酶解法分離高分子量肝素鈉的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶解法分解高分子量肝素鈉的方法，使肝素鈉精品分子量在15000-19000道爾頓之間，并且8000-16000道爾頓的分子量比例與16000-24000道爾頓之間分子量比例的比值不小于1.0。技術(shù)方案是采用酶解過程中調(diào)節(jié)胰蛋白酶和胃蛋白酶的用量將肝素鈉中的大分子量肝素鈉分解，再通過乙醇多次沉淀、氧化的精制步驟來實現(xiàn)肝素鈉與其他核糖核酸等雜質(zhì)徹底分離，肝素鈉精品收率達到90％以上，Xa效價與IIa效價比值為0.9-1.1其他質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均符合中國藥典、美國藥典、英國藥典及西歐藥典規(guī)定。
【專利說明】酶解法分離高分子量肝素鈉的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說涉及把高分子量肝素鈉分解為低分子量肝素鈉產(chǎn)品的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肝素鈉是從豬小腸粘膜中提取的一種生化藥品，是手術(shù)中不可替代的、挽救生命的、市場不能斷檔的首選藥物。自二十世紀(jì)四十年代用于臨床以來，其應(yīng)用范圍不斷擴大，尤其是二十世紀(jì)九十年代以來，該產(chǎn)品臨床主要用于防止血栓形成，治療心血管病、血液病、尿毒癥等。西方國家已開始研究肝素鈉對癌癥的防治作用，其新用途不斷增加。
[0003]進入二十世紀(jì)七十年代以來，我國肝素鈉生產(chǎn)工藝不斷改進，成為世界肝素鈉產(chǎn)量最大的國家。國際市場的肝素鈉產(chǎn)品有70%以上來自中國。肝素鈉精品生產(chǎn)已由高錳酸鉀氧化法發(fā)展到雙氧水氧化法，結(jié)合醇洗分離法，將大量的雜質(zhì)用乙醇帶走。2008年2月11日，美國因注射肝素鈉出現(xiàn)4例死亡，350多例不良反應(yīng)，成為轟動世界的“肝素鈉事件”。因此美國藥監(jiān)局每年都對肝素鈉的標(biāo)準(zhǔn)提升，明年將肝素鈉分子量的標(biāo)準(zhǔn)提升。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種酶解法分解肝素鈉中的高分量的方法，
[0005]本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn):
[0006]一種酶解法分解肝素鈉中的高分子量的方法，其特征在于:調(diào)節(jié)胰蛋白酶和胃蛋白酶的用量以及分次時間將肝素鈉中的大分子量肝素鈉分解
[0007]在發(fā)明的技術(shù)方案中，還具有以下技術(shù)特征:所述方法包括如下步驟:
[0008]一、提取
[0009]1、粗品溶解:
[0010]開啟水閥，加入飲用水，再將肝素鈉粗品加入到反應(yīng)罐中，邊攪邊加，按原料與飲用水1: ￠-7)比例溶解，攪拌5-10小時至全部溶解；
[0011]2、酶解:
[0012]將上一步溶解液，先用鹽酸溶液調(diào)PH7.0-8.0，升溫至50_55°C之間時加入胃蛋白酶5-10g /億單位，再加入10-20g /億單位胰酶，50-55°C保溫4小時，4小時后，再加胃蛋白酶3-5g /億單位，同時加入5-10g /億單位的胰蛋白酶，50°C繼續(xù)保溫4小時；
[0013]3、急升溫:
[0014]將上一步酶解液在30-40分鐘內(nèi)升溫至85-90°C，靜止10-30分鐘，開攪拌，通入循環(huán)水降溫，待溫度降至50-55°C時，用2-6mol / L氫氧化鈉溶液調(diào)PH10.0-12.0，靜止分層20-30小時；
[0015]4、底部沉淀的雜質(zhì)離心:
[0016]虹吸上清，用40-100目濾袋過濾，過濾后的溶液分為上清液和下層沉淀，留上清液待沉淀，下層沉淀放離心機離心，離心后留上層離心液；[0017]二、精制
[0018]1、第一次沉淀:
[0019]待上述上清液和離心液溫度降至20-30°C，加入20-30g / L氯化鈉，攪拌溶解后，用鹽酸將濾液調(diào)PH10.0-12.0，邊攪邊加濃度為95-97 %的乙醇溶液，使得乙醇的濃度在20°C時達到45-50%，沉淀10-12小時；
[0020]2、第一次氧化:棄去上層廢乙醇，下層沉淀物用純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)PH10.0-12.0，然后加入體積3-5%雙氧水，氧化10-12小時；
[0021]3、第二次沉淀:溶液加入20_30g / L氯化鈉，攪拌溶解后，用鹽酸溶液調(diào)將溶液PH6.0-7.0，邊攪邊加濃度為95-97%的乙醇溶液，使得乙醇的濃度在20°C時達到45-50%，沉淀10-12小時；
[0022]4、第二次氧化:棄去上層廢乙醇，下層沉淀物用純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)PH10.0-12.0，然后加入體積3-5%雙氧水，氧化10-12小時；
[0023]5、第三次沉淀:溶液加入20_30g / L氯化鈉，用鹽酸溶液將溶液調(diào)PH10.0-12.0，邊攪邊加濃度為95-97%的乙醇溶液，使得乙醇的濃度在20°C時達到45-50%，沉淀10-12小時；
[0024]6、第三次氧化:棄去上層廢乙醇，下層沉淀物用純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)PH10.0-12.0，然后加入體積3-5%雙氧水，氧化10-12小時；
[0025]7、第四次沉淀:上一步溶液若有沉淀物析出，則用離心機離心，沒有析出則直接加入20-30g / L氯化鈉，用鹽酸溶液將溶液調(diào)PH6.0-7.0，將溶液放冷庫中冷凍至-10 V —5 °C，邊攪邊加-10 °C —5 °C的丙酮，使得丙酮占溶液的質(zhì)量百分含量為40-45%,-50C -0°C保溫24-30小時，然后將廢丙酮棄去，留底部沉淀物用純化水溶解，溶液再加入20-30g / L氯化鈉，用鹽酸溶液調(diào)將溶液PH6.0-7.0，邊攪邊加乙醇，使乙醇濃度在20°C時為45-50%，沉淀10-12小時；
[0026]8、將沉淀物用純化水按2-5L /億單位溶解后，用孔徑0.22-0.3微米濾膜板框機微濾，用乙醇沉淀，使乙醇濃度達75-80%，再加入23-26%的氯化鈉溶液，每I升溶液加6-10ml氯化鈉溶液，靜止沉淀10-12小時；
[0027]9、將上層乙醇棄去，加入無水乙醇脫水，邊攪邊加，使乙醇濃度為97-99%，靜止24-30小時，棄去上層乙醇，將不銹鋼砂芯棒放在產(chǎn)品中，用真空泵通過管道和過濾瓶把剩余乙醇抽干，待干燥；
[0028]10、將抽干的產(chǎn)品均勻放置在不銹鋼盤中，放在真空干燥箱中抽真空，用循環(huán)水加溫，溫度35-60。。，烘干70-80小時；
[0029]11、包裝:將產(chǎn)品取出，稱重，使每包裝袋5kg，用封口機封口，放在鋁桶中待驗。
[0030]在發(fā)明的技術(shù)方案中，還具有以下技術(shù)特征:
[0031 ] I)、第四次沉淀后的溶液進行QA取樣化驗，測吸光度:260nm < 0.1 ；400nm< 0.02:
[0032]2)、分子量在15000-19000道爾頓之間，并且8000-16000道爾頓的分子量比例與16000-24000道爾頓之間分子量比例的比值不小于1.0 ；
[0033]3)、肝素鈉精品收率達到90%以上；
[0034]4)、Xa效價與IIa效價比值為0.9-1.1 ；[0035]5)、硫酸皮膚素的含量小于I %。
[0036]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是:
[0037]本發(fā)明的肝素鈉精品生產(chǎn)采用雙氧水氧化法，結(jié)合醇洗分離法，將大量的雜質(zhì)用乙醇帶走，再用丙酮萃取法將肝素鈉中的硫酸皮膚素去除，其精品收率達到90%以上，Xa效價與IIa效價比值為0.9-1.1，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)符合中國藥典、美國藥典、英國藥典及西歐藥典所規(guī)定的各項指標(biāo)。
[0038]肝素鈉與多硫酸軟骨素成功的徹底分離，為世界生物醫(yī)藥的發(fā)展作出貢獻；促進了國家的生豬生產(chǎn)；本產(chǎn)品每年出口在10個億以上，為國家出口創(chuàng)匯作出貢獻。又是一個支持三農(nóng)、變廢為寶，環(huán)境保護的好項目。
【具體實施方式】
[0039]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0040]實施例1
[0041]一、提取
[0042]1、粗品溶解:
[0043]開啟水閥，加入900L飲用水，再將150億單位肝素鈉粗品加入到反應(yīng)罐中，邊攪邊加，攪拌6小時后，用攪拌棒試底部是否全部溶解；
[0044]2、酶解:
[0045]將上一步溶解液，先用鹽酸溶液調(diào)PH7.5，升溫至53°C時加入胃蛋白酶1500g，再加入3000g胰酶，53°C保溫4小時，再加胃蛋白酶750g和胰蛋白酶1500g，繼續(xù)保溫4小時；
[0046]3、急升溫:
[0047]將上一步酶解液在35分鐘內(nèi)升溫至88°C，靜止15分鐘，開攪拌，通入循環(huán)水降溫，待溫度降至50°C時，用6mol / L氫氧化鈉溶液調(diào)PH11.0，靜止分層24小時；
[0048]4、底部沉淀的雜質(zhì)離心:
[0049]虹吸上清，用80目濾袋過濾，過濾后的溶液分為上清液和下層沉淀，留上清液待沉淀，下層沉淀放離心機離心，離心后留上層離心液；
[0050]二、精制
[0051]1、第一次沉淀:
[0052]待上述上清液和離心液溫度降至25°C，加入22.5kg氯化鈉，攪拌溶解后，用鹽酸將濾液調(diào)PH10.5，邊攪邊加濃度為95-97%的乙醇溶液920L，沉淀10小時；
[0053]2、第一次氧化:棄去上層廢乙醇，下層沉淀物即產(chǎn)品用640L純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)PHl1.0，然后加入20L雙氧水，氧化10小時；
[0054]3、第二次沉淀:溶液加入12.8kg氯化鈉，攪拌溶解后，用鹽酸溶液調(diào)將溶液PH6.0，邊攪邊加濃度為95-97%的乙醇溶液640L，沉淀10小時；
[0055]4、第二次氧化:棄去上層廢乙醇，下層沉淀物用640L純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)PHl1.0，然后加入20L雙氧水，氧化10小時；
[0056]5、第三次沉淀:溶液加入12.8kg氯化鈉，用鹽酸溶液將溶液調(diào)PH6.0，邊攪邊加濃度為95-97%的乙醇溶液640L，沉淀10小時；
[0057]6、第三次氧化:棄去上層廢乙醇，下層沉淀物用640L純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)PH l1.0，然后加入21L雙氧水，氧化10小時；
[0058]7、第四次沉淀:上一步溶液若有沉淀物析出，則用離心機離心，沒有析出則直接加入12.8kg氯化鈉，用鹽酸溶液將溶液調(diào)PH6.0,將溶液放冷庫中冷凍至-6°C，邊攪邊加-10°C的丙酮600L，_3°C保溫24小時，然后將廢丙酮棄去，留底部沉淀物用純化水溶解，溶液再加入12.8kg氯化鈉，用鹽酸溶液調(diào)將溶液PH6.0，邊攪邊加乙醇640L，沉淀10小時；
[0059]8、將沉淀物用300L純化水溶解后，用孔徑0.3微米濾膜板框機微濾，用840L乙醇沉淀，使乙醇濃度達75-80%，再加入26%的氯化鈉溶液11L，靜止沉淀10小時；
[0060]9、將上層乙醇棄去，加入500L無水乙醇脫水，邊攪邊加，使乙醇濃度為97-99%，靜止24小時，棄去上層乙醇，將不銹鋼砂芯棒放在產(chǎn)品中，用真空泵通過管道和過濾瓶把剩余乙醇抽干，待干燥；
[0061]10、將抽干的產(chǎn)品均勻放置在不銹鋼盤中，放在真空干燥箱中抽真空，用循環(huán)水加溫，溫度50°C，烘干72小時；
[0062]11、包裝:將產(chǎn)品取出，稱重，使每包裝袋5Kg，用封口機封口，放在鋁桶中待驗。
[0063]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種酶解分離法分解高分子量肝素鈉的方法，使肝素鈉精品分子量在15000-19000道爾頓之間，并且8000-16000道爾頓的分子量比例與16000-24000道爾頓之間分子量比例的比值不小于1.0。其特征在于:采用酶解過程中通過調(diào)節(jié)胰蛋白酶和胃蛋白酶的用量以及分次時間將肝素鈉中的大分子量肝素鈉分解。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于酶解過程中調(diào)節(jié)胰蛋白酶和胃蛋白酶的用量將肝素鈉中的大分子量肝素鈉分解。其步驟包括:一、提取I )、粗品溶解:開啟水閥，加入飲用水，再將肝素鈉粗品加入到反應(yīng)罐中，邊攪邊加，按原料與飲用水I: (6-7)比例溶解，攪拌5-10小時至全部溶解；2)、酶解:將上一步溶解液，先用鹽酸溶液調(diào)PH至7.0-8.0，升溫至50-55°C之間時加入胃蛋白酶5-10g /億單位，再加入10-20g /億單位胰酶，50-55°C保溫4小時，4小時后，再加胃蛋白酶3-5g /億單位， 同時加入5-10g /億單位的胰蛋白酶，50°C繼續(xù)保溫4小時；3)、急升溫:將上一步酶解液在30-40分鐘內(nèi)升溫至85-90°C，靜止10-30分鐘，開始攪拌，通入循環(huán)水降溫，待溫度降至50-55°C時，用2-6mol / L氫氧化鈉溶液調(diào)PH10.0-12.0，靜止分層20-30小時；4)、底部沉淀的雜質(zhì)離心:虹吸上清，用40-100目濾袋過濾，過濾后的溶液分為上清液和下層沉淀，留上清液待沉淀，下層沉淀放離心機離心，離心后留上層離心液；二、精制1)、第一次沉淀:待上述上清液和離心液溫度降至20-30°C，加入20-30g / L氯化鈉，攪拌溶解后，用鹽酸將濾液調(diào)PH10.0-12.0，邊攪邊加濃度為95-97%的乙醇溶液，使得乙醇的濃度在20°C時達到45-50%，沉淀10-12小時；2)、第一次氧化:棄去上層廢乙醇,下層沉淀物用純化水溶解,用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)PH10.0-12.0,然后加入體積3-5%雙氧水,氧化10-12小時；3)、第二次沉淀:溶液加入20-30g/ L氯化鈉，攪拌溶解后，用鹽酸溶液調(diào)將溶液PH6.0-7.0，邊攪邊加濃度為95-97%的乙醇溶液，使得乙醇的濃度在20°C時達到45-50%，沉淀10-12小時；4)、第二次氧化:棄去上層廢乙醇,下層沉淀物用純化水溶解,用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)PH10.0-12.0,然后加入體積3-5%雙氧水,氧化10-12小時；5)、第三次沉淀:溶液加入20-30g/ L氯化鈉，用鹽酸溶液將溶液調(diào)PH10.0-12.0，邊攪邊加濃度為95-97%的乙醇溶液，使得乙醇的濃度在20°C時達到45-50%，沉淀10-12小時；6)、第三次氧化:棄去上層廢乙醇，下層沉淀物用純化水溶解，用氫氧化鈉溶液將溶液調(diào)PH10.0-12.0,然后加入體積3-5%雙氧水,氧化10-12小時；7)、第四次沉淀:上一步溶液若有沉淀物析出，則用離心機離心，沒有析出則直接加入20-30g / L氯化鈉，用鹽酸溶液將溶液調(diào)PH6.0-7.0，將溶液放冷庫中冷凍至_10°C —5°C，邊攪邊加-10°C —5°C的丙酮，使得丙酮占溶液的質(zhì)量百分含量為40-45%，-50C -(TC保溫24-30小時，然后將廢丙酮棄去，留底部沉淀物用純化水溶解，溶液再加入20-30g / L氯化鈉，用鹽酸溶液調(diào)將溶液PH6.0-7.0，邊攪邊加乙醇，使乙醇濃度在20°C時為45-50%，沉淀10-12小時； 8)、將沉淀物用純化水按2-5L/億單位溶解后，用孔徑0.22-0.3微米濾膜板框機微濾，用乙醇沉淀，使乙醇濃度達75-80%，再加入23-26%的氯化鈉溶液，每I升溶液加6-10ml氯化鈉溶液，靜止沉淀10-12小時； 9)、將上層乙醇棄去，加入無水乙醇脫水，邊攪邊加，使乙醇濃度為97-99%，靜止24-30小時，棄去上層乙醇，將不銹鋼砂芯棒放在產(chǎn)品中，用真空泵通過管道和過濾瓶把剩余乙醇抽干，待干燥； 10)、將抽干的產(chǎn)品均勻放置在不銹鋼盤中，放在真空干燥箱中抽真空，用循環(huán)水加溫，溫度35-60。。，烘干70-80小時； 11)、包裝:將產(chǎn)品取出，稱重，使每包裝袋5kg，用封口機封口，放在鋁桶中待驗。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶解法分離肝素鈉中的高分子量的方法，其特征在于:第四次沉淀后的溶液進行QA取樣化驗，測吸光度:260nm < 0.1 ；400nm < 0.02。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶解法分離肝素鈉中的高分子量的方法，其特征在于:分子量在15000-19000道爾頓之間，并且8000-16000道爾頓的分子量比例與16000-24000道爾頓之間分子量比例的比值不小于1. 0。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶解法分離肝素鈉中的高分子量的方法，其特征在于:肝素鈉精品收率達到90%以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶解法分離肝素鈉中的高分子量的方法，其特征在于:Xa效價與IIa效價比值為0.9-1.1。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶解法分離肝素鈉中的高分子量的方法，其特征在于:硫酸皮膚素的含量小于I %。
【文檔編號】C08B37/10GK103450370SQ201310400474
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月31日
【發(fā)明者】劉乃山, 遲培升, 夏襯來, 劉汝榮 申請人:青島九龍生物醫(yī)藥有限公司