關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的聲明本發(fā)明在國(guó)立衛(wèi)生研究院授予的合作協(xié)議下，在授予號(hào)dk040949和dk074176下以政府支持進(jìn)行。美國(guó)政府對(duì)本發(fā)明可具有一定的權(quán)利。發(fā)明背景本發(fā)明涉及顯示增強(qiáng)的藥學(xué)性質(zhì)的多肽激素類似物，所述增強(qiáng)的藥學(xué)性質(zhì)例如熱力學(xué)穩(wěn)定性增加、對(duì)高于室溫的熱纖維化的抗性增強(qiáng)、促有絲分裂性降低和/或藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)改變，即，相對(duì)于(a)類似于對(duì)應(yīng)的膳食或野生型人激素的可溶性制劑的速效組分和(b)類似于野生型胰島素或胰島素類似物的微晶nph制劑的長(zhǎng)效組分，賦予雙相性作用時(shí)程。更特別地，本發(fā)明涉及由單一多肽鏈組成的胰島素類似物，其(i)包含一類新的在a和b結(jié)構(gòu)域之間縮短連接的(c)結(jié)構(gòu)域，其中第一和第二位置為酸性殘基；(ii)包含位置a8的氨基酸置換；和(iii)包含位置a14的酸性殘基。長(zhǎng)度6-11個(gè)殘基的該類型的c結(jié)構(gòu)域由類似于野生型前胰島素的n-末端酸性元件和c-末端區(qū)段堿性元件組成。本發(fā)明的單鏈胰島素類似物可任選地包含在a或b結(jié)構(gòu)域的其它位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)或非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸置換，例如本領(lǐng)域已知賦予速效作用的位置b28和b29。非標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，包括治療劑和疫苗的工程改造，可具有廣泛的醫(yī)學(xué)和社會(huì)益處。天然存在的蛋白質(zhì)—如通常在人類、其它哺乳動(dòng)物、脊椎生物、無脊椎生物或真核細(xì)胞的基因組中所編碼的—經(jīng)常賦予多種生物學(xué)活性。非標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的益處將實(shí)現(xiàn)選擇性活性，例如與無意和不利的副作用(例如促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng))有關(guān)的同源細(xì)胞受體的結(jié)合降低。社會(huì)益處的又一實(shí)例將是對(duì)室溫或高于室溫的降解的抗性增強(qiáng)，促進(jìn)運(yùn)輸、分配和使用。治療性蛋白質(zhì)的實(shí)例提供為胰島素。野生型人胰島素和其它哺乳動(dòng)物的基因組中編碼的胰島素分子結(jié)合在多種器官和各種類型的細(xì)胞中的胰島素受體，不管由可選的rna剪接模式或由可選的翻譯后糖基化模式產(chǎn)生的受體同種型如何。野生型胰島素還以較低的親和力結(jié)合同源的1型胰島素-樣生長(zhǎng)因子受體(igf-1r)。其它醫(yī)學(xué)益處的實(shí)例將是可溶性制劑的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的優(yōu)化，使得胰島素作用時(shí)程具有兩個(gè)階段，快速階段和延遲階段(圖1)。快速和延遲階段的這樣的組合在本領(lǐng)域已知由鋅胰島素類似物六聚體的溶液(如通過但不限于賴脯胰島素和門冬胰島素提供)與所述類似物的微晶混懸液(與鋅離子和魚精蛋白或魚精蛋白相關(guān)的堿性肽組合制備)的混合物賦予；后一組分在本領(lǐng)域被稱為neutralprotaminehagedorn(nph)微晶混懸液。本領(lǐng)域已知的預(yù)混合胰島素產(chǎn)品包含各種比率的這兩種組分，例如25％可溶相和75％微晶相、30％可溶相和70％微晶相、或50％的各相。由于這樣的預(yù)混合產(chǎn)品易于使用，相對(duì)于單獨(dú)給予膳食(速效)胰島素制劑(或膳食胰島素類似物制劑)和野生型胰島素或胰島素類似物的nph微晶混懸液，每天皮下注射次數(shù)減少，因此它們廣泛用于發(fā)展中國(guó)家的糖尿病患者。由預(yù)混合雙相性胰島素產(chǎn)品提供的胰島素的胰島素方案的簡(jiǎn)化還已證明了對(duì)以下患者的益處：富裕人社會(huì)的糖尿病患者，(i)對(duì)于他們而言，單獨(dú)通過膳食胰島素類似物制劑治療導(dǎo)致亞最佳的糖血控制或過度體重增加；(ii)對(duì)于他們而言，單獨(dú)通過nph胰島素產(chǎn)品或基礎(chǔ)胰島素類似物制劑治療導(dǎo)致亞最佳的糖血控制，這是由于在餐后3小時(shí)內(nèi)血糖濃度向上偏移導(dǎo)致；或(iii)上述兩種類型的患者，對(duì)于他們而言，加入口服藥(例如二甲雙胍)不導(dǎo)致令人滿意的糖血控制。由于發(fā)酵后和純化后步驟需要生長(zhǎng)nph微-結(jié)晶，現(xiàn)有的雙相性胰島素產(chǎn)品需要復(fù)雜和昂貴的生產(chǎn)方法。此外，這樣的產(chǎn)品經(jīng)受可溶性和微晶組分二者對(duì)高于室溫的物理和化學(xué)降解的內(nèi)在敏感性。由于在可溶相和微晶相之間胰島素分子的互換，這些預(yù)混合產(chǎn)品的雙相性藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)可隨小管在高于室溫下的貯存而變化。最后，因?yàn)槌槲胱⑸淦鞯奈?結(jié)晶的數(shù)量可隨不同抽吸而(即使來自同一小管)變化，使用微晶混懸液可能伴有劑量的不確定性。根據(jù)目前的雙相性胰島素產(chǎn)品的上述缺點(diǎn)，雙相性胰島素制劑的治療性和社會(huì)益處會(huì)通過工程改造胰島素類似物來提高，所述胰島素類似物作為單一組分可溶性溶液的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)賦予雙相性模式的胰島素作用。如果該新型的可溶性胰島素類似物制備較簡(jiǎn)單和成本較低(即，避免對(duì)于微-結(jié)晶的需要)和/或如果該新型的可溶性胰島素類似物比野生型胰島素更耐受在室溫下或高于室溫的化學(xué)或物理降解，會(huì)獲得另外的益處。所述耐受高于室溫的降解將預(yù)期促進(jìn)在發(fā)展中國(guó)家地區(qū)(其中不能持續(xù)獲得電力和冷藏)中使用。這樣的降解造成的挑戰(zhàn)通過非洲和亞洲的即將發(fā)生的糖尿病大流行被加深。因?yàn)槔w維化造成在高于室溫的降解主要途徑，抵抗纖維化的制劑的設(shè)計(jì)可提高在這樣的受到挑戰(zhàn)的地區(qū)中胰島素替換療法的安全性和功效。如果可溶性雙相性胰島素類似物應(yīng)在經(jīng)開發(fā)以監(jiān)測(cè)胰島素-刺激的人癌細(xì)胞系增殖的測(cè)定法中顯示促有絲分裂性降低，會(huì)獲得再另外的治療性和社會(huì)益處。很久以前就已將給予胰島素確立為用于糖尿病的治療。在糖尿病患者中常規(guī)胰島素替換療法的主要目的是緊密控制血糖濃度以防止其高于或低于健康人受試者特有的正常范圍的偏移。低于正常范圍的偏移伴隨有直接腎上腺素能癥狀或神經(jīng)性低血糖癥狀(neuroglycopenicsymptoms)，其在嚴(yán)重發(fā)作時(shí)其導(dǎo)致驚厥、昏迷和死亡。高于正常范圍的偏移伴隨有微血管疾病的長(zhǎng)期風(fēng)險(xiǎn)增加，包括視網(wǎng)膜病變、失明和腎衰竭。胰島素是一種小的球狀蛋白質(zhì)，其在脊椎動(dòng)物的新陳代謝中起重要作用。胰島素包含兩條鏈，包含21個(gè)殘基的a鏈和包含30個(gè)殘基的b鏈。該激素在胰腺β-細(xì)胞中作為zn2+-穩(wěn)定的六聚體貯存，但在血流中作為無zn2+-單體發(fā)揮作用。胰島素是單鏈前體前胰島素的產(chǎn)物，在該前胰島素中連接區(qū)域(35個(gè)殘基)連接b鏈的c-末端殘基(殘基b30)與a鏈的n-末端殘基。各種證據(jù)表明，其由胰島素-樣的核心和雜亂的連接肽組成。認(rèn)為三個(gè)特定的二硫橋(a6–a11、a7–b7和a20–b19)的形成與前胰島素在粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)中的氧化折疊有關(guān)。前胰島素在從er輸出至高爾基體后不久裝配形成可溶性zn2+-配位的六聚體。內(nèi)部蛋白水解消化和轉(zhuǎn)化為胰島素在未成熟的分泌顆粒中發(fā)生，接著形態(tài)學(xué)濃縮。在成熟貯藏顆粒中晶狀排列的鋅胰島素六聚體已通過電子顯微術(shù)(em)可視化。每個(gè)殘基通過氨基酸的身份(通常使用標(biāo)準(zhǔn)三字母代碼)、鏈和序列位置(通常作為上標(biāo))指明。本發(fā)明涉及長(zhǎng)度6-11個(gè)殘基的新型縮短的c結(jié)構(gòu)域的發(fā)明，其包含n-末端酸性基序和c-末端堿性基序，替換了人前胰島素特有的36-殘基野生型c結(jié)構(gòu)域；和與a鏈的位置a8和a14，和任選地b鏈的位置b28和b29的氨基酸置換組合。纖維化，其為一種在用于治療糖尿病的胰島素和胰島素類似物的生產(chǎn)、儲(chǔ)存和使用中的嚴(yán)重顧慮，隨更高溫度、更低ph、攪動(dòng)或存在脲、胍、乙醇共溶劑或疏水表面而增強(qiáng)。當(dāng)前的美國(guó)藥物條例要求如果發(fā)生1％或更高水平的纖維化，則胰島素被丟棄。因?yàn)槔w維化在較高溫度下增強(qiáng)，糖尿病患者最好在使用前必須保持胰島素冷藏。胰島素顯示在高于25℃的溫度下每10℃增量，降解速率增加10倍或更高；因此，指導(dǎo)方針要求在<30℃的溫度下貯存和優(yōu)選地冷藏。現(xiàn)有的雙相性胰島素產(chǎn)品的nph微晶組分對(duì)高于室溫的纖維化，以及由于a鏈內(nèi)的蛋白水解裂解導(dǎo)致的不同的化學(xué)降解模式敏感；這樣的裂解使胰島素或胰島素類似物失活。在nph微-結(jié)晶中胰島素a鏈的上述裂解代表了一個(gè)涉及化學(xué)鍵斷裂的過程。這樣的斷裂可導(dǎo)致胰島素分子內(nèi)的原子丟失或重排或在不同的胰島素分子之間化學(xué)鍵的形成，導(dǎo)致形成聚合物。盡管認(rèn)為在nph微-結(jié)晶中a鏈的裂解在折疊狀態(tài)的表面上發(fā)生，但在蛋白質(zhì)的未折疊狀態(tài)下或以部分未折疊形式的蛋白質(zhì)，介導(dǎo)化學(xué)鍵的其它變化，并且增加其熱力學(xué)穩(wěn)定性的這樣的胰島素修飾也有可能延遲或阻止化學(xué)降解。因此，胰島素類似物的一種合乎需要的性質(zhì)為，其變性自由能(如通常通過在螺旋-敏感性波長(zhǎng)下作為化學(xué)變性劑的濃度的函數(shù)通過圓二色性所測(cè)量)應(yīng)該等于或大于野生型胰島素的變性自由能，或等于或大于當(dāng)前臨床使用的膳食(速效)胰島素類似物的變性自由能。胰島素還對(duì)物理降解敏感。蛋白質(zhì)纖維化的當(dāng)前理論假定纖維化機(jī)制通過部分折疊的中間狀態(tài)進(jìn)行，其進(jìn)而聚集以形成淀粉狀蛋白發(fā)生核心。在該理論中，可能的是，穩(wěn)定天然狀態(tài)的氨基酸置換可能或不可能穩(wěn)定部分折疊的中間狀態(tài)，和可能或不可能增加(或降低)在天然狀態(tài)和中間狀態(tài)之間的自由能屏障。因此，當(dāng)前理論表明，在兩條鏈的胰島素分子中給定氨基酸置換增加或降低纖維化風(fēng)險(xiǎn)的趨勢(shì)是高度不可預(yù)測(cè)的。胰島素分子的結(jié)構(gòu)模型構(gòu)思了幾乎完全展開三個(gè)α-螺旋(如天然狀態(tài)中所見到的)，以及平行排列的β-片形成連續(xù)堆積的b鏈和連續(xù)堆積的a鏈；各鏈之間和a鏈內(nèi)的天然二硫鍵配對(duì)得到保持。這樣的平行交叉-β片需要a鏈的n-末端和b鏈的c-末端之間的顯著分離在胰島素單體的天然狀態(tài)下末端通常靠近具有縮短的c-結(jié)構(gòu)域的單鏈胰島素類似物顯著抵抗纖維化是本領(lǐng)域已知的，和其被認(rèn)為反映了在胰島素原細(xì)絲中的平行交叉-β片的伸展結(jié)構(gòu)和具有天然二硫鍵配對(duì)的單鏈胰島素類似物的結(jié)構(gòu)之間的拓?fù)鋵W(xué)不相容性，其中縮短的c-結(jié)構(gòu)域迫使在a鏈的n-末端和b鏈的c-末端之間的距離不利于原細(xì)絲。單鏈胰島素類似物的帶狀模型顯示于圖2；胰島素部分的空間填充模型顯示于圖3，突出了工程改造的連接結(jié)構(gòu)域(c結(jié)構(gòu)域；圖3中的棍狀表示)的作用。本發(fā)明受醫(yī)學(xué)和社會(huì)需要的啟發(fā)，工程改造了預(yù)期用于每天兩次注射(即，按照類似于當(dāng)前預(yù)混合常規(guī)-nph雙相性胰島素產(chǎn)品的時(shí)間表)的中性ph的可溶性和單相制劑中雙相性單鏈胰島素類似物。我們的單鏈設(shè)計(jì)預(yù)期組合(i)抵抗降解與(ii)顯著的體內(nèi)低血糖功效與(iii)與igf-1r交叉結(jié)合降低和(iv)在不存在由微晶混懸液組成的組分情況下內(nèi)在的雙相性藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)。因此，將需要的是，發(fā)明單鏈胰島素類似物，其在中性ph下作為可溶性蛋白質(zhì)溶液，在皮下注射時(shí)顯示雙相性藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)，使得實(shí)現(xiàn)快速開始作用和作用結(jié)束延長(zhǎng)(prolongedtailofaction)兩者，導(dǎo)致類似于預(yù)混合產(chǎn)品例如“mix75/25”或“30”的總體特征。因此，本發(fā)明的雙相性胰島素類似物制劑會(huì)提供簡(jiǎn)化的基于一天兩次推注的方案，這在發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家將具有臨床優(yōu)點(diǎn)。單鏈雙相性胰島素類似物制劑也可在不受二甲雙胍(一種廣泛用于治療t2dm的一線口服藥)充分控制的未用過胰島素的患者中引入。當(dāng)前常規(guī)nph預(yù)混合產(chǎn)品基于兩種組分的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的雙相性作用機(jī)制，以圖示形式顯示于圖4a。盡管不希望受理論的約束，本發(fā)明類推的雙相性藥代動(dòng)力學(xué)的可能機(jī)制以圖示形式顯示于圖4b。我們展望本發(fā)明的產(chǎn)品將不相稱地使西方社會(huì)的患者獲益，所述西方社會(huì)的患者與較復(fù)雜的方案的相容性是不確定的。本領(lǐng)域已知健康護(hù)理結(jié)果—以及對(duì)慢性疾病例如t2dm和代謝綜合征的處方方案的長(zhǎng)期堅(jiān)持—是社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀態(tài)、正式教育、家庭結(jié)構(gòu)和文化信念體系的一項(xiàng)復(fù)雜功能。事實(shí)上，鑒于在缺乏代表性的少數(shù)人中，包括非洲裔美國(guó)人、西班牙人裔美國(guó)人和本土美國(guó)人，越來越多的肥胖癥和t2dm負(fù)擔(dān)，這些社會(huì)問題日益受到關(guān)注。因此預(yù)期本發(fā)明的單鏈雙相性胰島素類似物制劑使需要胰島素的t1dm和t2dm患者獲益，所述患者用僅基礎(chǔ)胰島素的療法具有不充足的糖血控制，但對(duì)其而言，完全基礎(chǔ)推注的方案是不實(shí)際的。發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供單鏈胰島素類似物，在皮下注射時(shí)其提供雙相性藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)。本發(fā)明的類似物包含在位置b10的組氨酸，因此回避了關(guān)于與該位置的酸性置換(天冬氨酸或谷氨酸)有關(guān)的致癌物的顧慮。本發(fā)明的另一方面是，相對(duì)于野生型人胰島素，單鏈胰島素類似物對(duì)ir-a和ir-b的絕對(duì)體外親和力在范圍5-100％內(nèi)，因此不可能在激素-受體復(fù)合物中顯示延長(zhǎng)的停留時(shí)間。上述特征組合由新型的c-結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)賦予，其中縮短的連接多肽(長(zhǎng)度6-11個(gè)殘基)包含n-末端酸性元件(殘基c1和c2)、柔性連接或鉸鏈(c3和c4)，和包含一對(duì)類似于天然前胰島素中見到的那些的堿性殘基的c-末端區(qū)段(c5和c6)。對(duì)于c-結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度，選擇上限11，其低于描述于具有提高的igf-1r結(jié)合活性的嵌合胰島素類似物中的12個(gè)殘基igf-i衍生的接頭(kristensen,c.等1995)。選擇下限4，以保持連接結(jié)構(gòu)域的n-末端部分的酸性基序(例如但不限于glu-glu)和連接結(jié)構(gòu)域的c-末端部分的堿性基序(例如但不限于arg-arg)。盡管不希望受理論的約束，我們?cè)O(shè)想在所述類似物結(jié)合igf-1r時(shí)，兩個(gè)-殘基的酸性殘基引入不利的靜電斥，但被胰島素受體同種型充分耐受。也不希望受理論的約束，我們進(jìn)一步設(shè)想，c-末端堿性基序有助于部分皮下聚集，而不是僅僅的系鏈或空間元件(tetherorspaceelement)。總體而言，本發(fā)明提供單鏈胰島素類似物，其包含本發(fā)明的c-結(jié)構(gòu)域和包含位置a8和a14的置換的修飾的a鏈。本發(fā)明因此涉及一類新的單鏈胰島素類似物，其中連接結(jié)構(gòu)域(c結(jié)構(gòu)域)具有長(zhǎng)度4-11和由兩個(gè)元件組成。n-末端元件由前兩個(gè)殘基組成(稱為c1和c2，對(duì)應(yīng)于延伸的胰島素b鏈的殘基b31-b32)，其中c1和c2包含至少一個(gè)酸性側(cè)鏈和在ph7.4時(shí)-1或-2的凈形式靜電荷。c-末端元件包含兩個(gè)堿性殘基，例如arg-arg、lys-lys、arg-lys或lys-arg。對(duì)于4個(gè)殘基的連接結(jié)構(gòu)域，本發(fā)明的序列會(huì)因此包括但不限于glu-glu-arg-arg、glu-ala-arg-arg、ala-glu-arg-arg、asp-glu-arg-arg、glu-glu-lys-arg、glu-glu-arg-lys和glu-glu-lys-lys。在長(zhǎng)度大于4(即，范圍5-11)的連接結(jié)構(gòu)域的情況下在n-和c-末端元件之間，連接結(jié)構(gòu)域包含柔性連接。在6個(gè)殘基的連接結(jié)構(gòu)域的實(shí)例中，這樣的序列可包含位置c3和c4的gly-pro、ser-pro、ala、pro、gly-ser、ser-ser、gly-gly或ala-ala，但本發(fā)明的范圍不限于這些可能性。a鏈包含在a8的堿性置換(賴氨酸、精氨酸或組氨酸)和在a21的置換(gly、ala或ser)，以避免酸-催化的脫酰胺作用或其它asn-相關(guān)的化學(xué)降解模式。在一個(gè)實(shí)例中，b鏈還包含置換lysb29→arg，以避免在酵母中進(jìn)行生物合成的過程中l(wèi)ys-特異性的蛋白水解裂解。本發(fā)明的類似物還包含位置a8的置換(ala、glu、gln、his、lys或arg)，預(yù)期提高穩(wěn)定性和活性；和a14的置換(glu)，預(yù)期避免推測(cè)由野生型tyra14導(dǎo)致的反-疏水作用和提供另外的負(fù)電荷。也考慮位置a14的其它可能的置換。附圖簡(jiǎn)述圖1.雙相性胰島素產(chǎn)品的圖示目標(biāo)。最初的實(shí)施使用野生型胰島素(常規(guī)和nph)，而當(dāng)前的產(chǎn)品使用膳食胰島素類似物。該圖獲自r.beaser&s.braunstein,medscapemultispeciality(education/cmesection；2009)(http://www.medscape.org/viewarticle/708784)。圖2.57-殘基sci的帶狀模型。α-螺旋以紅色(外側(cè))和黃色(內(nèi)側(cè))顯示，和b24-b28β-鏈以藍(lán)色(箭頭)顯示。顯示了三個(gè)二硫橋(胱氨酸)(星號(hào))。c-結(jié)構(gòu)域(序列g(shù)ggprr)是充分有序的(hua,q.x.等j.biol.chem.283,14703-16(2008))。圖3.57-殘基sci平臺(tái)的分子結(jié)構(gòu)。6個(gè)殘基的c-結(jié)構(gòu)域(棍；藍(lán)綠色)提供了在a和b結(jié)構(gòu)域之間的系鏈(空間填充圖)。根據(jù)靜電位以標(biāo)準(zhǔn)grasp格式將表面顏色編碼(紅色，負(fù)電；紫色，正電；和白色，中性)。該圖獲自pdb條目2jzq，其基于weiss實(shí)驗(yàn)室的nmr研究(hua,q.x.等j.biol.chem.283,14703-16(2008))。圖4.舊范例和新范例。(a)當(dāng)前的雙相性胰島素產(chǎn)品包含可溶相(鋅六聚體；綠色)和不可溶相(nph微晶混懸液；藍(lán)色)。(b)提議的新范例試圖利用在單體胰島素類似物(i)、無鋅二聚體(i2)、鋅穩(wěn)定的和/或無鋅六聚體(i6)和可溶性聚集物(i6n)中的配對(duì)平衡。未顯示：tr躍遷。圖5.在酵母巴斯德畢赤酵母(p.pastoris)中thermalin-雙相性(形式1和2)的過表達(dá)。考馬斯染色的sds-page凝膠：(a)sci-57pe(泳道b-d)，相對(duì)于分子量標(biāo)記(a)。(b)sci-57dp(泳道g)，相對(duì)于作為陽(yáng)性對(duì)照的hisa8-微小前胰島素(mpi)(f)和標(biāo)準(zhǔn)品(e)。sci遷移≈6千道爾頓(kd)；微小-前胰島素接近5.8kd。圖6.糖尿病大鼠(時(shí)間0血糖為400±20mg/dl)用1單位的指定胰島素類似物/300g體重注射s.q.。a.humalog(賴脯胰島素)對(duì)比(δ)humalog25/75-premix對(duì)比sci-57pe(在圖中標(biāo)記為sci-1)新鮮對(duì)比(◆)sci-57dp(標(biāo)記為sci-2)新鮮對(duì)比(●)稀釋液。b.注射后在前1小時(shí)期間的血糖減少(相同的符號(hào)代碼)。指出了各組的大鼠數(shù)量(n)；誤差棒，標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖7.在1單位指定胰島素類似物s.q.注射后，[血糖]降低的初始速率：+表示在45℃攪動(dòng)25天的sci-57pe(標(biāo)記為sci-1)；++表示在45℃攪動(dòng)57天的sci-57dp(標(biāo)記為sci-2)。*p<0.05，與所有其它胰島素相比。**p<0.05，與預(yù)混合賴脯胰島素75/25相比。數(shù)據(jù)關(guān)于注射后的前1小時(shí)(見圖8b)；誤差棒，標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖8.糖尿病大鼠(時(shí)間0血糖為410±20mg/dl)用1單位的指定類似物/300g體重注射s.q.。a.新鮮樣品：(◆)sci-57dp(標(biāo)記為sci-2)，(δ)lantus(甘精胰島素)，humalog(賴脯胰島素)和(●)稀釋液。a.新鮮胰島素。b.在高溫下攪動(dòng)的影響：(◆)新鮮sci-57dp對(duì)比(□)在45℃攪動(dòng)57天的sci-57dp對(duì)比(○)在45℃攪動(dòng)11天的lantus(甘精胰島素)。圖9.lillyco2+–edta螯合測(cè)定法：在25℃下在加入edta(以10倍摩爾過量)至r6鈷胰島素六聚體或sci-1六聚體的溶液后，在可見波長(zhǎng)574nm處的標(biāo)準(zhǔn)化吸光度作為時(shí)間的函數(shù)顯示。野生型胰島素(黑線)：?jiǎn)?指數(shù)躍遷，時(shí)間常數(shù)6.3(±0.1)min。sci-1(綠線)：雙相性躍遷，時(shí)間常數(shù)0.9(±0.1)min(快速相)和14.1(±0.1)min(慢速相)；r2＝0.998。蛋白質(zhì)為3.5mg/ml，在包含1mmnascn、0.2mmcocl2和50mm苯酚的50mmtris-hcl(ph7.4)中。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及單鏈胰島素類似物，其提供延長(zhǎng)的作用持續(xù)時(shí)間、類似于具有范圍為5-100％的絕對(duì)親和力的野生型胰島素(所選下限對(duì)應(yīng)于前胰島素)的ir-a/ir-b受體結(jié)合親和力的比率、對(duì)igf-1r增加的辨別力、推測(cè)增強(qiáng)的對(duì)位置a21的化學(xué)降解的抗性(由于asn置換為gly、ala或ser)，推測(cè)增強(qiáng)的對(duì)高于室溫的纖維化的抗性(由于單鏈拓?fù)鋵W(xué))和推測(cè)增加的熱力學(xué)活性(部分地由于thra8置換為堿性側(cè)鏈；arg、lys、his、orn)。本發(fā)明的特征在于當(dāng)作為澄清和可溶的蛋白質(zhì)單相溶液配制時(shí)，可通過單鏈胰島素類似物產(chǎn)生自皮下儲(chǔ)庫(kù)的雙相性吸收動(dòng)力學(xué)。本領(lǐng)域已知的常規(guī)預(yù)混合產(chǎn)品，提供了在自裝配的狀態(tài)之間連續(xù)的可能配對(duì)平衡的最終末端(圖4a)。考慮了提供組合快速和延遲吸收的備選策略，其依賴于管理這些配對(duì)平衡和相對(duì)熱力學(xué)穩(wěn)定性的速率常數(shù)，如圖4b中圖示形式所示。該策略的分子實(shí)施需要胰島素類似物，其(i)作為無鋅單體和二聚體是超級(jí)穩(wěn)定的，和(ii)還順從于形成穩(wěn)定的鋅介導(dǎo)的六聚體，其對(duì)高級(jí)聚集敏感(在小瓶或筆中可溶，但在儲(chǔ)庫(kù)中可能不溶)。盡管不希望受理論的約束，無鋅單體和二聚體可提供膳食組分；鋅穩(wěn)定的六聚體聚集物會(huì)提供長(zhǎng)效組分。還不希望受理論的約束，進(jìn)一步可能的是，單鏈胰島素類似物，當(dāng)在血流中作為單體蛋白質(zhì)分子提供時(shí)，可通過它們的激素-受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的固有特征，顯示對(duì)靶細(xì)胞的雙相性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)性質(zhì)，使得它們的藥效學(xué)性質(zhì)可以此方式模擬現(xiàn)有的常規(guī)-nph預(yù)混合產(chǎn)品的雙相性藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。本發(fā)明的特征在于單鏈類似物的等電點(diǎn)為6.8-7.8，使得在存在2-3個(gè)鋅離子/6個(gè)蛋白質(zhì)單體的情況下或在存在少于2個(gè)鋅離子/6個(gè)蛋白質(zhì)單體的情況下在中性條件下(ph7.0-8.0)可溶性制劑是可行的，以至于不能完成六聚體裝配。因此，本發(fā)明的特征在于單鏈胰島素類似物保留經(jīng)歷鋅離子依賴性形成蛋白質(zhì)六聚體的能力，這類似于本領(lǐng)域稱為t6胰島素六聚體、t3rf3胰島素六聚體或r6胰島素六聚體的經(jīng)典的鋅胰島素六聚體。還考慮了單鏈類似物也可用衍生自動(dòng)物胰島素的a-和b-結(jié)構(gòu)域序列制成，非限制性實(shí)例有，例如豬、牛、馬和犬胰島素。此外或備選地，本發(fā)明的胰島素類似物可包含殘基b1-b3的缺失，或可與缺少賴氨酸(例如，野生型人胰島素中的lysb29)的變體b鏈組合，以避免在巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)、釀酒酵母(saccharomycescerevisciae)或其它酵母表達(dá)物種或菌株中在酵母生物合成中前體多肽的指向lys(lys-directed)的蛋白水解。本發(fā)明的單鏈胰島素的b-結(jié)構(gòu)域可任選地包含非標(biāo)準(zhǔn)置換，例如位置b20和/或b23的d-氨基酸(預(yù)期增加熱力學(xué)穩(wěn)定性、受體結(jié)合親和力和對(duì)纖維化的抗性)、在pheb24的2環(huán)位置的鹵素修飾(即，鄰位-f-pheb24、鄰位-cl-pheb24或鄰位-br-pheb24；預(yù)期提高熱力學(xué)穩(wěn)定性和對(duì)纖維化的抗性)、pheb24的2-甲基環(huán)修飾(預(yù)期提高受體結(jié)合親和力)和/或在tyrb16和/或tyrb26的芳環(huán)內(nèi)引入碘-取代(3-單-碘-tyr或[3,5]-二-碘-tyr)；預(yù)期提高熱力學(xué)穩(wěn)定性和受體結(jié)合活性)。還考慮了thrb27、thrb30或c-結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)絲氨酸殘基可單獨(dú)或組合通過單糖加合物而被修飾；實(shí)例為o-連接的n-乙酰基-β-d-吡喃半乳糖苷(稱為galnac-oβ-ser或galnac-oβ-thr)、o-連接的α-d-吡喃甘露糖苷(甘露糖-oβ-ser或甘露糖-oβ-thr)和/或α-d-吡喃葡糖苷(葡萄糖-oβ-ser或葡萄糖-oβ-thr)。此外，根據(jù)人和動(dòng)物胰島素之間的相似性，和在過去動(dòng)物胰島素在人糖尿病患者中的使用，還考慮了在胰島素序列中可引入其它較小修飾，特別是認(rèn)為“保守的”那些置換。例如，可在具有類似側(cè)鏈的氨基酸組內(nèi)進(jìn)行另外的氨基酸置換，而不背離本發(fā)明。這些包括中性疏水氨基酸：丙氨酸(ala或a)、纈氨酸(val或v)、亮氨酸(leu或l)、異亮氨酸(ile或i)、脯氨酸(pro或p)、色氨酸(trp或w)、苯丙氨酸(phe或f)和甲硫氨酸(met或m)。同樣，中性極性氨基酸可在甘氨酸(gly或g)、絲氨酸(ser或s)、蘇氨酸(thr或t)、酪氨酸(tyr或y)、半胱氨酸(cys或c)、谷氨酰胺(glu或q)和天冬酰胺(asn或n)的組內(nèi)彼此置換。認(rèn)為堿性氨基酸包括賴氨酸(lys或k)、精氨酸(arg或r)和組氨酸(his或h)。酸性氨基酸是天冬氨酸(asp或d)和谷氨酸(glu或e)。除非另外注明或從上下文顯而易見，本文所述的氨基酸應(yīng)認(rèn)為是l-氨基酸。標(biāo)準(zhǔn)氨基酸還可被屬于相同化學(xué)類別的非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸置換。通過非限制性實(shí)例，堿性側(cè)鏈lys可被較短側(cè)鏈長(zhǎng)度的堿性氨基酸(鳥氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸)置換。lys還可被中性脂族電子等排體正亮氨酸(nle)置換，其可進(jìn)而被包含較短脂族側(cè)鏈的類似物(氨基丁酸或氨基丙酸)置換。為比較目的，提供了人前胰島素的氨基酸序列，作為seqidno:1。seqidno:1(人前胰島素)phe-val-asn-gln-his-leu-cys-gly-ser-his-leu-val-glu-ala-leu-tyr-leu-val-cys-gly-glu-arg-gly-phe-phe-tyr-thr-pro-lys-thr-arg-arg-glu-ala-glu-asp-leu-gln-val-gly-gln-val-glu-leu-gly-gly-gly-pro-gly-ala-gly-ser-leu-gln-pro-leu-ala-leu-glu-gly-ser-leu-gln-lys-arg-gly-ile-val-glu-gln-cys-cys-thr-ser-ile-cys-ser-leu-tyr-gln-leu-glu-asn-tyr-cys-asn提供了人胰島素的a鏈的氨基酸序列，作為seqidno:2。seqidno:2(人a鏈)gly-ile-val-glu-gln-cys-cys-thr-ser-ile-cys-ser-leu-tyr-gln-leu-glu-asn-tyr-cys-asn提供了人胰島素的b鏈的氨基酸序列，作為seqidno:3。seqidno:3(人b鏈)phe-val-asn-gln-his-leu-cys-gly-ser-his-leu-val-glu-ala-leu-tyr-leu-val-cys-gly-glu-arg-gly-phe-phe-tyr-thr-pro-lys-thr提供了kp-胰島素(賴脯胰島素，的活性組分，elilillyandco.)的修飾的b鏈的氨基酸序列，作為seqidno:4。seqidno:4(人“kp”b鏈)phe-val-asn-gln-his-leu-cys-gly-ser-his-leu-val-glu-ala-leu-tyr-leu-val-cys-gly-glu-arg-gly-phe-phe-tyr-thr-lys-pro-thrseqidno5提供了之前應(yīng)公開的單鏈胰島素類似物的氨基酸序列(hua,q.x.等j.biol.chem.283,14703-16(2008))，其結(jié)構(gòu)顯示在圖1和2。與本發(fā)明的類似物不同，該序列缺少位置a14、c1和c2的酸性殘基，并包含位置b10的酸性殘基；得到的單鏈胰島素類似物不顯示本發(fā)明的需要的雙相性藥效學(xué)性質(zhì)。本發(fā)明的單鏈胰島素類似物的氨基酸序列在seqidno6-19中部分地給出，對(duì)應(yīng)于單鏈胰島素類似物。這些序列使用標(biāo)準(zhǔn)單字母代碼，使得ala由a表示，半胱氨酸由c表示，天冬氨酸由d表示，谷氨酸由e表示等等，如本領(lǐng)域已知的。紅色的元件表示在野生型胰島素或野生型前胰島素中不存在的序列或置換。seqidno13和19中的短劃線表示缺失n-末端殘基b1-b3(稱為des-b1-b3類似物)。本發(fā)明的單鏈胰島素類似物的氨基酸序列還在seqidno20-34中給出，對(duì)應(yīng)于在由x1、x2等表示的位置具有任選元件的單鏈胰島素類似物；這些位置以綠色表示。按上所述，紅色的元件表示在野生型胰島素或野生型前胰島素中不以另外形式存在的序列或置換。seqidno13和19中短劃線表示缺失n-末端殘基b1-b3(稱為des-b1-b3類似物)。其中x1選自ala,arg,asn,asp,gln,glu,或lys；x2選自ala,arg,gln,glu,或lys；x3選自gln,glu,phe,trp,或tyr；和x1選自ala,arg,glu,lys,或pro。本發(fā)明的單鏈胰島素類似物的氨基酸序列還在seqidno35-49中給出，對(duì)應(yīng)于在由y1、y2等表示的連接結(jié)構(gòu)域的位置(紫紅色)具有任選元件并包括以綠色表示的上述任選序列特征x1、x2等的單鏈胰島素類似物。如上述，紅色的元件表示在野生型胰島素或野生型前胰島素中不以另外形式存在的序列或置換。seqidno13和19中的短劃線表示缺失n-末端殘基b1-b3(稱為des-b1-b3類似物)。其中x1選自ala,arg,asn,asp,gln,glu,或lys；x2選自ala,arg,gln,glu,或lys；x3選自gln,glu,phe,trp,或tyr；x1選自ala,arg,glu,lys,或pro；和其中y1和y2各自是asp或glu。本發(fā)明的單鏈胰島素類似物的氨基酸序列還在seqidno50-64中給出，對(duì)應(yīng)于具有另外1-5個(gè)氨基酸殘基(稱為b1-5，在下文以藍(lán)色表示)的單鏈胰島素類似物，其在由y1、y2等表示的連接結(jié)構(gòu)域的位置(紫紅色)具有任選元件并包括以綠色表示的上述任選序列特征x1、x2等。如上述，紅色的元件表示在野生型胰島素或野生型前胰島素中不以另外形式存在的序列或置換。seqidno13和19中的短劃線表示缺失n-末端殘基b1-b3(稱為des-b1-b3類似物)。其中x1選自ala,arg,asn,asp,gln,glu,或lys；x2選自ala,arg,gln,glu,或lys；x3選自gln,glu,phe,trp,或tyr；x1選自ala,arg,glu,lys,或pro；其中y1和y2各自是asp或glu；和其中殘基b1,b2,b3,b4,b5各自任選地存在和可選自ala,asn,gln,gly,pro,ser或thr。以下dna序列編碼seqidno6(見上文)指定的單鏈胰島素類似物，其密碼子對(duì)于巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)中的使用模式進(jìn)行優(yōu)化。seq.id.no65ttcgtcaatcaacacttgtgtggttcccacttggttgaggcattgtacttggtctgtggtgagagaggattcttctacaccgatccaactggtggtggtcctagaagaggaatcgtcgagcaatgttgccactccatttgttccttggaacaattggaaaactactgcaactaa以下dna序列編碼seqidno7(見上文)指定的單鏈胰島素類似物，其密碼子對(duì)于巴斯德畢赤酵母中的使用模式進(jìn)行優(yōu)化。seq.id.no66ttcgtcaatcaacacttgtgtggttcccacttggttgaggcattgtacttggtctgtggtgagagaggattcttctacaccgatccaactggtgagggtcctagaagaggaatcgtcgagcaatgttgccactccatttgttccttggaacaattggaaaactactgcaactaa以下dna序列編碼seqidno8(見上文)指定的單鏈胰島素類似物，其密碼子對(duì)于巴斯德畢赤酵母中的使用模式進(jìn)行優(yōu)化。seq.id.no67ttcgtcaatcagcacttgtgtggttcccacttggttgaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactgatccaactgaagagggtccaagaagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttccttggagcagttggagaactactgtaactga以下dna序列編碼seqidno9(見上文)指定的單鏈胰島素類似物，其密碼子對(duì)于巴斯德畢赤酵母中的使用模式進(jìn)行優(yōu)化。seq.id.no68ttcgtcaatcagcacttgtgtggttcccacttggttgaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactgatccaactgaagagggtccaagaagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttcctgggagcagttggagaactactgtaactga以下dna序列編碼seqidno10(見上文)指定的單鏈胰島素類似物，其密碼子對(duì)于巴斯德畢赤酵母中的使用模式進(jìn)行優(yōu)化。seq.id.no69ttcgtcaatcagcacttgtgtggttcccacttggttgaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactccagaaactgaagagggtccaagaagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttccttggagcagttggagaactactgtaactga以下dna序列編碼seqidno11(見上文)指定的單鏈胰島素類似物，其密碼子對(duì)于巴斯德畢赤酵母中的使用模式進(jìn)行優(yōu)化。seq.id.no70ttcgtcaatcagcacttgtgtggttcccacttggttgaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactccaagaactgaagagggtccaagaagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttccttggagcagttggagaactactgtaactga以下dna序列編碼seqidno12(見上文)指定的單鏈胰島素類似物，其密碼子對(duì)于巴斯德畢赤酵母中的使用模式進(jìn)行優(yōu)化。seq.id.no71ttcgtcaatcagcacttgtgtggttcccacttggttgaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactgagccaactgaagagggtccaagaagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttccttggagcagttggagaactactgtaactga以下dna序列編碼seqidno13(見上文)指定的單鏈胰島素類似物，其密碼子對(duì)于巴斯德畢赤酵母中的使用模式進(jìn)行優(yōu)化。seq.id.no72ttcgtcaaacagcacttgtgtggttcccacttggttgaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactccagaaactgaagagggtccaagaagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttccttggagcagttggagaactactgtaactga以下dna序列編碼seqidno15(見上文)指定的單鏈胰島素類似物，其密碼子對(duì)于巴斯德畢赤酵母中的使用模式進(jìn)行優(yōu)化。seq.id.no73ttcgttaaccagcacttgtgtggttcccacttggttgaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactgatccaactgaagagagaagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttccttggagcagttggagaactactgtaactaa以下dna序列編碼seqidno16(見上文)指定的單鏈胰島素類似物，其密碼子對(duì)于巴斯德畢赤酵母中的使用模式進(jìn)行優(yōu)化。seq.id.no74ttcgttaaccagcacttgtgtggttcccacttggttgaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactgatccaactgaagagagaagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttccttggagcagttggagaactactgtaactaa以下dna序列編碼seqidno17(見上文)指定的單鏈胰島素類似物，其密碼子對(duì)于巴斯德畢赤酵母中的使用模式進(jìn)行優(yōu)化。seq.id.no75ttcgttaaccagcacttgtgtggttcccacttggttgaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactgatccaactgaagagagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttccttggagcagttggagaactactgtaactaa以下dna序列編碼seqidno18(見上文)指定的單鏈胰島素類似物，其密碼子對(duì)于巴斯德畢赤酵母中的使用模式進(jìn)行優(yōu)化。seq.id.no76ttcgtcaatcagcacttgtgtggttcccacttggttcaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactccagaaactgaagagggtccaagaagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttccttggagcagttggagaactactgtaactga以下dna序列編碼seqidno19(見上文)指定的單鏈胰島素類似物，其密碼子對(duì)于巴斯德畢赤酵母中的使用模式進(jìn)行優(yōu)化。seq.id.no77ttcgtcaaacagcacttgtgtggttcccacttggttgaggctttgtacttggtttgtggtgagagaggtttcttctacactgacccaactgaagagggtccaagaagaggtatcgttgagcagtgttgtcactccatctgttccttggagcagttggagaactactgtaactga制備類似的合成基因并克隆至巴斯德畢赤酵母，其編碼sci-59a(見下文)以及sci-59a和sci-59b的衍生物，其包含另外的置換glub13→gln，如seq.idno31-37所具體表達(dá)的。本發(fā)明的兩個(gè)單鏈胰島素類似物(由seqidno8和seqidno10編碼；分別稱為sci-57dp和sci-57pe)通過在巴斯德畢赤酵母中生物合成前體多肽來制備；該系統(tǒng)分泌包含天然二硫橋以及裂解的n-末端延伸肽的折疊的蛋白質(zhì)。過表達(dá)的效率(>200mg/l發(fā)酵培養(yǎng)基)顯示于圖5。裂解的單鏈胰島素產(chǎn)物具有長(zhǎng)度57，其為30個(gè)殘基的b-結(jié)構(gòu)域、6個(gè)殘基的c-結(jié)構(gòu)域(在各情況下序列為eegprr)和21個(gè)殘基的a-結(jié)構(gòu)域的總和。sci-57dp和sci-57pe的形式等電點(diǎn)(pi)在各情況下通過除去野生型位置b29(lysb29)的正電荷，通過b28或b29的酸性置換，通過a14的酸性置換(tyra14→glu)和通過抵消c-結(jié)構(gòu)域中的堿性和酸性側(cè)鏈，預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)變至低于5.0。單鏈類似物的熱力學(xué)穩(wěn)定性通過cd-監(jiān)測(cè)的胍變性來探查，如(hua,q.x.等j.biol.chem.283,14703-16(2008))所述。結(jié)果(表1的第2欄)表明，sci-57dp和sci-57pe各自比野生型胰島素或kp-胰島素對(duì)化學(xué)變性更穩(wěn)定。在各情況下，需要較高濃度的鹽酸胍以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的50％解折疊(表1的第3欄)；觀察到向較大的m值的趨勢(shì)(第4欄)，表明折疊狀態(tài)的非極性表面的更有效的去溶劑化。發(fā)現(xiàn)相對(duì)于野生型胰島素或kp-胰島素(表1的第5欄)，在37℃輕輕攪動(dòng)時(shí)sci-57pe對(duì)纖維化的易感性顯著延長(zhǎng)。盡管在這些條件下在少于10天內(nèi)野生型胰島素和kp-胰島素形成原纖維，但sci-57pe耐受纖維化至少9個(gè)月。sci-57dp和sci-57pe的受體-結(jié)合親和力相對(duì)于野生型人胰島素進(jìn)行測(cè)定。該測(cè)定法使用胰島素受體的a同種型。相對(duì)于人胰島素(平衡解離常數(shù)為0.05(±0.01)nm)，sci-57dp和sci-57pe各自顯示0.06(±0.01)nm和0.08(±0.01)nm的結(jié)合常數(shù)。sci-57dp對(duì)促有絲分裂1型igf-i受體的親和力是野生型人胰島素的至多1/5。受體-結(jié)合活性的測(cè)定法方案如下。微量滴定條板(nuncmaxisorb)在4℃下用au5igg(100μl/孔，40mg/ml，在磷酸鹽緩沖鹽水中)孵育過夜。通過兩位點(diǎn)連續(xù)模型分析結(jié)合數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)針對(duì)非特異性結(jié)合(在存在1μm人胰島素的情況下保持膜關(guān)聯(lián)的放射性的量)進(jìn)行校正。在所有測(cè)定法中，在不存在競(jìng)爭(zhēng)性配體的情況下結(jié)合的示蹤劑的百分比少于15％，以避免配體-耗盡假象。解離常數(shù)(kd)通過擬合至數(shù)學(xué)模型確定，如whittaker和whittaker(2005.j.biol.chem.280:20932-20936)所述；該模型使用假定異源競(jìng)爭(zhēng)的非線性回歸(wang,1995,febslett.360:111-114)。表1.在25℃的胰島素類似物的熱力學(xué)和物理穩(wěn)定性aa熱力學(xué)穩(wěn)定性自在25℃下cd-檢測(cè)的胍變性(222nm)推斷，通過外推至零變性濃度的兩狀態(tài)模型分析。bδgu表示在鹽酸胍中變性自由能的表觀變化，通過兩狀態(tài)模型外推至零變性濃度。ccmid定義為50％的蛋白質(zhì)被解折疊的鹽酸胍的濃度。dm值是揭示(unfolding)自由能δgu相對(duì)于變性劑的摩爾濃度的斜率；其與變性時(shí)非極性表面的暴露程度相關(guān)。e纖維化滯后時(shí)間是硫磺素-t-陽(yáng)性聚集開始之前的天數(shù)的度量；一式三份的類似物在45℃下在tris-hcl制劑中以標(biāo)稱強(qiáng)度u-100輕輕搖動(dòng)。fnd；未檢測(cè)生物學(xué)活性和藥效學(xué)在通過鏈脲菌素導(dǎo)致糖尿病的雄性sprague-dawley大鼠(約300g)中測(cè)試(圖6)。相對(duì)于和25-75預(yù)混物，評(píng)價(jià)s.q.注射u-100(0.6mm)sci-57pe和sci-57dp的pd影響；得到的血糖濃度總體特征(圖6a)表明，我們的兩個(gè)候選物的pd性質(zhì)類似于預(yù)混合lilly產(chǎn)品，概況了其長(zhǎng)效(120-540min)和速效組分兩者(圖6b)。在注射后的前1小時(shí)內(nèi)降低血糖濃度的初始速率顯示于圖7。sci的熱穩(wěn)定性。在上述大鼠中在有利于快速降解當(dāng)前的胰島素產(chǎn)品的條件下(即，在存在空氣-液體界面的情況下在45℃下在玻璃小瓶中輕輕攪動(dòng)；圖8)，評(píng)價(jià)sci-57dp的效力保留或損失。在圖8a中使用新鮮材料。對(duì)照為和盡管在11天后失活(圖8b中的○)和在5天內(nèi)失活(未顯示)，但sci-2(◆和□)當(dāng)在57天后作為澄清溶液測(cè)試時(shí)保持完全活性(圖8b)。sci-57pe(其gu大于sci-dp；上表1)顯示類似的對(duì)降解的抗性(未顯示)。結(jié)構(gòu)研究使用圓二色性(cd)和nmr光譜。sci-57dp和sci-57pe的遠(yuǎn)紫外線cd譜表明主要是α-螺旋，與人胰島素的天然結(jié)構(gòu)和單鏈胰島素類似物的溶液結(jié)構(gòu)一致(hua,q.x.等j.biol.chem.283,14703-16(2008))。nmr研究集中于在缺少鋅離子的情況下根據(jù)蛋白質(zhì)濃度<1mm的單體狀態(tài)的sci-57dp的水溶液(ph7-8)。以質(zhì)子頻率700mhz獲得光譜。2d-nmrnoesy光譜和1h-15n異核單量子相干性(hsqc)2d“指紋”光譜提供了折疊結(jié)構(gòu)的證據(jù)；noes和化學(xué)位移的模式與57個(gè)殘基的單鏈胰島素類似物的在先分析一致(hua,q.x.等j.biol.chem.283,14703-16(2008))。六聚體分解的速度在sci-1的r6鈷六聚體中在25℃和ph7.4下通過可見吸收光譜評(píng)價(jià)。該測(cè)定法利用在r6胰島素六聚體中的兩個(gè)四面體co2+位點(diǎn)的藍(lán)色d-d吸收譜帶以監(jiān)測(cè)通過過量螯合劑edta的金屬離子釋放和螯合的速率；八面體co2+–edta絡(luò)合物是無色的。值得注意的是，盡管野生型胰島素的lillyco2+–edta螯合測(cè)定法在這些條件下導(dǎo)致574nm吸光度的單指數(shù)損失(圖9中的黑線)，但sci-1顯示具有快速相(比賴脯胰島素更快；未顯示)和慢速相(比野生型胰島素更慢；圖9中的綠線)的雙指數(shù)躍遷。在由cwru的weiss小組測(cè)試的兩條鏈胰島素類似物的列表中，在edta測(cè)定法中這樣的雙相性動(dòng)力學(xué)行為是無先例的。與pk有關(guān)的該測(cè)定法在動(dòng)物(隨后在人)中研究，這些光譜結(jié)果啟示我們提出的假設(shè)，即本發(fā)明的sci可在皮下儲(chǔ)庫(kù)中顯示雙相性pk性質(zhì)(如在大鼠中)。該雙相性行為的分子機(jī)制仍然待定，但可能涉及酚依賴性rt躍遷，如在德谷胰島素(一種新的基礎(chǔ)類似物，來自novo-nordisk)中發(fā)現(xiàn)的。用于治療糖尿病患者的方法包括給予本文所述的單鏈胰島素類似物。本發(fā)明的另一方面，單鏈胰島素類似物可在酵母(巴斯德畢赤酵母)中制備或通過天然片段連接進(jìn)行全化學(xué)合成。在非標(biāo)準(zhǔn)修飾的情況下，例如d-氨基酸置換、phe或tyr的芳環(huán)內(nèi)的鹵素取代，或絲氨酸或蘇氨酸通過碳水化合物的o-連接的修飾，合成制備途徑是優(yōu)選的；然而，通過擴(kuò)展遺傳密碼技術(shù)或四堿基密碼子技術(shù)制備包含非標(biāo)準(zhǔn)修飾的單鏈類似物的亞組會(huì)是可行的(對(duì)于綜述，參見hohsaka,t.,&sisido,m.,2012)。本發(fā)明的又一方面，使用非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸置換可增加單鏈胰島素類似物對(duì)化學(xué)降解或物理降解的抗性。我們進(jìn)一步考慮了本發(fā)明的類似物提供用于治療糖尿病或代謝綜合征的方法。胰島素類似物的遞送途徑為通過使用注射器或筆式裝置的皮下注射。本發(fā)明的單鏈胰島素類似物還可包含其它修飾，例如位置b24、b25或b26的鹵素原子，如在同時(shí)待審的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?3/018,011中更全面描述的，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。本發(fā)明的胰島素類似物還可包含由于缺失殘基b1-b3導(dǎo)致的縮短的b鏈，如在同時(shí)待審的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/589,012中更全面描述的。藥物組合物可包含這樣的胰島素類似物，和其可任選地包含鋅。鋅離子可以各種鋅離子:蛋白質(zhì)比率包括在內(nèi)，范圍為2.2個(gè)鋅原子/胰島素類似物六聚體至10個(gè)鋅原子/胰島素類似物六聚體。制劑的ph范圍為ph7.0-8.0；緩沖液(通常為磷酸鈉或tris-鹽酸)可存在或可不存在。在這樣的制劑中，胰島素類似物的濃度通常會(huì)為約0.6-5.0mm；至多5mm的濃度可用于小瓶或筆；更濃縮的制劑(u-200或更高)可在具有明顯的胰島素抵抗的患者中具有特別的益處。賦形劑可包括甘油、甘氨酸、精氨酸、tris、其它緩沖液和鹽，和抗微生物防腐劑，例如苯酚和間甲酚；后面的防腐劑已知提高胰島素六聚體的穩(wěn)定性。這樣的藥物組合物可用于通過給予具有糖尿病或其它醫(yī)學(xué)病況的患者生理學(xué)有效量的組合物來治療所述患者。根據(jù)前述公開內(nèi)容，現(xiàn)在應(yīng)該顯而易見的是，提供的單鏈胰島素類似物將實(shí)現(xiàn)上文所述的目標(biāo)。即，這些胰島素類似物顯示提高的對(duì)纖維化的抗性，同時(shí)保留需要的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特征(賦予雙相性作用)和保持野生型胰島素的至少一部分的生物學(xué)活性。因此，應(yīng)理解，在未背離本文所公開和描述的發(fā)明精神的情況下，可確定明顯落入所要求保護(hù)的發(fā)明的范圍內(nèi)的任何變化，以及因此可確定特定組分要素的選擇。引用以下文獻(xiàn)以證實(shí)本文描述的試驗(yàn)和測(cè)定方法會(huì)被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解。brangejeditor.(1987)galenicsofinsulin:thephysico-chemicalandpharmaceuticalaspectsofinsulinandinsulinpreparations.berlin:springerberlinheidelberg.hohsaka,t.andsisido,m.(2012)incorporationofnon-naturalaminoacidsintoproteins.curr.opin.chem.biol.6,809-15.hua,q.x.,nakagawa,s.h.,jia,w.,huang,k.,phillips,n.b.,hu,s.和weiss,m.a.(2008)designofanactiveultrastablesingle-chaininsulinanalog:synthesis,structure,andtherapeuticimplications.j.biol.chem.283,14703-14716.ilag,l.l.,kerr,l.,malone,j.k.andtan,m.h.(2007)prandialpremixedinsulinanalogueregimensversusbasalinsulinanalogueregimensinthemanagementoftype2diabetes:anevidence-basedcomparison.clin.ther.29,1254-70.jang,h.c.,guler,s.andshestakova,m.(2008)whenglycaemictargetscannolongerbeachievedwithbasalinsulinintype2diabetes,can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