一種生物功能化尼龍及其制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供的一種生物功能化尼龍，所述生物功能化尼龍由羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯通過硅烷偶聯劑接枝在尼龍表面。還提供了該生物功能化尼龍的制備方法及其在細胞篩選中的應用。該生物功能化尼龍制備工藝簡單、成本低廉，通過硅烷偶聯劑將羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯接枝在尼龍表面，簡單、便捷、有效地改善尼龍材料的生物相容性，大大提高了其親水性和抗凝血性；該尼龍可與抗體分子結合，賦予尼龍材料粘附和篩選細胞或蛋白的功能，從而實現對特定蛋白、細胞的生物學功能特異性粘附，在腫瘤的篩查、早期診斷等領域具有廣泛的應用前景。
【專利說明】一種生物功能化尼龍及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫用材料領域，特別涉及一種生物功能化尼龍，還涉及該生物功能化尼龍的制備方法以及在細胞篩選中的應用。
【背景技術】
[0002]惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的一大殺手，其致死的主要原因是具有侵襲能力的腫瘤細胞轉移其它組織器官。目前腫瘤轉移理論認為，腫瘤細胞需要先從原發病灶脫離并進入血液或淋巴循環，才能在遠處形成轉移灶。同時研究表明循環腫瘤細胞數目與預后有著非常密切的關聯。因此對外周血中循環腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTC)的檢測和分析有助于腫瘤的早期診斷、術后監測、療效評估，為發展個體化治療提供新的依據。然而，CTC在外周血中細胞數目稀少，一般在IO6 -1O7個細胞中僅含有一個CTC。
[0003]另外CTC缺少有別于其它血細胞的特異性標志物；而且不同組織學類型和分子表型的腫瘤表達不同的標志物。這些問題使得CTC檢測和分析面臨這重大挑戰。目前，CTC檢測和分析方法主要有基于細胞形態學或細胞免疫學的細胞計數法、流式細胞術、鐳射掃描細胞計數器和光導纖維陣列掃描技術等。這些方法在臨床應用上取得不同程度的進展。但是分析儀器昂貴、樣品細胞需要預處理和較長的分析時間，以及特異性抗體的缺失等問題使得這些方法無法滿足CTC便捷、快速和高特異性和高靈敏的分析要求。
[0004]尼龍是一種長鏈聚酰胺結構高分子材料，廣泛應用于工業領域。在生物與醫學領域，尼龍材料已經用于制造各類植入和介入醫療器械、生物化學與分子生物學實驗耗材，如各種球囊導管、穿刺鞘、分子印跡實驗、超濾膜等。然而，值得注意的是，在醫學應用領域，尤其是在應用于植入和介入醫療器械時，尼龍材料生物相容性不佳、抗凝血性較差，迫切需要更好的生物相容性、抗凝血性以及更多樣的生物學功能。
`[0005]羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯(CBMA)是一種兩性離子化合物，利用CBMA為單體合成的高分子具有良好的生物相容性，主要表現在良好的抗血小板吸附、血漿復鈣時間較長等方面。同時，CBMA分子結構中具有可活化的羧基，在特定條件下可以與抗體的氨基反應，實現與抗體的連接。

【發明內容】

[0006]發明目的:本發明的第一目的在于提供一種生物相容性好、抗凝血性能佳的生物功能化尼龍及其制備方法。
[0007]本發明的第二目的在于提供包括上述生物功能化尼龍的選擇性黏附細胞的尼龍。
[0008]本發明的第三目的在于提供上述選擇性黏附細胞的尼龍在細胞篩選中的應用。
[0009]技術方案:本發明提供的一種生物功能化尼龍，所述生物功能化尼龍由羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯通過硅烷偶聯劑接枝在尼龍表面。
[0010]本發明還提供了上述生物功能化尼龍的制備方法，包括以下步驟:
[0011](I)表面羥基化尼龍的制備:將尼龍置于堿水溶液中水解反應后，再置于磷酸-甲醛-水溶液中羥基化反應，即得表面羥基化尼龍；
[0012](2)表面硅烷化的尼龍的制備:將表面羥基化的尼龍置于硅烷偶聯劑混合溶液中反應即得；
[0013](3)生物功能化尼龍的制備:將表面硅烷化的尼龍和羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯溶液混合反應，即得。
[0014]其中，步驟(1)中，堿水溶液選自氫氧化鉀水溶液、氫氧化鈉水溶液、氫氧化鈣水溶液和氨水溶液中的一種或幾種，堿水溶液的質量百分比濃度為0.5-70%，優選20%-50% ；所述磷酸-甲醛-水溶液為體積比為50:1的質量百分比濃度為1-80%的甲醛水溶液與質量百分比濃度為50-95%的磷酸水溶液的混合溶液；水解反應溫度為室溫，反應時間為30-120min ;羥基化反應溫度為30_90°C，反應時間為2_12h。
[0015]其中，步驟(2)中，所述硅烷偶聯劑選自含有氨基官能團的硅氧烷中的一種或幾種，優選氨丙基三甲氧基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷、氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷、氨乙基氣丙基二乙氧基硅烷、氣丙基甲基二甲氧基硅烷和氣丙基乙基二乙氧基硅烷等含有氣基官能團的硅氧烷中的一種或幾種；所述硅烷偶聯劑混合溶液的溶劑為水、乙醇、甲醇、異丙醇、丁醇、戊二醇、二甲亞砜或四氫呋喃，溶質包括質量百分比濃度為0.05-10%的硅烷偶聯劑和質量百分比濃度為0.05-10%乙酸、硫酸、硝酸或鹽酸；反應溫度為室溫，反應時間為30_120mino
[0016]其中，步驟(3)中，羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯溶液的溶劑為水、乙醇、甲醇、異丙醇、丁醇、丁二醇、丙三醇或戊二醇，其質量百分比濃度為0.2-4% ;反應溫度為30-80°C，反應時間為2-48h。
[0017]本發明還提供了選擇性黏附細胞的尼龍，所述選擇性黏附細胞的尼龍為抗體接枝在上述的生物功能化尼龍表面。
[0018]本發明還提供了上述的一種選擇性黏附細胞的尼龍的制備方法，具體包括以下步驟:
[0019](I)活化:將權利要求1所述的生物功能化尼龍置于混合溶液中活化，所述混合溶液的溶劑為體積比為(1-20):1的二氧六環與水的混合液，溶質為摩爾濃度為0.5-1 Omg/mL碳二亞胺與0.5-10mg/ml N-羥基琥拍酰亞胺；
[0020](2)接枝:將抗體溶液滴于活化處理后的生物功能化尼龍表面反應，即得。
[0021]其中，步驟(1)中，活化溫度為室溫，活化時間為l_4h。
[0022]其中，步驟(2)中，所述抗體溶液為以磷酸緩沖液:lmg/ml的抗體溶液體積比(10-100):1的比例稀釋得到，反應溫度為0-37°C，反應時間為18-72h。
[0023]其中，步驟(2)中，所述抗體為針對人上皮細胞粘附分子EpCAM的抗體、針對人細胞角蛋白CK19的抗體、針對人細胞角蛋白CK8的抗體、針對人CD45分子的抗體。
[0024]本發明還提供了上述選擇性黏附細胞的尼龍在細胞篩選中的應用。
[0025]有益效果:本發明提供的生物功能化尼龍制備工藝簡單、成本低廉，通過硅烷偶聯劑將羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯接枝在尼龍表面，簡單、便捷、有效地改善尼龍材料的生物相容性，大大提高了其親水性和抗凝血性；該尼龍可與抗體分子結合，賦予尼龍材料粘附和篩選細胞或蛋白的功能，從而實現對特定蛋白、細胞的生物學功能特異性粘附，在腫瘤的篩查、早期診斷等領域具有廣泛的應用前景。【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為硅烷化的尼龍和生物功能化尼龍的表面電子能譜圖；其中，圖1a為硅烷化的尼龍表面電子能譜圖，圖1a為生物功能化尼龍表面電子能譜圖。圖1a中僅在285.0eV處、398.4eV處及531.8eV處可見分別歸屬Cls、Nls和Ols的電子能結合峰，符合尼龍材料為聚酰胺的特征；而圖1b中可見新出現的位于100.1eV和150.5eV處的Si元素特征性雙峰，證明了硅烷偶聯劑的成功接枝。同時，圖1b中的Cls、Nls和Ols的峰高度和峰型都發生了變化，經過分峰分析證實了這些變化是由于羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯的成功接枝引起的。
[0027]圖2為硅烷化的尼龍和生物功能化尼龍的表面水接觸角圖，a為硅烷化的尼龍的水接觸角，b為生物功能化尼龍的水接觸角。結果表明生物功能化尼龍的表面具有更好的親水性。
[0028]圖3為血漿復鈣時間實驗結果。空白對照(Blank Control)為未經處理的玻璃片，Silicon Oil為經硅油涂抹的玻璃片,Nylon和Nylon with CBMA分別代表未經處理的尼龍和本發明生物功能化尼龍。結果表明本發明生物功能化尼龍血漿復鈣時間最長，差異有統計學意義，接枝處理增強了尼龍的抗凝血性能。
[0029]圖4為尼龍經接枝抗體獲得功能后進行細胞粘附實驗結果。表面接枝的為抗EpCAM抗體，采用的細胞為表面EpCAM抗原表達陽性的SGC7901細胞。圖4a為接枝抗EpCAM抗體的尼龍細胞粘附結果，圖4b為未接枝抗體的尼龍細胞粘附結果，細胞經DAPI熒光染料染色。可見經過抗體接枝的尼龍表面粘附細胞明顯多于未經處理的尼龍表面。
【具體實施方式】
[0030]就以上
【發明內容】
，以下通過實施例加以進一步說明，但實施例的描述不對本發明請求保護的范圍形成任何限制。`
[0031 ] 本發明中，羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯可采用公知的方法經改進后合成，具體包括以下步驟:將摩爾比為1:1.05的甲基丙烯酸二甲基胺基乙酯(DMAEMA)和3-氯丙酸溶解于水中，用飽和氫氧化鈉溶液調節PH值為7。稱取占反應體系總質量0.1%的阻聚劑MEHQ加入上述混合溶液中，升溫至60°C反應2小時。反應結束后向混合溶液中加入大量四氫呋喃，可見白色粉末沉淀出現，抽濾獲得白色粉末，反復用丙酮及乙醚沖洗、抽濾上述白色粉末，后真空干燥。通過分析白色粉末的紅外光譜檢測的特征峰和核磁共振氫譜譜圖，證實經上述步驟合成的白色粉末為羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯。
[0032]實施例1
[0033]將尼龍置入10%氫氧化鈉水溶液室溫水解60分鐘，后取出用蒸餾水清洗，室溫干燥。將50毫升35% (wt%)甲醛水溶液與I毫升85% (wt%)磷酸水溶液配制成混合溶液，將尼龍置入該混合溶液中，60°C條件下反應12小時，之后用大量蒸餾水清洗尼龍，室溫真空干燥。
[0034]以乙醇為溶劑，配制包括0.1% (wt%)的硅烷偶聯劑氨丙基三乙氧基硅烷和0.1%(wt%)的乙酸的混合溶液，將前述干燥的尼龍置入該溶液中，室溫反應60分鐘，取出60°C干燥2小時，得到表面接枝硅烷偶聯劑氨丙基三乙氧基硅烷的尼龍。[0035]配制2% (wt%)的羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯水溶液，將已經制備的接枝氨丙基三乙氧基硅烷的尼龍置入該溶液中，30°C下反應24小時，室溫干燥，獲得接枝氨丙基三乙氧基硅烷與羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯的尼龍。
[0036]經過電子能譜檢測，證實硅烷偶聯劑氨丙基三乙氧基硅烷與羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯成功接枝于尼龍表面(圖1)。性能測試包括水接觸角檢測(圖2)和血漿復鈣時間檢測(圖3)，結果表明經接枝處理后的尼龍親水性更好，抗凝血性能增強。
[0037]用體積比為14:1的二氧六環與水的混合液作為溶劑，配制碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺濃度均為2mg/ml的混合溶液，將接枝氨丙基三乙氧基硅烷與羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯的尼龍置入該溶液中活化尼龍表面基團，I小時后取出，室溫干燥。用抗體:磷酸緩沖液體積比1:50的比例稀釋抗lmg/ml市售人EpCAM抗體溶液,將該稀釋液滴于活化后的尼龍膜表面，環境濕潤、溫度4°C條件下反應24小時，后磷酸緩沖液沖洗，室溫干燥。
[0038]用EpCAM抗原表達陽性的人胃癌細胞株SGC7901為研究工具，對經過抗體接枝與未經抗體接枝的尼龍表面行細胞粘附實驗，通過對粘附細胞性Dapi熒光染色觀察，發現接枝抗體的尼龍表面粘附細胞數目明顯較多(圖4)，接枝后的尼龍表面發揮了明顯的粘附特定細胞的功能，具有在細胞分離領域的適用性。
[0039]實施例2
[0040]將尼龍置入20%氫氧化鉀水溶液室溫水解60分鐘，后取出用蒸餾水清洗，室溫干燥。將50毫升35% (wt%)甲醛水溶液與I毫升85% (wt%)磷酸水溶液配制成混合溶液，將尼龍置入該混合溶液中，80°C條件下反應10小時，之后用大量蒸餾水清洗尼龍，室溫真空干燥。
[0041]以甲醇為溶劑，配制包括0.1% (wt%)的硅烷偶聯劑氨丙基三甲氧基硅烷和0.1%(wt%)的鹽酸的混合溶液，將前 述干燥的尼龍置入該溶液中，室溫反應60分鐘，取出60°C干燥2小時，得到表面接枝硅烷偶聯劑氨丙基三甲氧基硅烷的尼龍。
[0042]配制1% (wt%)的羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯乙醇溶液，將已經制備的接枝氨丙基三甲氧基硅烷的尼龍置入該溶液中，50°C下反應12小時，室溫干燥，獲得接枝氨丙基三甲氧基硅烷與羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯的尼龍。
[0043]電子能譜、水接觸角、血漿復鈣時間檢測的實施同實施例1，結果可證實成功接枝與生物相容性的改善。
[0044]用體積比為12:1的二氧六環與水的混合液作為溶劑，配制碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺濃度均為5mg/ml的混合溶液，將接枝氨丙基三甲氧基硅烷與羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯的尼龍置入該溶液中活化尼龍表面基團，2小時后取出，室溫干燥。用抗體:磷酸緩沖液體積比1:100的比例稀釋lmg/ml市售抗人EpCAM抗體溶液,將該稀釋液滴于活化后的尼龍膜表面，環境濕潤、溫度37°C條件下反應18小時，后磷酸緩沖液沖洗，室溫干燥。
[0045]SGC7901細胞株的粘附實驗同實施例1，可證實接枝后的尼龍表面發揮了明顯的粘附特定細胞的功能，具有在細胞分離領域的適用性。
[0046]實施例3
[0047]將尼龍置入50%氫氧化鈉水溶液室溫水解60分鐘，后取出用蒸餾水清洗，室溫干燥。將50毫升35% (wt%)甲醛水溶液與I毫升85% (wt%)磷酸水溶液配制成混合溶液，將尼龍置入該混合溶液中，40°C條件下反應12小時，之后用大量蒸餾水清洗尼龍，室溫真空干燥。
[0048]以四氫呋喃為溶劑，配制包括7.0% (wt%)的硅烷偶聯劑氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷和3.0% (wt%)的硫酸的混合溶液，將前述干燥的尼龍置入該溶液中，反應120分鐘，取出60°C干燥2小時，得到表面接枝硅烷偶聯劑氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷的尼龍。
[0049]配制3% (wt%)的羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯異丙醇溶液，將已經制備的接枝氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷的尼龍置入該溶液中，40°C下反應48小時，室溫干燥，獲得接枝氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷與羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯的尼龍。
[0050]電子能譜、水接觸角、血漿復鈣時間檢測的實施同實施例1，結果可證實成功接枝與生物相容性的改善。
[0051]用體積比為10:1的二氧六環與水的混合液作為溶劑，配制碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺濃度均為lmg/ml的混合溶液，將接枝氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷與羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯的尼龍置入該溶液中活化尼龍表面基團，4小時后取出，室溫干燥。用抗體:磷酸緩沖液體積比1:20的比例稀釋lmg/ml市售抗人EpCAM抗體溶液,將該稀釋液滴于活化后的尼龍膜表面，環境濕潤、溫度4°C條件下反應24小時，后磷酸緩沖液沖洗，室溫干燥。
[0052]SGC7901細胞株的粘附實驗同實施例1，可證實接枝后的尼龍表面發揮了明顯的粘附特定細胞的功能，具有在細胞分離領域的適用性。
[0053]實施例4
[0054]將尼龍置入50%氫氧化鉀水溶液室溫水解40分鐘，后取出用蒸餾水清洗，室溫干燥。將50毫升35% (wt%)甲醛水溶液與I毫升85% (wt%)磷酸水溶液配制成混合溶液，將尼龍置入該混合溶液中`，70°C條件下反應12小時，之后用大量蒸餾水清洗尼龍，室溫真空干燥。
[0055]以二甲亞砜為溶劑，配制包括2.0% (wt%)的硅烷偶聯劑氨乙基氨丙基三乙氧基硅烷和8.0% (wt%)的醋酸的混合溶液，將前述干燥的尼龍置入該溶液中，室溫反應60分鐘，取出60°C干燥2小時，得到表面接枝硅烷偶聯劑氨乙基氨丙基三乙氧基硅烷的尼龍。
[0056]配制4% (wt%)的羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯丁醇溶液，將已經制備的接枝氨乙基氨丙基三乙氧基硅烷的尼龍置入該溶液中，30°C下反應24小時，室溫干燥，獲得接枝氨乙基氨丙基三乙氧基硅烷與羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯的尼龍。
[0057]電子能譜、水接觸角、血漿復鈣時間檢測的實施同實施例1，結果可證實成功接枝與生物相容性的改善。
[0058]用體積比為8:1的二氧六環與水的混合液作為溶劑，配制碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺濃度均為2mg/ml的混合溶液，將接枝氨乙基氨丙基三乙氧基硅烷與羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯的尼龍置入該溶液中活化尼龍表面基團，I小時后取出，室溫干燥。用抗體:磷酸緩沖液體積比1:80的比例稀釋lmg/ml市售抗人EpCAM抗體溶液,將該稀釋液滴于活化后的尼龍膜表面，環境濕潤、溫度4°C條件下反應24小時，后磷酸緩沖液沖洗，室溫干燥。
[0059]SGC7901細胞株的粘附實驗同實施例1，可證實接枝后的尼龍表面發揮了明顯的粘附特定細胞的功能，具有在細胞分離領域的適用性。
[0060]實施例5
[0061]將尼龍置入10%氫氧化鈉水溶液室溫水解100分鐘，后取出用蒸餾水清洗，室溫干燥。將50毫升20% (wt%)甲醛水溶液與I毫升75% (wt%)磷酸水溶液配制成混合溶液，將尼龍置入該混合溶液中，60°C條件下反應12小時，之后用大量蒸餾水清洗尼龍，室溫真空干燥。
[0062]以戊二醇為溶劑，配制包括5.0% (wt%)的硅烷偶聯劑氨丙基甲基二甲氧基硅烷和
0.05% (wt%)的醋酸的混合溶液，將前述干燥的尼龍置入該溶液中，室溫反應60分鐘，取出60°C干燥2小時，得到表面接枝硅烷偶聯劑氨丙基甲基二甲氧基硅烷的尼龍。
[0063]配制2% (wt%)的羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯丁二醇溶液，將已經制備的接枝氨丙基甲基二甲氧基硅烷的尼龍置入該溶液中，30°C下反應24小時，室溫干燥，獲得接枝氨丙基甲基二甲氧基硅烷與羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯的尼龍。
[0064]電子能譜、水接觸角、血漿復鈣時間檢測的實施同實施例1，結果可證實成功接枝與生物相容性的改善。
[0065]用體積比為14:1的二氧六環與水的混合液作為溶劑，配制碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺濃度均為8mg/ml的混合溶液，將接枝氨丙基甲基二甲氧基硅烷與羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯的尼龍置入該溶液中活化尼龍表面基團，I小時后取出，室溫干燥。用抗體:磷酸緩沖液體積比1:100的比例稀釋lmg/ml市售抗人EpCAM抗體溶液,將該稀釋液滴于活化后的尼龍膜表面，環境濕潤、溫度4°C條件下反應24小時，后磷酸緩沖液沖洗，室溫干燥。
[0066]SGC7901細胞株的粘附實驗同實施例1，可證實接枝后的尼龍表面發揮了明顯的粘附特定細胞的功能，具有在細胞分離領域的適用性。
`[0067]實施例6
[0068]將尼龍置入70%氫氧化鈉水溶液室溫水解30分鐘，后取出用蒸餾水清洗，室溫干燥。將50毫升50% (wt%)甲醛水溶液與I毫升60% (wt%)磷酸水溶液配制成混合溶液，將尼龍置入該混合溶液中，60°C條件下反應12小時，之后用大量蒸餾水清洗尼龍，室溫真空干燥。
[0069]以丁醇為溶劑，配制包括0.05% (wt%)的硅烷偶聯劑氨丙基乙基二乙氧基硅烷和5.0% (wt%)的醋酸的混合溶液,將前述干燥的尼龍置入該溶液中，室溫反應60分鐘,取出60°C干燥2小時，得到表面接枝硅烷偶聯劑氨丙基乙基二乙氧基硅烷的尼龍。
[0070]配制2% (wt%)的羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯丙三醇溶液，將已經制備的接枝氨丙基乙基二乙氧基硅烷的尼龍置入該溶液中，80°C下反應2小時，室溫干燥，獲得接枝氨丙基乙基二乙氧基硅烷與羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯的尼龍。
[0071]電子能譜、水接觸角、血漿復鈣時間檢測的實施同實施例1，結果可證實成功接枝與生物相容性的改善。
[0072]用體積比為5:1的二氧六環與水的混合液作為溶劑，配制碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺濃度均為0.5mg/ml的混合溶液，將接枝氨丙基乙基二乙氧基硅烷與羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯的尼龍置入該溶液中活化尼龍表面基團，I小時后取出，室溫干燥。用抗體:磷酸緩沖液體積比1:50的比例稀釋lmg/ml市售人CD45分子的抗體溶液,將該稀釋液滴于活化后的尼龍膜表面，環境濕潤、溫度4°C條件下反應24小時，后磷酸緩沖液沖洗，室溫干燥。
[0073]用人T淋巴細胞株Karpas為研究工具,對經過抗體接枝與未經抗體接枝的尼龍表面行細胞粘附實驗，通過對粘附細胞性Dapi熒光染色觀察，發現接枝抗體的尼龍表面粘附細胞數目明顯較多，接枝后的尼龍表面發揮了明顯的粘附特定細胞的功能，具有在細胞分離領域的適用性。[0074]實施例7
[0075]將尼龍置入0.5%氫氧化鈣水溶液室溫水解120分鐘，后取出用蒸餾水清洗，室溫干燥。將50毫升1% (wt%)甲醛水溶液與I毫升95% (wt%)磷酸水溶液配制成混合溶液，將尼龍置入該混合溶液中，90°C條件下反應2小時，之后用大量蒸餾水清洗尼龍，室溫真空干燥。
[0076]以水為溶劑，配制包括1.0%(wt%)的硅烷偶聯劑氨丙基三乙氧基硅烷和10%(wt%)的醋酸的混合溶液，將前述干燥的尼龍置入該溶液中，室溫反應120分鐘,取出60°C干燥2小時，得到表面接枝硅烷偶聯劑氣丙基乙基二乙氧基硅烷的尼龍。
[0077]配制0.2% (wt%)的羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯戊二醇溶液，將已經制備的接枝氨丙基乙基二乙氧基硅烷的尼龍置入該溶液中，60°C下反應48小時，室溫干燥，獲得接枝氨丙基乙基二乙氧基硅烷與竣酸甜菜喊甲基丙稀酸酷的尼龍。
[0078]電子能譜、水接觸角、血漿復鈣時間檢測的實施同實施例1，結果可證實成功接枝與生物相容性的改善 。
[0079]用體積比為20:1的二氧六環與水的混合液作為溶劑，配制碳二亞胺濃度為2mg/ml與N-羥基琥珀酰亞胺濃度為10mg/ml的混合溶液，將接枝氨丙基乙基二乙氧基硅烷與羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯的尼龍置入該溶液中活化尼龍表面基團，I小時后取出，室溫干燥。用抗體:磷酸緩沖液體積比1:50的比例稀釋lmg/ml人細胞角蛋白8 (CK8)的抗體溶液，將該稀釋液滴于活化后的尼龍膜表面，環境濕潤、溫度0°C條件下反應72小時，后磷酸緩沖液沖洗，室溫干燥。
[0080]用人胃癌細胞株BGC823為研究工具，對經過抗體接枝與未經抗體接枝的尼龍表面行細胞粘附實驗，通過對粘附細胞性Dapi熒光染色觀察，發現接枝抗體的尼龍表面粘附細胞數目明顯較多，接枝后的尼龍表面發揮了明顯的粘附特定細胞的功能，具有在細胞分離領域的適用性。
[0081]實施例8
[0082]將尼龍置入30%氨水水溶液室溫水解60分鐘,后取出用蒸懼水清洗,室溫干燥。
[0083]將50毫升80% (wt%)甲醛水溶液與I毫升50% (wt%)磷酸水溶液配制成混合溶液，將尼龍置入該混合溶液中，30°C條件下反應6小時，之后用大量蒸餾水清洗尼龍，室溫
真空干燥。
[0084]以異丙醇為溶劑，配制包括10% (wt%)的硅烷偶聯劑氨丙基三乙氧基硅烷和1.0%(wt%)的醋酸的混合溶液，將前述干燥的尼龍置入該溶液中，室溫反應30分鐘，取出60°C干燥2小時，得到表面接枝硅烷偶聯劑氣丙基乙基二乙氧基硅烷的尼龍。
[0085]配制0.8% (wt%)的羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯甲醇溶液，將已經制備的接枝氨丙基乙基二乙氧基硅烷的尼龍置入該溶液中，30°C下反應48小時，室溫干燥，獲得接枝氨丙基乙基二乙氧基硅烷與羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯的尼龍。
[0086]電子能譜、水接觸角、血漿復鈣時間檢測的實施同實施例1，結果可證實成功接枝與生物相容性的改善。
[0087]用體積比為1:1的二氧六環與水的混合液作為溶劑，配制碳二亞胺濃度為IOmg/ml與N-羥基琥珀酰亞胺濃度為2mg/ml的混合溶液，將接枝氨丙基乙基二乙氧基硅烷與羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯的尼龍置入該溶液中活化尼龍表面基團，I小時后取出，室溫干燥。用抗體:磷酸緩沖液體積比1:50的比例稀釋lmg/ml市售人細胞角蛋白19 (CK19)的抗體溶液，將該稀釋液滴于活化后的尼龍膜表面，環境濕潤、溫度4°C條件下反應48小時，后磷酸緩沖液沖洗，室溫干燥。
[0088]用人胃癌細胞株BGC823為研究工具，對經過抗體接枝與未經抗體接枝的尼龍表面行細胞粘附實驗，通過對粘附細胞性Dapi熒光染色觀察，發現接枝抗體的尼龍表面粘附細胞數目明顯較多，接枝后的尼 龍表面發揮了明顯的粘附特定細胞的功能，具有在細胞分離領域的適用性。
【權利要求】
1.一種生物功能化尼龍，其特征在于:所述生物功能化尼龍由羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯通過硅烷偶聯劑接枝在尼龍表面。
2.權利要求1所述的一種生物功能化尼龍的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)表面羥基化尼龍的制備:將尼龍置于堿水溶液中水解反應后，再置于磷酸-甲醛-水溶液中羥基化反應，即得表面羥基化尼龍； (2)表面硅烷化的尼龍的制備:將表面羥基化的尼龍置于硅烷偶聯劑混合溶液中反應即得； (3)生物功能化尼龍的制備:將表面硅烷化的尼龍和羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯溶液混合反應，即得。
3.根據權利要求2所述的一種生物功能化尼龍的制備方法，其特征在于:步驟(1)中，堿水溶液選自氫氧化鉀水溶液、氫氧化鈉水溶液、氫氧化鈣水溶液和氨水溶液中的一種或幾種，堿水溶液的質量百分比濃度為0.5-70%,優選20%-50% ;所述磷酸-甲醛-水溶液為體積比為50:1的質量百分比濃度為1-80%的甲醛水溶液與質量百分比濃度為50-95%的磷酸水溶液的混合溶液；水解反應溫度為室溫，反應時間為30-120min ;羥基化反應溫度為30-90°C，反應時間為2-12h。
4.根據權利要求2所述的一種生物功能化尼龍的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，所述硅烷偶聯劑選自含有氨基官能團的硅氧烷中的一種或幾種，優選氨丙基三甲氧基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷、氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷、氨乙基氨丙基三乙氧基硅烷、氨丙基甲基二甲氧基硅烷和氣丙基乙基二乙氧基硅烷等含有氣基官能團的硅氧烷中的一種或幾種；所述硅烷偶聯劑混合溶液的溶劑為水、乙醇、甲醇、異丙醇、丁醇、戊二醇、二甲亞砜或四氫呋喃，溶質包括質量百分比濃度為0.05-10%的硅烷偶聯劑和質量百分比濃度為0.05-10%乙酸、硫酸、硝酸或鹽酸；反應溫度為室溫，反應時間為30-120min。
5.根據權利要求2所述的一種生物功能化尼龍的制備方法，其特征在于:步驟(3)中，羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯溶液的溶劑為水、乙醇、甲醇、異丙醇、丁醇、丁二醇、丙三醇或戊二醇，其質量百分比濃度為0.2-4% ;反應溫度為30-80°C，反應時間為2-48h。
6.一種選擇性黏附細胞的尼龍，其特征在于:所述選擇性黏附細胞的尼龍為抗體接枝在權利要求1所述的生物功能化尼龍表面。
7.權利要求6所述的一種選擇性黏附細胞的尼龍的制備方法，其特征在于:具體包括以下步驟: (1)活化:將權利要求1所述的生物功能化尼龍置于混合溶液中活化，所述混合溶液的溶劑為體積比為(1-20 ):1的二氧六環與水的混合液，溶質為摩爾濃度為0.5-1Omg/mL碳二亞胺與0.5-10mg/ml N-羥基琥珀酰亞胺； (2)接枝:將抗體溶液滴于活化處理后的生物功能化尼龍表面反應，即得。
8.根據權利要求7所述的一種選擇性黏附細胞的尼龍的制備方法，其特征在于:步驟Cl)中，活化溫度為室溫，活化時間為l_4h。
9.根據權利要求7所述的一種選擇性黏附細胞的尼龍的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，所述抗體為針對人上皮細胞粘附分子EpCAM的抗體、針對人細胞角蛋白CK19的抗體、針對人細胞角蛋白CK8的抗體、針對人CD45分子的抗體；反應溫度為0-37°C，反應時間為 18-72h。
10.權利要求6所述的選擇性黏附細胞的尼龍在細胞篩選中的應用。
【文檔編號】C08L77/00GK103554544SQ201310478736
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月14日 優先權日:2013年10月14日
【發明者】劉寶瑞, 張弢, 王惠宇, 董超群 申請人:南京大學