專利名稱：一種紫陽富硒綠茶含硒多糖及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于茶制品與生物工程技術領域，具體涉及一種紫陽富硒綠茶硒多糖及其制備方法和用途。
背景技術：
茶葉可分為三大類綠茶(未發酵茶)、烏龍茶(半發酵茶)和紅茶(發酵茶)。 其中，綠茶因具有香高、味醇、形美、耐沖泡等特點，是我國產量最多的一類茶葉，其花色品種之多居世界首位，每年出口數萬噸，占世界茶葉市場貿易量的70%左右。現代科學研究表明，綠茶在諸多疾病的預治中發揮著重要作用，特別是在心血管疾病、腫瘤發生等慢性疾病的防治中作用尤為突出。20世紀70年代末，產自高硒地區的天然富硒茶引起人們的廣泛關注，其主要產自高硒地區，例如陜西紫陽和湖北恩施。富硒綠茶被認為有非常高的價值，主要是硒一直被看作是重要的食物源抗氧化劑(比維生素高500倍)，其攝入與免疫、腫瘤等疾病的防治密切相關。現代流行病學調查結果也認為適量補硒有益人體健康。硒通常在動植物體內能以硒酶、硒蛋白等有機硒的形態存在，在維持細胞膜的完整性和保護脂肪、脂蛋白和DNA免受氧化損傷中發揮者十分重要的作用。一些研究結果表明，富硒綠茶生物活性顯著高于普通綠茶，且發現有機硒較無機硒有更高的生物利用度和更低的毒性。但是，有關富硒茶葉中硒的化學存在形態的鑒定仍然是一個尚未解決的挑戰性難題。目前，對于富硒茶的研究主要集中在人工栽培，富硒茶的人工栽培方法，授權公告號CN10M388C ；富硒茶的生產方法，公開號CN1568655 ；—種富硒茶葉的生產調節劑及其用法，授權公告號CN1225984C層面上，活性評價也僅限于原茶材料或水提物水平(抗腫瘤活性納米富硒綠茶的制備方法及其產品，公開號CN101142951)。而對天然富硒茶功能因子的深入研究報導卻很少，尤其是天然富硒茶多糖幾乎沒有報道。紫陽富硒綠茶，在醫藥領域被稱為“抗癌之王”與“抗衰老明星”，被營養學界譽為 21世紀健康佳品和綠色保健飲料，是具有廣闊前景的保健食品，尤其對人體硒的攝入有益。 更值得注意的是，在眾多茶多酚(活性類黃酮)、皂苷、酶、蛋白、多糖等潛在活性成分中，綠茶中水溶性酶、蛋白、多糖等大分子成分較脂溶性類黃酮、皂苷等小分子成分更容易進入茶飲水中，作為綠茶的功效成分被人體攝入，而且生物大分子成分通常是微量元素硒的理想載體，易與硒復合為有機硒呈現重要的生物活性。特別是，近年來隨著蛋白質與核酸研究的深入以及對糖類參與組織細胞功能活動機制的闡明，天然多糖作為一類重要的生物效應調節劑，倍受研究者的關注。但是，目前已報導的硒多糖主要是通過人工合成獲取。如硒化角叉菜膠、硒化箬葉多糖、硒化葡聚糖和硒化黃芪多糖等。可見，綠茶硒多糖的研究已成為食品藥品領域中的一個新的增長點，如何開發新型硒多糖食品功能因子或藥品具有重要的科學意義，并發揮其潛在的巨大經濟與社會效益。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在于針對上述現有技術中的不足，提供一種成本低廉，適于推廣使用，具有增強免疫力的作用，對于腫瘤細胞，特別是結腸癌細胞生長有明顯的抑制作用，同時對肝損傷亦有明顯的保護作用的紫陽富硒綠茶含硒多糖。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是一種紫陽富硒綠茶含硒多糖，其特征在于，該含硒多糖的組成按質量百分比計為硒1.5ppm 8. 5ppm，余量為雜多糖；所述雜多糖的組成按摩爾百分比計為甘露糖3. 3% 5. 3%，核糖 2%，鼠李糖3. 5% 5 %，葡萄糖醛酸2% 3.5%，半乳糖醛酸2. 6% 3.8%，葡萄糖30% ；34.2%，木糖
3.6% 5. 6%，半乳糖 19. 8% 23. 2%，阿拉伯糖 21. 5% 25. 6%。上述的一種紫陽富硒綠茶含硒多糖，該含硒多糖的組成按質量百分比計為 硒3ppm 7ppm，余量為雜多糖；所述雜多糖的組成按摩爾百分比計為甘露糖4.
4.9 %，核糖1. 2 % 1. 8 %，鼠李糖4. 0 % 4. 5 %，葡萄糖醛酸2. 3 % 2. 9 %，半乳糖醛酸 2. 8% 3. 4%，葡萄糖31% 33. 5%，木糖4% 5%，半乳糖20. 3% 22. 6%，阿拉伯糖 22. 5% 24. 7%。上述的一種紫陽富硒綠茶含硒多糖，該含硒多糖的組成按質量百分比計為硒 5ppm，余量為雜多糖；所述雜多糖的組成按摩爾百分比計為甘露糖4.5%，核糖1.6%， 鼠李糖4.3%，葡萄糖醛酸2.7%，半乳糖醛酸3.2%，葡萄糖32.7%，木糖4.6%，半乳糖 22. 4%，阿拉伯糖24%。本發明還提供了一種紫陽富硒綠茶含硒多糖的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)將紫陽富硒綠茶茶葉在自然條件下晾曬干或烘干，然后粉碎成茶葉粉末；(2)向步驟(1)中所述茶葉粉末中加入所述茶葉粉末質量10 15倍且溫度為 80°c的蒸餾水，浸提池后過濾；(3)重復步驟0)2 3次，合并濾液后濃縮至濾液體積的1/4 ；(4)向步驟C3)中濃縮后的濾液中加入3 5倍體積的無水乙醇浸泡，離心后收集沉淀；(5)重復步驟(4)三次后向收集的沉淀中加入所述沉淀質量3 5倍的蒸餾水，反復凍融8 10次除去蛋白，離心，棄沉淀，將上清液用蒸餾水透析7 后冷凍干燥，得到紫陽富硒綠茶含硒多糖。另外，本發明還提供了紫陽富硒綠茶含硒多糖作為功能性保健食品的用途，尤其是作為增強免疫保健食品或護肝保健食品的用途；紫陽富硒綠茶含硒多糖在制備免疫增強劑藥物中的用途；紫陽富硒綠茶含硒多糖在制備治療腫瘤的藥物中的用途，尤其是在制備治療結腸癌的藥物中的用途；紫陽富硒綠茶含硒多糖在制備治療肝損傷的藥物中的用途。本發明的紫陽富硒綠茶含硒多糖可作為保健食品(免疫增強保健食品和護肝保健食品)直接服用，也可作為食品添加劑用于制作保健食品，另外，還可采用常規方法將紫陽富硒綠茶含硒多糖制備成膠囊劑、片劑、顆粒劑或口服液劑等劑型的保健食品。本發明的紫陽富硒綠茶含硒多糖制備免疫增強藥物、抗腫瘤藥物和治療肝損傷的藥物的方法為膠囊劑的制備方法將紫陽富硒綠茶含硒多糖按常規制膠囊的方法制成膠囊， 載體為常規藥用膠囊載體，每粒膠囊0. 15g 0. 25g，每粒膠囊含紫陽富硒綠茶含硒多糖 IOOmg 160mg。該膠囊劑的用法用量為每日3次，每次3 5粒。
片劑的制備方法將紫陽富硒綠茶含硒多糖按常規制片劑的方法制成片劑，輔料為常規藥學上可接受的輔料(如淀粉、硬脂酸鎂、糊精等)，每片0. 25g 0. 5g，每片含紫陽富硒綠茶含硒多糖IOOmg 160mg。該片劑的用法用量為每日3次，每次3 5片。口服液的制備方法將紫陽富硒綠茶含硒多糖溶解于無菌水中，按常規制口服液的方法加藥學上可接受的輔助性成分(如調味劑)制成口服液，每瓶10mL，每瓶含紫陽富硒綠茶含硒多糖IOOmg 160mg。該口服液的用法用量為每日3次，每次1 2瓶。本發明采用氫化物原子熒光光譜法(HG-AFS)進行紫陽富硒綠茶含硒多糖中硒含量的測定1、標準曲線繪制將硒標準應用液(1 μ g/mL)分別取0. 0、0. lmL、0. 2mL、0. 4mL、 0. 8mL、1. 6mL、3. 2mL于一系列IOOmL容量瓶中，加5mL鹽酸混勻，并用去離子水定容IOOmL, 采用AFS-3100型全自動雙道原子熒光光度計測量繪制標準曲線；2、樣品(紫陽富硒綠茶含硒多糖)測定稱取一定量樣品于消化管內，加入IOmL混合酸(HNO3 HClO4 = 4 1)冷消化過夜，次日，加入幾粒玻璃珠，于175°C加熱消化證 6h，當消化液變為澄清無色溶液并有白煙產生時，再繼續加熱至管內液體體積剩余2mL左右，停止加熱，不可蒸干，冷卻后再加5mL鹽酸，于150°C至溶液清亮，樣品中的％6+還原成％4+，用硼氫化鈉(NaBH4)作還原劑，將在鹽酸介質中還原成％Η2。將消化液轉移至50mL容量瓶中，加2. 5mL濃鹽酸后定容，同時做空白對照；采用AFS-3100型全自動雙道原子熒光光度計測定樣品；儀器參數設定為負高壓300V，總電流80mA，原子化器高度8mm，原子化溫度800°C，載氣流速400mL/ min，屏蔽氣流量900mL/min，延遲時間ls，讀數時間10s，加液時間6s，上樣量2mL。結果顯示，紫陽富硒綠茶含硒多糖中硒含量為1. 5 μ g/g 8. 5 μ g/g，顯著高于茶葉中硒含量 (0. 57 μ g/g)。本發明采用傅里葉紅外光譜(IR)法測定紫陽富硒綠茶含硒多糖紅外特征，結果如圖1所示，從圖中可以看出，在:3431(31^1左右有羥基的強特征吸收峰，在^52-2958(31^1 處有C-H伸縮吸收峰，在1039-1145(31^1附近的吸收峰顯示亞硒酸酯中弱吸收峰，在 1629cm-1處有-COOH的弱吸收峰，表明紫陽富硒綠茶多糖為含硒酸性多糖。本發明采用化學水解法(三氟乙酸法)水解釋放含硒多糖的成分組成并采用PMP 柱前衍生化高效液相色譜(HPLC)法分析成分組成。分別取標準品[D-甘露糖(Man)，D-核糖(Rib)，L-鼠李糖(Rha)，D-葡萄糖醛酸(GlcUA)，D-半乳糖醛酸(GalUA)，D-葡萄糖 (Glc)，D-木糖(Xyl)，D-半乳糖(Gal)，L-阿拉伯糖(Ara)，D-巖藻糖(Fuc)均購自美國 Sigma公司]和待測多糖水解樣品溶液50 μ L于具塞試管中，向其中分別加入0. 3Μ NaOH 溶液50 μ L和0. 5Μ PMP甲醇溶液60 μ L，混勻后置于70°C水浴反應30min，取出，冷卻至室溫后，加入0. 3M HCl溶液50 μ L，得還原糖的PMP標記溶液，對該溶液進行HPLC進樣分析。 分析采用Siimadzu LC-2010A液相色譜系統，紫外檢測波長250nm，色譜柱采用Xterra-C18 分析柱 O50X4.6mm i. d.，5 μ m，美國 Waters)或 Venusil C18 柱 Q50 X 4. 6mm i. d. ,5ym, USA)。流動相為A 乙腈；B 0. 045%的KH2PO4水溶液(用KOH調節pH至系列測試值)，采用不同梯度分離模式，進樣體積10μ L，流速為1. OmL/min。結果表明，紫陽富硒綠茶含硒多糖是雜多糖，該雜多糖由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖九種成分組成，其摩爾百分含量分別為甘露糖3. 3% 5. 3%，核糖 2%, 鼠李糖3. 5% 5%，葡萄糖醛酸2% 3. 5%，半乳糖醛酸2. 6% 3. 8%，葡萄糖30% 34. 2%，木糖 3. 6% 5. 6%，半乳糖 19. 8% 23. 2%，阿拉伯糖 21. 5% 25. 6%。
本發明與現有技術相比具有以下優點本發明采用水提取乙醇沉淀、反復凍融、透析方法獲得高純度含硒多糖，方法簡便，成本低廉，適于推廣使用，該含硒多糖具有明顯的免疫調節功效，對于腫瘤細胞，特別是結腸癌細胞生長有明顯的抑制作用，同時對肝損傷亦有明顯的保護作用。下面結合附圖和實施例，對本發明的技術方案做進一步的詳細描述。


圖1為本發明紫陽富硒綠茶含硒多糖的傅里葉紅外光譜(IR)圖。圖2為本發明實施例3制備的紫陽富硒綠茶含硒多糖的HPLC色譜圖。圖3為本發明抗氧化實驗中總還原能力測定結果。圖4為本發明抗氧化實驗中清除超氧陰離子活性測定結果。圖5為本發明抗氧化實驗中羥自由基清除作用的測定結果。圖6為本發明抗氧化實驗中DPPH自由基清除作用的測定結果。圖7為本發明抗腫瘤實驗中對結腸癌細胞(LoVo)周期影響的測定結果。圖8為本發明抗腫瘤實驗中對照組對結腸癌細胞(LoVo)周期影響的測定結果。圖9為本發明抗腫瘤實驗中紫陽富硒綠茶含硒多糖濃度為100 μ g/mL時對結腸癌細胞(LoVo)周期影響的測定結果。圖10為本發明抗腫瘤實驗中紫陽富硒綠茶含硒多糖濃度為500 μ g/mL時對結腸癌細胞(LoVo)周期影響的測定結果。圖11為本發明抗腫瘤實驗中對照組對結腸癌細胞(LoVo)凋亡作用的測定結果。圖12為本發明抗腫瘤實驗中5-Fu濃度為100 μ g/mL時對結腸癌細胞(LoVo)凋亡作用的測定結果。圖13為本發明抗腫瘤實驗中紫陽富硒綠茶含硒多糖濃度為100 μ g/mL時對結腸癌細胞(LoVo)凋亡作用的測定結果。圖14為本發明抗腫瘤實驗中紫陽富硒綠茶含硒多糖濃度為500 μ g/mL時對結腸癌細胞(LoVo)凋亡作用的測定結果。
具體實施例方式實施例1本實施例的一種紫陽富硒綠茶含硒多糖，該含硒多糖的組成按質量百分比計為硒8. 5ppm，余量為雜多糖；所述雜多糖的組成按摩爾百分比計為甘露糖5. 3%，核糖 2%，鼠李糖5%，葡萄糖醛酸3.5%，半乳糖醛酸3.8%，葡萄糖30%，木糖5.2%，半乳糖 23. 2%，阿拉伯糖22%。其制備方法包括以下步驟(1)將紫陽富硒綠茶茶葉在自然條件下晾曬干，然后粉碎成茶葉粉末；(2)向步驟(1)中所述茶葉粉末中加入所述茶葉粉末質量的10倍且溫度為80°C 的蒸餾水，浸提池后過濾；(3)重復步驟( 2次，合并濾液后濃縮至濾液體積的1/4 ；(4)向步驟(3)中濃縮后的濾液中加入5倍體積的無水乙醇浸泡，離心后收集沉淀；(5)重復步驟(4)三次后向收集的沉淀中加入所述沉淀質量的3倍的蒸餾水，反復凍融8次除去蛋白，離心，棄沉淀，將上清液用蒸餾水透析7 后冷凍干燥，得到紫陽富硒綠茶含硒多糖。采用氫化物原子熒光光譜法(HG-AFS)測定制備的紫陽富硒綠茶含硒多糖中的硒含量(按質量含量計)為8. 5ppm ；采用化學水解法(三氟乙酸法)水解釋放含硒多糖中雜多糖的成分，進行HPLC進樣分析，得到雜多糖組成(按摩爾百分比計)為甘露糖5.3%，核糖2 %，鼠李糖5 %，葡萄糖醛酸3.5%，半乳糖醛酸3.8%，葡萄糖30 %，木糖5. 2 %，半乳糖 23. 2%，阿拉伯糖22%。實施例2本實施例的一種紫陽富硒綠茶含硒多糖，該含硒多糖的組成按質量百分比計為 硒1. 5ppm，余量為雜多糖；所述雜多糖的組成按摩爾百分比計為甘露糖5. 3%，核糖1%， 鼠李糖3.5%，葡萄糖醛酸2 %，半乳糖醛酸2.6%，葡萄糖34.2%，木糖3.6%，半乳糖 22. 2%，阿拉伯糖25. 6%0其制備方法包括以下步驟(1)將紫陽富硒綠茶茶葉在自然條件下晾曬干，然后粉碎成茶葉粉末；(2)向步驟(1)中所述茶葉粉末中加入所述茶葉粉末質量的15倍且溫度為80°C 的蒸餾水，浸提池后過濾；(3)重復步驟( 2次，合并濾液后濃縮至濾液體積的1/4 ；(4)向步驟(3)中濃縮后的濾液中加入3倍體積的無水乙醇浸泡，離心后收集沉淀；(5)重復步驟(4)三次后向收集的沉淀中加入所述沉淀質量的4倍的蒸餾水，反復凍融10次除去蛋白，離心，棄沉淀，將上清液用蒸餾水透析7 后冷凍干燥，得到紫陽富硒綠茶含硒多糖。采用氫化物原子熒光光譜法(HG-AFS)測定制備的紫陽富硒綠茶含硒多糖中的硒含量(按質量含量計)為1. 5ppm ；采用化學水解法(三氟乙酸法)水解釋放含硒多糖中雜多糖的成分，進行HPLC進樣分析，得到雜多糖組成(按摩爾百分比計)為甘露糖5.3%，核糖1 %，鼠李糖3. 5 %，葡萄糖醛酸2 %，半乳糖醛酸2.6%，葡萄糖34. 2 %，木糖3. 6 %，半乳糖22. 2%，阿拉伯糖25. 6%。實施例3本實施例的一種紫陽富硒綠茶含硒多糖，該含硒多糖的組成按質量百分比計為硒5ppm，余量為雜多糖；所述雜多糖的組成按摩爾百分比計為甘露糖4.9%，核糖 1. 2 %，鼠李糖4 %，葡萄糖醛酸2.9%，半乳糖醛酸3.4%，葡萄糖33. 5 %，木糖5 %，半乳糖 21. 8%，阿拉伯糖23. 3%0其制備方法包括以下步驟(1)將紫陽富硒綠茶茶葉烘干，然后粉碎成茶葉粉末；(2)向步驟(1)中所述茶葉粉末中加入所述茶葉粉末質量的12倍且溫度為80°C 的蒸餾水，浸提池后過濾；(3)重復步驟(2) 3次，合并濾液后濃縮至濾液體積的1/4 ；
(4)向步驟(3)中濃縮后的濾液中加入4倍體積的無水乙醇浸泡，離心后收集沉淀；(5)重復步驟(4)三次后向收集的沉淀中加入所述沉淀質量的5倍的蒸餾水，反復凍融9次除去蛋白，離心，棄沉淀，將上清液用蒸餾水透析7 后冷凍干燥，得到紫陽富硒綠茶含硒多糖。采用氫化物原子熒光光譜法(HG-AFS)測定制備的紫陽富硒綠茶含硒多糖中的硒含量(按質量含量計)為5ppm ；采用化學水解法(三氟乙酸法)水解釋放含硒多糖中雜多糖的成分，進行HPLC進樣分析，結果如圖2所示，圖中1為甘露糖，2為核糖，3為鼠李糖，4 為葡萄糖醛酸，5為半乳糖醛酸，6為葡萄糖，7為木糖，8為半乳糖，9為阿拉伯糖，10為巖藻糖(內標)，得到雜多糖組成(按摩爾百分比計)為甘露糖4.9%，核糖1.2%，鼠李糖4%， 葡萄糖醛酸2. 9 %，半乳糖醛酸3. 4 %，葡萄糖33. 5 %，木糖5 %，半乳糖21.8%，阿拉伯糖 23. 3 % ο實施例4本實施例的一種紫陽富硒綠茶含硒多糖，該含硒多糖的組成按質量百分比計為 硒3ppm，余量為雜多糖；所述雜多糖的組成按摩爾百分比計為甘露糖3. 3%，核糖1. 8%, 鼠李糖4.5%，葡萄糖醛酸2.3%，半乳糖醛酸2.8%，葡萄糖31%，木糖5.6%，半乳糖 23. 1%，阿拉伯糖25. 6%0其制備方法包括以下步驟(1)將紫陽富硒綠茶茶葉在自然條件下晾曬干或烘干，然后粉碎成茶葉粉末；(2)向步驟(1)中所述茶葉粉末中加入所述茶葉粉末質量的14倍且溫度為80°C 的蒸餾水，浸提池后過濾；(3)重復步驟( 2次，合并濾液后濃縮至濾液體積的1/4 ；(4)向步驟(3)中濃縮后的濾液中加入5倍體積的無水乙醇浸泡，離心后收集沉淀；(5)重復步驟(4)三次后向收集的沉淀中加入所述沉淀質量的3倍的蒸餾水，反復凍融8次除去蛋白，離心，棄沉淀，將上清液用蒸餾水透析7 后冷凍干燥，得到紫陽富硒綠茶含硒多糖。采用氫化物原子熒光光譜法(HG-AFS)測定制備的紫陽富硒綠茶含硒多糖中的硒含量(按質量含量計)為3ppm ；采用化學水解法(三氟乙酸法)水解釋放含硒多糖中雜多糖的成分，進行HPLC進樣分析，得到雜多糖組成(按摩爾百分比計)為甘露糖3.3%，核糖 1. 8 %，鼠李糖4. 5 %，葡萄糖醛酸2.3%，半乳糖醛酸2.8%，葡萄糖31 %，木糖5. 6 %，半乳糖23. 1%，阿拉伯糖25. 6%。實施例5本實施例的一種紫陽富硒綠茶含硒多糖，該含硒多糖的組成按質量百分比計為 硒7ppm，余量為雜多糖；所述雜多糖的組成按摩爾百分比計為甘露糖4. 1%，核糖1.8%， 鼠李糖4. 5 %，葡萄糖醛酸2. 9 %，半乳糖醛酸3. 4 %，葡萄糖33. 2 %，木糖5 %，半乳糖 22. 6%，阿拉伯糖22. 5%。其制備方法包括以下步驟(1)將紫陽富硒綠茶茶葉在自然條件下晾曬干，然后粉碎成茶葉粉末；
(2)向步驟(1)中所述茶葉粉末中加入所述茶葉粉末質量的10倍且溫度為80°C 的蒸餾水，浸提池后過濾；(3)重復步驟0)3次，合并濾液后濃縮至濾液體積的1/4 ；(4)向步驟(3)中濃縮后的濾液中加入5倍體積的無水乙醇浸泡，離心后收集沉淀；(5)重復步驟(4)三次后向收集的沉淀中加入所述沉淀質量的4倍的蒸餾水，反復凍融10次除去蛋白，離心，棄沉淀，將上清液用蒸餾水透析7 后冷凍干燥，得到紫陽富硒綠茶含硒多糖。采用氫化物原子熒光光譜法(HG-AFS)測定制備的紫陽富硒綠茶含硒多糖中的硒含量(按質量含量計)為7ppm ；采用化學水解法(三氟乙酸法)水解釋放含硒多糖中雜多糖的成分，進行HPLC進樣分析，得到雜多糖組成(按摩爾百分比計)為甘露糖4.1%，核糖 1. 8 %，鼠李糖4. 5 %，葡萄糖醛酸2.9%，半乳糖醛酸3.4%，葡萄糖33. 2 %，木糖5 %，半乳糖22. 6%，阿拉伯糖22. 5%。實施例6本實施例的一種紫陽富硒綠茶含硒多糖，該含硒多糖的組成按質量百分比計為 硒5ppm，余量為雜多糖；所述雜多糖的組成按摩爾百分比計為甘露糖4. 5%，核糖1. 6%， 鼠李糖4.3%，葡萄糖醛酸2.7%，半乳糖醛酸3.2%，葡萄糖32.7%，木糖4.6%，半乳糖 22. 4%，阿拉伯糖24%。其制備方法包括以下步驟(1)將紫陽富硒綠茶茶葉在自然條件下晾曬干，然后粉碎成茶葉粉末；(2)向步驟(1)中所述茶葉粉末中加入所述茶葉粉末質量的13倍且溫度為80°C 的蒸餾水，浸提池后過濾；(3)重復步驟( 2次，合并濾液后濃縮至濾液體積的1/4 ；(4)向步驟(3)中濃縮后的濾液中加入4倍體積的無水乙醇浸泡，離心后收集沉淀；(5)重復步驟(4)三次后向收集的沉淀中加入所述沉淀質量的4倍的蒸餾水，反復凍融10次除去蛋白，離心，棄沉淀，將上清液用蒸餾水透析7 后冷凍干燥，得到紫陽富硒綠茶含硒多糖。采用氫化物原子熒光光譜法(HG-AFS)測定制備的紫陽富硒綠茶含硒多糖中的硒含量(按質量含量計)為5ppm ；采用化學水解法(三氟乙酸法)水解釋放含硒多糖中雜多糖的成分，進行HPLC進樣分析，得到雜多糖組成(按摩爾百分比計)為甘露糖4.5%，核糖 1. 6%，鼠李糖4. 3%，葡萄糖醛酸2.7%，半乳糖醛酸3.2%，葡萄糖32. 7%，木糖4. 6%，半乳糖？？乂^，阿拉伯糖對1^。實施例7本實施例的一種紫陽富硒綠茶含硒多糖，該含硒多糖的組成按質量百分比計為 硒6ppm，余量為雜多糖；所述雜多糖的組成按摩爾百分比計為甘露糖5. 3%，核糖2%， 鼠李糖5 %，葡萄糖醛酸3. 5 %，半乳糖醛酸3. 8 %，葡萄糖33. 5 %，木糖5. 6 %，半乳糖 19. 8%，阿拉伯糖21.5%。其制備方法包括以下步驟
(1)將紫陽富硒綠茶茶葉烘干，然后粉碎成茶葉粉末；(2)向步驟(1)中所述茶葉粉末中加入所述茶葉粉末質量的12倍且溫度為80°C 的蒸餾水，浸提池后過濾；(3)重復步驟(2) 3次，合并濾液后濃縮至濾液體積的1/4 ；(4)向步驟(3)中濃縮后的濾液中加入3倍體積的無水乙醇浸泡，離心后收集沉淀；(5)重復步驟(4)三次后向收集的沉淀中加入所述沉淀質量的5倍的蒸餾水，反復凍融10次除去蛋白，離心，棄沉淀，將上清液用蒸餾水透析7 后冷凍干燥，得到紫陽富硒綠茶含硒多糖。采用氫化物原子熒光光譜法(HG-AFS)測定制備的紫陽富硒綠茶含硒多糖中的硒含量(按質量含量計)為6ppm ；采用化學水解法(三氟乙酸法)水解釋放含硒多糖中雜多糖的成分，進行HPLC進樣分析，得到雜多糖組成(按摩爾百分比計)為甘露糖5.3%，核糖 2 %，鼠李糖5 %，葡萄糖醛酸3.5%，半乳糖醛酸3.8%，葡萄糖33. 5 %，木糖5. 6 %，半乳糖
19.8%，阿拉伯糖21.5%。實施例8本實施例的一種紫陽富硒綠茶含硒多糖，該含硒多糖的組成按質量百分比計為 硒6ppm，余量為雜多糖；所述雜多糖的組成按摩爾百分比計為甘露糖4. 9%，核糖1. 8%， 鼠李糖4. 5 %，葡萄糖醛酸2. 9 %，半乳糖醛酸3. 4 %，葡萄糖33. 5 %，木糖4 %，半乳糖
20.3%，阿拉伯糖24. 7%。其制備方法包括以下步驟(1)將紫陽富硒綠茶茶葉在自然條件下晾曬干或烘干，然后粉碎成茶葉粉末；(2)向步驟(1)中所述茶葉粉末中加入所述茶葉粉末質量的15倍且溫度為80°C 的蒸餾水，浸提池后過濾；(3)重復步驟0)3次，合并濾液后濃縮至濾液體積的1/4 ；(4)向步驟(3)中濃縮后的濾液中加入3倍體積的無水乙醇浸泡，離心后收集沉淀；(5)重復步驟次后向收集的沉淀中加入所述沉淀質量的5倍的蒸餾水，反復凍融9次除去蛋白，離心，棄沉淀，將上清液用蒸餾水透析7 后冷凍干燥，得到紫陽富硒綠茶含硒多糖。采用氫化物原子熒光光譜法(HG-Are)測定制備的紫陽富硒綠茶含硒多糖中的硒含量(按質量含量計)為6ppm ；采用化學水解法(三氟乙酸法)水解釋放含硒多糖中雜多糖的成分，進行HPLC進樣分析，得到雜多糖組成(按摩爾百分比計)為甘露糖4.9%，核糖 1. 8 %，鼠李糖4. 5 %，葡萄糖醛酸2.9%，半乳糖醛酸3.4%，葡萄糖33. 5 %，木糖4 %，半乳糖20. 3%，阿拉伯糖24. 7%。實施例9以紫陽富硒綠茶含硒多糖為活性成分的免疫增強藥物的制備方法膠囊劑的制備方法將紫陽富硒綠茶含硒多糖按常規制膠囊的方法制成膠囊， 載體為常規藥用膠囊載體，每粒膠囊0. 15g 0. 25g，每粒膠囊含紫陽富硒綠茶含硒多糖 IOOmg 160mg。該膠囊劑的用法用量為每日3次，每次3 5粒。
片劑的制備方法將紫陽富硒綠茶含硒多糖按常規制片劑的方法制成片劑，輔料為常規藥學上可接受的輔料(如淀粉、硬脂酸鎂、糊精等)，每片0. 25g 0. 5g，每片含紫陽富硒綠茶含硒多糖IOOmg 160mg。該片劑的用法用量為每日3次，每次3 5片。口服液的制備方法將紫陽富硒綠茶含硒多糖溶解于無菌水中，按常規制口服液的方法加藥學上可接受的輔助性成分(如調味劑)制成口服液，每瓶10mL，每瓶含紫陽富硒綠茶含硒多糖IOOmg 160mg。該口服液的用法用量為每日3次，每次1 2瓶。實施例10以紫陽富硒綠茶含硒多糖為活性成分的治療腫瘤藥物的制備方法膠囊劑的制備方法將紫陽富硒綠茶含硒多糖按常規制膠囊的方法制成膠囊， 載體為常規藥用膠囊載體，每粒膠囊0. 15g 0. 25g，每粒膠囊含紫陽富硒綠茶含硒多糖 IOOmg 160mg。該膠囊劑的用法用量為每日3次，每次3 5粒。片劑的制備方法將紫陽富硒綠茶含硒多糖按常規制片劑的方法制成片劑，輔料為常規藥學上可接受的輔料(如淀粉、硬脂酸鎂、糊精等)，每片0. 25g 0. 5g，每片含紫陽富硒綠茶含硒多糖IOOmg 160mg。該片劑的用法用量為每日3次，每次3 5片。口服液的制備方法將紫陽富硒綠茶含硒多糖溶解于無菌水中，按常規制口服液的方法加藥學上可接受的輔助性成分(如調味劑)制成口服液，每瓶10mL，每瓶含紫陽富硒綠茶含硒多糖IOOmg 160mg。該口服液的用法用量為每日3次，每次1 2瓶。實施例11以紫陽富硒綠茶含硒多糖為活性成分的治療肝損傷的藥物的制備方法膠囊劑的制備方法將紫陽富硒綠茶含硒多糖按常規制膠囊的方法制成膠囊， 載體為常規藥用膠囊載體，每粒膠囊0. 15g 0. 25g，每粒膠囊含紫陽富硒綠茶含硒多糖 IOOmg 160mg。該膠囊劑的用法用量為每日3次，每次3 5粒。片劑的制備方法將紫陽富硒綠茶含硒多糖按常規制片劑的方法制成片劑，輔料為常規藥學上可接受的輔料(如淀粉、硬脂酸鎂、糊精等)，每片0. 25g 0. 5g，每片含紫陽富硒綠茶含硒多糖IOOmg 160mg。該片劑的用法用量為每日3次，每次3 5片。口服液的制備方法將紫陽富硒綠茶含硒多糖溶解于無菌水中，按常規制口服液的方法加藥學上可接受的輔助性成分(如調味劑)制成口服液，每瓶10mL，每瓶含紫陽富硒綠茶含硒多糖IOOmg 160mg。該口服液的用法用量為每日3次，每次1 2瓶。本發明對紫陽富硒綠茶含硒多糖抗氧化功能、免疫調節功能、抗腫瘤功能和治療肝損傷的功能進行了研究。一、抗氧化實驗用生理鹽水將紫陽富硒綠茶含硒多糖配制成不同濃度的樣品液。①總還原力測定取ImL不同濃度的樣品液分別與2. 5mL磷酸鹽緩沖液(pH 6. 6) 及2. 5mL鐵氰化鉀(Iwt^ )混合，將混合物在50°C水浴中孵育20min，然后加入2. 5mL 的TCA(10wt % )終止反應，離心lOmin，取上清液2. 5mL,依次加入2. 5mL無水乙醇和 0. 5mLFeCl3(0. Iwt % )，混勻后于700nm波長處測定吸光度，以蒸餾水作空白對照，以維生素C(Vc)作陽性對照。對測定結果進行統計學處理，結果見圖3，從圖中可以看出，當濃度為40 μ g/mL時，Vc管700nm吸光度為0. 482士0. 034，紫陽富硒綠茶含硒多糖(Se-TPS)管吸光度為0. 119 士0. 027。
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②清除超氧陰離子活性測定取ImL不同濃度的k-TPS樣品液于試管中，依次加入ImL濃度為0. 078mol/L的NBT，ImL濃度為0. 468mol/L的NADH，最后加入0. 4mL濃度為 0. 06mol/L的PMS溶液，室溫搖勻后靜置5min，于560nm波長處測定吸光度(Ai)，調零孔用不同濃度樣品液lmL，0. 4mL蒸餾水代替PMS溶液調零，用蒸餾水作陰性對照(Aj)，Vc和BHT 作陽性對照，清除率=[l-Ai/AjXlOO^。對測定結果進行統計學處理，結果見圖4，從圖中可以看出，濃度為lOOyg/mL時，相對Vc的清除活性8士3. 2) %, k_TPS清除活性達 (78. 0 士 2. 2) %。③對羥自由基清除作用的測定取ImL不同濃度的樣品液，先后加入1. 5mL反應液 [含 0. ImM EDTA、0. ImM FeCl3 和 2. 8mM DR 的磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)]，0. 35mL H2O2 (20mM), 37°C恒溫水浴作用40min后，終止反應，于532nm波長處測定吸光度(Ai)，蒸餾水為陰性對照(Ap，Vc為陽性對照，清除率=[l-Ai/AjXlOO^。對測定結果進行統計學處理，結果見圖5，從圖中可以看出，濃度從增至lOOOyg/mL，清除活性由0. 1 士2. 2%增至 18. 5士4. 3%。④對DPPH自由基清除作用的測定取ImL不同濃度的樣品液于試管中，然后依次加入3mL質量濃度為0. 004%的DPPH甲醇溶液，充分混勻，避光靜置20min后，以甲醇作空白對照，517nm波長測吸光度(Ai)，以蒸餾水代替樣品液作陰性對照(Aj，Vc作陽性對照，清除率=[I-AiAj] X 100%。對測定結果進行統計學處理，結果見圖6，從圖中可以看出，濃度由 5μ g/mL 增至 20μ g/mL，Se-TPS 的清除活性由 1. 8士3. 2%劇增至 30. 0士3. 3%。綜上所述，紫陽富硒綠茶含硒多糖的總還原能力、對羥自由基的清除活性和對 DPPH自由基的清除活性均低于同濃度的強效抗氧化劑Vc，但在相同的數量級范圍；而對超氧自由基的清除活性，％-TPS則顯著高于Vc，而且都呈現一定的劑量依賴關系。說明紫陽富硒綠茶含硒多糖具有強的抗氧化功能，是潛在的抗氧化劑。二、免疫調節實驗將健康小鼠40只隨機分成4組，每組10只小鼠，并將4組分為低劑量組、中劑量組、高劑量組和對照組。對低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠分別灌胃紫陽富硒綠茶含硒多糖Se-TPS，灌胃劑量分別為50mg/kg. bwU00mg/kg. bw,300mg/kg. bw，每天一次，連續灌胃30天，對對照組小鼠灌胃蒸餾水，每天一次，連續灌胃30天，進行以下試驗①小鼠碳粒廓清試驗按順序給各組小鼠尾靜脈注射印度墨汁G倍稀釋)0. lmL/10g. bw，每鼠均于注射墨汁后^iiin及IOmin分別準時內眥采血20 μ L，并將血迅速加入到2mL 0. 碳酸鈉溶液搖勻，以752-C紫外可見分光光度計600nm波長處測光密度值(OD)，同樣取小鼠肝、脾稱重，計算吞噬指數，結果見表1。②小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗各組小鼠均腹腔注射20%雞紅細胞懸液lmL，間隔30min處死小鼠，腹腔注入生理鹽水2mL，振搖一分鐘后取腹腔洗液制片，37°C 溫育30min，漂洗、固定后染色鏡檢，計數吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數和巨噬細胞吞噬雞紅細胞數，以吞噬率和吞噬指數進行方差分析，結果見表1。③小鼠遲發型變態反應(DTH)測定灌胃第沈天給小鼠腹腔注射2%綿羊紅細胞 (SRBC)O. 2mL,于免疫后第4天每鼠左后足趾部皮下注射2% SRBC (20 μ L/只)進行攻擊，并于攻擊前和攻擊后24h測量每鼠左后足趾同一部位厚度，計算攻擊前、后的差值，結果與對照組比較進行方差分析，見表1。
表1小鼠碳粒廓清試驗(A)、腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗(B)、遲發性變態反應試驗結果
權利要求
1.一種紫陽富硒綠茶含硒多糖，其特征在于，該含硒多糖的組成按質量百分比計為硒1.5ppm 8. 5ppm，余量為雜多糖；所述雜多糖的組成按摩爾百分比計為甘露糖 3. 3% 5. 3%，核糖 2%，鼠李糖3. 5% 5%，葡萄糖醛酸20Z0 3. 5%，半乳糖醛酸 2. 6% 3. 8%，葡萄糖30% 34. 2%，木糖3. 6% 5. 6%，半乳糖19. 8% 23. 2%，阿拉伯糖 21. 5% 25. 6%。
2.根據權利要求1所述的一種紫陽富硒綠茶含硒多糖，其特征在于，該含硒多糖的組成按質量百分比計為硒3ppm 7ppm，余量為雜多糖；所述雜多糖的組成按摩爾百分比計為甘露糖4. 1% 4.9%，核糖1. 2% 1.8%，鼠李糖4.0% 4. 5%，葡萄糖醛酸2. 3% 2.9%，半乳糖醛酸2. 8% 3.4%，葡萄糖31% 33. 5%，木糖4% 5%，半乳糖20. 3% 22. 6%,阿拉伯糖 22. 5% 24. 7%。
3.根據權利要求2所述的一種紫陽富硒綠茶含硒多糖，其特征在于，該含硒多糖的組成按質量百分比計為硒5ppm，余量為雜多糖；所述雜多糖的組成按摩爾百分比計為甘露糖4. 5%，核糖1. 6%，鼠李糖4. 3%，葡萄糖醛酸2.7%，半乳糖醛酸3.2%，葡萄糖32.7%， 木糖4. 6%，半乳糖22. 4%，阿拉伯糖。
4.一種制備如權利要求1、2或3所述紫陽富硒綠茶含硒多糖的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)將紫陽富硒綠茶茶葉在自然條件下晾曬干或烘干，然后粉碎成茶葉粉末；(2)向步驟(1)中所述茶葉粉末中加入所述茶葉粉末質量10 15倍且溫度為80°C的蒸餾水，浸提池后過濾；(3)重復步驟0)2 3次，合并濾液后濃縮至濾液體積的1/4；(4)向步驟(3)中濃縮后的濾液中加入3 5倍體積的無水乙醇浸泡，離心后收集沉淀；(5)重復步驟(4)三次后向收集的沉淀中加入所述沉淀質量3 5倍的蒸餾水，反復凍融8 10次除去蛋白，離心，棄沉淀，將上清液用蒸餾水透析7 后冷凍干燥，得到紫陽富硒綠茶含硒多糖。
5.一種如權利要求1所述紫陽富硒綠茶含硒多糖作為功能性保健食品的用途。
6.根據權利要求5所述的用途，其特征在于，所述功能性保健食品為增強免疫保健食品或護肝保健食品。
7.—種如權利要求1所述紫陽富硒綠茶含硒多糖在制備免疫增強劑藥物中的用途。
8.—種如權利要求1所述紫陽富硒綠茶含硒多糖在制備治療腫瘤的藥物中的用途。
9.根據權利要求8所述的用途，其特征在于，所述治療腫瘤的藥物為治療結腸癌的藥物。
10.一種如權利要求1所述紫陽富硒綠茶含硒多糖在制備治療肝損傷的藥物中的用途。
全文摘要
本發明公開了一種紫陽富硒綠茶含硒多糖，該含硒多糖的組成按質量百分比計為硒1.5ppm～8.5ppm，余量為雜多糖；所述雜多糖的組成按摩爾百分比計為甘露糖3.3％～5.3％，核糖1％～2％，鼠李糖3.5％～5％，葡萄糖醛酸2％～3.5％，半乳糖醛酸2.6％～3.8％，葡萄糖30％～34.2％，木糖3.6％～5.6％，半乳糖19.8％～23.2％，阿拉伯糖21.5％～25.6％。本發明還提供了紫陽富硒綠茶含硒多糖的制備方法以及用途。本發明制備方法簡便，成本低廉，適于推廣使用，該含硒多糖具有增強免疫力的作用；對于腫瘤細胞，特別是結腸癌細胞生長有明顯的抑制作用；對肝損傷亦有明顯的保護作用。
文檔編號C08B37/00GK102417544SQ201110293739
公開日2012年4月18日 申請日期2011年9月28日 優先權日2011年9月28日
發明者何念武, 楊興斌, 王東英, 田靈敏, 趙燕 申請人:陜西師范大學