將包含高含量的游離脂肪酸的潤滑脂轉化為脂肪酸酯的方法以及用于所述方法的催化劑的制作方法
【專利摘要】從包含甘油酯和按重量計至少10％的游離脂肪酸(FFA)的組合物產生脂肪酸酯的方法，方法包括用所述組合物溫育多個微米或納米尺寸的催化顆粒以催化FFA至脂肪酸酯的轉化，以便至少80％的FFA轉化為脂肪酸酯。
【專利說明】將包含高含量的游離脂肪酸的潤滑脂轉化為脂肪酸酯的方法以及用于所述方法的催化劑

【技術領域】
[0001]本公開內容廣泛地涉及將游離脂肪酸轉化為脂肪酸酯的方法。具體地，本公開內容包括將含有高含量的游離脂肪酸的潤滑脂轉化為脂肪酸酯的方法。本公開內容還涉及用于這樣的方法的催化劑。
[0002]背景
[0003]伴隨非可再生能源例如原油的快速消耗的世界能源和燃料需求的增加已導致日益增加的對作為替代能源的生物柴油的興趣。
[0004]生物柴油包含來源于甘油三酯例如植物油和動物脂肪的長鏈脂肪酸烷基脂并且被當作是基于石油的柴油的可再生和更清潔的替代品。更常見的生物柴油之一包含脂肪酸甲酯(FAME)。
[0005]FAME通常通過使用堿催化劑，通過植物油(精煉油菜籽油、向日葵油和大豆油)和動物脂肪(牛肉、牛油、豬油)的甲醇分解來產生。然而，目前FAME的價格仍然太高以致不能替代傳統化石燃料。FAME的高價格主要是由于用于產生FAME的起始材料的原料的高成本所致。例如，報道已顯示菜籽油和大豆油成本分別為約1.28USD/L和約0.70USD/L，這構成了幾乎80%的常見生物柴油的生產成本。
[0006]在另一個方面，隔油池油(GTO)例如褐色潤滑脂(具有15_40wt%的游離脂肪酸(FFA))是廉價的(成本低于約0.3USD/L，并且在一些報道中低至約0.19USD/L)和不可食用的資源。其被大量排放而無任何利用(在新加坡約800-1000噸/年，在美國約169萬噸/年)。因此，由于其低獲取成本和豐富的量，GTO被看作是用于生物柴油生產的極具吸引力的替代原料。可從使用GTO作為生物柴油生產的起始材料收集的有前景的有利方面包括(i)生物柴油生產成本的下降和(ii)廢油例如褐色潤滑脂的處理問題的避免。鑒于此，已經嘗試利用廢棄潤滑脂例如褐色潤滑脂來產生有用的生物柴油。
[0007]然而，這些嘗試遭到當使用GTO產生生物柴油時出現的技術挑戰。例如，將甘油三酯轉化為FAME的傳統堿催化法因升高的存在于GTO中的FFA的量而不太適用于GT0，所述方法通常導致肥皂形成。因此，期望在進行通過堿催化劑對甘油三酯進行的轉酯法之前降低存在于GTO中的FFA的水平。因此，設計了由FFA的酸催化酯化和隨后利用堿催化劑進行的剩余甘油三酯的轉酯組成的兩步反應。
[0008]均質酸催化劑例如硫酸已被用于FFA與甲醇的酯化，但遭到幾個問題的困擾，例如產生大量鹽需要隨后處理的利用堿對剩余酸的復雜中和、使用的設備的腐蝕和與高度濃酸的使用相關的環境問題。
[0009]雖然非均質酸催化劑的使用可避免均質酸催化劑有關的上述問題的一些問題，報道的非均質酸催化劑例如酸性離子交換樹脂、沸石類、硫酸氧化鋯和鈮酸經發現對于通過酯化的潤滑脂的預處理是令人不滿意的。例如，沸石類和鈮酸具有低密度的有效酸位點，從而在酯化中產生令人不滿意的性能；酸性離子交換樹脂例如Amberlystl5和Naf1n受困于高成本、低熱穩定性和較低的催化活性；硫酸氧化鋯因鋯是稀有昂貴金屬而極其昂貴；一系列摻入不溶性多孔聚合物和多孔性二氧化硅結構的二芳基銨催化劑可提供改善的生物柴油轉化，但它們需要在催化劑合成和再生步驟中使用昂貴的三氟甲磺酸以及使用高反應溫度(95-125°C)和用于容納高于大氣壓的壓力的高壓設備。例如，當在95-125°C (所述溫度遠高于甲醇(65°C)的沸點)應用使用二芳基銨催化劑的反應時，甲醇的對應蒸氣壓高至3.0-7.2atm。這樣，所述方法必需使用高壓設備。此外，大部分目前用于上述兩步法的催化劑不能足夠地再使用或再循環。
[0010]概括而言，目前酸催化劑在上述兩步反應中的使用仍充滿許多缺點。這樣的兩步反應還可導致環境污染和腐蝕。此外，利用非均質酸催化劑實現的轉化不充分高，即使當使用高溫(超過100°c的)和長反應時間時。因此，目前使用的將潤滑脂轉化為生物柴油的兩步酸-堿催化法不是如所期望的高效和環境友好的。
[0011]鑒于上述內容，還進行了依賴于生物催化劑例如酶替代酸催化劑的嘗試。一個已知的實例是使用脂肪酶。然而，這些分離的酶相對昂貴且不穩定。同樣地，使用分離的酶的效率和FAME的轉化相當低，特別地對于具有超過按重量計15% (15wt% )的FFA的高FFA含量的潤滑脂。還已報道了固定化的酶用于生物柴油生產的用途。報道的使用固定化的酶從包含超過10wt%的FFA的GTO進行的生物柴油生產仍然不令人滿意。例如，固定在顆粒化二氧化娃(Grant-CA和Gran-TL)上的南極假絲酵母(Candida antartica)脂肪酶B(CALB)和疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces Ianuginose)脂肪酶(TLL)和商購可得的固定化酶Novozyme SP435在48小時的反應時間后分別僅提供30%、5%和60%的潤滑脂(包含6.8wt%的FFA)至FAME的轉化。此外，據報道，固定在層狀硅酸鹽溶膠基質(PS-30)上的洋蔥假單胞菌(Pseusomonas cepacia)脂肪酶可在約48小時的溫育時間后，以合理地可接受的產率從僅包含6.8被％的 FFA的餐館油脂產生FAME，但當油脂中的FFA增加至8.5wt% FFA時，FAME產率急劇下降。因此可看到，增加FFA的量削弱生物催化劑的性能，并且使用這樣的生物催化劑的目前的方法不能達到從包含超過10wt%的的FFA(例如按重量計15-40%的FFA)的褐色潤滑脂的期望的FAME轉化水平。這得到報道的進一步證明，所述報道顯示使用南極假絲酵母脂肪酶(Chirazyme L_2)將包含10.6%的FFA的潤滑脂轉化為生物柴油在24小時的溫育時間后僅提供25%的產率。
[0012]除了分離的和固定的酶外，多年來，一些完整的細胞系統已被開發來用于從大豆油或麻風果油生產生物柴油。然而，仍然沒有使用完整細胞生物催化劑來從包含超過10wt%的FFA的GTO產生FAME的成功實例。例如，已報道當使用米根霉(R.0ryzae)完整細胞生物催化劑在叔丁醇系統中利用甲醇轉化預酸化的油菜籽油(67m0l%的FFA含量)以進行FAME生產時，獲得70%的不令人滿意的產率。
[0013]因此，鑒于上述內容，目前用于將含有高FFA (例如超過1wt %的FFA)的GTO轉化為FAME的方法遠未令人滿意或期望。
[0014]存在對提供解決或至少部分改善上述缺點的方法的需要。還存在提供用于這樣的方法的催化劑的需要。
[0015]概述
[0016]根據一個方面，提供了從包含甘油酯和按重量計至少10%的游離脂肪酸(FFA)的組合物產生脂肪酸酯的方法，所述方法包括將多個微米或納米尺寸的催化顆粒與所述組合物溫育，以催化FFA至脂肪酸酯的轉化，以便至少80%的FFA被轉化為脂肪酸酯。
[0017]在一個實施方案中，在醇存在的情況下進行溫育步驟。
[0018]在一個實施方案中，微米或納米尺寸的催化顆粒具有不超過800 μ m的平均粒度或直徑。
[0019]在一個實施方案中，微米或納米尺寸的催化顆粒能夠額外地催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化。
[0020]在一個實施方案中，微米或納米尺寸的催化顆粒選自聚合物顆粒、二氧化硅顆粒、微生物細胞及其混合物。
[0021]在一個實施方案中，聚合物顆粒和二氧化硅顆粒的至少一種是磁性顆粒，所述磁性顆粒包含外殼；至少一部分被外殼封裝的磁性核心；和選自無機酸基團或酶的至少一種的催化實體，所述催化實體被固定在所述外殼上，用于催化FFA至脂肪酸酯的轉化，任選地用于額外地催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化。
[0022]在一個實施方案中，微生物是表達水解酶的微生物的野生型菌株或表達水解酶的重組微生物。
[0023]根據另一個方面，提供了用于從包含甘油酯和按重量計至少10%的游離脂肪酸(FFA)的組合物產生脂肪酸酯的微米或納米尺寸的催化顆粒，所述顆粒包含具有微米或納米范圍的尺度的小體(body);和與小體結合的用于催化游離脂肪酸(FFA)至脂肪酸酯的轉化以及任選地用于額外地催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化的催化裝置，其中催化顆粒適合催化包含按重量計至少10%的FFA的組合物中至少80%的FFA至脂肪酸酯的轉化。
[0024]在一個實施方案中，顆粒是磁性顆粒并且小體包含外殼；和至少部分地被外殼封裝的磁性核心，其中與小體結合的催化裝置是固定在外殼上的催化實體，用于催化FFA至脂肪酸酯的轉化，和任選地用于額外地催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化。
[0025]在一個實施方案中，磁性核心包含多個具有5至20nm的平均尺寸或直徑的磁性納米尺寸的顆粒。
[0026]在一個實施方案中，外殼是二氧化硅殼或從由聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯)(PGMA)、聚苯乙烯(PS)和聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)組成的聚合物的組制造的聚合物殼的至少一種。
[0027]在一個實施方案中，催化實體選自無機酸基團或酶的至少一種。
[0028]在一個實施方案中，催化實體通過接頭固定在聚合物殼上，所述接頭選自含環氧化物官能團接頭、含胺官能團接頭、含醛官能團接頭、含苯官能團接頭、含酯官能團接頭及其混合物。
[0029]在一個實施方案中，顆粒具有10至500mg酶/顆粒的單位載荷(specificloading)。
[0030]在一個實施方案中,顆粒具有0.1至3mmol H+/克顆粒的單位載荷。
[0031]在一個實施方案中，微米或納米尺寸的催化顆粒是微生物的細胞，顆粒的小體是細胞的小體，并且與小體結合的催化裝置是在細胞的小體中產生的或從細胞的小體產生的酶，所述酶用于催化FFA至脂肪酸酯的轉化和任選地用于額外地催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化。
[0032]在一個實施方案中，重組微生物包含編碼酶的核酸序列，所述核酸序列與SEQ IDN0.1或SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.5的至少一個具有至少80%的同源性/同一性。
[0033]根據另一個方面，提供了用于產生微米或納米尺寸的催化顆粒的方法，所述方法包括形成磁性核心；用外殼封裝磁性核心的至少一部分；和將催化實體固定在外殼上，其中催化實體適合催化包含按重量計至少10%的FFA的組合物中至少80%的FFA至脂肪酸酯的轉化，和任選地用于額外地催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化。
[0034]在一個實施方案中，形成磁性核心的步驟包括形成多個具有5至20nm的平均尺寸或直徑的磁性納米尺寸的顆粒。
[0035]在一個實施方案中，形成多個磁性納米尺寸的顆粒的步驟包括共沉淀以獲得磁性納米尺寸的顆粒。
[0036]在一個實施方案中，外殼包括聚合物殼并且利用聚合物殼封裝磁性核心的至少一部分的步驟包括將磁性核心與聚合物殼的一個或多個單體前體混合；和聚合單體前體以形成封裝磁性核心的至少一部分的聚合物殼。在一個實施方案中，聚合物殼封裝大體上整個磁性核心。
[0037]在一個實施方案中，在引發劑存在的情況下進行將磁性核心與聚合物殼的一個或多個單體前體混合的步驟。在一個實施方案中，在水存在的情況下進行將磁性核心與聚合物殼的一個或多個單體前體以及引發劑混合的步驟。
[0038]在一個實施方案中，外殼包括二氧化硅殼，利用二氧化硅殼封裝至少一部分磁性核心的步驟包括將磁性核心與烷基硅酸鹽、堿和醇混合以獲得混合物；和從混合物的沉淀形成封裝磁性核心的至少一部分的二氧化硅殼。在一個實施方案中，堿是銨。
[0039]在一個實施方案中，外殼包括二氧化硅殼，利用二氧化硅殼封裝至少一部分磁性核心的步驟包括將磁性核心與四乙基正硅酸鹽在含有醇和氨的水中混合以獲得混合物；和從混合物沉淀二氧化硅以形成封裝磁性核心的二氧化硅殼。
[0040]在一個實施方案中，將催化實體固定至外殼的步驟包括:將催化實體與外殼的與催化實體有化學反應活性的官能團共價偶聯，以將催化實體固定至外殼；或利用與催化實體有化學反應活性的官能團官能化外殼的表面；和將催化實體與官能團共價或非共價地偶聯，以將催化實體固定至外殼。
[0041]根據另一個方面，提供了獲得用于從包含甘油酯和按重量計至少10%的游離脂肪酸(FFA)的組合物產生脂肪酸酯的細胞催化劑的方法，所述方法包括:
[0042]a.從產生水解酶的微生物的文庫鑒定微生物的菌株，所述鑒定的微生物菌株相較于文庫中至少50%的其它微生物菌株能夠催化更多的FFA至脂肪酸酯的轉化，和任選地能夠額外地催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化；
[0043]b.從步驟a)中鑒定的菌株鑒定水解酶的基因序列，所述水解酶能夠催化FFA至脂肪酸酯的轉化和任選地能夠額外地催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化；和
[0044]c.將所述基因序列引入宿主細胞以獲得重組宿主細胞，所述重組宿主細胞能夠在大體上相似的條件下以比步驟a)中鑒定的微生物的菌株更多的量表達水解酶，
[0045]其中重組宿主細胞能夠催化包含按重量計至少10%的FFA的組合物中至少80%的FFA至脂肪酸酯的轉化和任選地能夠額外地催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化。
[0046]根據另一個方面，提供了從混合物分離多個上文中公開的微米或納米尺寸的催化顆粒的方法，所述方法包括施加外部磁場或離心力以使催化顆粒聚集在一起；和從聚集的催化顆粒除去混合物的其余部分。
[0047]根據另一個方面，提供了從包含甘油酯和按重量計至少10%的游離脂肪酸(FFA)的組合物產生脂肪酸酯的方法，所述方法包括將多個微米或納米尺寸的催化顆粒(從上文中公開的分離多個磁性催化顆粒的方法再循環的)與所述組合物溫育以催化FFA至脂肪酸酯的轉化，以便至少80 %的FFA轉化為脂肪酸酯，和任選地額外地催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化。
[0048]定義
[0049]如本文中所用，術語〃微米〃被廣泛地解釋為包括約I微米至約1000微米的尺度。
[0050]如本文中所用，術語〃納米〃被廣泛地解釋為包括小于約100nm的尺度。
[0051]如本文中所用，術語“顆粒”廣泛地是指離散的實體或離散的小體。本文中描述的顆粒可包括有機、無機或生物顆粒。生物顆粒可包括生物顆粒哺乳動物細胞、血細胞、細菌細胞、細胞器以及病毒。本文中描述的使用的顆粒還可以是通過多個亞顆粒或小物體的碎片的聚集形成的大顆粒。本公開內容的顆粒可以是球形的，大體上球形的或非球形的，例如具有不規則形狀的顆粒或橢圓形顆粒。術語“尺寸”，當用于指顆粒時，廣泛地指顆粒的最大尺度。例如，當顆粒是大體上球形時，術語“尺寸”可指顆粒的直徑；或當顆粒大體上是非球形時，術語“尺寸”可指顆粒的最大長度。
[0052]如本文中所用，術語〃脂肪酸〃廣泛地指具有飽和的或不飽和的脂肪族尾的非酯化羧酸，或其對應的羧酸陰離子，并且可分別表示為RCOOH或RC00_，其中R是脂肪族尾。脂肪族尾可以例如包含3至25個碳原子。
[0053]本文中使用的術語〃游離脂肪酸〃或"FFA"意欲包括大體上不與其它分子締合的任何脂肪酸。例如，游離脂肪酸包括這樣的脂肪酸:其羧基不共價地鍵合于另一種化合物。
[0054]本文中使用的術語〃脂肪酸酯〃廣泛地指脂肪酸的酯，包括脂肪酸單酯、二酯或三酯。術語"脂肪酸酯"還意欲包括脂肪酸烷基酯例如脂肪酸甲酯(FAME)。
[0055]術語〃烷基〃包括具有I至50個碳原子，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20……或50個碳原子的直鏈或支鏈飽和脂肪族基團。例如，術語烷基包括但不限于甲基、乙基、1-丙基、異丙基、1- 丁基、2- 丁基、異丁基、叔-丁基、戊基、1，2-二甲基丙基、1，1-二甲基丙基、戊基、異戊基、己基、4-甲基戊基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、1，2，2-三甲基丙基、1，1,2-三甲基丙基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、庚基、1-甲基己基、2，2- 二甲基戊基、3，3- 二甲基戊基、4，4- 二甲基戊基、1，2- 二甲基戊基、1，3- 二甲基戊基、1，4-二甲基戊基、1，2，3-三甲基丁基、1，1，2-三甲基丁基、1，1，3-三甲基丁基、5-甲基庚基、1-甲基庚基、辛基、壬基、癸基等。
[0056]如本說明書中所用，除非另有所指，否則術語〃偶聯的〃或〃連接的〃意欲覆蓋直接連接的或通過一個或多個中間裝置連接的。
[0057]本文中使用的術語“微生物”、“微生物細胞”和“微生物”廣泛地指原核和真核微觀生物例如細菌或原生動物、病毒或任何類型的高等生物，例如真菌、藻類、植物或動物，可將其以細胞懸浮液或細胞培養物的形式維持。
[0058]本文中使用的術語“細菌”是指原核生物域。細菌可包括但不限于至少11個不同的種類，如下:(I)革蘭陽性(gram+)細菌，其存在兩個主要亞類:(I)高G+C組(放線菌，分支桿菌，微球菌等等)；(2)低G+C組(芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridia)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococci)、鏈球菌屬(Streptococci)、支原體屬(Mycoplasmas) ； (2)變形菌(Proteobacteria),例如紫色光合+非光合革蘭陰性菌(包括大部分“常見的”革蘭陰性細菌)；(3)藍藻菌例如產氧性光能利用菌；(4)螺旋體和相關物種；(5)浮霉狀菌屬(Planctomyces) ； (6)擬桿菌屬(Bacteroides)、產黃菌屬(Flavobacteria) ； (7)衣原體屬(Chlamydia) ； (8)綠硫細菌；(9)綠色非硫細菌(也是厭氧光能利用菌)；(10)抗福射微球菌屬及親緣細菌；(11)棲熱袍菌屬(Thermotoga)和Thermosipho thermophiles。
[0059]“革蘭陰性細菌”可包括但不限于球菌、非腸道桿狀菌和腸道桿狀菌。革蘭陰性細菌的屬包括例如奈瑟球菌屬(Neisseria)、螺旋菌屬(Spirillum)、巴斯德菌屬(Pasteurella)、布魯桿菌屬(Brucella)、耶爾森菌屬(Yersinia)、弗朗西絲菌屬(Francisella)、嗜血菌屬(Haemophilus)、博德特菌屬(Bordetella)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門菌屬(Salmonella)、志賀菌屬(Shigella)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、弧菌屬(Vibr1)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、擬桿菌屬(Bacteroides)、醋桿菌屬(Acetobacter)、氣桿菌屬(Aerobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、固氮菌屬(Azotobacter)、螺旋菌屬(Spirilla)、沙雷菌屬(Serratia)、弧菌屬(Vibr1)、根瘤菌屬(Rhizobium)、衣原體屬(Chlamydia)、立克次體屬(Rickettsia)、密螺旋體屬(Treponema)和梭桿菌屬(Fusobacterium)。
[0060]“革蘭陽性細菌”可包括但不限于球菌(cocci)、非孢子形成桿狀菌和孢子形成桿狀菌。革蘭陽性細菌的屬包括例如放線菌屬(Actinomyces)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、利斯特菌屬(Listeria)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、粘球菌屬(Myxococcus)、諾卡爾菌屬(Nocardia)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)和鏈霉菌屬(Streptomyces)。
[0061]本文中使用的術語“重組微生物”和“重組宿主細胞”可互換使用，包括已進行了遺傳修飾以表達或過表達內源多核苷酸、或表達非內源序列例如包含在載體中的那些，或內源基因表達減少的微生物。多核苷酸通常編碼參與用于產生上述期望的代謝物的代謝途徑的靶酶。因此，本文中描述的重組微生物包括已進行了遺傳工程化以表達或過表達先前未被親代微生物表達或過表達的靶酶的那些重組微生物。應理解，術語“重組微生物”和“重組宿主細胞”不僅指指定的重組微生物而且還指這樣的微生物的后代或潛在后代。
[0062]上文中所用的術語“親代微生物”是指用于產生重組微生物的細胞。術語“親代微生物”包括已進行遺傳修飾的細胞和已進行了遺傳修飾但不表達或過表達靶酶的細胞。
[0063]術語“野生型”，當指微生物時，廣泛地指天然存在的細胞，即還未進行遺傳修飾的細胞。
[0064]術語“酶”，當在本文中使用時，廣泛地指完全由或大部分由催化或促進一種或多種化學或生物化學反應的蛋白質或多肽組成的任何物質。
[0065]術語“基因”，當在本文中使用時，是指編碼包含一種或多種蛋白質或酶的全部或部分的特定氨基酸序列的多核苷酸，并且可包括調控(非轉錄)DNA序列，例如啟動子序列，其決定例如在其下基因被表達的條件。基因的轉錄區可包括非翻譯區，包括內含子、5'-非翻譯區(UTR)和3' -UTR，以及編碼序列。
[0066]術語“核酸”或“重組核酸”是指多核苷酸例如脫氧核糖核酸(DNA)和，當適當時，核糖核酸(RNA)。
[0067]術語“表達”等，當與基因序列結合使用時，是指基因的轉錄和適當時，所得mRNA轉錄物至蛋白質的翻譯。
[0068]本文中使用的術語“載體”廣泛地指可籍以將核酸擴增和/或在生物、細胞或細胞組分之間轉移的任何工具。載體可包括但不限于病毒、噬菌體、原病毒、質粒、噬菌粒、轉座子和人工染色體例如YAC (酵母人工染色體)、BAC (細菌人工染色體)和PLAC (植物人工染色體)等，并且可以是“附加體”(即，可自主復制)或可整合進入宿主細胞的染色體。載體還可以是:不是天然附加型的裸露的RNA多核苷酸、裸露的DNA多核苷酸、在相同鏈內由DNA和RNA兩者組成的多核苷酸、綴合有多聚賴氨酸的DNA或RNA、綴合有肽的DNA或RNA、綴合有脂質體的DNA等，或其可以是包含上述多核苷酸構建體的一個或多個的生物體例如農桿菌或細菌。
[0069]術語“轉化”、“轉染”等，當在遺傳工程的上下文中使用時，是指籍以將載體引入宿主細胞的方法。轉化(或轉導或轉染)可通過許多方法，包括電穿孔、微注射、生物微粒轟擊(或微粒轟擊介導的遞送)或農桿菌介導的轉化的任一種來實現。
[0070]如本文中所用，術語“任選地取代的”意指該術語所指的基團可不被取代，或可被 Iv或多個基團取代。不例性取代基包括烷基、烯基、炔基、硫代烷基、環烷基、環烯基、雜環烷基、鹵素、竣基、鹵代烷基、鹵代炔基、羥基、烷氧基、硫代烷氧基、烯基氧、鹵代烷氧基、齒代稀氧基、硝基、氣基、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基雜環基、燒氣基、二燒氣基、稀胺基、炔氨基、酰基、烯酰基、炔酰基、酰氨基、二酰氨基、酰氧基、烷基磺酰氧基、雜環氧基、雜環氣基、鹵代雜環烷基、烷基亞橫酸基、烷基擬氧基、燒硫基、酸硫基、含憐基團例如勝酸基和氧勝基、芳基、雜芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、氰!基、氰!酸酷和異氰I酸酷。
[0071]本文中使用的術語〃同源性〃和“同一性”是指多聚體分子之間，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之間和/或多肽分子之間的總體未緣關系。
[0072]本文中使用的術語〃與……締合"，當指兩個元件時，是指兩個元件之間廣泛的關系。關系包括但不限于物理、化學或生物學關系。例如，當元件A與元件B締合時，元件A與B可直接或間接彼此連接，或元件A可通過元件B產生或反之亦然。
[0073]術語〃和/或〃，例如"X和/或Y"被理解為意指"X和Y"或"X或Y"，并且應當被用來提供對兩種含義或任一含義的明確支持。
[0074]此外，在本文中的說明中，單詞“大體”，無論何時使用，被理解為包括但不限于“整個地”或“完全地”等。此外，術語例如“包含”、“包括”等，無論何時使用，意欲為非限制性描述語言，即它們廣泛地包括在這樣的術語之后提及的元素/組成部分，還有其它未明確提及的組成部分。此外，術語例如〃約〃、"大致〃等，無論何時使用，通常意指合理的變化，例如公開的值的+/-5%的變化，或公開的值的4%的變化，或公開的值的3%的變化，或公開的值的2%的變化或公開的值的I %的變化。
[0075]此外，在本文中的描述中，某些值可以以以范圍公開。顯示范圍的終點的值意欲說明優選范圍。無論何時描述范圍，范圍意欲覆蓋和教導所有可能的子范圍以及該范圍內的單個數值。即，范圍的終點不應當解釋為不可改變的限制。例如，1%至5%的范圍的描述意欲明確公開子范圍1%至2%、1%至3%、1%至4%、2%至3%等，以及單個地，該范圍內的值例如I %、2 %、3 %、4 %和5 %。上述特定公開內容的意圖適用于任何深度/寬度的范圍。
[0076]當適用時，在本領域技術人員的能力之內的化學、分子生物學、遺傳工程、重組DNA的常規技術可用于幫助實踐本文中公開的一個或多個步驟。技術可在教科書例如Ausubel, F.M.等人(1995和期刊補充材料；Current Protocols in Molecular B1logy,第9, 13 和 16 章，John ffiley&Sons, New York, N.Y.) ；B.Roe, J.Crabtree 和 A.Kahn, 1996, DNAIsolat1n and Sequencing:Essential Techniques,John ffiley&Sons J.M.Polak 和James 0'D.McGee, 1990, In Situ Hybridizat1n !Principles and Practice ；0xfordUniversity Press ； J.Sambrook, E.F.Fritsch 和 T.Maniatis, 1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，Booksl-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press ；M.J.Gait (編輯)，1984，Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach, Irl Press ；D.M.J.Lilley 和 J.E.Dahlberg, 1992，Methods of Enzymology:DNA Structure Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press ；和 Lab Ref:A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Useat the Bench, Edited Jane Roskams 和 Linda Rodgers, 2002, Cold Spring HarborLaboratory, ISBN0-87969-630-3 中獲得。
[0077]詳述
[0078]在下文中公開了從游離脂肪酸產生脂肪酸酯的方法和用于該方法的催化劑的示例性非限定性實施方案。
[0079]從包含按重量計至少約10%的游離脂肪酸(FFA)的組合物產生脂肪酸酯的方法可包括用將多個微米或納米尺寸的催化顆粒與所述組合物溫育，以催化至少約80%的FFA至脂肪酸酯的轉化。可在醇存在的情況下進行方法。
[0080]在一個實施方案中，脂肪酸酯包括脂肪酸烷基酯。脂肪酸烷基酯可以是直鏈或支鏈脂肪酸烷基酯。烷基酯可選自甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯、己酯及其混合物。在一個實施方案中，脂肪酸烷基酯包括脂肪酸甲酯(FAME)。本文中公開的脂肪酸可選自辛酸；癸酸；十二烷酸；十四烷酸；十六烷酸；十七烷酸；順，順_9，12-十八碳二烯酸；順-9-十八碳烯酸；和十八烷酸。
[0081]本文中公開的組合物可包含按重量計至少10%的游離脂肪酸，按重量計至少約11%的游離脂肪酸，按重量計至少約12%的游離脂肪酸，按重量計至少約13%的游離脂肪酸，按重量計至少約14%的游離脂肪酸，按重量計至少約15%的游離脂肪酸，按重量計至少約20%的游離脂肪酸，按重量計至少約21 %的游離脂肪酸，按重量計至少約22%的游離脂肪酸，按重量計至少約23 %的游離脂肪酸，按重量計至少約24%的游離脂肪酸，按重量計至少約25%的游離脂肪酸，按重量計至少約30%的游離脂肪酸，按重量計至少約35%的游離脂肪酸，按重量計至少約40 %的游離脂肪酸，按重量計至少約45 %的游離脂肪酸，按重量計至少約50%的游離脂肪酸，按重量計至少約60%的游離脂肪酸，按重量計至少約70%的游離脂肪酸或至少按重計約80%的游離脂肪酸。在一個實施方案中，本文中公開的組合物包含按重量計約12%至約22%的游離脂肪酸。
[0082]在一個實施方案中，本文中公開的組合物還包含甘油酯。因此，在一個實施方案中，微米或納米尺寸的催化顆粒能夠額外地催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化。甘油酯可選自甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯。
[0083]本文中公開的組合物可以是潤滑脂。潤滑脂還可以是褐色潤滑脂或包含動物和/或植物油的廢油。潤滑脂可作為副產品獲自工業或制造過程，例如獲自食品工業(例如餐館)。
[0084]本文中公開的醇可以是選自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇和甘油的醇。在一個實施方案中，醇包括單醇。在一些實施方案中，醇具有通式R —0H，其中R表示Cn(H2n+1)并且η為從1至10的整數。適合于使用的單醇的實例包括甲醇、乙醇、正-丙醇(1-丙醇)、異丙醇(2-丙醇)、正-丁醇(1- 丁醇)、仲-丁醇(2- 丁醇)、異丁醇(2-甲基-1-丙醇)、叔-丁醇(2-甲基-2-丙醇)、正-戊醇(1-戊醇)、2_戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、叔-戊醇(2-甲基-2- 丁醇)、3_甲基-1- 丁醇、3-甲基-2- 丁醇、新-戊醇(2，2- 二甲基-1-丙醇)、1-己醇、1-庚醇、1-辛醇或其組合。在一些實施方案中，醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其組合。
[0085]在一些實施方案中，醇包括多元醇例如二醇、三醇等。在一個實施方案中，醇包括甲醇、甘油的至少一種及其混合物。醇與FFA的摩爾比可以為約2:1至約50: 1、約3:1至約40:1、約4:1至約30:1、約5:1至約20:1、約6:1至約15:1、約7:1至約10:1、約7:1至約9: 1、或約2:1至約8:1。醇與GTO的摩爾比可以為約2:1至約50: 1、約3:1至約40:1、約4:1至約30:1、約5:1至約20:1、約6:1至約15:1、約7:1至約10:1、約7:1至約9:1、或約2:1至約8:1。在一個實施方案中，醇以超過完成反應所需的理論量的過量的量使用。
[0086]可在適合于至少80%的FFA至脂肪酸酯的轉化的條件下進行溫育步驟。還可在開始方法之前預先確定條件，或在反應過程中專門地確定條件。這樣的條件可包括溫育時間、溫育溫度和溫育壓力的至少一個。
[0087]溫育溫度可以是低于約150°C、低于約140°C、低于約130°C、低于約125°C、低于約120°C、低于約100°C、低于約90V、低于約80 V、低于約70V、低于約60 V、低于約50V或低于約40°C的溫度。在一個實施方案中，溫育溫度不超過約100°C或不超過約70°C。在另一個實施方案中，溫育溫度不超過約40°C或不超過約30°C。在一個實施方案中，當使用的醇是甲醇時，溫育溫度不超過70°C、不超過80°C或不超過90°C。在一個實施方案中，當使用的醇是甘油時，溫育溫度不超過100°C、不超過110°C、不超過120°C、不超過125°C或不超過130。。。
[0088]溫育壓力可以是不過約150kPa、不超過約140kPa、不超過約130kPa、不超過約125kPa、不超過約121kPa、不超過約120kPa、不超過約115kPa、不超過約IlOkPa,或不超過約105kPa的壓力。在一個實施方案中，溫育壓力大體上為標準大氣壓，即為IatmdOl.325kPa)。在一個實施方案中，溫育壓力低于約7.2atm(729.54kPa)、7.0atm (709.275kPa)、6.0atm (607.95kPa)、5.0atm (506.625kPa)、4.0atm (405.3kPa)、3.0atm (303.975kPa)。
[0089]溫育時間可以為約0.5小時至約100小時。在一個實施方案中,溫育時間為約0.5小時至約12小時。在一個實施方案中，溫育時間為約0.5小時至約26小時。在一個實施方案中,溫育時間為約84小時至約96小時。
[0090]在一個實施方案中，在適合于至少80%的FFA至烷基酯的轉化的條件下進行溫育步驟，其中所述條件包括不超過約50°C的溫育溫度、不超過121kPa的溫育壓力或約0.5小時至約8小時的溫育時間的至少一個。
[0091]添加至組合物中以進行溫育的微米或納米尺寸的催化顆粒的量可以為按組合物重量計約0.01%至約20%、約0.01%至約15%、約0.01%至約10%、約0.05%至約10%、約 0.1 %至約 5%、約 0.15%至約 4.5%、約 0.2%至約 4.4%、約 0.25%至約 4.3%、約 0.3%至約4.2 %、約0.35 %至約4.1 %、約0.4 %至約4.0 %、約0.45 %至約3.9 %、約0.5 %至約3.8%、約1%至約3.7%、約1%至約3.5%、約1%至約3%、或約1%至約2%。在一個實施方案中，添加至組合物以進行溫育的固定在微米或納米尺寸的催化顆粒上的酶的量為按組合物重量計約0.01%至約1%。在一個實施方案中，添加至組合物以進行溫育的微米或納米尺寸的催化顆粒的量為按組合物重量計約3.5%至約10%。在一個實施方案中，添加至組合物以進行溫育的的微米或納米尺寸的催化顆粒的量為按組合物重量計約0.1%至約20%。
[0092]溫育步驟還可包括攪拌包含游離脂肪酸(FFA)的組合物、微米或納米尺寸的催化顆粒和醇的混合物的步驟。可在約20rpm至約1200rpm下進行攪拌步驟。在一個實施方案中，可在約30rpm下進行攪拌步驟。在一個實施方案中，可在約100rpm下進行攪拌步驟。在一個實施方案中，可在約250rpm至約500rpm下進行攪拌步驟。
[0093]在一個實施方案中，本文中公開的方法是“一鍋”反應，其中將包含游離脂肪酸(FFA)的組合物、微米或納米尺寸的催化顆粒和醇一起在一個反應容器中溫育以從組合物產生脂肪酸酯。因此，可在一個單一步驟中進行脂肪酸酯的產生。因此，在一個實施方案中，當組合物包含甘油酯時，同時進行FFA至脂肪酸酯的轉化和甘油酯至所述脂肪酸酯的轉化。在一個實施方案中，本文中公開的方法大體上不含溶劑例如叔-丁醇或正己烷。
[0094]在另一個實施方案中，方法還可包括將甘油酯暴露于堿以催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化。可在至少約80 %的FFA已轉化為脂肪酸酯后將堿添加至組合物，以進一步將甘油酯轉化為脂肪酸酯。堿催化劑可以是包含OH-基團的堿。在一個實施方案中，堿催化劑可以是金屬氫氧化物。金屬氫氧化物可選自NaOH、KOH等。堿催化劑還可選自CH3ONa, CH3OK, Na2CO3, K2CO3等。將FFA轉化為脂肪酸酯的化學反應可包括酯化過程。將甘油酯轉化為脂肪酸酯的化學反應可包括轉酯過程。
[0095]本文中公開的方法可以能夠催化至少約80%的FFA至脂肪酸酯，至少約85%的FFA至脂肪酸酯，至少約90%的FFA至脂肪酸酯，至少約95%的FFA至脂肪酸酯，至少約96%的FFA至脂肪酸酯，至少約97%的FFA至脂肪酸酯，至少約98%的FFA至脂肪酸酯，至少約99%的FFA至脂肪酸酯或至少約99.5%的FFA至脂肪酸酯的轉化。
[0096]本文中公開的方法可具有至少約80%，至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約96%，至少約97%，至少約98%，至少約99%或至少約99.5%的脂肪酸酯例如脂肪酸甲酯(FAME)的產率。FAME產率可通過下列公式來計算:
[0097]FAME產率=[(由公開的催化劑產生的FAME的總量)/ (FAME標準)]xlOO (% )。FAME標準可以是通過由Novozyme435和KOH催化的兩步反應獲得的FAME產率。在某些實施方案中，這樣的FAME標準可通過第三方校準曲線來獲得，所述校準曲線使用由Novozyme435和KOH催化的兩步反應。
[0098]微米或納米尺寸的催化顆粒可具有不超過約800 μ m、不超過約700 μ m、不超過約600 μ m、不超過約500 μ m、不超過約400 μ m、不超過約300 μ m、不超過約200 μ m、不超過約100 μ m、不超過約50 μ m、不超過約20 μ m、不超過約10 μ m、不超過約I μ m、不超過約800nm、不超過約700nm、不超過約600nm、不超過約500nm、不超過約400nm、不超過約300nm、不超過約200nm、不超過約lOOnm、不超過約50nm或不超過約40 μ m的平均尺寸或直徑。在一個實施方案中，微米或納米尺寸的催化顆粒具有約40nm至約100 μ m的平均尺寸或直徑。在一個實施方案中，微米或納米尺寸的催化顆粒具有約80nm至約500 μ m的平均尺寸或直徑。在一個實施方案中，微米或納米尺寸的催化顆粒具有約500nm至約1ym的平均尺寸或直徑。在一些實施方案中，微米-尺寸催化顆粒由納米-尺寸催化顆粒的簇組成。有利地，納米-和微米-尺寸催化劑的高表面積/體積比率使得顆粒表面上具有高催化劑載荷，并且小的尺寸減少質量轉移限制，從而導致高轉化和產率。
[0099]微米或納米尺寸的催化顆粒可以是大體上球形的，大體上長形的或大體具有無規則形狀的。因此，當微米或納米尺寸的催化顆粒是大體上球形時，平均尺寸可通過平均直徑來提供。當微米或納米尺寸的催化顆粒是大體上長形或大體上具有無規則形狀時，顆粒的平均尺寸可通過平均長度來提供。
[0100]微米或納米尺寸的催化顆粒可包括具有在微米或納米范圍內的維度的小體；和用于催化游離脂肪酸(FFA)至脂肪酸酯的轉化的與小體結合的催化裝置，其中催化顆粒適合催化包含按重量計至少10%的FFA的組合物中的至少80%的FFA至脂肪酸酯的轉化。在一個實施方案中，微米或納米尺寸的催化顆粒選自聚合酶顆粒、二氧化硅顆粒、微生物細胞及其混合物。
[0101]催化裝置可包含酶和酸基團的至少一種。催化裝置可包含超過一種酶。酶可以是脂肪酶。在一個實施方案中，酶包括水解酶。水解酶可以是選自疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces Ianuginosus)脂肪酶(TLL)、南極假絲酵母(Candida antarctica)脂肪酶B(CALB)、南極假絲酵母脂肪酶A(CALA)、粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)脂肪酶(SML)、洋蔥假單胞菌 (Pseudomonas cepacia)脂肪酶、皺裙念珠菌(Candida rugosa)脂肪酶、伯霍爾德桿菌屬(Burkholderia)脂肪酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)月旨肪酶、黑曲霉菌(Aspergillus niger)脂肪酶、婁地青霉菌(Penicillium roqueforti)脂肪酶、雪白根霉(Rhizopus niveus)脂肪酶、稻根霉菌(Rhizopus oryzae)脂肪酶、產堿菌屬(Alcaligenes sp.)脂肪酶、無色桿菌屬(Achromo-bacter sp.)脂肪酶、施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)脂肪酶的脂肪酶。
[0102]酸基團可以是無機酸基團。酸基團可選自磺酸、雜多酸及其混合物。在一個實施方案中，磺酸來源于甲磺酸、苯磺酸或丙磺酸的至少一種。在一個實施方案中，酸基團包括磺酸基團。在一個實施文案中，當微米或納米尺寸的催化顆粒包括聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯)(PGMA)顆粒時,磺酸基團來源于甲磺酸。在一個實施方案中，當微米或納米尺寸的催化顆粒包括聚苯乙烯(PS)顆粒時，磺酸基團來源于苯磺酸。在一個實施方案中，當微米或納米-尺寸催化顆粒包括二氧化硅顆粒時，磺酸基團來源于丙磺酸。當催化裝置是酸基團時，微米或納米尺寸的催化顆粒可具有約0.1至約3mmol H+/克顆粒的單位H+載荷。單位H+載荷可以為每克顆粒約 0.1mmol H+、約 0.2mmol H+、約 0.3mmol H+、約 0.4mmol H+、約 0.5mmolH+、約 0.6mmol H+、約 0.7mmol H+、約 0.8mmol H+、約 0.9mmol H+、約 1.1Ommol H+、約 1.20mmolH+、約 1.30mmol H+、約 1.40mmo1 H+、約 1.50mmol H+、約 1.BOmmoI H+、約 1.70mmol H+、約
1.8OmmoI H+、約 1.9OmmoI H+、約 2.0mmol H+、約 2.10mmol H+、約 2.2OmmoI H+、約 2.3OmmoIH+、約 2.40mmol H+、約 2.5OmmoI H+、約 2.6OmmoI H+、約 2.70mmol H+、約 2.8OmmoI H+、約2.90mmol H+或約3.0mmol H+。在一個實施方案中，微米-或納米-尺寸催化顆粒具有約0.5至約2.3mmol H+/克顆粒的單位H+載荷。在一個實施方案中,微米-或納米-尺寸催化顆粒具有約2.3mmol H+/克顆粒的單位H+載荷。在一個實施方案中,微米-或納米-尺寸催化顆粒具有約2.25mmol H+/克顆粒的單位H+載荷。在一個實施方案中,微米-或納米-尺寸催化顆粒具有約0.54mmol H+/克顆粒的單位H+載荷。在一個實施方案中，微米-或納米-尺寸催化顆粒具有約1.1lmmol H+/克顆粒的單位H+載荷。
[0103]微米或納米尺寸的催化顆粒可以是磁性顆粒。磁性顆粒可以是順磁性顆粒。磁性顆粒的小體可包括外殼；和被外殼至少部分封裝的磁性核心，其中與小體結合的催化裝置是固定在外殼上的催化實體，用于催化FFA至脂肪酸酯的轉化。在一個實施方案中，聚合物殼封裝大體上整個磁性核心。在一個實施方案中，磁性核心包含多個磁性納米-尺寸顆粒。磁性核心可通過為非交聯的并且可以可逆地彼此分離的磁性納米-尺寸顆粒的簇形成。磁性納米-尺寸顆粒可具有直徑為約40nm至約800nm的大體上均一的尺寸分布。磁性納米_尺寸顆粒可具有約5nm至約30nm、約5nm至約20nm、約5nm至約15nm或約8nm至約20nm的平均尺寸或直徑。磁性納米-尺寸顆粒可被封端劑(capping agent)涂覆。封端劑可以是酸。不受理論束縛，相信封端劑可在磁性顆粒之間提供位阻以改善穩定性。封端劑可選自油酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、檸檬酸三鈉、溴化十六烷基三甲銨(CTAB)和油胺。磁性核心的磁性性質可通過金屬氧化物來提供。金屬氧化物的金屬可選自過渡金屬。在一個實施方案中，金屬氧化物的金屬選自元素周期表的第6族、第7族或第8族的金屬。金屬氧化物可選自Fe304、Y-Fe2O3、FeCo、MnFe2O4和CoFe2O4。在一個實施方案中，金屬氧化物包括氧化鐵(Fe3O4)15因此，在一個實施方案中，磁性納米-尺寸顆粒為涂覆有油酸的氧化鐵納米-尺寸顆粒。
[0104]外殼是聚合物殼或二氧化硅殼的至少之一。聚合物可選自聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯)(PGMA)、聚苯乙烯(PS)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(乙酸乙烯酯)(PVAc)、聚(乙烯醇)(PVA)和聚(乙二醇)(PEG)。在一個實施方案中，外殼包含選自聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯)(PGMA)、聚苯乙烯(PS)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、二氧化硅及其混合物的材料。當催化實體包含酶時，酶可通過接頭固定在外殼上，所述接頭選自含環氧化物官能團接頭、含胺官能團接頭、含醛官能團接頭、含苯官能團接頭、含酯官能團接頭、含酐官能團接頭、含碳酸酯官能團接頭、含酰疊氮官能團接頭、含異氰酸酯官能團接頭、含羧酸苯酯官能團接頭及其混合物。在一個實施方案中，接頭是4，7，10-三氧-1，13-十三烷二胺。在一個實施方案中，接頭通過將顆粒的外殼與胺和醛的至少一種反應來獲得。胺可以是乙二胺(EDA)，醛可以是戊二醛(GA)。在一個實施方案中，外殼表面上的醛基團通過胺表面基團與戊二醛的反應來引入。
[0105] 微米或納米尺寸的催化顆粒可具有約5mg至約500mg酶/克顆粒的單位載荷。單位載荷可以為約1mg、約20mg、約30mg、約40mg、約50mg、約60mg、約70mg、約80mg、約90mg、約 lOOmg、約 llOmg、約 120mg、約 130mg、約 140mg、約 150mg、約 160mg、約 170mg、約 180mg、約 190mg、約 200mg、約 210mg、約 220mg、約 230mg、約 240mg、約 250mg、約 260mg、約 270mg、約 280mg、約 290mg、約 300mg enzyme、約 310mg、約 320mg、約 330mg、約 340mg、約 350mg、約360mg、約 370mg、約 380mg、約 390mg、約 400mg、約 410mg、約 420mg、約 430mg、約 440mg、約450mg、約460mg、約470mg、約480mg、約490mg或約500mg酶/克顆粒。在一個實施方案中，微米-尺寸催化顆粒具有約10至約10mg酶/克顆粒的單位載荷。在另一個實施方案中，納米-尺寸催化顆粒可具有約10至約300mg酶/克顆粒的單位載荷。
[0106]鑒于上述內容，在一個實施方案中，還提供了產生上述微米或納米尺寸的催化顆粒的方法。方法可包括形成磁性核心；利用外殼封裝磁性核心的至少一部分；和將催化實體固定在外殼上，其中催化實體適合催化包含按重量計至少10%的FFA的組合物中的至少80%的FFA至脂肪酸酯的轉化。形成磁性核心的步驟可包括形成多個磁性納米-尺寸顆粒。形成多個磁性納米-尺寸顆粒的步驟可包括共沉淀以獲得磁性納米-尺寸顆粒。
[0107]在一個實施方案中，當外殼是聚合物殼時，利用聚合物殼封裝磁性核心的至少一部分的步驟包括將磁性核心與聚合物殼的單體前體混合；和聚合單體前體以形成封裝磁性核心的至少一部分的聚合物殼。聚合反應可以是自由基聚合反應。聚合反應可通過在磁性核心存在的情況下添加引發劑例如過硫酸銨(APS)和相關單體來進行，以獲得磁性微米或納米顆粒。
[0108]在另一個實施方案中，當外殼是二氧化硅殼時，用二氧化硅殼封裝磁性核心的步驟包括將磁性核心與四乙基正硅酸鹽在包含醇和氨的水中混合以獲得混合物；和從混合物沉淀二氧化硅以形成封裝磁性核心的二氧化硅殼。在一個實施方案中，用二氧化硅殼封裝磁性核心的步驟包括使用Stober法。
[0109]將催化實體固定至外殼的步驟可包括將催化實體化學偶聯至外殼或將催化實體物理地吸附至外殼的至少之一。將催化實體化學地偶聯至外殼的步驟可包括將聚合物或二氧化硅顆粒添加至酸溶液，以將來源于酸溶液的催化實體固定至外殼。將聚合物或二氧化硅顆粒添加至酸溶液的步驟可在環境條件下進行。將催化實體化學偶聯至外殼可包括將催化實體與外殼的與催化實體有化學反應活性的官能團共價綴合，以將催化實體固定至外殼；或利用與催化實體有化學反應活性的官能團官能化外殼的表面；和共價地或非共價地將催化實體與官能團偶聯以將催化實體固定至外殼。官能化外殼的表面的步驟可包括(i)將包含有機胺基的溶液添加至聚合物顆粒；(ii)在第一溫育溫度下溫育混合物；(iii)在步驟(ii)后將醛添加至混合物；和(iv)在第二溫育溫度下溫育步驟(iii)的混合物。第一溫育溫度可高于室溫，并且可超過約50°C。第一溫育溫度可以在約室溫，并且可低于約50°C。利用官能團化學偶聯催化實體以將催化實體固定至外殼的步驟可包括在適當的緩沖劑存在的情況下，將酶添加至包含與催化實體有化學反應活性的官能團的外殼，和在約40 V或更低溫度溫育混合物。
[0110]在一個實施方案中，微米-或納米-尺寸催化磁性顆粒適合于重復使用，以進行多個循環，其中包含按重量計約10%的(FFA)的組合物中的至少約80%的FFA在每一個循環中被轉化為脂肪酸。多個循環可以為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個循環。可通過施加磁場以進行收集來收集微米-或納米-尺寸催化磁性顆粒以進行再循環或再利用。
[0111]因此，還提供了從混合物分離本文中公開的磁性催化顆粒的方法，所述方法包括施加外部磁場以將磁性催化顆粒聚集在一起；和從聚集的磁性催化顆粒除去混合物的其余部分。還提供了從包含按重量計至少10%的游離脂肪酸(FFA)的組合物產生脂肪酸酯的方法，所述方法包括將多個獲自上述分離方法的再循環的微米或納米尺寸的催化顆粒與所述組合物溫育，以催化FFA至脂肪酸酯的轉化，以便至少80%的FFA被轉化為脂肪酸酯。
[0112]在一個實施方案中，微米-尺寸顆粒為包含具有固定在納米顆粒表面上的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(TLL)的CHO-磁性納米顆粒(CHO-MNP)的非交聯簇的MNA TL顆粒，所述納米顆粒包含氧化鐵核心、聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯)殼和醛表面基團。MNA TL(利用疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶固定的磁性納米生物催化劑聚集體)顆粒可通過在4-30°C搖動濃度為7mM、pH5-8的磷酸鹽緩沖液中的TLL和CH0-MNP，進行0.5_12h來制備。
[0113]在另一個實施方案中，微米-尺寸顆粒為聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯)微粒，其包含具有固定在納米顆粒表面上的南極假絲酵母脂肪酶B (CALB)的CHO功能化磁性納米顆粒(CHO-MNP)的非交聯簇，所述納米顆粒包含氧化鐵核心、聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯)殼和醛表面基團。MNA CA(利用CALB固定的磁性納米生物催化劑聚集體)顆粒可通過在4_30°C搖動濃度為7mM、pH5-8的磷酸鹽緩沖液中的CALB和CH0-MNP，進行0.5_12h來制備。
[0114]在另一個實施方案中，納米-尺寸顆粒包括具有固定在納米顆粒表面上的南極假絲酵母脂肪酶B (CALB)的聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯)磁性納米顆粒(GA-MNP)，所述納米顆粒包含氧化鐵核心、聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯)殼和醛表面基團。GAP CA顆粒可通過在4-30°C搖動pH7的磷酸鹽緩沖液中的CALB和GA-MNP，進行4_12h來制備。
[0115]在另一個實施方案中，納米-尺寸顆粒包含具有固定在納米顆粒表面上的南極假絲酵母脂肪酶B (CALB)的乙二胺功能化的磁性納米顆粒(EDA-MNP)，所述納米顆粒包含氧化鐵核心、聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯)殼和胺表面基團。EDAP CA顆粒可通過在4-30°C搖動PH7的磷酸鹽緩沖液中的CALB、戊二醛和EDA-MNP，進行4_12h來制備。
[0116]在另一個實施方案中，納米-尺寸顆粒包含具有固定在納米顆粒表面上的南極假絲酵母脂肪酶B (CALB)的聚苯乙烯磁性納米顆粒(PS-MNP)，所述納米顆粒包含氧化鐵核心、聚苯乙烯殼和苯基表面基團。PSP CA顆粒可通過在4-30°C搖動pH7的磷酸鹽緩沖液中的CALB和PS-MNP，進行4_12h，將CALB物理吸附至納米顆粒上來制備。
[0117]在另一個實施方案中，納米-尺寸顆粒包含具有固定在納米顆粒表面上的南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)的聚(甲基丙烯酸甲酯)磁性納米顆粒(PMMA-MNP)，所述納米顆粒包含氧化鐵核心、聚(甲基丙烯酸甲酯)殼和酯表面基團。PSP CA顆粒可通過在4-30°C搖動PH7的磷酸鹽緩沖液中的CALB和PMMA-MNP，進行4_12h將CALB物理吸附至納米顆粒上來制備。
[0118]在一些實施方案中，可在除了微米或納米尺寸的催化顆粒以外還存在硅膠微珠的情況下進行所述方法。
[0119]在一個實施方案中，微米或納米尺寸的催化顆粒是微生物的細胞，其中顆粒的小體是細胞的小體，與小體結合的催化裝置是在細胞的小體中產生的或從細胞的小體產生的用于催化FFA至脂肪酸酯的轉化的酶。與小體結合的催化裝置可以是可以相同或不同的多個酶。酶可以是脂肪酶例如甘油三酯脂肪酶(EC3.1.1.3)。在一個實施方案中，酶包括水解酶。水解酶可以是來自或來源于下列脂肪酶的脂肪酶:粘質沙雷氏菌脂肪酶(SML)、疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(TLL)、南極假絲酵母脂肪酶A(CALA)、南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)、米赫根毛霉脂肪酶、黑曲霉菌脂肪酶、皺褶念珠菌脂肪酶、婁地青霉菌脂肪酶、雪白根霉脂肪酶、稻根霉菌脂肪酶、產堿菌屬脂肪酶、無色桿菌屬脂肪酶、洋蔥伯霍爾德桿菌(Burkholderia cepacia)脂肪酶、施氏假單胞菌脂肪酶、米黑毛霉(Mucor miehei)脂肪酶、洋蔥假單胞菌脂肪酶和米曲霉脂肪酶，以及任何變體，所述變體具有與這些脂肪酶之一具有至少約70%同源性/同一性，至少約80%同源性/同一性，至少約90%同源性/同一性，至少約95%同源性/同一性，至少約96%同源性/同一性，至少約97%同源性/同一性，至少約98%同源性/同一性，至少約99%同源性/同一性或約100%同源性/同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，變體可與上文所列脂肪酶之一具有達到10個、達到9個、達到8個、達到7個、達到6個或達到5個氨基酸的改變，其中每一個氨基酸改變是任意組合的氨基酸置換、缺失或添加。在一個實施方案中，氨基酸置換是保守置換。
[0120]微生物可以是表達水解酶的微生物的野生型菌株。在一個實施方案中，微生物的野生型菌株是或來源于粘質沙雷氏菌、疏綿狀嗜熱絲孢菌、南極假絲酵母、米赫根毛霉、黑曲霉菌、米曲霉菌、米黑毛霉、皺褶念珠菌、婁地青霉菌、雪白根霉、稻根霉菌、米赫根毛霉、產堿菌屬、無色桿菌屬、洋蔥伯霍爾德桿菌、施氏假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) >突光假單胞菌(Pseudomonas fIuorescens)、洋蔥假單胞菌、短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)、 熱鏈形芽抱桿菌(B.thermocatenulatus)、枯草芽抱桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.1icheniformis)、芽孢乳酸菌(B.coagulans)、臘樣芽孢桿菌(B.Cereus)、洋蔥伯霍爾德桿菌和嗜堿芽孢桿菌(B.halodurans)。其它屬如不動桿菌屬(Acinetobacter)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、伯霍爾德桿菌屬(Serratia)、無色桿菌屬(Achromobacter)、節桿菌屬(Arthrobacter)、產喊菌屬(Alcaligenes)和色桿菌屬(Chromobacterium)。微生物還可以是表達一種或多種是/來源于一個或多個野生型菌株的水解酶的重組微生物。因此，重組微生物可包含編碼一個或多個來源于上文中提供的微生物的列表的一個或多個外源核酸序列。
[0121]在一個實施方案中，重組微生物是或來源于大腸桿菌(E.coli),稻根霉菌，巴斯德畢赤酵母或釀酒酵母的至少一種。在一個實施方案中，在大腸桿菌中克隆和表達來源于野生型菌株的水解酶(其基因序列已被報道)。在一個實施方案中，水解酶來源于南極假絲酵母的脂肪酶CALB (Genbank登錄號Z30645.1)。因此，在一些實施方案中，還可在重組大腸桿菌中克隆和表達來自野生型菌株的基因序列。
[0122]編碼南極假絲酵母(Genbank登錄號Z30645.1)的脂肪酶CALB的核苷酸序列示于下文的SEQ ID Nol中。
[0123]SEQ ID Nol:脂肪酶B的南極假絲酵母核酸序列(Genbank登錄號Z30645.1)
[0124]

【權利要求】
1.從包含甘油酯和按重量計至少10%的游離脂肪酸(FFA)的組合物產生脂肪酸酯的方法，所述方法包括: 將多個微米或納米尺寸的催化顆粒與所述組合物溫育，以催化FFA至脂肪酸酯的轉化，以便至少80%的FFA被轉化為脂肪酸酯。
2.權利要求1所述的方法，其中所述溫育步驟在醇存在的情況下進行。
3.權利要求1所述的方法，其中所述微米或納米尺寸的催化顆粒具有不超過800μ m的平均粒度或直徑。
4.權利要求1所述的方法，其中所述微米或納米尺寸的催化顆粒能夠額外地催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化。
5.權利要求1所述的方法，其中所述微米或納米尺寸的催化顆粒選自聚合物顆粒、二氧化硅顆粒、微生物細胞及其混合物。
6.權利要求5所述的方法，其中所述聚合物顆粒和二氧化硅顆粒的至少之一為磁性顆粒，所述磁性顆粒包含: 外殼; 被所述外殼至少部 分封裝的磁性核心；和 選自無機酸基團或酶的至少一種的催化實體，所述催化實體被固定在所述外殼上，用于催化FFA至脂肪酸酯的轉化，任選地用于額外地催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化。
7.權利要求5所述的方法，其中所述微生物是表達水解酶的微生物的野生型菌株，或表達水解酶的重組微生物。
8.微米或納米尺寸的催化顆粒，其用于從包含甘油酯和按重量計至少10%的游離脂肪酸(FFA)的組合物產生脂肪酸酯，所述顆粒包含: 具有在微米或納米范圍內的維度的小體；和 與所述小體結合的用于催化游離脂肪酸(FFA)至脂肪酸酯的轉化和任選地用于額外地催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化的催化裝置， 其中所述催化顆粒適用于催化包含按重量計至少10%的FFA的組合物中的至少80%的FFA至脂肪酸酯的轉化。
9.權利要求8所述的微米或納米尺寸的催化顆粒，其中所述顆粒為磁性顆粒，所述小體包含: 外殼；和 被所述外殼至少部分封裝的磁性核心， 其中與所述小體結合的催化裝置是固定在所述外殼上的催化實體，用于催化FFA至脂肪酸酯的轉化，和任選地用于額外地催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化。
10.權利要求9所述的微米或納米尺寸的催化顆粒，其中所述磁性核心包含多個具有5至20nm的平均尺寸或直徑的磁性納米尺寸的顆粒。
11.權利要求9所述的微米或納米尺寸的催化顆粒，其中所述外殼為二氧化硅殼或聚合物殼的至少一種，所述聚合物殼制造自:由聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯)(PGMA)、聚苯乙烯(PS)和聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)組成的聚合物的組。
12.權利要求9所述的微米或納米尺寸的催化顆粒，其中所述催化實體選自無機酸基團或酶的至少一種。
13.權利要求11所述的微米或納米尺寸的催化顆粒，其中所述催化實體通過接頭固定在所述聚合物殼上，所述接頭選自含環氧化物官能團接頭、含胺官能團接頭、含醛官能團接頭、含苯官能團接頭、含酯官能團接頭及其混合物。
14.權利要求12所述的微米或納米尺寸的催化顆粒，其中所述顆粒具有10至500mg酶/顆粒的單位載荷或0.1至3mmol H+/克顆粒的單位載荷。
15.權利要求8所述的微米或納米尺寸的催化顆粒，其中所述微米或納米尺寸的催化顆粒為微生物的細胞，所述顆粒的小體為細胞的小體，并且與所述小體結合的催化裝置是在細胞的小體中產生的或從細胞的小體產生的酶，其用于催化FFA至脂肪酸酯的轉化和任選地用于額外地催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化。
16.權利要求15所述的微米或納米尺寸的催化顆粒，其中所述重組微生物包含編碼酶的核酸序列，所述核酸序列與SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.5具有至少80%的同源性/同一 性

17.產生微米或納米尺寸的催化顆粒的方法，所述方法包括: 形成磁性核心； 用外殼封裝磁性核心的至少一部分；和 將催化實體固定在所述外殼上， 其中所述催化實體適用于催化包含按重量計至少10%的FFA的組合物中的至少80%的FFA至脂肪酸酯的轉化，和任選地額外地催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化。
18.權利要求17所 述的方法，其中形成磁性核心的步驟包括形成多個具有5至20nm的平均尺寸或直徑的磁性納米尺寸的顆粒。
19.權利要求18所述的方法，其中形成多個磁性納米尺寸顆粒的步驟包括共沉淀以獲得所述磁性納米尺寸顆粒。
20.權利要求17所述的方法，其中所述外殼包括聚合物殼并且利用聚合物殼封裝所述磁性核心的至少一部分的步驟包括: 將所述磁性核心與所述聚合物殼的一個或多個單體前體混合；和 將所述單體前體聚合以形成封裝所述磁性核心的至少一部分的聚合物殼。
21.權利要求17所述的方法,其中所述外殼包括二氧化娃殼并且利用二氧化娃殼封裝所述磁性核心的至少一部分的步驟包括: 將所述磁性核心與烷基硅酸鹽、堿和醇混合以獲得混合物；和 從所述混合物的沉淀形成封裝所述磁性核心的至少一部分的二氧化硅殼。
22.權利要求17所述的方法，其中將催化實體固定至所述外殼的步驟包括: (i)將催化實體與所述外殼的與催化實體有化學反應性的官能團共價偶聯，以將催化實體固定至所述外殼；或 (?)用與催化實體有化學反應性的官能團官能化所述外殼的表面；和將催化實體共價地或非共價地與所述官能團偶聯以將催化實體固定至所述外殼。
23.獲得用于從包含甘油酯和按重量計至少10%的游離脂肪酸(FFA)的組合物產生脂肪酸酯的細胞催化劑的方法，所述方法包括: a.從產生水解酶的微生物的文庫鑒定微生物的菌株，所述鑒定的微生物菌株相較于所述文庫中至少50%的其它微生物菌株能夠催化更多的FFA至脂肪酸酯的轉化，和任選地能夠額外地催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化； b.從步驟a)中鑒定的菌株鑒定水解酶的基因序列，所述水解酶能夠催化FFA至脂肪酸酯的轉化和任選地能夠額外地催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化；和 c.將所述基因序列引入宿主細胞以獲得重組宿主細胞，所述重組宿主細胞能夠在大體上相似的條件下以比步驟a)中鑒定的微生物的菌株更多的量表達所述水解酶， 其中所述重組宿主細胞能夠催化包含按重量計至少10%的FFA的組合物中的至少80%的FFA至脂肪酸酯的轉化，和任選地能夠額外地催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化。
24.從混合物分離多個權利要求1中所述的微米或納米尺寸的催化顆粒的方法，所述方法包括: 施加外部磁場或離心力以使所述催化顆粒聚集在一起；和 從聚集的催化顆粒除去所述混合物的其余部分。
25.從包含甘油酯和按重量計至少10%的游離脂肪酸(FFA)的組合物產生脂肪酸酯的方法，所述方法包括: 將由權利要求24的方法獲得的多個微米或納米尺寸的催化顆粒與所述組合物溫育以催化FFA至脂肪酸酯的轉化，以便至少80%的FFA轉化為脂肪酸酯，和任選地額外地催化甘油酯至脂肪酸酯的轉化。
【文檔編號】C08G63/48GK104080897SQ201280056907
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2012年10月1日 優先權日:2011年9月30日
【發明者】李智, N·P·T·南高, 王文, Z·茲里拉, 陳國威, 李愛濤, 閻金勇 申請人:新加坡國立大學