一種制備依諾肝素鈉的工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種制備依諾肝素鈉的工藝，包括：S1：肝素-芐索氯銨鹽的制備；S2：肝素芐基酯的制備；S3：肝素芐基酯的裂解；S4：依諾肝素鈉的脫色；S5：陰離子交換層析：收集洗脫液，檢測分子量分布為重均分子量4000～4600，2000～8000分子量的比例為72-78％；S6：凍干：酒精沉淀，除菌，凍干，得到所述的依諾肝素鈉。該方法通過采用陰離子交換樹脂層析等得到收率高、高純度的依諾肝素鈉產品，且該工藝自動化程度高，操作便捷，為提升產能提供了有力保障，適合大規(guī)模生產。
【專利說明】一種制備依諾肝素鈉的工藝

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥和化學領域中的一種藥用化學藥品的制備，具體涉及一種制備依 諾肝素鈉的工藝。

【背景技術】
[0002] 肝素自上世紀80年代以來一直是預防和治療血栓類藥物的首選藥物，低分子肝 素（包括達肝素鈉、依諾肝素、那屈肝素）是由普通肝素通過特異性的化學切割和純化分離 制成，自上個世紀末，賽諾菲公司的依諾肝素被美國FDA批準在美國上市以來，低分子肝素 由于其療效確切，副作用小而且可預測等優(yōu)點，逐步取代了傳統(tǒng)肝素的市場地位。依諾肝素 可有效預防靜脈血栓栓塞癥和肺栓塞癥，可用于矯形外科、神經外科術前和術后血栓形成， 可大大降低患中風風險，能更有效減少不穩(wěn)定性冠狀動脈綜合癥患者的死亡、心力衰竭、復 發(fā)性心絞痛等，并可降低高甘油三脂血癥，能有效解決普通未分級肝素及其衍生物長期使 用后的出血、骨質疏松、誘導血小板減少等副作用。
[0003] 由于低分子肝素類多糖藥物由一系列未能完全鑒別的寡糖混合物組成，結構及其 復雜，無法依靠單一方法對其進行結構確定，技術難度很高，所以對國內企業(yè)來說，形成了 進入歐美高附加值終端市場特別是美國市場的一個技術壁壘。
[0004] 目前，國內有采用酒精分級沉淀、超濾膜分離、分子篩和凝膠過濾層析的方法來控 制依諾肝素的分子量，這些方法有個共同的特點就是收率很低，一般只有20%以下，分子量 控制精度低，且不同程度的具有費時、費力，自動化程度低的缺點，不適合大規(guī)模生產，限制 了產能的提升。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種制備依諾肝素鈉的工藝，該方法通過采用陰離子交換樹 脂層析等得到收率高、高純度的依諾肝素鈉產品，且該工藝自動化程度高，操作便捷，為提 升產能提供了有力保障，適合大規(guī)模生產；克服了現(xiàn)有技術中的費時、費力，自動化程度低， 不適合大規(guī)模生產，并限制了產能的提升的不足。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)：
[0007] -種制備依諾肝素鈉的工藝，該制備方法包括以下步驟：
[0008] S1 :肝素-芐索氯銨鹽的制備：將肝素鈉和芐索氯銨分別溶解于純化水中，得肝素 鈉溶解液和芐索氯銨溶解液，室溫攪拌下將肝素鈉溶解液緩慢加入到芐索氯銨溶解液中， 加入完畢后繼續(xù)室溫下攪拌，收集沉淀物，即為肝素-芐索氯銨鹽，并將其在50°C?60°C真 空干燥，得到含水量低于5 %的肝素-芐索氯銨鹽；
[0009] S2 :肝素芐基酯的制備：將步驟S1中得到的肝素-芐索氯銨鹽溶解于二氯甲烷 中，在25?45°C下攪拌至充分溶解，加入氯化芐，繼續(xù)攪拌反應24?48小時，再將反應液 壓入過濾器內，加入醋酸鈉甲醇溶液，析出沉淀，靜置，利用壓縮空氣壓濾，甲醇洗滌，沉淀 冷凍干燥，得到含水量低于5%、酯化率大于9的肝素芐基酯；
[0010] S3 :肝素芐基酯的裂解：將步驟S2中得到的肝素芐基酯充分溶解于純化水中，攪 拌，并在35?65°C下加入氫氧化鈉，反應1?3小時，冷卻到室溫，調pH到中性，加入氯化 鈉，析出油狀物，板框過濾，過膜，加入甲醇析出沉淀，濾板過濾，乙醇洗滌，空氣壓干，得沉 淀物；
[0011] S4 :依諾肝素鈉的脫色：將步驟S3中所述的沉淀物用水充分溶解，調pH到堿性， 室溫脫色10?20分鐘，pH調回到中性，準備進行陰離子交換層析；
[0012] S5 :陰離子交換層析：采用陰離子交換樹脂，按25-35mg低分子肝素鈉/ml-resin 上樣，溫度為室溫，檢測波長為UV232nm，上樣結束后先用350?550mmol/L的氯化鈉溶液洗 滌，再用1?2mol/L的氯化鈉溶液洗脫，洗脫終點為232nm紫外吸收降至基線平穩(wěn)，收集洗 脫液，檢測分子量分布為重均分子量4000?4600,2000?8000分子量的比例為72-78% ;
[0013] S6 :凍干：酒精沉淀，除菌，凍干，得到所述的依諾肝素鈉。
[0014] 進一步優(yōu)選地，步驟S1中，所述肝素-芐索氯銨鹽的獲得方法為：將肝素鈉溶解 液緩慢加入到芐索氯銨溶解液中后繼續(xù)室溫下攪拌1?5小時，將初步得到的沉淀物離心， 反復用純化水洗滌，再離心，直到濾液遇10%的硝酸銀溶液不顯渾濁的沉淀物為所述的肝 素-芐索氯銨鹽，然后將其真空干燥，得到最終含水量低于5%的肝素芐索氯銨鹽。
[0015] 進一步優(yōu)選地，步驟S2中，肝素芐基酯的具體制備方法為：將步驟S1中得到的肝 素-芐索氯銨鹽按1 : 1?5溶解于二氯甲烷中，開啟機械攪拌，在25?45°C下攪拌至充 分溶解，加入1?5倍量的氯化芐，繼續(xù)保持25?45°C，攪拌反應24?48小時，將反應液 壓入三合一濾器，邊攪拌邊加入醋酸鈉甲醇溶液，析出沉淀，靜置，利用壓縮空氣壓濾，甲醇 洗滌，反復幾次直至濾液遇水無乳化現(xiàn)象，沉淀冷凍干燥24小時，得到肝素芐基酯，含水量 低于5%，酯化率大于9。
[0016] 進一步優(yōu)選地，加入等體積的10%醋酸鈉甲醇溶液。
[0017] 進一步優(yōu)選地，在步驟S3中，將肝素芐基酯按1 : 1?30的重量比加入至純化水 中并充分溶解。
[0018] 進一步優(yōu)選地，將步驟S3中充分溶解于純化水中的肝素芐基酯在35?65 °C的 攪拌條件下加入5%?12%氫氧化鈉固體的溶解液，反應完畢后接上冷媒管迅速冷卻到室 溫。
[0019] 進一步優(yōu)選地，所述過膜為過0. 45 μ m的膜。
[0020] 進一步優(yōu)選地，步驟S4中，通過加入0. 5?1. 5%的雙氧水在室溫下進行脫色。
[0021] 進一步優(yōu)選地，步驟S6中所述酒精沉淀是向洗脫液中加入兩倍酒精進行沉淀，開 啟冷媒，靜置過夜，第二天棄去上清液，沉淀再加一倍酒精進行脫水，棄去上清，加入一定量 的純化水進行溶解。
[0022] 進一步優(yōu)選地，步驟S6中所述的除菌為通過除菌膜進行除菌。
[0023] 本發(fā)明提供了一種制備依諾肝素鈉的工藝，其主要具有的有益效果為：該工藝通 過陰離子交換層析來控制低分子肝素鈣的分子量，使得分子量能在1 %以內精確控制，同時 收率能提高至50%以上，且該方法能夠制備出高純度、高活性的依諾肝素鈉產品，產品質量 明顯高于EP現(xiàn)行版藥典標準；并且自動化程度高，操作便捷，為提升產能提供了有力保障； 故該方法具有重要的工業(yè)應用前景。

【具體實施方式】
[0024] 本發(fā)明實施例所述的一種制備依諾肝素鈉的工藝，下面以具體實驗案例為例來說 明【具體實施方式】，應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定 本發(fā)明。
[0025] 實施例1 :制備依諾肝素鈉的工藝
[0026] ①肝素-芐索氯銨鹽的制備：將4kg肝素鈉溶解于40kg的純化水中，將4?6kg芐 索氯銨溶解在50L純化水中，室溫攪拌下將肝素鈉溶解液緩慢加入到芐索氯銨溶解液中， 加入完畢后繼續(xù)室溫下攪拌1?5小時，沉淀物離心，反復用純化水洗滌，離心，直到濾液遇 10%的硝酸銀溶液不顯渾濁，沉淀50°C?60°C真空干燥24小時，得到含水量低于5%的肝 素芐索氯銨鹽。
[0027] ②肝素芐基酯的制備：將上步得到的肝素鈉芐索氯銨鹽按重量比1 : 1(肝素鈉 芐索氯銨鹽：二氯甲烷）溶解于二氯甲烷中，開啟機械攪拌，保持水浴夾套溫度25?45°C 攪拌至充分溶解，加入肝素鈉芐索氯銨鹽1?2倍重量的氯化芐，保持夾套水溫攪拌反應 24?48小時，將反應液壓入三合一過濾器，邊攪拌邊加入等體積的10%醋酸鈉甲醇溶液， 析出沉淀，靜置，利用壓縮空氣壓濾，甲醇洗滌，反復幾次直至濾液遇水無乳化現(xiàn)象，沉淀冷 凍干燥24小時，得到肝素芐基酯，含水量低于5%，酯化率大于9。
[0028] ③肝素芐基酯的裂解：將上步得到的肝素芐基酯按重量比1 : 1?5(肝素芐基 酯：純化水）溶解于純化水中，反應罐水浴夾套保持35?65°C，開啟機械攪拌，待肝素芐基 酯充分溶解后加入8%?12%氫氧化鈉固體的溶解液，反應1?3小時，接上冷媒管迅速冷 卻到室溫，用HC1調pH到中性，加入氯化鈉（10% )，析出油狀物，板框過濾，過0. 45 μ m膜， 加入溶液3倍體積的甲醇析出沉淀物，10 μ m濾板過濾，乙醇洗滌，空氣壓干，得到肝素芐基 酯裂解后的沉淀物。
[0029] ④依諾肝素鈉的脫色：將上述沉淀物用1?4倍重量的水溶解，溶解完全后放入容 器中，調pH到堿性，加入0. 5?1%的雙氧水室溫脫色10?20分鐘，pH調回到中性，準備 上柱層析。
[0030] ⑤陰離子交換層析調節(jié)分子量：采用GE healthcare公司生產的Q Sepharose FF陰離子交換樹脂，按25-35mg低分子肝素鈉/ml-resin上樣，溫度為室溫，檢測波長為 UV232nm，上樣結束后先用350?550mmol/L的氯化鈉溶液洗滌，再用1?2mol/L的氯化 鈉溶液洗脫，洗脫終點為232nm紫外吸收降至基線平穩(wěn)，收集洗脫液，檢測分子量分布為重 均分子量4000-4600,小于2000分子量的比例為15-17%，2000?8000分子量的比例為 72-78 %，完全符合依諾肝素鈉的質量標準。
[0031] ⑥凍干：向洗脫液中加入兩倍酒精進行沉淀，開啟冷媒，靜置過夜，第二天棄去上 清液，沉淀再加一倍酒精進行脫水，棄去上清，加入一定量的純化水溶解，溶解液過除菌膜， 放入冰箱凍干，收得最終產品依諾肝素鈉2. 15kg，收率為53. 75%。
[0032] 實施例2 :制備依諾肝素鈉的工藝
[0033] ①肝素-芐索氯銨鹽的制備：將4kg肝素鈉溶解于40kg的純化水中，將5?8kg芐 索氯銨溶解在50L純化水中，室溫攪拌下將肝素鈉溶解液緩慢加入到芐索氯銨溶解液中， 加入完畢后繼續(xù)室溫下攪拌1?5小時，沉淀物離心，反復用純化水洗滌，離心，直到濾液遇 10%的硝酸銀溶液不顯渾濁，沉淀50°C?60°C真空干燥24小時，得到含水量低于5%的肝 素芐索氯銨鹽。
[0034] ②肝素芐基酯的制備：將上步得到的肝素鈉芐索氯銨鹽按重量比1 : 2?3(肝 素鈉芐索氯銨鹽：二氯甲烷）溶解于二氯甲烷中，開啟機械攪拌，保持水浴夾套溫度25? 45°C攪拌至充分溶解，加入肝素鈉芐索氯銨鹽3倍重量的氯化芐，保持夾套水溫攪拌反應 24?48小時，將反應液壓入三合一過濾器，邊攪拌邊加入等體積的10 %醋酸鈉甲醇溶液， 析出沉淀，靜置，利用壓縮空氣壓濾，甲醇洗滌，反復幾次直至濾液遇水無乳化現(xiàn)象，沉淀冷 凍干燥24小時，得到肝素芐基酯，含水量低于5%，酯化率大于9。
[0035] ③肝素芐基酯的裂解：將上步得到的肝素芐基酯按重量比1 : 6?10 (肝素芐基 酯：純化水）溶解于純化水中，反應罐水浴夾套保持35?65°C，開啟機械攪拌，待肝素芐基 酯充分溶解后加入5%?7%氫氧化鈉固體的溶解液，反應1?3小時，接上冷媒管迅速冷 卻到室溫，用HC1調pH到中性，加入氯化鈉（10% )，析出油狀物，板框過濾，過0. 45 μ m膜， 加入溶液3倍體積的甲醇析出沉淀物，10 μ m濾板過濾，乙醇洗滌，空氣壓干，得到肝素芐基 酯裂解后的沉淀物。
[0036] ④依諾肝素鈉的脫色：將上述沉淀物用5?7倍重量的水溶解，溶解完全后放入容 器中，調pH到堿性，加入1. 1?1. 5%的雙氧水室溫脫色10?20分鐘，pH調回到中性，準 備上柱層析。
[0037] ⑤陰離子交換層析調節(jié)分子量：采用GE healthcare公司生產的Q Sepharose FF陰離子交換樹脂，按25-35mg低分子肝素鈉/ml-resin上樣，溫度為室溫，檢測波長為 UV232nm，上樣結束后先用350?550mmol/L的氯化鈉溶液洗滌，再用1?2mol/L的氯化 鈉溶液洗脫，洗脫終點為232nm紫外吸收降至基線平穩(wěn)，收集洗脫液，檢測分子量分布為重 均分子量4000-4600,小于2000分子量的比例為15-17%，2000?8000分子量的比例為 72-78 %，完全符合依諾肝素鈉的質量標準。
[0038] ⑥凍干：向洗脫液中加入兩倍酒精進行沉淀，開啟冷媒，靜置過夜，第二天棄去上 清液，沉淀再加一倍酒精進行脫水，棄去上清，加入一定量的純化水溶解，溶解液過除菌膜， 放入冰箱凍干，收得最終產品依諾肝素鈉2. 5kg。
[0039] 實施例3
[0040] 本發(fā)明創(chuàng)造了一種通過陰離子交換層析技術制備依諾肝素鈉的工藝。肝素鈉依次 經過芐索氯銨鹽化、芐基酯化、堿性降解、氧化脫色、過濾除雜、濾液再經陰離子交換層析處 理，得到平均分子量分布范圍符合要求的依諾肝素鈉產品。本發(fā)明采用陰離子交換樹脂，分 布洗脫收集液，制備出質量穩(wěn)定可控，高純度、高活性的依諾肝素產品，質量明顯高于EP現(xiàn) 行版藥典標準（見下表）。
[0041]
【權利要求】
1. 一種制備依諾肝素鈉的工藝，其特征在于：該制備方法包括以下步驟： S1:肝素-芐索氯銨鹽的制備：將肝素鈉和芐索氯銨分別溶解于純化水中，得肝素鈉溶 解液和芐索氯銨溶解液，室溫攪拌下將肝素鈉溶解液緩慢加入到芐索氯銨溶解液中，加入 完畢后繼續(xù)室溫下攪拌，收集沉淀物，即為肝素-芐索氯銨鹽，并將其在50°c?60°C真空干 燥，得到含水量低于5%的肝素-芐索氯銨鹽； 52 :肝素芐基酯的制備：將步驟S1中得到的肝素-芐索氯銨鹽溶解于二氯甲烷中，在 25?45°C下攪拌至充分溶解，加入氯化芐，繼續(xù)攪拌反應24?48小時，再將反應液壓入過 濾器內，加入醋酸鈉甲醇溶液，析出沉淀，靜置，利用壓縮空氣壓濾，甲醇洗滌，沉淀冷凍干 燥，得到含水量低于5%、酯化率大于9的肝素芐基酯； 53 :肝素芐基酯的裂解：將步驟S2中得到的肝素芐基酯充分溶解于純化水中，攪拌，并 在35?65°C下加入氫氧化鈉，反應1?3小時，冷卻到室溫，調pH到中性，加入氯化鈉，析 出油狀物，板框過濾，過膜，加入甲醇析出沉淀，濾板過濾，乙醇洗滌，空氣壓干，得沉淀物； 54 :依諾肝素鈉的脫色：將步驟S3中所述的沉淀物用水充分溶解，調pH到堿性，室溫 脫色10?20分鐘，pH調回到中性，準備進行陰離子交換層析； 55 :陰離子交換層析：采用陰離子交換樹脂，按25-35mg低分子肝素鈉/ml-resin上 樣，溫度為室溫，檢測波長為UV232nm，上樣結束后先用350?550mmol/L的氯化鈉溶液洗 滌，再用1?2mol/L的氯化鈉溶液洗脫，洗脫終點為232nm紫外吸收降至基線平穩(wěn)，收集洗 脫液，檢測分子量分布為重均分子量4000?4600,2000?8000分子量的比例為72-78% ; 56 :凍干：酒精沉淀，除菌，凍干，得到所述的依諾肝素鈉。
2. 根據(jù)權利要求1所述的制備依諾肝素鈉的工藝，其特征在于：步驟S1中，所述肝 素-芐索氯銨鹽的獲得方法為：將肝素鈉溶解液緩慢加入到芐索氯銨溶解液中后繼續(xù)室溫 下攪拌1?5小時，將初步得到的沉淀物離心，反復用純化水洗滌，再離心，直到濾液遇10% 的硝酸銀溶液不顯渾濁的沉淀物為所述的肝素-芐索氯銨鹽，然后將其真空干燥，得到最 終含水量低于5%的肝素節(jié)索氯銨鹽。
3. 根據(jù)權利要求1所述的制備依諾肝素鈉的工藝，其特征在于：步驟S2中，肝素芐基 酯的具體制備方法為：將步驟S1中得到的肝素-芐索氯銨鹽按1 : 1?5溶解于二氯甲 烷中，開啟機械攪拌，在25?45°C下攪拌至充分溶解，加入1?5倍量的氯化芐，繼續(xù)保持 25?45°C，攪拌反應24?48小時，將反應液壓入三合一濾器，邊攪拌邊加入醋酸鈉甲醇溶 液，析出沉淀，靜置，利用壓縮空氣壓濾，甲醇洗滌，反復幾次直至濾液遇水無乳化現(xiàn)象，沉 淀冷凍干燥24小時，得到肝素芐基酯，含水量低于5%，酯化率大于9。
4. 根據(jù)權利要求3所述的制備依諾肝素鈉的工藝，其特征在于：加入等體積的10%醋 酸鈉甲醇溶液。
5. 根據(jù)權利要求1所述的制備依諾肝素鈉的工藝，其特征在于：在步驟S3中，將肝素 芐基酯按1 : 1?30的重量比加入至純化水中并充分溶解。
6. 根據(jù)權利要求1所述的制備依諾肝素鈉的工藝，其特征在于：將步驟S3中充分溶解 于純化水中的肝素芐基酯在35?65°C的攪拌條件下加入5%?12%氫氧化鈉固體的溶解 液，反應完畢后接上冷媒管迅速冷卻到室溫。
7. 根據(jù)權利要求1所述的制備依諾肝素鈉的工藝，其特征在于：所述過膜為過0. 45 μ m 的膜。
8. 根據(jù)權利要求1所述的制備依諾肝素鈉的工藝，其特征在于：步驟S4中，通過加入 0. 5?1. 5%的雙氧水在室溫下進行脫色。
9. 根據(jù)權利要求1所述的制備依諾肝素鈉的工藝，其特征在于：步驟S6中所述酒精沉 淀是向洗脫液中加入兩倍酒精進行沉淀，開啟冷媒，靜置過夜，第二天棄去上清液，沉淀再 加一倍酒精進行脫水，棄去上清，加入一定量的純化水進行溶解。
10. 根據(jù)權利要求1所述的制備依諾肝素鈉的工藝，其特征在于：步驟S6中所述的除 菌為通過除菌膜進行除菌。
【文檔編號】C08B37/10GK104086674SQ201410361424
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權日:2014年7月28日
【發(fā)明者】周翔, 金晶, 陶翎, 費清清 申請人:常州千紅生化制藥股份有限公司