專利名稱：從靈芝的深層發酵菌絲體中提取靈芝多糖的方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種從靈芝的深層發酵菌絲體中提取靈芝多糖的方法。
背景技術：
煙草白粉病是煙草生產中常見的一種真菌病害，具有發生和流行迅速，危害嚴重等特性，它是由二孢白粉菌(Eryshe cichoracearum DC.)引起,該病多為害成熟老葉，由下向上發展。嚴重時為害嫩莖，病莖上也布滿白粉。病葉烘烤后薄如紙，色暗銹褐色，喪失經 濟價值。真菌多糖是是一類天然高分子化合物，它廣泛存在于真菌的細胞壁中，是由醛基和酮基通過糖苷鍵連接起來的高分子聚合物。真菌多糖具有豐富的生物活性，無毒副作用，是目前最具開發前景的藥物新資源。有效防治白粉病的真菌多糖制備是滿足生產需要的保障。對于提高煙葉質量，減少化學農藥使用，提高我國卷煙在國際卷煙市場中的競爭力，防止病害大流行造成的煙葉損失，具有重要意義。靈芝(Ganoderma Lucidum)為擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌,又稱瑞草。靈芝多糖(Ganoderma lucidum Polysaccharide)是由多個單糖構成的大分子葡聚糖,它廣泛存在于靈芝的子實體和菌絲體中。在真菌多糖的提取方面，目前國內外主要采用熱水浸提法和溶劑提取法。熱水浸提法是一種常規的提取方法，其優點是提取條件溫和，操作簡單、方便；但存在的缺點是多糖得率不高，因為當使用熱水浸提時，熱水在加熱的過程中不斷地從罐內蒸出，這就要求在提取過程不停的補水、加熱，以致浪費了大量的溶劑和能源。溶劑提取法主要采取低濃度的草酸、草酸銨、鹽酸、氫氧化鈉等溶劑提取。然而，酸對多糖有水解作用，且操作比較繁雜，故多不采取酸提法。而鹽對多糖的提取率提高不大。堿法的多糖得率比水提取及酸提取高，但要注意堿濃度不能太高，以免多糖變性；而且堿法提取條件劇烈，容易引起多糖變性，對多糖也有降解作用，且提取液粘稠，不宜過濾。現有的從靈芝中提取真菌多糖的工藝方法，普遍所使用的設備基本上都是無法密閉的蒸煮鍋或罐，而且都是分批間歇操作。總之，這些方法普遍存在著不能實現浸煮和濃縮的連續化操作，能源利用率低，溶劑用量大、損耗大，生產周期長和生產效率低等缺點，且在某些情況下還可能造成環境污染；難以滿足國家GMP標準要求。本領域迫切需要改進靈芝多糖的提取技術，以進一步提高靈芝多糖的提取率。

發明內容
本發明的目的在于，提供一種從靈芝的深層發酵菌絲體中提取靈芝多糖的方法，該方法提取效率高，過程簡單，生產成本低，所獲得的靈芝多糖純度高。為了實現上述任務，本發明采取如下的技術解決方案一種從靈芝的深層發酵菌絲體中提取靈芝多糖的方法，其特征在于，按照下列步驟實施I)取靈芝的深層發酵菌絲體為原料，常溫下與原料重量2 4倍的純凈水混合，調整溶液的PH值至4 ;2)將溶液加溫，當溫度上升至40°C 50°C時加入由木瓜蛋白酶、果膠酶、纖維素酶組成的復合酶，酶解反應I小時；3)酶解反應完成后，將溶液升溫至60°C 70°C，用NaOH調pH值至7-8，以每分鐘8-10轉的轉速攪拌，浸提2-4次，每次2-3小時，收集浸提液；
4)將浸提液合并，過濾，減壓濃縮至浸提液總體積30 %，用乙醇沉淀濃縮液，過濾，得上清液；上清液用膜分離裝置脫鹽，脫鹽后經反復加水稀釋和超過濾操作，得靈芝多糖濃縮液；靈芝多糖濃縮液經冷凍干燥或噴霧干燥得到純度達到97%以上的靈芝多糖粉末。所述的木瓜蛋白酶的用量為原料重量的2% 3%、果膠酶的用量為原料重量的
0.5% I %、纖維素酶的用量為原料重量的1% 2%。所述的膜分離裝置采用截留分子量范圍為10000的膜分離裝置，操作的室溫為
18。。 22°C，壓力為 0. 02MPa 0. 04MPa。所述過濾使用的篩網為250目-400目的篩網。本發明采用了適量的復合酶，為了提高靈芝活性成分提取率，僅靠單一酶作用顯然是難以實現，所以采用復合酶有針對性的對不同底物降解，才可以達到既不破壞靈芝多糖生物活性又破壞菌絲體結構而充分釋放多糖。它能夠提高靈芝多糖的浸出率，主要是因為該復合酶對菌類物質中的游離蛋白質具有分解作用，使得菌類物質結構變松，降低了它們與多糖的結合力。因此，它和現有技術中常用的水提方法相比提取率高；和傳統的酸堿提取法相比，不易破壞多糖的立體結構與活性。其工藝簡單、產品制備效率高，質量好，成本低。而且避免了使用任何有機溶劑，無污染物質排放，適合大規模工業化生產。有很好的推廣應用價值。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步的詳細說明，需要說明的是，這些實施例僅供本領域的技術人員充分理解本發明，本發明不限于這些實施例。實施例I :將IOOkg靈芝深層發酵的菌絲體粉碎，加入300水，調整溶液的pH值至4后加溫，溫度上升至40°C時，加入木瓜蛋白酶2. 5kg，果膠酶0. 6kg，纖維素酶I. 5kg，酶解反應I小時；酶解反應后升溫至60°C，用NaOH調pH值至7，以每分鐘8轉的轉速攪拌，浸提2次，每次3小時，收集浸提液；將2次浸提液合并用250目的篩網過濾，減壓，濃縮至浸提液總體積30%，用乙醇沉淀濃縮液，再用250目的篩網過濾得上清液；上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置(膜分離裝置的操作溫度為18°C _22°C，壓力0. 02Mpa)脫鹽，脫鹽后的上清液反復進行加水稀釋和超過濾操作，每次超過濾操作控制透過液的體積為60kg，并向透過液中加入60kg水稀釋，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后I次的透過液，冷凍干燥或噴霧干燥制得純度達到97%的靈芝多糖粉末。實施例2 將IOOkg靈芝深層發酵的菌絲體粉碎，加入300kg水，調整溶液的pH值至4后加溫，溫度上升至45°C時，加入木瓜蛋白酶2kg，果膠酶1kg，纖維素酶2kg，酶解反應I小時；酶解反應后升溫至65°C，用NaOH調pH值至8，以每分鐘8轉的轉速攪拌，浸提4次，每次2小時，收集浸提液；將4次浸提液合并，用250目篩網過濾，減壓濃縮至浸提液總體積30%，用乙醇沉淀濃縮液，再用250目篩網過濾得上清液；上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置(操作溫度20°C左右，操作壓力0. 02Mpa)進行脫鹽，脫鹽后的上清液反復進行加水稀釋和超過濾操作，每次超過濾操作控制透過液體積為70kg，并向透過液中加入70kg水稀釋，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后I次透過液，冷凍干燥或噴霧干燥制得純度 達到97%的靈芝多糖粉末。實施例3 將IOOkg靈芝深層發酵的菌絲體粉碎，加入300kg水，調整溶液的pH值至4后加溫，溫度上升至50°C時，加入木瓜蛋白酶2kg，果膠酶1kg，纖維素酶2kg，酶解反應I小時；酶解反應后升溫至65°C，用NaOH調pH值至7. 5，以每分鐘10轉的轉速攪拌，浸提2次，每次3小時，收集浸提液；將2次浸提液合并，用300目篩網過濾，減壓濃縮至浸提液總體積30%，用乙醇沉淀濃縮液，再用300目篩網過濾得上清液；上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置(膜分離裝置的操作溫度為18°C _22°C，壓力0. 02Mpa)脫鹽，脫鹽后的上清液反復進行加水稀釋和超過濾操作，每次超過濾操作控制透過液的體積為90kg，并向透過液中加入90kg水稀釋，再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后I次的透過液，冷凍干燥或噴霧干燥制得純度達到97%的靈芝多糖粉末。實施例4 將IOOkg靈芝深層發酵的菌絲體粉碎，加入300水，調整溶液的pH值至4后加溫，溫度上升至45°C時，加入木瓜蛋白酶2. 5kg，果膠酶0. 6kg，纖維素酶I. 5kg，酶解反應I小時；酶解反應后升溫至70°C，用NaOH調pH值至7. 5，以每分鐘10轉的轉速攪拌，浸提4次，每次2小時，收集浸提液；將4次浸提液合并過濾，減壓濃縮至總體積30 %時用乙醇沉淀，用400目篩網過濾得上清液；上清液用截留分子量為10000的膜分離裝置(膜分離裝置的操作溫度為18°c -22°c，壓力0. 02Mpa)脫鹽，脫鹽后的上清液反復進行加水稀釋和超過濾操作，每次超過濾操作控制透過液的體積為80kg,并向透過液中加入80kg水,再進行超過濾操作，如此進行30次循環操作，收集最后I次的透過液，冷凍干燥或噴霧干燥制得純度達到97%的靈芝多糖粉末。
權利要求
1.一種從靈芝的深層發酵菌絲體中提取靈芝多糖的方法，其特征在于，按照下列步驟實施 1)取靈芝的深層發酵菌絲體為原料，常溫下與原料重量2 4倍的純凈水混合，調整溶液的PH值至4 ; 2)將溶液加溫，當溫度上升至40°C 50°C時加入由木瓜蛋白酶、果膠酶、纖維素酶組成的復合酶，酶解反應I小時； 3)酶解反應完成后，將溶液升溫至60V 70°C，用NaOH調pH值至7_8，以每分鐘8-10轉的轉速攪拌，浸提2-4次，每次2-3小時，收集浸提液； 4)將浸提液合并，過濾，減壓濃縮至浸提液總體積30%，用乙醇沉淀濃縮液，過濾，得 上清液；上清液用膜分離裝置進行脫鹽，脫鹽后經反復加水稀釋和超過濾操作，得靈芝多糖濃縮液；靈芝多糖濃縮液經冷凍干燥或噴霧干燥得到純度達到97%以上的靈芝多糖粉末。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的木瓜蛋白酶的用量為原料重量的2% 3%、果膠酶的用量為原料重量的0. 5% I %、纖維素酶的用量為原料重量的1% 2%。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的膜分離裝置操作的室溫為180C -22°C，壓力為 0. 02MPa-0. 04MPa。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述過濾使用的篩網為250目-400目的篩網。
5.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的加水稀釋的水用量是提取時加入水重量的1/5-1/3。
6.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的膜分離裝置為截留分子量范圍為10000的膜分離裝置。
全文摘要
本發明公開了一種從靈芝的深層發酵菌絲體中提取靈芝多糖的方法，將靈芝的深層發酵菌絲體與其重量2-4倍的純凈水混合，調整pH值至4后加溫，當溫度上升至40-50℃時加入由木瓜蛋白酶、果膠酶、纖維素酶組成的復合酶，一個小時后升溫至60-70℃，此時用NaOH調整pH值至7-8，每分鐘以8-10轉攪拌，浸提2-4次，每次2-3小時，將2-4次浸提液合并過濾，減壓濃縮至總體積30％，用乙醇沉淀濃縮液，過濾得上清液，上清液用超過濾分離裝置脫鹽，經反復加水稀釋和超過濾操作，獲得靈芝多糖濃縮液，濃縮液經冷凍干燥或噴霧干燥得靈芝多糖純度達到97％以上的靈芝多糖粉末。該方法避免使用任何有機溶劑，無污染物質排放，適合大規模工業化生產。
文檔編號C08B37/02GK102643364SQ20121010900
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月14日 優先權日2012年4月14日
發明者安德榮, 宋雙 申請人:西北農林科技大學