小麥麩皮活性多糖的提取純化方法
【專利摘要】本發明屬于小麥麩皮深加工【技術領域】，尤其涉及一種小麥麩皮活性多糖的提取純化方法，其步驟包括：預處理、脫脂、多糖提取和粗多糖精制，最后對提取的粗品和純化后組分的得率、化學組成以及免疫調節活性進行了分析。本發明小麥麩皮活性多糖的提取純化方法，是利用水提醇沉法制得小麥麩皮多糖粗品，再利用瓊脂糖凝膠柱純化得到具有免疫調節活性的多糖，其提取方法簡單，運行成本低，所得的小麥麩皮粗多糖其得率為5.0%，經過純化小麥麩皮活性多糖其得率為5.6%，且具有較強的免疫調節活性。
【專利說明】小麥麩皮活性多糖的提取純化方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于小麥麩皮深加工【技術領域】，尤其涉及一種小麥麩皮活性多糖的提取純化方法。
【背景技術】[0002]小麥麩皮是小麥制面粉過程中提取小麥粉和胚芽后的殘留部分，是小麥面粉廠的主要加工副產品，以皮層為主(包括果皮、種皮、珠心層和糊粉層)，混入少量的胚芽和未剝刮干凈的胚乳，通常占小麥重量的14%~19%，它含有非淀粉多糖、淀粉、脂肪、木質素、蛋白質、維生素、酚酸類化合物等多種成分。目前小麥麩皮除少許用于麥麩面筋、麥麩膳食纖維、木糖醇和阿魏酸提取外，主要用作飼料，經濟效益不高，而小麥麩皮中非淀粉多糖含量約為46%，所以很有必要對從小麥麩皮中提取純化多糖的方法進行研究，提高其經濟利用價值。
[0003]經對現有技術的文獻檢索發現，中國專利CN200910237352.8公開了一種具有抗腫瘤與免疫調節活性的小麥麩皮多糖及其提取方法，它是以木聚糖酶酶解小麥麩皮，得到阿拉伯木聚糖(或稱戊聚糖)為主的多糖產品，但利用酶提取成本高，不適合大規模生產應用，而且多糖沒有經過純化，粗品生物活性低。

【發明內容】

[0004]本發明旨在于克服現有技術的不足，提供了一種利用水提醇沉法制得小麥麩皮粗多糖，之后去除雜質，利用瓊脂糖凝膠柱純化得到具有免疫調節活性的小麥麩皮活性多糖的方法，提取方法簡單，運行成本低，純化得到的多糖生物活性高。
[0005]小麥麩皮活性多糖的提取純化方法，步驟如下:
a、預處理:將小麥麩皮去除雜質后，55~65°C烘干,研磨至30~60目；
b、脫脂:
(1)乙醇脫脂:
將經a步驟處理的小麥麩皮粉浸入為其重量5~15倍、純度為85%的乙醇中，在60~80°C加熱回流攪拌1.5~3h，冷卻至室溫繼續攪拌10~18h，去除液體，二次加入其重量5~15倍、純度為85%的乙醇，室溫攪拌3~7h，去除液體；
(2)丙酮脫脂:
將乙醇脫脂后的小麥麩皮中加入其重量2~8倍、純度為99%的丙酮溶液，攪拌30min后去除液體，在室溫自然揮發干燥12h，得到脫脂麩皮；
C、多糖提取:
將b步驟制得的脫脂麩皮加入其重量22~30倍的水，在70°C~90°C下加熱回流攪拌2~6h,取其液體,在加熱至50°C蒸發,至其濃縮為原體積的1/6~1/2止,再加入乙醇至乙醇濃度不低于75%，降溫至3~6°C靜置10~18h，后去除液體，在室溫自然揮發干燥10~18h，制得小麥麩皮粗多糖；d、小麥麩皮粗多糖精制:(1)去蛋白:
將C步驟所得的小麥麩皮粗糖加入其重量8~20倍的水，再加入其體積份數為1/6~1/2的Sevage試劑,攪拌20min,去除下層液體及絮狀沉淀物,在上層液體中加入乙醇至乙醇溶液濃度不小于75%，降溫至3~6°C靜置10~18h，去除液體，再分別用其重量25~45倍的無水乙醇、25~45倍的無水丙酮和25~45倍的無水乙醚逐次洗漆,再用0.45Mm的濾膜過濾，將其沉淀物在自然揮發干燥10~18h，制得小麥麩皮去蛋白多糖；
(2)去低分子量雜質:
將(I)步驟所得的小麥麩皮去蛋白多糖溶于其重量8~20倍的水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，凍干制得除雜質小麥麩皮粗多糖；
(3)吸附純化:
將(2)步驟得到的除雜質小麥麩皮粗多糖加入其重量為0.01~0.06倍的水、加熱至60°C溶解，注入DEAE-瓊脂糖凝膠柱中色譜分離，首先用蒸餾水控制流速1.5mL/min沖洗5h，再用0.5M NaCL以同樣流速繼續沖洗3h、同時開始收集解析液，2h后更換1.0M NaCL作為解析劑以同樣的流速洗滌I小時以上，后停止收集，所得的收集液即為小麥麩皮活性多糖溶液；
(4)去鹽: 將(3)步驟所得的小麥麩皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，凍干制得小麥麩皮活性多糖；
其中:Sevage是由氯仿和正丁醇按4~6:1的體積比混合制成；
進一步優化小麥麩皮活性多糖的提取純化方法，其步驟如下:
a、預處理:將小麥麩皮去除雜質后，60°C~65°C烘干,研磨至40~50目；
b、脫脂:
(1)乙醇脫脂:
將經a步驟處理的小麥麩皮粉浸入為其重量6~10倍、純度為85%的乙醇中，在65°C~75°C加熱回流攪拌2~2.5h，冷卻至室溫繼續攪拌12~16h，去除液體，二次加入其重量10~13倍、純度為85%的乙醇，室溫攪拌4~6h，去除液體；
(2)丙酮脫脂:
將乙醇脫脂后的小麥麩皮中加入其重量3~6倍、純度為99%的丙酮溶液，攪拌30min后去除液體，在室溫自然揮發干燥12h，得到脫脂麩皮；
C、多糖提取:
將b步驟制得的脫脂麩皮加入其重量24~28倍的水，在80°C~90°C下加熱回流攪拌3~5h,取其液體,在加熱至50°C蒸發,至其濃縮為原體積的1/5~1/3止,再加入乙醇至乙醇濃度不低于75%，降溫至4~5°C靜置12~16h，后去除液體，在室溫自然揮發干燥12h，制得小麥麩皮粗多糖；
d、小麥麩皮粗多糖精制:
(I)去蛋白:
將c步驟所得的小麥麩皮粗糖加入其重量10~15倍的水，再加入其體積份數為1/5~1/3的Sevage試劑,攪拌20min,去除下層液體及絮狀沉淀物,在上層液體中加入乙醇至乙醇溶液濃度不小于75%，降溫至4~5°C靜置12~16h，去除液體，再分別用其重量30~40倍的無水乙醇、30~40倍的無水丙酮和30~40倍的無水乙醚逐次洗漆,再用0.45μm的濾膜過濾，將其沉淀物在自然揮發干燥12h，制得小麥麩皮去蛋白多糖；
(2)去低分子量雜質:
將(I)步驟所得的小麥麩皮去蛋白多糖溶于其重量10~20倍的水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，凍干制得除雜質小麥麩皮粗多糖；
(3)吸附純化:
將(2)步驟得到的除雜質小麥麩皮粗多糖加入其重量為0.02~0.04倍的水、加熱至60°C溶解，注入DEAE-瓊脂糖凝膠柱中色譜分離，首先用蒸餾水控制流速1.5mL/min沖洗5h，再用0.5M NaCL以同樣流速繼續沖洗3h、同時開始收集解析液，2h后更換1.0M NaCL作為解析劑以同樣的流速洗滌I小時，后停止收集，所得的收集液即為小麥麩皮活性多糖溶液；
(4)去鹽:
將(3)步驟所得的小麥麩皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，凍干制得小麥麩皮活性多糖；
其中:Sevage是由氯仿和正丁醇按5~6:1的體積比混合制成。
[0006]作為本發明的進一步優化，步驟c中，所述的待蒸發的液體為脫脂麩皮連續進行I次以上加熱回流后合并的液體。
[0007]作為本發明的進一步優化，步驟d (I)中，所述的上層液體為2次以上經過加入Sevag試劑、攪拌并去除下層液體及絮狀沉淀物后合并的液體。
[0008]本發明小麥麩皮活性多糖的提取純化方法，是利用水提醇沉法制得小麥麩皮多糖粗品，再利用瓊脂糖凝膠柱純化得到具有免疫調節活性多糖的方法，提取方法簡單，運行成本低，所得的小麥麩皮粗多糖其得率為5.0%，經過吸附純化得到小麥麩皮活性多糖其得率為5.6%，具有較強的免疫調節活性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1小麥麩皮粗多糖與小麥麩皮活性多糖激活巨噬細胞生產一氧化氮量；
圖中，a，b，c代表同組內不同濃度處理間的差異性，相同字母表示無顯著性差異，不同
字母表示存在顯著性差異(P〈0.05)；
x, y, z代表不同組間相同濃度處理間的差異性，相同字母表示無顯著性差異，不同字母表示存在顯著性差異(P〈0.05)。
【具體實施方式】
[0010]實施例1
小麥麩皮活性多糖的提取純化方法，其進一步優化的操作步驟如下:
a、預處理:將小麥麩皮去除雜質后，60°C烘干，研磨至40~50目；
b、脫脂:
(I)乙醇脫脂:
將經a步驟處理的小麥麩皮粉浸入為其重量6倍、純度為85%的乙醇中，在75°C加熱回流攪拌2.5h，冷卻至室溫繼續攪拌16h，去除液體，二次加入其重量10倍、純度為85%的乙醇,室溫攪拌6h，去除液體；
(2)丙酮脫脂:
將乙醇脫脂后的小麥麩皮中加入其重量3倍、純度為99%的丙酮溶液，攪拌30min后去除液體，在室溫自然揮發干燥12h，得到脫脂麩皮；
C、多糖提取:
將b步驟制得的脫脂麩皮加入其重量24倍的水，在90°C下加熱回流攪拌3h，取其液體，在加熱至50°C蒸發,至其濃縮為原體積的1/5~1/3止,再加入乙醇至乙醇濃度不低于75%，降溫至5°C靜置12h，后去除液體，在室溫自然揮發干燥12h，制得小麥麩皮粗多糖；
d、小麥麩皮粗多糖精制:
(1)去蛋白:
將c步驟所得的小麥麩皮粗糖加入其重量15倍的水，再加入其體積份數為1/5~1/3的Sevage試劑，攪拌20min，去除下層液體及絮狀沉淀物，在上層液體中加入乙醇至乙醇溶液濃度不小于75%，降溫至4~5°C靜置12h，去除液體，再分別用其重量30倍的無水乙醇、40倍的無水丙酮和40倍的無水乙醚逐次洗漆,再用0.45Mm的濾膜過濾,將其沉淀物在自然揮發干燥12h，制得小麥麩皮去蛋白多糖；
(2)去低分子量雜質: 將(I)步驟所得的小麥麩皮去蛋白多糖溶于其重量20倍的水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，凍干制得除雜質小麥麩皮粗多糖；
(3)吸附純化:
將(2)步驟得到的除雜質小麥麩皮粗多糖加入其重量為0.04倍的水、加熱至60°C溶解，注入DEAE-瓊脂糖凝膠柱中色譜分離，首先用蒸餾水控制流速1.5mL/min沖洗5h，再用
0.5M NaCL以同樣流速繼續沖洗3h、同時開始收集解析液，2h后更換1.0M NaCL作為解析劑以同樣的流速洗滌I小時以上，后停止收集，收集液即為小麥麩皮活性多糖溶液；
(4)去鹽:
將(3)步驟所得的小麥麩皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，凍干制得小麥麩皮活性多糖。
[0011] 實施例2
小麥麩皮活性多糖的提取純化方法，其進一步優化的操作步驟如下:
a、預處理:將小麥麩皮去除雜質后，65°C烘干，研磨至40~50目；
b、脫脂:
(1)乙醇脫脂:
將經a步驟處理的小麥麩皮粉浸入為其重量10倍、純度為85%的乙醇中，在65°C加熱回流攪拌2h，冷卻至室溫繼續攪拌12h，去除液體，二次加入其重量13倍、純度為85%的乙醇,室溫攪拌4h，去除液體；
(2)丙酮脫脂:
將乙醇脫脂后的小麥麩皮中加入其重量6倍、純度為99%的丙酮溶液，攪拌30min后去除液體，在室溫自然揮發干燥12h，得到脫脂麩皮；
C、多糖提取:
將b步驟制得的脫脂麩皮加入其重量28倍的水，在80°C下加熱回流攪拌5h，取其液體，在加熱至50°C蒸發,至其濃縮為原體積的1/5~1/3止,再加入乙醇至乙醇濃度不低于75%，降溫至4°C靜置16h，后去除液體，在室溫自然揮發干燥12h，制得小麥麩皮粗多糖；
d、小麥麩皮粗多糖精制:
(1)去蛋白:
將c步驟所得的小麥麩皮粗糖加入其重量10倍的水，再加入其體積份數為1/5~1/3的Sevage試劑，攪拌20min，去除下層液體及絮狀沉淀物，在上層液體中加入乙醇至乙醇溶液濃度不小于75%，降溫至4~5°C靜置16h，去除液體，再分別用其重量40倍的無水乙醇、30倍的無水丙酮和30倍的無水乙醚逐次洗滌，再用0.45M?的濾膜過濾，將其沉淀物在自然揮發干燥12h，制得小麥麩皮去蛋白多糖；
(2)去低分子量雜質:
將(I)步驟所得的小麥麩皮去蛋白多糖溶于其重量20倍的水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，凍干制得除雜質小麥麩皮粗多糖；
(3)吸附純化:
將(2)步驟得到的除雜質小麥麩皮粗多糖加入其重量為0.02倍的水、加熱至60°C溶解，注入DEAE-瓊脂糖凝膠柱中色譜分離，首先用蒸餾水控制流速1.5mL/min沖洗5h，再用
0.5M NaCL以同樣流速繼續沖洗3h、同時開始收集解析液，2h后更換1.0M NaCL作為解析劑以同樣的流速洗滌I小時以上，后停止收集，收集液即為小麥麩皮活性多糖溶液；
(4)去鹽:
將(3)步驟所得的小麥麩皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，凍干制得小麥麩皮活性多糖。
[0012]實施例3
小麥麩皮活性多糖的提取純化方法，其進一步優化的操作步驟如下:
a、預處理:將小麥麩皮去除雜質后，60°C~65°C烘干,研磨至40~50目；
b、脫脂:
(1)乙醇脫脂:
將經a步驟處理的小麥麩皮粉浸入為其重量8倍、純度為85%的乙醇中，在68°C~72°C加熱回流攪拌2.3h，冷卻至室溫繼續攪拌14h，去除液體，二次加入其重量12倍、純度為85%的乙醇,室溫攪拌5h，去除液體；
(2)丙酮脫脂:
將乙醇脫脂后的小麥麩皮中加入其重量5倍、純度為99%的丙酮溶液，攪拌30min后去除液體，在室溫自然揮發干燥12h，得到脫脂麩皮；
C、多糖提取:
將b步驟制得的脫脂麩皮加入其重量26倍的水，在80°C~90°C下加熱回流攪拌4h，取其液體，在加熱至50°C蒸發,至其濃縮為原體積的1/5~1/3止,再加入乙醇至乙醇濃度不低于75%，降溫至5°C靜置14h，后去除液體，在室溫自然揮發干燥12h，制得小麥麩皮粗多糖；
d、小麥麩皮粗多糖精制:
(I)去蛋白:
將c步驟所得的小麥麩皮粗糖加入其重量12倍的水，再加入其體積份數為1/5~1/3的Sevage試劑，攪拌20min，去除下層液體及絮狀沉淀物，在上層液體中加入乙醇至乙醇溶液濃度不小于75%，降溫至5°C靜置14h，去除液體，再分別用其重量35倍的無水乙醇、35倍的無水丙酮和35倍的無水乙醚逐次洗滌，再用0.45M?的濾膜過濾，將其沉淀物在自然揮發干燥12h，制得小麥麩皮去蛋白多糖；
(2)去低分子量雜質:
將(I)步驟所得的小麥麩皮去蛋白多糖溶于其重量15倍的水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，凍干制得除雜質小麥麩皮粗多糖；
(3)吸附純化:
將(2)步驟得到的除雜質小麥麩皮粗多糖加入其重量為0.03倍的水、加熱至60°C溶解，注入DEAE-瓊脂糖凝膠柱中色譜分離，首先用蒸餾水控制流速1.5mL/min沖洗5h，再用
0.5M NaCL以同樣流速繼續沖洗3h、同時開始收集解析液，2h后更換1.0M NaCL作為解析劑以同樣的流速洗滌I小時以上，后停止收集，收集液即為小麥麩皮活性多糖溶液；
(4)去鹽:
將(3)步驟所得的小麥麩皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，凍干制得小麥麩皮活性多糖。
[0013]實施例4
小麥麩皮活性多糖的提取純 化方法，具體實施步驟如下:
a、預處理:首先對小麥麩皮原料進行挑選除雜，去除異物，之后在烘箱中55°C烘干，研磨過30目篩；
b、脫脂:
(1)乙醇脫脂:
將經a步驟處理的小麥麩皮粉50g中加入250mL85%乙醇，60°C加熱回流攪拌3h，冷卻后室溫攪拌10h。4000rpm離心20min，棄去乙醇，小麥麩皮中再加入250mL85%乙醇室溫攪拌3小時，離心后棄去乙醇，得乙醇脫脂麩皮；
(2)丙酮脫脂:
將乙醇脫脂后的小麥麩皮中加入IOOmL丙酮攪拌30min，離心后收集沉淀放到錫箔紙上在通風櫥中自然干燥，制得脫脂麩皮；
C、多糖提取:
取b步驟制得脫脂麩皮50g加入IlOOmL蒸餾水，70°C加熱回流攪拌6h，離心后收集液體，殘渣按照相同程序再提取一次，離心后合并兩次液體，50°C真空旋轉蒸發后濃縮到200mL,加入800mL無水乙醇,3°C沉淀10h,4000rpm離心IOmin,收集沉淀通風櫥中干燥,得到小麥麩皮粗多糖；
d、小麥麩皮粗多糖精制:
(I)去蛋白:
將c步驟制得的小麥麩皮粗多糖3g加入24mL蒸懼水,之后加入Sevage試劑4mL,磁力攪拌器上高速攪拌20min,靜置IOmin后4000rpm離心20min,棄去下層有機相和沉淀蛋白，取上層多糖溶液再加入Sevge試劑重復三次，上層溶液加入80mL無水乙醇，3°C沉淀IOh,離心后取沉淀,再分別用75ml無水乙醇、75ml無水丙酮和75ml無水乙醚逐次洗漆,再用0.45Mm的濾膜過濾,沉淀在通風櫥中干燥12h,制得小麥麩皮去蛋白多糖；(2)去低分子量雜質:
將(I)步驟所得的小麥麩皮去蛋白多糖溶于24mL蒸餾水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，真空冷凍干燥制得除雜質小麥麩皮粗多糖；
(3)吸附純化:
將(2)步驟中得到的除雜質小麥麩皮粗多糖250mg中加入2.5 mL蒸餾水中，加熱至60°C溶解lOmin，注入DEAE-瓊脂糖凝膠柱中色譜分離，首先用蒸餾水控制流速1.5mL/min沖洗5h，再用0.5M NaCL以同樣流速繼續沖洗3h、同時開始收集解析液，2h后更換1.0MNaCL作為解析劑以同樣的流速洗滌I小時以上，后停止收集，所得的收集液即為小麥麩皮活性多糖溶液；
(4)去鹽: 將(3)步驟所得的小麥麩皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，凍干制得小麥麩皮活性多糖；
其中:Sevage是由氯仿和正丁醇按4: I的體積比混合制成。
[0014]實施例5
小麥麩皮活性多糖的提取純化方法，具體實施步驟如下:
a、預處理:首先對小麥麩皮原料進行挑選除雜，去除異物，之后在烘箱中65°C烘干，研磨過60目篩；
b、脫脂:
(1)乙醇脫脂:
將經a步驟處理的小麥麩皮粉50g中加入750mL85%乙醇，80°C加熱回流攪拌1.5h，冷卻后室溫攪拌18h。4000rpm離心20min，棄去乙醇，小麥麩皮中再加入750mL85%乙醇室溫攪拌7小時，離心后棄去乙醇，得乙醇脫脂麩皮；
(2)丙酮脫脂:
將乙醇脫脂后的小麥麩皮中加入400mL丙酮攪拌30min，離心后收集沉淀放到錫箔紙上在通風櫥中自然干燥，制得脫脂麩皮；
C、多糖提取:
取b步驟制得脫脂麩皮50g加入1500mL蒸餾水，90°C加熱回流攪拌2h，離心后收集上清液，殘渣按照相同程序再提取一次，離心后合并兩次上清液，50°C真空旋轉蒸發后濃縮到750mL,加入2.3L無水乙醇，6°C沉淀18h, 4000rpm離心IOmin,收集沉淀通風櫥中干燥,得到小麥麩皮粗多糖；；
d、小麥麩皮粗多糖精制:
(1)去蛋白:將c步驟制得的小麥麩皮粗多糖3g加入到60mL蒸餾水中，之后加入Sevage試劑30mL,磁力攪拌器上高速攪拌20min,靜置IOmin后4000rpm離心20min,棄去下層有機相和沉淀蛋白，取上層多糖溶液再加入Sevge試劑重復三次，上層溶液加入180mL無水乙醇，6°C沉淀18h,離心后取沉淀,再分別用135ml無水乙醇、135ml無水丙酮和135ml無水乙醚逐次洗滌，再用0.45Mfli的濾膜過濾，沉淀在通風櫥中干燥12h，制得小麥麩皮去蛋白多糖；
(2)去低分子量雜質:
取(I)步驟所得的小麥麩皮去蛋白多糖溶于66mL蒸餾水，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，真空冷凍干燥制得除雜質小麥麩皮粗多糖；
(3)吸附純化:
去d步驟中得到的除雜質小麥麩皮粗多糖250mg中加入15 mL蒸懼水,加熱至60°C溶解lOmin，注入DEAE-瓊脂糖凝膠柱中色譜分離，首先用蒸餾水控制流速1.5mL/min沖洗5h，再用0.5M NaCL以同樣流速繼續沖洗3h、同時開始收集解析液，2h后更換1.0M NaCL作為解析劑以同樣的流速洗滌I小時以上，后停止收集，所得的收集液即為小麥麩皮活性多糖溶液；
(4)去鹽:
將(3)步驟所得的小麥麩皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，凍干制得小麥麩皮活性多糖；
其中:Sevage是由氯仿和正丁醇按6: I的體積比混合制成。
[0015]實施例6
小麥麩皮活性多糖的提取純化方法，具體實施步驟如下:
a、預處理:首先對小麥麩皮原料進行挑選除雜，去除異物，之后在烘箱中60°C烘干，研磨過40目篩；
b、脫脂:
(1)乙醇脫脂:
將經a步驟處理的小麥麩皮粉50g中加入300mL85%乙醇，65°C加熱回流攪拌2.5h，冷卻后室溫攪拌12h。4000rpm離心20min，棄去乙醇，小麥麩皮中再加入500mL85%乙醇室溫攪拌4小時，離心后棄去乙醇，得乙醇脫脂麩皮；
(2)丙酮脫脂:
將乙醇脫脂后的小麥麩皮中加入150mL丙酮攪拌30min，離心后收集沉淀放到錫箔紙上在通風櫥中自然干燥，制得脫脂麩皮；
C、多糖提取:
取b步驟制得脫脂麩皮50g加入1200mL蒸餾水，80°C加熱回流攪拌5h。離心后收集液體，殘渣按照相同程序再提取一次，離心后合并兩次液體，50°C真空旋轉蒸發后濃縮到400mL,加入1.6L無水乙醇，4°C沉淀12h, 4000rpm離心lOmin,收集沉淀通風櫥中干燥,得到小麥麩皮粗多糖；
d、小麥麩皮粗多糖精制:
(1)去蛋白:將c步驟制得的小麥麩皮粗多糖3g加入30mL蒸懼水,之后加入Sevage試劑5mL,磁力攪拌器上高速攪拌20min,靜置IOmin后4000rpm離心20min,棄去下層有機相和沉淀蛋白，取上層多糖溶液再加入Sevge試劑重復三次。上層溶液加入90mL無水乙醇，3°C沉淀12h,離心后取沉淀,再分別用90ml無水乙醇、90ml無水丙酮和90ml無水乙醚洗漆后，再用0.45M?的濾膜過濾，沉淀在通風櫥中干燥12h，制得小麥麩皮去蛋白多糖；
(2)去低分子量雜質:
將(I)步驟所得的小麥麩皮去蛋白多糖溶于30mL蒸餾水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，真空冷凍干燥制得除雜質小麥麩皮粗多糖；
(3)吸附純化:
將(2)步驟中得到的除雜質小麥麩皮粗多糖250mg中加入5 mL蒸餾水，加熱至60°C溶解lOmin，注入DEAE-瓊脂糖凝膠柱中色譜分離，首先用蒸餾水控制流速1.5mL/min沖洗5h，再用0.5M NaCL以同樣流速繼續沖洗3h、同時開始收集解析液，2h后更換1.0M NaCL作為解析劑以同樣的流速洗滌I小時以上，后停止收集，所得的收集液即為小麥麩皮活性多糖溶液；
(4)去鹽:
將(3)步驟所得的小麥麩皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，凍干制得小麥麩皮活性多糖；
其中:Sevage是由氯仿和正丁醇按5: I的體積比混合制成。
[0016]實施例7
小麥麩皮活性多糖的提取純化方法，具體實施步驟如下:
a、預處理:首先對小麥麩皮原料進行挑選除雜，去除異物，之后在烘箱中65°C烘干，研磨過50目篩；
b、脫脂:
(1)乙醇脫脂:
將經a步驟處理的小麥麩皮粉50g加入到500mL85%乙醇中，75°C加熱回流攪拌2 h，冷卻后室溫攪拌16h, 4000rpm離心20min,棄去乙醇，小麥麩皮中再加入650mL85%乙醇室溫攪拌7小時，離心后棄去乙醇，得乙醇脫脂麩皮；
(2)丙酮脫脂:
將乙醇脫脂后的小麥麩皮中加入300mL丙酮攪拌30min，離心后收集沉淀放到錫箔紙上在通風櫥中自然干燥，制得脫脂麩皮；
C、多糖提取:
取b步驟制得物質A 50g加入到1400mL蒸餾水中，90°C加熱回流攪拌3h。離心后收集液體，殘渣按照相同程序再提取一次，離心后合并兩次液體，50°C真空旋轉蒸發后濃縮到280mL,加入1.0無水乙醇，5°C沉淀16h, 4000rpm離心lOmin,收集沉淀通風櫥中干燥,得到小麥麩皮粗多糖；
d、小麥麩皮粗多糖精制:
(1)去蛋白:將c步驟制得的小麥麩皮粗多糖3g加入45mL蒸懼水,之后加入Sevage試劑23mL,磁力攪拌器上高速攪拌20min,靜置IOmin后4000rpm離心20min,棄去下層有機相和沉淀蛋白，取上層多糖溶液再加入Sevge試劑重復三次，上層溶液加入180mL無水乙醇，6°C沉淀16h,離心后取沉淀,再分別用120ml無水乙醇、120ml無水丙酮和120ml無水乙醚洗滌后，再用0.45M?的濾膜過濾，沉淀在通風櫥中干燥12h，制得小麥麩皮去蛋白多糖；
(2)去低分子量雜質:
將(I)步驟所得的小麥麩皮去蛋白多糖溶于60mL蒸餾水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，真空冷凍干燥制得除雜質小麥麩皮粗多糖；
(3)吸附純化:
將(2)步驟中得到的除雜質小麥麩皮粗多糖250mg中加入10 mL蒸餾水，加熱至60°C溶解lOmin，注入DEAE-瓊脂糖凝膠柱中色譜分離，首先用蒸餾水控制流速1.5mL/min沖洗5h，再用0.5M NaCL以同樣流速繼續沖洗3h、同時開始收集解析液，2h后更換1.0M NaCL作為解析劑以同樣的流速洗滌I小時以上，后停止收集，所得的收集液即為小麥麩皮活性多糖溶液；
(4)去鹽:
將(3)步驟所得的小麥麩皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，凍干制得小麥麩皮活性多糖；
其中:Sevage是由氯仿和正丁醇按6: I的體積比混合制成。
[0017]實施例8
小麥麩皮活性多糖的提取純化方法，具體實施步驟如下:
a、預處理:首先對小麥麩皮原料進行挑選除雜，去除異物，之后在烘箱中60°C烘干，研磨過40目篩；
b、脫脂:
(1)乙醇脫脂:
將經a步驟處理的小麥麩皮粉50g加入到500mL85%乙醇中，70°C加熱回流攪拌2小時，冷卻后室溫攪拌過夜。4000rpm離心20min,棄去乙醇,小麥麩皮中再加入500mL85%乙醇室溫攪拌5小時，離心后棄去乙醇，得乙醇脫脂麩皮；
(2)丙酮脫脂:
將乙醇脫脂后的小麥麩皮中 加入200mL丙酮攪拌30min，離心后收集沉淀放到錫箔紙上在通風櫥中自然干燥，制得脫脂麩皮；
C、多糖提取:
取b步驟制得脫脂麩皮50g中加入1250mL蒸餾水，90°C加熱回流攪拌4h，離心后收集液體，殘渣按照相同程序再提取一次，離心后合并兩次液體，50°C真空旋轉蒸發后濃縮到400mL,加入1.6L無水乙醇，4°C沉淀12h, 4000rpm離心lOmin,收集沉淀通風櫥中干燥,得到小麥麩皮粗多糖；
d、小麥麩皮粗多糖精制:
(1)去蛋白:
將c步驟制得的小麥麩皮粗多糖3g加入30mL蒸懼水,之后加入Sevage試劑6mL,,磁力攪拌器上高速攪拌20min,靜置IOmin后4000rpm離心20min,棄去下層有機相和沉淀蛋白，取上層多糖溶液再加入Sevge試劑重復三次，上層溶液加入120mL無水乙醇，4°C沉淀12h，離心后取沉淀，再分別用100 mL無水乙醇、100 mL無水丙酮和100 mL無水乙醚逐次洗漆，再用0.45M?的濾膜過濾，沉淀在通風櫥中干燥12h，制得小麥麩皮去蛋白多糖；
(2)去低分子量雜質:
將(I)步驟所得的小麥麩皮去蛋白多糖溶于溶于50mL蒸餾水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，真空冷凍干燥制得除雜質小麥麩皮粗多糖；
(3)吸附純化:
將(2)步驟中得到的除雜質小麥麩皮粗多糖250mg中加入IOmL蒸餾水，加熱至60V溶解IOmin注入DEAE-瓊脂糖凝膠柱中色譜分離，首先用蒸餾水控制流速1.5mL/min沖洗5h，再用0.5M NaCL以同樣流速繼續沖洗3h、同時開始收集解析液，2h后更換1.0M NaCL作為解析劑以同樣的流速洗滌I小時以上，后停止收集，所得的收集液即為小麥麩皮活性多糖溶液；
(4)去鹽:將(3)步驟所得的小麥麩皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，凍干制得小麥麩皮活性多糖；其中:Sevage是由氯仿和正丁醇按5: I的體積比混合制成。
[0018]
【權利要求】
1.小麥麩皮活性多糖的提取純化方法，其步驟如下: a、預處理:將小麥麩皮去除雜質后，55~65°C烘干,研磨至30~60目； b、脫脂: (1)乙醇脫脂: 將經a步驟處理的小麥麩皮粉浸入為其重量5~15倍、純度為85%的乙醇中，在60~80°C加熱回流攪拌1.5~3h，冷卻至室溫繼續攪拌10~18h，去除液體，二次加入其重量5~15倍、純度為85%的乙醇，室溫攪拌3~7h，去除液體； (2)丙酮脫脂: 將乙醇脫脂后的小麥麩皮中加入其重量2~8倍、純度為99%的丙酮溶液，攪拌30min后去除液體，在室溫自然揮發干燥12h，得到脫脂麩皮； C、多糖提取: 將b步驟制得的脫脂麩皮加入其重量22~30倍的水，在70°C~90°C下加熱回流攪拌2~6h,取其液體,在加熱至50°C蒸發,至其濃縮為原體積的1/6~1/2止,再加入乙醇至乙醇濃度不低于75%，降溫至3~6°C靜置10~18h后去除液體，在室溫自然揮發干燥10~18h，制得小麥麩皮粗多糖； d、小麥麩皮粗多糖精制: (1)去蛋白: 將c步驟所得的小麥麩皮粗糖加入其重量8~20倍的水，再加入其體積份數為1/6~1/2的Sevage試劑,攪拌20min,去除下層液體及絮狀沉淀物,在上層液體中加入乙醇至乙醇溶液濃度不小于75%，降溫至3~6°C靜置10~18h，去除液體，再分別用其重量25~45倍的無水乙醇、25~45倍的無水丙酮和25~45倍的無水乙醚逐次洗漆,再用0.45Mm的濾膜過濾，將其沉淀物在自然揮發干燥10~18h，制得小麥麩皮去蛋白多糖； (2)去低分子量雜質: 將(I)步驟所得的小麥麩皮去蛋白多糖溶于其重量8~20倍的水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，凍干制得除雜質小麥麩皮粗多糖； (3)吸附純化: 將(2)步驟得到的除雜質小麥麩皮粗多糖加入其重量為0.01~0.06倍的水、加熱至60°C溶解，注入DEAE-瓊脂糖凝膠柱中色譜分離，首先用蒸餾水控制流速1.5mL/min沖洗5h，再用0.5M NaCL以同樣流速繼續沖洗3h，同時開始收集解析液，2h后更換1.0M NaCL作為解析劑以同樣的流速洗滌I小時以上，后停止收集，收集液即為小麥麩皮活性多糖溶液； (4)去鹽: 將(3)步驟所得的小麥麩皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，凍干制得小麥麩皮活性多糖。
2.根據權利要求1所述的小麥麩皮活性多糖的提取純化方法，其特征在于操作步驟如下: a、預處理:將小麥麩皮去除雜質后，60°C~65°C烘干,研磨至40~50目； b、脫脂: (I)乙醇脫脂: 將經a步驟處理的小麥麩皮粉浸入為其重量6~10倍、純度為85%的乙醇中，在65°C~75°C加熱回流攪拌2~2.5h，冷卻至室溫繼續攪拌12~16h，去除液體，二次加入其重量10~13倍、純度為85%的乙醇，室溫攪拌4~6h，去除液體； (2)丙酮脫脂: 將乙醇脫脂后的小麥麩皮中加入其重量3~6倍、純度為99%的丙酮溶液，攪拌30min后去除液體，在室溫自然揮發干燥12h，得到脫脂麩皮； C、多糖提取: 將b步驟制得的脫脂麩皮加入其重量24~28倍的水，在80°C~90°C下加熱回流攪拌3~5h,取其液體,在加熱至50°C蒸發,至其濃縮為原體積的1/5~1/3止,再加入乙醇至乙醇濃度不低于75%，降溫至4~5°C靜置12~16h，后去除液體，在室溫自然揮發干燥12h，制得小麥麩皮粗多糖； d、小麥麩皮粗多糖精制: (1)去蛋白: 將c步驟所得的小麥麩皮粗糖加入其重量10~15倍的水，再加入其體積份數為1/5~1/3的Sevage試劑,攪拌20min,去除下層液體及絮狀沉淀物,在上層液體中加入乙醇至乙醇溶液濃度不小于75%，降溫至4~5°C靜置12~16h，去除液體，再分別用其重量30~40倍的無水乙醇、30~40倍的無水丙酮和30~40倍的無水乙醚逐次洗漆,再用0.45Mm的濾膜過濾，將其沉淀物在自然揮發干燥12h，制得小麥麩皮去蛋白多糖； (2)去低分子量雜質: 將(I)步驟所得的小麥麩皮去 蛋白多糖溶于其重量10~20倍的水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，凍干制得除雜質小麥麩皮粗多糖； (3)吸附純化: 將(2)步驟得到的除雜質小麥麩皮粗多糖加入其重量為0.02~0.04倍的水、加熱至60°C溶解，注入DEAE-瓊脂糖凝膠柱中色譜分離，首先用蒸餾水控制流速1.5mL/min沖洗5h，再用0.5M NaCL以同樣流速繼續沖洗3h、同時開始收集解析液，2h后更換1.0M NaCL作為解析劑以同樣的流速洗滌I小時以上，后停止收集，收集液即為小麥麩皮活性多糖溶液； (4)去鹽: 將(3)步驟所得的小麥麩皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，凍干制得小麥麩皮活性多糖。
3.根據權利要求1或2所述的小麥麩皮活性多糖的提取純化方法，其特征在于:步驟c中，所述的待蒸發的液體為脫脂麩皮連續進行I次以上加熱回流后合并的液體。
4.根據權利要求1或2所述的小麥麩皮活性多糖的提取純化方法，其特征在于:步驟d(I)中，所述的上層液體為2次以上經過加入Sevag試劑、攪拌并去除下層液體及絮狀沉淀物后合并的液體。
【文檔編號】C08B37/00GK103497258SQ201310472002
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月11日 優先權日:2013年10月11日
【發明者】曹榮安, 賈建, 李良玉, 張建強, 鹿保鑫, 劉妍妍, 張麗萍, 楊楠, 郭希娟 申請人:黑龍江八一農墾大學