胞的水凝膠；第五步，將不銹鋼毛細管抽出，在載細胞的水凝膠中形成微通道，給微通道里注入由光引發劑、水凝膠單體和水凝膠溶劑按照質量比為0.1 2 100制成的水凝膠溶膠，光引發劑為艷固佳四59，水凝膠單體為透明質酸，水凝膠溶劑為PH值為5. 7 8. 0的磷酸鹽 (PBS)緩沖溶液；第六步，等待aiiin后，重新插入不銹鋼毛細管，紫外照射使之發生二次交聯在微通道壁面區域形成帶有水凝膠密層的載細胞水凝膠，再次將不銹鋼毛細管抽出；第七步，在發生二次交聯形成的載細胞水凝膠的微通道中注入細胞濃度為 2X106cells/ml的內皮細胞培養液0. lmL，培養使內皮細胞生長鋪展以形成內皮化的微通道。實施例3一種力學增強型載細胞微通道水凝膠的制備方法，包括以下步驟第一步，制備水凝膠溶膠，將光引發劑、水凝膠單體和水凝膠溶劑按質量比 1 30 100混合均勻配置成水凝膠溶膠，光引發劑為艷固佳四59，水凝膠單體為聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)，水凝膠溶劑是PH值為5. 7 8. 0的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液；第二步，制備水凝膠溶膠與細胞培養液的混合液，將第一步中制備的水凝膠溶膠與細胞濃度為3X IO6ceIlsAiL的細胞培養液按體積比1 1在40°C混合均勻，細胞培養液中的細胞為軟骨細胞；第三步，將第二步中制備的水凝膠溶膠與細胞培養液的混合液倒入聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具中，模具中間插入一根外徑為0. 4mm的不銹鋼毛細管；第四步，紫外照射，使模具中的混合液發生一次交聯形成載細胞的水凝膠；第五步，將不銹鋼毛細管抽出，在載細胞的水凝膠中形成微通道，給微通道里注由入光引發劑、水凝膠單體和水凝膠溶劑按照質量比為1 30 100制成的水凝膠溶膠，光引發劑為艷固佳四59，水凝膠單體為聚乙二醇衍生物，水凝膠溶劑為PH值為5. 7 8. 0的磷酸鹽(PBQ緩沖溶液；第六步，等待:3min后，將微通道中多余的水凝膠溶膠吸出，紫外照射使之發生二次交聯在微通道壁面區域形成帶有水凝膠密層的載細胞微通道水凝膠；第七步，在發生二次交聯形成的載細胞水凝膠的微通道中注入細胞濃度為 2X106cells/ml的內皮細胞培養液0. 4mL，培養使內皮細胞生長鋪展以形成內皮化的微通道。
權利要求
1.一種力學增強型載細胞微通道水凝膠的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 第一步，制備水凝膠溶膠，將光引發劑、水凝膠單體和水凝膠溶劑按質量比0 1 3 30 100混合均勻配制成水凝膠溶膠，光引發劑為2-羥基-2-甲基苯丙酮或艷固佳四59，水凝膠單體為瓊脂糖、膠原、明膠、透明質酸、殼聚糖、海藻酸納或聚乙二醇及其衍生物與透明質酸或聚乙二醇及其衍生物的混合物，混合物的質量比為1 0 20，水凝膠溶劑為去離子水、純水或PH值為5. 7 8.0的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液；第二步，制備水凝膠溶膠與細胞培養液的混合液，將第一步中制備的水凝膠溶膠與細胞濃度為IO5 Kfcells/mL的細胞培養液按體積比1 4 1混合均勻，細胞培養液中的細胞為軟骨細胞、造骨細胞、骨髓基質細胞、肝細胞、成纖維細胞、心肌細胞、間充質干細胞、 胚胎干細胞、脂肪干細胞或神經前體細胞；第三步，將第二步中制備的水凝膠溶膠與細胞培養液的混合液倒入聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA)模具中，模具中間插入一根外徑為0. 1 Imm的毛細管或纖維；第四步，改變溫度、離子濃度或紫外照射，使模具中的混合液發生一次交聯形成載細胞的水凝膠；第五步，將毛細管或纖維抽出，在載細胞的水凝膠中形成微通道，給微通道里注入由光引發劑、水凝膠單體和水凝膠溶劑按照質量比為0.1 1 2 30 100制成的水凝膠溶膠，光引發劑為2-羥基-2-甲基苯丙酮或艷固佳四59，水凝膠單體為透明質酸或聚乙二醇及其衍生物，水凝膠溶劑為去離子水、純水或PH值為5. 7 8. 0的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液； 第六步，等待0 IOmin后，重新插入毛細管或纖維，或將微通道中多余的水凝膠溶膠吸出，紫外照射使之發生二次交聯在微通道壁面區域形成帶有水凝膠密層的載細胞水凝膠，再次將毛細管或纖維抽出；第七步，在發生二次交聯形成的載細胞水凝膠的微通道中注入細胞濃度為IO5 Kfcells/mL的內皮細胞培養液0. 1 lmL，培養使內皮細胞生長鋪展以形成內皮化的微通道。
2.根據權利要求1所述的一種力學增強型載細胞微通道水凝膠的制備方法，其特征在于，包括以下步驟第一步，制備水凝膠溶膠，將光引發劑、水凝膠單體和水凝膠溶劑按質量比 1 20 100混合均勻配制成水凝膠溶膠，光引發劑為2-羥基-2-甲基苯丙酮，水凝膠單體為瓊脂糖與聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEG-DMA)的混合物，混合物的質量比為1 4，水凝膠溶劑為PH值為5. 7 8. 0的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液；第二步，制備水凝膠溶膠與細胞培養液的混合液，將第一步中制備的水凝膠溶膠與細胞濃度為3X IO6ceIlsAiL的細胞培養液按體積比1 1在40°C混合均勻，細胞培養液中的細胞為篇成纖維細胞；第三步，將第二步中制備的水凝膠溶膠與細胞培養液的混合液倒入聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA)模具中，模具中間插入一根外徑為0. 5mm的不銹鋼毛細管；第四步，改變溫度，使模具中的混合液發生一次交聯形成載細胞的水凝膠； 第五步，將不銹鋼毛細管抽出，在載細胞的水凝膠中形成微通道，給微通道里注入由光引發劑、水凝膠單體和水凝膠溶劑按照質量比為0.5 20 100制成的水凝膠溶膠，光引發劑為2-羥基-2-甲基苯丙酮，水凝膠單體為聚乙二醇衍生物，水凝膠溶劑為PH值為.5. 7 8. 0的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液；第六步，等待Imin后，重新插入不銹鋼毛細管，紫外照射使之發生二次交聯在微通道壁面區域形成帶有水凝膠密層的載細胞水凝膠，再次將不銹鋼毛細管抽出；第七步，在發生二次交聯形成的載細胞水凝膠的微通道中注入細胞濃度為 2X106cells/ml的內皮細胞培養液0. 7mL，培養使內皮細胞生長鋪展以形成內皮化的微通道。
3.根據權利要求1所述的一種力學增強型載細胞微通道水凝膠的制備方法，其特征在于，包括以下步驟第一步，制備水凝膠溶膠，將光引發劑、水凝膠單體和水凝膠溶劑按質量比 0.2 4 100混合均勻配置成水凝膠溶膠，光引發劑為艷固佳四59，水凝膠單體為瓊脂糖與透明質酸的混合物，混合物的質量比為1 1，水凝膠溶劑是PH值為5. 7 8.0的磷酸鹽 (PBS)緩沖溶液；第二步，制備水凝膠溶膠與細胞培養液的混合液，將第一步中制備的水凝膠溶膠與細胞濃度為3X IO6ceIlsAiL的細胞培養液按體積比1 1在40°C混合均勻，細胞培養液中的細胞為平滑肌細胞；第三步，將第二步中制備的水凝膠溶膠與細胞培養液的混合液倒入聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA)模具中，模具中間插入一根外徑為0. 2mm的不銹鋼毛細管；第四步，改變溫度，使模具中的混合液發生一次交聯形成載細胞的水凝膠； 第五步，將不銹鋼毛細管抽出，在載細胞的水凝膠中形成微通道，給微通道里注入由光引發劑、水凝膠單體和水凝膠溶劑按照質量比為0.1 2 100制成的水凝膠溶膠，光引發劑為艷固佳四59，水凝膠單體為透明質酸，水凝膠溶劑為PH值為5. 7 8. 0的磷酸鹽(PBS) 緩沖溶液；第六步，等待anin后，重新插入不銹鋼毛細管，紫外照射使之發生二次交聯在微通道壁面區域形成帶有水凝膠密層的載細胞水凝膠，再次將不銹鋼毛細管抽出；第七步，在發生二次交聯形成的載細胞水凝膠的微通道中注入細胞濃度為 2X106cells/ml的內皮細胞培養液0. lmL，培養使內皮細胞生長鋪展以形成內皮化的微通道。
4.根據權利要求1所述的一種力學增強型載細胞微通道水凝膠的制備方法，其特征在于，包括以下步驟第一步，制備水凝膠溶膠，將光引發劑、水凝膠單體和水凝膠溶劑按質量比 1 30 100混合均勻配置成水凝膠溶膠，光引發劑為艷固佳四59，水凝膠單體為聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)，水凝膠溶劑是PH值為5. 7 8. 0的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液；第二步，制備水凝膠溶膠與細胞培養液的混合液，將第一步中制備的水凝膠溶膠與細胞濃度為3X IO6ceIlsAiL的細胞培養液按體積比1 1在40°C混合均勻，細胞培養液中的細胞為軟骨細胞；第三步，將第二步中制備的水凝膠溶膠與細胞培養液的混合液倒入聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA)模具中，模具中間插入一根外徑為0. 4mm的不銹鋼毛細管；第四步，紫外照射，使模具中的混合液發生一次交聯形成載細胞的水凝膠； 第五步，將不銹鋼毛細管抽出，在載細胞的水凝膠中形成微通道，給微通道里注由入光引發劑、水凝膠單體和水凝膠溶劑按照質量比為1 30 100制成的水凝膠溶膠，光引發劑為艷固佳四59，水凝膠單體為聚乙二醇衍生物，水凝膠溶劑為PH值為5. 7 8. 0的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液；第六步，等待3min后，將微通道中多余的水凝膠溶膠吸出，紫外照射使之發生二次交聯在微通道壁面區域形成帶有水凝膠密層的載細胞微通道水凝膠；第七步，在發生二次交聯形成的載細胞水凝膠的微通道中注入細胞濃度為 2X106cells/ml的內皮細胞培養液0. 4mL，培養使內皮細胞生長鋪展以形成內皮化的微通道。
全文摘要
一種力學增強型載細胞微通道水凝膠的制備方法，先制備水凝膠溶膠與細胞培養液的混合溶液，將溶膠-細胞混合液倒入中間插有毛細管或纖維的聚甲基丙烯酸甲酯模具中，使之發生一次交聯，將毛細管或纖維抽出，在載細胞水凝膠的微通道中通入水凝膠溶膠，重新插入毛細管或纖維，或將微通道中多余的水凝膠溶膠吸出，紫外照射使之發生二次交聯在微通道壁面區域形成帶有水凝膠密層的載細胞水凝膠，再次將毛細管或纖維抽出，在載細胞水凝膠的微通道中通入內皮細胞培養液，培養使內皮細胞生長鋪展后形成內皮化的微通道，本發明中水凝膠密層的引入可以維持水凝膠中微通道的穩定性，同時可以防止內皮細胞脫落和侵入，還可以對微通道中的培養液進行過濾和篩選。
文檔編號C08J3/075GK102266589SQ20111021502
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月28日 優先權日2011年7月28日
發明者盧天健, 周麗宏, 徐峰, 黃國友 申請人:西安交通大學