一種濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝，屬于生物工程領(lǐng)域。采用擴(kuò)張柱床離子交換樹脂法。改變了使用傳統(tǒng)的離子交換固定柱床吸附技術(shù)原料液中不能含有不溶性顆粒的限制，并可將肝素與雜質(zhì)蛋白、核酸及其余硫酸多糖分離，濃縮，純化一次完成。減少工序，縮短時(shí)間，降低成本，提高效率和質(zhì)量。
【專利說明】一種濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝，屬于生物工程領(lǐng)域，具體是一種采用擴(kuò)張柱床離子交換吸附層析技術(shù)濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝。
技術(shù)背景
[0002]肝素(heparin)是1916年Mclean研宄凝血機(jī)制時(shí)從肝臟組織中發(fā)現(xiàn)的一種酸性粘多糖。1939年，Brinkhous等證明了肝素具有抗凝血活性，從此，肝素作為天然抗凝血物質(zhì)而受到世界各國的重視。
目前，非氧化法制備肝素比較常用的方法是離子交換樹脂法。離子交換樹脂的性能和工藝是決定收率的關(guān)鍵，要選擇好樹脂的處理方法和處理時(shí)間，使其最大限度地進(jìn)行肝素的交換吸附。國內(nèi)離子交換樹脂法普遍采用分批吸附的方法，上柱、除雜、洗脫分開進(jìn)行。這種方法柱效低，對(duì)樹脂損害大，操作步驟多，費(fèi)用高，活性成分提取率低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明公開了一種純化肝素的生產(chǎn)工藝。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝，其步驟如下:
(I)粗品制備:
a)豬、牛、羊等哺乳動(dòng)物的小腸粘膜或肝、肺等臟器的組織勻漿液中加入NaCI，攪拌、靜置、過濾。
[0005]b)在 ρΗ7.5-10.5，40-50 °C 下酶解數(shù)小時(shí)，NaOH 調(diào) pH 至 8.0-10.0，升溫至50-55°C，保溫2-4h，不斷攪拌，然后快速升溫到92-95°C，保持10_15min，趁熱用80目濾網(wǎng)過濾，得到濾液(I)備用。
c)擴(kuò)張床柱Streamline50裝入已處理好的強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂。控制溫度40-65°C，用蠕動(dòng)泵調(diào)pH為7.5-10.5，適量MTris-HCl緩沖液自柱床底部泵入，使樹脂擴(kuò)張并保持平衡。保持PH值不變，將適量濾液(I)加MTris-HCl緩沖液配制成NaCI為2_6%，pH為7.5-10.5的溶液，用蠕動(dòng)泵通進(jìn)擴(kuò)張交換柱中先平衡樹脂，然后反復(fù)進(jìn)行離子交換，流速約為每小時(shí)2倍柱床體積，直至流出液檢驗(yàn)無肝素，全部吸附在樹脂上為止。
d)然后配制適量的的2.5-6.5%氯化鈉溶液，MTris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)pH3_5，以2?3個(gè)沉積床體積的緩沖液平衡/擴(kuò)張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個(gè)過程控制溫度15-30°C。
e)關(guān)掉蠕動(dòng)泵，使D254樹脂重新沉積，調(diào)節(jié)活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態(tài)進(jìn)行洗脫。
[0006]f)按洗脫液體積加入1.0倍量的預(yù)冷乙醇，沉淀過夜。
g)次日吸除乙醇。沉淀物用1.5-2.5%氯化鈉溶液溶解，調(diào)pH至6.0。按溶液體積加
0.7倍乙醇，沉淀過夜。
h)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水。真空干燥后得肝素。
(2)精品制備:
a)將肝素粗品以1: 10的比例溶于3%的氯化鈉溶液中，然后再用2%的氫氧化鈉溶液調(diào)PH至7.5-11.5，于室溫靜置數(shù)小時(shí)，真空抽濾，去沉淀物，濾液待用。
b)在上述清液中加入0.05-0.2%胰蛋白酶，在pH7.5-10.5，35_45°C酶解數(shù)小時(shí)，升溫98-100°C，10-15min，趁熱真空抽濾，濾液備用。
c)擴(kuò)張床柱Streamline50裝入已處理好的強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，用蠕動(dòng)泵將PH7-10，適量MTris-HCl緩沖液自柱床底部泵入，使樹脂擴(kuò)張并保持平衡。
d)控制溫度40-60°C，將適量濾液加MTris-HCl緩沖液配制pH為7.5-10.5的溶液，用蠕動(dòng)泵通進(jìn)擴(kuò)張交換柱中反復(fù)進(jìn)行離子交換，交換過程中保持PH值與溫度恒定，流速約為每小時(shí)2倍柱床體積，直至流出液檢驗(yàn)無肝素，全部吸附在樹脂上為止。
e)然后配制適量的預(yù)冷的2.5-6.5%氯化鈉溶液，MTris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)ρΗ1_3，以2?3個(gè)沉積床體積的緩沖液平衡/擴(kuò)張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個(gè)過程控制溫度3-6 °C，流速約為每小時(shí)2.5柱床體積。
f)關(guān)掉蠕動(dòng)泵，使樹脂重新沉積，調(diào)節(jié)活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態(tài)進(jìn)行洗脫。
[0007]g)按洗脫液體積加入1.0倍量的預(yù)冷乙醇，沉淀過夜。
h)次日吸除乙醇。沉淀物用2 %氯化鈉溶液溶解，調(diào)pH至6.0。
[0008]i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水。真空干燥后得精品肝素。
有益效果:
本發(fā)明用濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝最后得到效價(jià)高于180U/mg，收率高于80%的高純度肝素鈉。達(dá)到中國藥典標(biāo)準(zhǔn)。

【具體實(shí)施方式】
[0009]實(shí)施例1
a)豬、牛、羊等哺乳動(dòng)物的小腸粘膜的組織勻漿液50g左右加水至250L，加入NaCI，攪拌、靜置、過濾。
b)濾液加入0.25%胰蛋白酶，在pH8.5，40 °C下酶解數(shù)小時(shí)，NaOH調(diào)pH至9.0，升溫至50°C，保溫2h，不斷攪拌，然后快速升溫到92-95°C，保持10_15min，趁熱用80目濾網(wǎng)過濾，濾液(I )備用。
c)取適量強(qiáng)堿性D254干樹脂，在蒸餾水中充分浸泡，溶脹后濾干，加等體積乙醇或丙酮攪拌I小時(shí)，用蒸餾水洗凈濾干，加4倍量的2mol/l的鹽酸溶液攪拌2小時(shí)，用蒸餾水洗至中性，濾干；加2倍量2mol/l的氫氧化鈉溶液攪拌2小時(shí)，蒸餾水洗至中性，濾干；最后用2倍量2mol/l的鹽酸溶液攪拌2小時(shí)，水洗至中性。
d)取10g已處理好的強(qiáng)堿性D254樹脂加入擴(kuò)張床柱Streamline50，用蠕動(dòng)泵以每小時(shí)2倍柱床體積的流速將pH為8.0的適量MTris-HCl緩沖液(II )自柱床底部泵入，使樹脂擴(kuò)張并保持平衡。控制溫度40°C (平衡)。
e)將適量濾液(I)加緩沖液(II )，配置成料液(III)。調(diào)整料液(III)NaCI濃度達(dá)到3%左右，NaOH調(diào)pH至8.0。用蠕動(dòng)泵將料液(III)通進(jìn)擴(kuò)張交換柱中反復(fù)進(jìn)行離子交換，交換過程中保持恒定的PH值，溫度為18°C。流速約為每小時(shí)2.5倍柱床體積，直至流出液檢驗(yàn)無肝素，全部吸附在樹脂上為止(上樣)。，
f)配制10個(gè)柱床體積的6%氯化鈉溶液，MTris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)pH3_5，以2?3個(gè)沉積床體積的緩沖液平衡/擴(kuò)張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個(gè)過程控制溫度15-25°C，流速約為每小時(shí)2.5柱床體積。(向上沖洗，除雜)。
g)關(guān)掉蠕動(dòng)泵，使D254樹脂重新沉積，調(diào)節(jié)活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態(tài)進(jìn)行洗脫。樹脂先用用約4倍柱床體積的4%氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。再用約2倍柱床體積的3%氯化鈉溶液(用量先多后少)同法洗脫2次。合并全部洗脫液，調(diào)節(jié)PH為6 (洗脫)。
h)按洗脫液體積加入1.0倍量的預(yù)冷乙醇，沉淀過夜。次日吸除乙醇。沉淀物用2%氯化鈉溶液溶解，調(diào)pH至6.0。按溶液體積加0.7倍乙醇，沉淀過夜。
i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水。真空干燥后得肝素成品。
實(shí)施例2
a)將1g肝素粗品溶于3%的10ml氯化鈉溶液中，然后再用2%的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至9，于18°C靜置6小時(shí)，真空抽濾，濾液待用。
[0010]b)在上述清液中加入0.03 %胰蛋白酶，在pH8.5，40 °C下酶解4小時(shí)，升溫98-100°C，10min，趁熱真空抽濾，濾液(I )備用。
[0011]c)取適量強(qiáng)堿性D254干樹脂，在蒸餾水中充分浸泡，溶脹后濾干，加等體積乙醇或丙酮攪拌I小時(shí)，用蒸餾水洗凈濾干，加4倍量的2mol/l的鹽酸溶液攪拌2小時(shí)，用蒸餾水洗至中性，濾干；加2倍量2mol/l的氫氧化鈉溶液攪拌2小時(shí)，蒸餾水洗至中性，濾干；最后用2倍量2mol/l的鹽酸溶液攪拌2小時(shí)，水洗至中性。
[0012]d)取30g已處理好的強(qiáng)堿性D254樹脂加入擴(kuò)張床柱Streamline50 (5cm內(nèi)徑)、用蠕動(dòng)泵以每小時(shí)2倍柱床體積的流蘇將pH為8.0的適量MTris-HCl緩沖液(II )自柱床底部泵入，使樹脂擴(kuò)張并保持平衡(平衡)。
[0013]e)調(diào)整pH值9不變，將適量濾液(I )加緩沖液(II )，使粗品氯化鈉濃度達(dá)到3%左右(III)。用蠕動(dòng)泵將料液(III)通進(jìn)擴(kuò)張交換柱中反復(fù)進(jìn)行離子交換，交換過程中保持恒定的PH值，保持溫度20°C。流速約為每小時(shí)2倍柱床體積，直至流出液檢驗(yàn)無肝素，全部吸附在樹脂上為止(上樣)。
[0014]f)配制約10個(gè)柱床體積的預(yù)冷的6 %氯化鈉溶液，用MTris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)PH1.2，緩沖液平衡/擴(kuò)張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個(gè)過程控制溫度5°C度以下，流速約為每小時(shí)2.5柱床體積。(向上沖洗)。
[0015]g)關(guān)掉蠕動(dòng)泵，使D254樹脂重新沉積，調(diào)節(jié)活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態(tài)進(jìn)行洗脫。樹脂先用用約4倍柱床體積的pH為8的4%氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。再用約2倍柱床體積的3%氯化鈉溶液(用量先多后少)同法洗脫2次。合并全部洗脫液，調(diào)節(jié)pH為6 (洗脫)。
[0016]h)按洗脫液體積加入1.0倍量的預(yù)冷乙醇，沉淀過夜。次日吸除乙醇。沉淀物用2%氯化鈉溶液溶解，調(diào)pH至6.0。按溶液體積加0.7倍乙醇，沉淀過夜。
[0017]i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水。真空干燥后得精品肝素。
[0018]實(shí)施例3
a)豬、牛、羊等哺乳動(dòng)物的肝、肺等臟器的組織勻漿液30g左右加水至250L，加入NaCI至5%，攪拌、靜置、過濾。
[0019]b)在上述清液中加入0.4%木瓜蛋白酶，在pH8.5，40°C下酶解4小時(shí)，升溫98-100°C，10分鐘，趁熱真空抽濾，濾液(I )備用。
[0020]c)取適量強(qiáng)堿性D254干樹脂，在蒸餾水中充分浸泡，溶脹后濾干，加等體積乙醇或丙酮攪拌I小時(shí)，用蒸餾水洗凈濾干，加4倍量的2mol/l的鹽酸溶液攪拌2小時(shí)，用蒸餾水洗至中性，濾干；加2倍量2mol/l的氫氧化鈉溶液攪拌2小時(shí)，蒸餾水洗至中性，濾干；最后用2倍量2mol/l的鹽酸溶液攪拌2小時(shí)，水洗至中性。
[0021]d)取10g已處理好的強(qiáng)堿性D254樹脂加入擴(kuò)張床柱Streamline50 (5cm內(nèi)徑)、用蠕動(dòng)泵以每小時(shí)2倍柱床體積的流速將pH為8.0的適量MTris-HCl緩沖液(II )自柱床底部泵入，使樹脂擴(kuò)張并保持平衡。控制溫度40°C (平衡)。
[0022]e)將適量濾液(I )加緩沖液(II )，配置成料液(III)。調(diào)整料液(III) NaCI濃度達(dá)到3%左右，NaOH調(diào)pH至8.0。用蠕動(dòng)泵將料液(III)通進(jìn)擴(kuò)張交換柱中反復(fù)進(jìn)行離子交換，交換過程中保持恒定的PH值，溫度為18°C。流速約為每小時(shí)2.5倍柱床體積，直至流出液檢驗(yàn)無肝素，全部吸附在樹脂上為止(上樣)。
[0023]f)配制10個(gè)柱床體積的6%氯化鈉溶液，MTris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)pH3_5，以2?3個(gè)沉積床體積的緩沖液平衡/擴(kuò)張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個(gè)過程控制溫度15-25°C，流速約為每小時(shí)2.5柱床體積。(向上沖洗，除雜)。
[0024]g)關(guān)掉蠕動(dòng)泵，使D254樹脂重新沉積，調(diào)節(jié)活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態(tài)進(jìn)行洗脫。樹脂先用用約4倍柱床體積的4%氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。再用約2倍柱床體積的3%氯化鈉溶液(用量先多后少)同法洗脫2次。合并全部洗脫液，調(diào)節(jié)PH為6(洗脫)。
[0025]h)按洗脫液體積加入1.0倍量的預(yù)冷乙醇，沉淀過夜。次日吸除乙醇。沉淀物用2%氯化鈉溶液溶解，調(diào)pH至6.0。按溶液體積加0.7倍乙醇，沉淀過夜。
[0026]i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水。真空干燥后得肝素成品。
【權(quán)利要求】
1.一種濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝，其特征在于其工藝步驟如下: (1)粗品制備: a)豬、牛、羊等哺乳動(dòng)物的小腸粘膜或肝、肺等臟器的組織勻漿液中加入NaCI，攪拌、靜置、過濾； b)在ρΗ7.5-10.5，40-50 °C 下酶解數(shù)小時(shí)，NaOHi周 pH 至 8.0-10.0，升溫至 50-55。。，保溫2-4h，不斷攪拌，然后快速升溫到92-95°C，保持10-15min，趁熱用80目濾網(wǎng)過濾，得到濾液⑴備用； c)擴(kuò)張床柱Streamline50裝入已處理好的強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂； 控制溫度40-65°C，用蠕動(dòng)泵調(diào)pH為7.5-10.5，適量MTris-HCl緩沖液自柱床底部泵入，使樹脂擴(kuò)張并保持平衡； 保持pH值不變，將適量濾液⑴加MTris-HCl緩沖液配制成NaCI為2_6%，pH為7.5-10.5的溶液，用蠕動(dòng)泵通進(jìn)擴(kuò)張交換柱中先平衡樹脂，然后反復(fù)進(jìn)行離子交換，流速約為每小時(shí)2倍柱床體積，直至流出液檢驗(yàn)無肝素，全部吸附在樹脂上為止； d)然后配制適量的的2.5-6.5%氯化鈉溶液，MTris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)pH3_5，以2?3個(gè)沉積床體積的緩沖液平衡/擴(kuò)張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個(gè)過程控制溫度15-30 0C ； e)關(guān)掉蠕動(dòng)泵，使D254樹脂重新沉積，調(diào)節(jié)活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態(tài)進(jìn)行洗脫； f)按洗脫液體積加入1.0倍量的預(yù)冷乙醇，沉淀過夜； g)次日吸除乙醇； 沉淀物用1.5-2.5%氯化鈉溶液溶解，調(diào)pH至6.0 ; 按溶液體積加0.7倍乙醇，沉淀過夜； h)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物； 沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水； 真空干燥后得肝素； (2)精品制備: a)將肝素粗品以1: 10的比例溶于3%的氯化鈉溶液中，然后再用2%的氫氧化鈉溶液調(diào)PH至7.5-11.5，于室溫靜置數(shù)小時(shí)，真空抽濾，去沉淀物，濾液待用； b)在上述清液中加入0.05-0.2%胰蛋白酶，在pH7.5-10.5，35_45°C酶解數(shù)小時(shí)，升溫98-100°C，10-15min，趁熱真空抽濾，濾液備用； c)擴(kuò)張床柱Streamline50裝入已處理好的強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，用蠕動(dòng)泵將PH7-10，適量MTris-HCl緩沖液自柱床底部泵入，使樹脂擴(kuò)張并保持平衡； d)控制溫度40-60°C，將適量濾液加MTris-HCl緩沖液配制pH為7.5-10.5的溶液，用蠕動(dòng)泵通進(jìn)擴(kuò)張交換柱中反復(fù)進(jìn)行離子交換，交換過程中保持PH值與溫度恒定，流速約為每小時(shí)2倍柱床體積，直至流出液檢驗(yàn)無肝素，全部吸附在樹脂上為止； e)然后配制適量的預(yù)冷的2.5-6.5%氯化鈉溶液，MTris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)ρΗ1_3，以2?3個(gè)沉積床體積的緩沖液平衡/擴(kuò)張柱床后，以5-6倍沉積床體積的緩沖液除雜，整個(gè)過程控制溫度3-6 °C，流速約為每小時(shí)2.5柱床體積； f)關(guān)掉蠕動(dòng)泵，使樹脂重新沉積，調(diào)節(jié)活塞至剛好在沉積床的表面，然后以向下的液流和沉積床的狀態(tài)進(jìn)行洗脫； g)按洗脫液體積加入1.0倍量的預(yù)冷乙醇，沉淀過夜； h)次日吸除乙醇； 沉淀物用2%氯化鈉溶液溶解，調(diào)pH至6.0 ; i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物； 沉淀物依序用無水乙醇、丙酮洗滌脫水； 真空干燥后得精品肝素； 如權(quán)利要求1所述:擴(kuò)張柱床離子交換色譜技術(shù)的原料為豬、牛、羊等哺乳動(dòng)物的小腸粘膜、肝、肺臟等臟器和粗品肝素。
2.如權(quán)利要求1所述的濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝，其特征在于:步驟(I)中c擴(kuò)張柱床溫度控制為40-65 °C。
3.如權(quán)利要求1所述的濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝，其特征在于:步驟(I)中c擴(kuò)張柱床Ph 調(diào)控在 7.5-10.5。
4.如權(quán)利要求1所述的濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝，其特征在于:步驟(I)中d使用的氯化鈉質(zhì)量百分濃度為2.5-6.5%。
5.如權(quán)利要求1所述的濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝，其特征在于:步驟(2)中a氫氧化鈉調(diào)節(jié)Ph范圍為7.5-11.5。
6.如權(quán)利要求1所述的濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝，其特征在于:步驟(2)中c強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂作為吸附介質(zhì)。
7.如權(quán)利要求1所述的濃縮純化肝素的生產(chǎn)工藝，其特征在于:步驟(2)中e溫度控制的范圍為3 — 6°C。
【文檔編號(hào)】C08B37/10GK104479050SQ201410813643
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月24日
【發(fā)明者】劉乃山, 劉忠凱, 遲培升 申請(qǐng)人:青島九龍生物醫(yī)藥有限公司