本發(fā)明涉及用于以酶促方式使玉米赤霉烯酮解毒的多肽，編碼使玉米赤霉烯酮解毒的多肽的分離的多核苷酸，用于制備使玉米赤霉烯酮解毒的單加氧酶的轉(zhuǎn)基因宿主細胞，用于以酶促方式使玉米赤霉烯酮解毒的添加劑及其用途，以及用于以酶促方式使玉米赤霉烯酮解毒的方法。

真菌毒素是絲狀真菌產(chǎn)生的次生代謝物。其一個重要的代表是世界范圍傳播的玉米赤霉烯酮(zen)(以前稱為f-2毒素)，其由許多鐮孢菌真菌產(chǎn)生。這些真菌尤其侵染栽培植物，例如各種各樣的谷類，其中真菌侵染通常出現(xiàn)在收獲之前，其中真菌生長或真菌毒素產(chǎn)生可以在收獲之前發(fā)生，或者在不適當?shù)馁A藏的情況下也可以在收獲之后發(fā)生。fao估計，在世界范圍內(nèi)25％的農(nóng)產(chǎn)品被真菌毒素污染，這導致巨大的經(jīng)濟損失。在一項最近在世界范圍內(nèi)進行的研究中，從2009年1月至2011年分析了總共23，781個樣品，其中81％經(jīng)測試為對于至少一種真菌毒素來說陽性和45％對于zen來說陽性。可以在世界的所有地區(qū)中，同樣地在所有經(jīng)測試的谷物類別和飼料類別，例如玉米、大豆粉、小麥、麥麩、ddgs(干酒糟)中，以及在預制飼料混合物中，以直至100％的頻率發(fā)現(xiàn)zen。

zen是一種非甾類的、雌激素的、大環(huán)的、通過聚酮化合物物質(zhì)代謝途徑合成的內(nèi)酯，其具有下述結(jié)構(gòu)式：

和iupac命名名稱“(2e，11s)-15，17-二羥基-11-甲基-12-氧雜雙環(huán)[12.4.0]十八碳-1(18)，2，14，16-四烯-7，13-二酮”。對于zen和zen代謝物，存在有不同的命名法，其中在該文獻中盡可能采用metzler的命名法(2011，mycotox.res.，27：1-3)。除了zen之外，在自然界中還存在有許多zen衍生物，其通過zen的酶促或化學修飾而形成。此外，zen代謝物尤其在人或動物機體中形成。

zen，同樣地還有zen衍生物，例如α-zel或β-zel，由于其高的化學和物理穩(wěn)定性而還可以在經(jīng)加工的食物或飼料例如面包、啤酒或干酒糟中檢測到。

雖然zen具有相對低的急性毒性并且具有直至20,000mg/kg體重的口服ld50值，但是在較長期攝入的情況下可以在動物或人中出現(xiàn)亞急性和/或亞慢性的毒性效應，例如致畸形的、致癌的、免疫抑制的和動情的效應。zen與雌激素受體結(jié)合并且可以引起激素紊亂，因此通常將相比于zen而言所形成的代謝物降低理解為“玉米赤霉烯酮的解毒或脫毒”。

攝入被zen污染的飼料導致哺乳動物中的發(fā)育障礙，其中豬，特別是幼豬對于zen是極其敏感的。超過0.5ppm的在飼料中的zen濃度導致發(fā)育障礙，其中例如超過1.5ppm的濃度可以導致豬中的超雌激素活性，和12ppmzen的濃度被認為對牛中的流產(chǎn)負責。由于玉米赤霉烯酮通過粘膜，特別是通過胃粘膜，但也通過口腔粘膜被迅速吸收，因此立即的和尤其是定量的解毒是必要的。在zen的口服給藥后30分鐘已經(jīng)可以在血液中檢測到它們。為了達到盡可能完全的解毒，已證明使用經(jīng)分離的酶相對于微生物而言是有利的，因為它們具有更高的比活性或更快的作用。由于zen的有害效應，因而在歐盟存在有在食物中的強制性的zen上限以及對于在飼料中的zen上限的推薦(ecno：1881/2006)。

為了減少食物或飼料的zen污染的最初策略是限制真菌生長，例如通過遵循“良好的農(nóng)業(yè)實踐經(jīng)驗”。這尤其包括，種子沒有害蟲和真菌侵染，或者及時從田地中移除農(nóng)業(yè)廢料。此外，還可以通過使用殺真菌劑來減少田地上的真菌生長。在收獲之后，應當將收獲物儲藏在低于15％的殘留水分含量和低的溫度下，以阻止真菌生長。同樣地，應當在再加工之前去除由于真菌侵染而被污染的物料。盡管有著這一系列措施，但i.rodriges和k.naehrer(2012)仍然報道了，即使在具有最高農(nóng)業(yè)標準的地區(qū)，例如usa和中歐，在2009年至2011年中，分別有29％和39％的經(jīng)測試的玉米樣品被zen污染。

用于從飼料或食物中去除zen的其他可能性為真菌毒素的吸附或轉(zhuǎn)化。為此所必需的是，真菌毒素與吸附劑的結(jié)合在寬的ph范圍內(nèi)是強的且特異的，并且在胃腸區(qū)域內(nèi)的整個消化過程中保持穩(wěn)定。雖然對于黃曲霉毒素可以有效地使用幾種非生物吸附劑，例如活性炭、硅酸鹽或合成的聚合物，例如消膽胺，但是它們用于其他真菌毒素則受到限制。吸附劑的主要缺點是其他有時候?qū)τ跔I養(yǎng)供給來說必需的分子的非特異性結(jié)合。在文獻中同樣也描述了生物吸附劑，例如酵母或酵母提取物，然而生物吸附劑像非生物吸附劑一樣也類似地受到限制。

通過物理和化學處理來對zen進行解毒也受到限制。通過熱處理，不能有效地使zen鈍化，但是可以通過擠出和用氧化劑進行處理，例如在80℃下用10％的過氧化氫溶液處理16小時，來使zen含量降低83.9％。在飼料和食物的制備中擠出方法和氧化劑例如臭氧或過氧化氫的使用，由于高的成本、品質(zhì)損失、有時候低的效率和低的特異性而受限。

從ep0938575b1中知曉了紅球菌屬(rhodococcus)和諾卡氏菌屬(nocardia)的細菌，特別是球狀紅球菌(r.globerulus)、紅串紅球菌(r.erythropolis)和球形諾卡氏菌(n.globerula)的zen降解特性。

vekiru等人(appl.andenviron.microb.，2010，76，7，2353-2359)描述了通過噬真菌毒素絲孢酵母(trichosporonmycotoxinivorans)這種微生物將zen生物轉(zhuǎn)化為動情性較低的代謝物zom-1。

下面所使用的術(shù)語取自專業(yè)用語并且總是以傳統(tǒng)的意義進行使用，除非另外指出。因此，術(shù)語“多核苷酸”涉及具有所有長度和序列的每一種類型的遺傳物質(zhì)，例如單鏈和雙鏈dna和rna分子，包括調(diào)控元件、結(jié)構(gòu)元件、基因群、質(zhì)粒、全基因組及其片段。名稱“多肽”包括蛋白質(zhì)，例如酶、抗體，以及具有直至500個氨基酸的多肽，例如肽抑制劑，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，還有具有小的序列長度例如少于10個氨基酸的短多肽，例如受體、配體、肽激素、標簽等。名稱“在多核苷酸或多肽中的‘位置’”涉及在所述多核苷酸或多肽的序列中單個特定的堿基或氨基酸。

現(xiàn)在，本發(fā)明旨在提供這樣的多肽以供使用，用所述多肽可成功實現(xiàn)將玉米赤霉烯酮快速地且可靠地轉(zhuǎn)化為玉米赤霉烯酮衍生物，所述玉米赤霉烯酮衍生物的毒性和動情效應被降低至這樣的程度，即它可以對于各自的最終使用者來說無危險地殘留在飼料或食品中。

為了解決該任務，本發(fā)明的特征主要在于，所述多肽為將在玉米赤霉烯酮的位置7處的酮基團轉(zhuǎn)變成酯基團的單加氧酶。單加氧酶為屬于ec-分類的i組的酶，其催化來自o2的氧原子摻入到相應的底物(在本情況下，玉米赤霉烯酮)中。更準確而言，在玉米赤霉烯酮的情況下，將氧原子摻入在玉米赤霉烯酮的環(huán)結(jié)構(gòu)的位置7處，由此獲得毒性強度較低的玉米赤霉烯酮衍生物(izom)。令人驚訝地證實，該解毒在僅單個酶促反應步驟中進行；并且反應產(chǎn)物izom盡管具有仍然存在的封閉的環(huán)結(jié)構(gòu)和在位置7處的碳-氧雙鍵，但是具有低大約100倍的毒性并且?guī)缀醪辉亠@示出動情效應。

迄今為止假定，內(nèi)酯環(huán)系統(tǒng)的裂解對于zen的有效解毒來說是必需的。然而，令人驚訝地已證實，通過將在玉米赤霉烯酮的位置7處的酮基團轉(zhuǎn)變成酯基團也可實現(xiàn)極為有效的解毒，在所述重排中不發(fā)生環(huán)系統(tǒng)的裂解。

根據(jù)本發(fā)明的一個進一步方案，對所述單加氧酶進行選擇，從而使得其為baeyer-villiger單加氧酶。baeyer-villiger單加氧酶系統(tǒng)的使用確保了，反應可以僅僅在所希望的位置7處發(fā)生，因為只有該位置可供用于所謂的baeyer-villiger氧化，即通過摻入氧原子來將酮轉(zhuǎn)變成酯。

根據(jù)本發(fā)明的一個進一步方案，對所述多肽進行選擇，從而使得它在一步反應中使至少70％的玉米赤霉烯酮解毒。這成功實現(xiàn)，特別地是因為反應產(chǎn)物izom令人驚訝地具有低大約100倍的毒性。

由于玉米赤霉烯酮分子的具體結(jié)構(gòu)和特別是由于在玉米赤霉烯酮分子的位置7處存在的酮基團，借助于baeyer-villiger單加氧酶的一個亞組，即環(huán)己酮單加氧酶，成功實現(xiàn)在玉米赤霉烯酮的位置7處有針對性地摻入所希望的氧原子，正如這相應于本發(fā)明的一個進一步方案一樣。通過該摻入而產(chǎn)生的酯基團令人驚訝地導致，所形成的環(huán)狀代謝物(izom)具有比玉米赤霉烯酮明顯更低的毒性。

當所述多肽為選自seqidno.1、2和3的氨基酸序列或者其功能性變體時，成功實現(xiàn)將玉米赤霉烯酮特別完全地轉(zhuǎn)變成毒性更低的衍生物izom，其中在所述功能性變體與至少一個所述氨基酸序列之間存在至少60％，優(yōu)選地至少70％，更優(yōu)選地至少80％，和最優(yōu)選地至少90％的序列同一性。由于至少一個這樣的保守氨基酸序列例如seqidno.1、2和3的序列或者其功能性變體的存在，成功實現(xiàn)提供這樣的多肽以供使用，除了zen的快速且完全的轉(zhuǎn)變外，所述多肽還具有相比于迄今已知的轉(zhuǎn)化zen的多肽而言特別高的活性值。

術(shù)語“序列同一性”是指序列同一性百分比。對于氨基酸序列和核苷酸序列，相互間的序列同一性可以目視測定，但是優(yōu)選地用計算機程序來計算出來。將具有seqidno.1、2和3的氨基酸序列以及具有seqidno.3、4和5的核苷酸序列定義為參考序列。還在序列區(qū)段內(nèi)進行序列比較，其中參考序列的連續(xù)序列被理解為區(qū)段。對于核苷酸序列來說，序列區(qū)段的長度通常為18至600個核苷酸，優(yōu)選地45至200個核苷酸，更優(yōu)選地100至150個核苷酸。對于肽序列來說，序列區(qū)段的長度通常為3至200個氨基酸，更優(yōu)選地15至65個氨基酸，最優(yōu)選地30至50個氨基酸。存在有許多可購得的或免費可用的生物信息學程序，其可以被召來用于同源性測定并且持續(xù)地得到進一步發(fā)展。對此的例子為gcgwisconsinbestfit軟件包(devereux等人，1984)、blast(altschul等人，1990)或blast2(tatusova和madden，1999)。由于這些算法的不同的設置可能性，在相同的輸入序列的情況下它們得到不同的結(jié)果是可能的，因此必須定義搜索算法和與此有關(guān)的設置。在本情況下，序列同一性借助于程序ncbiblast(basiclocalalignmentsearchtool)來進行測定，特別地對于多肽，用blastp，和對于多核苷酸，用blastn(在2014年10月20日的版本中)，其提供在“nationalcenterforbiotechnologyinformation”的主頁(ncbi；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上以供使用。因此，可能的是，根據(jù)altschul等人，1997(nucleicacidsres.，25：3389-3402)的算法，將兩個或更多個序列互相進行比較。在此，使用2013年5月15日的那個版本的程序。作為程序設置，考慮基本設置，但是特別地，對于氨基酸序列比較：“最大靶序列(maxtargetsequence)”＝100；“期望閾值(expectedthreshold)”＝10；“字長(wordsize)”＝3；“矩陣(matrix)”＝blosom62；“缺口成本(gapcosts)”＝“存在(existence)：11；延伸(extention)：1”；“計算調(diào)整(computationaladjustment)”＝“條件式組成得分矩陣調(diào)整(conditionalcompositionalscorematrixadjustment)”；以及對于核苷酸序列比較：字長：11；期望值(expectvalue)：10；缺口成本：存在＝5，延伸＝2；過濾器(filter)＝低復雜度激活的(lowcomplexityactivated)；匹配/錯配得分(match/mismatchscores)：2，-3；過濾器字符串(filterstring)：l；m。

術(shù)語“功能性多肽變體”或“功能性變體”一方面涉及多肽的“等位基因變體”和多肽的“功能性片段”，另一方面涉及“經(jīng)修飾的多肽”，其中酶促功能相比于具有seqidno.1的多肽而言基本上未改變。名稱“等位基因變體”涉及這樣的多肽，所述多肽通過在自然界中隨機發(fā)生的核苷酸序列突變而產(chǎn)生并且引起氨基酸序列的改變，其中其酶促功能未受影響。術(shù)語“功能性片段”涉及多肽的部分或部分序列或者其功能性變體的部分或部分序列，其中酶促功能基本上得到保留?！敖?jīng)修飾的多肽”可以是c-末端或n-末端的融合蛋白或者有針對性地經(jīng)突變的多肽，其中突變可以通過至少一個氨基酸的置換、插入或缺失來獲得，這特別地通過位點特異性誘變或隨機誘變、重組和/或任何其他蛋白質(zhì)工程方法來進行，其中酶促功能基本上得到保留。術(shù)語“置換”、“插入”和“缺失”以在基因技術(shù)中通常的和專業(yè)人員熟悉的含義來進行使用。當酶促反應機制保持不變，即將在真菌毒素zen的位置7處的酮基團轉(zhuǎn)變成相應的酯基團(如在上面提及的反應機制中所顯示的)，并且相對于原始多肽而言的比殘余活性為至少5％，優(yōu)選地至少10％，特別地至少50％時，那么基本上保留了酶促功能。

具有有著seqidno.1和3的氨基酸序列的多肽是功能性等位基因變體，其中所述序列各自來源于不同的微生物。這從下列中可清楚地看出來：借助于序列同一性百分比而測量出的接近的相互親緣關(guān)系，以及這樣的事實，即所述多肽通過相同的機制作用于zen。具有seqidno.1的多肽被完全包含在具有seqidno.2的序列中，然而具有seqidno.2的多肽具有長了28個氨基酸的n-末端。

術(shù)語“解毒”或“使……解毒”是指zen的雌激素活性的降低。在此，雌激素活性的測量優(yōu)選地按照在實施例中所描述的方法來進行。也可以采用其他方法，其中決定性因素總是為通過其酶促轉(zhuǎn)變成izom來降低zen的雌激素活性。用在實施例中所描述的動情性能測定法，izom具有比zen低大約100倍的雌激素活性。

此外，本發(fā)明旨在提供分離的多核苷酸以供使用，用所述多核苷酸可成功實現(xiàn)制備用于使zen快速地且可靠地解毒的多肽。

為了解決該任務，本發(fā)明的特征主要在于，所述分離的多核苷酸具有這樣的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼作為將在玉米赤霉烯酮的位置7處的酮基團轉(zhuǎn)變成酯基團的單加氧酶的多肽，和/或與至少一個選自seqidno.4、5和6的核苷酸序列具有至少60％的序列同一性程度。在此，所述核苷酸序列可以在中等嚴緊條件下與至少一個選自seqidno.4-6的核苷酸序列雜交，和/或與具有至少200個核苷酸，特別地至少100個核苷酸的其部分序列雜交，和/或與上述核苷酸序列或其部分序列的互補鏈雜交。通過這樣的多核苷酸的表達，可以確保所得的多肽將zen轉(zhuǎn)化為izom。

待表達的核苷酸序列，特別是其三聯(lián)體(密碼子)，通常隨著宿主細胞而變化，從而密碼子偏倚性隨著宿主細胞而優(yōu)化。這導致，具有遠低于80％，還有低于70％或低于60％的序列同一性程度的多核苷酸也可以編碼同一種多肽。用于確定序列同一性程度的序列比較還必須在序列區(qū)段內(nèi)進行，其中區(qū)段是指參考序列的連續(xù)序列。對于核苷酸序列，序列區(qū)段的長度通常為15至600。

借助于現(xiàn)有的分離的核苷酸序列或序列區(qū)段，可成功產(chǎn)生具有通常至少15、30或40個核苷酸的長度的核酸探針。借助于此類稱為探針的核苷酸序列(其大多數(shù)另外還例如用³h、³²p、³⁵s、生物素或抗生物素蛋白進行標記)，可以通過使用標準方法來鑒定編碼具有降解zen的作用的多肽的核苷酸序列。作為用于鑒定此類序列的起始材料，可以考慮例如單個微生物的dna、rna或cdna，基因組dna文庫，或者cdna文庫。

對于具有至少100個核苷酸的長度的核苷酸序列，中等嚴緊條件被定義為在42℃下在包含0.3％十二烷基硫酸鈉(sds)、200μg/ml經(jīng)剪切和變性的鮭精dna和35％甲酰胺的配備有5×naci的na-edta緩沖液(sspe，0.9mnaci，60mmnah2po4，6mmedta)中的預雜交和雜交，隨后為標準southern印跡條件，其中最后將載體材料用2×的氯化鈉-檸檬酸鹽緩沖液(ssc，300mmnacl和30mm檸檬酸三鈉，0.2％sds)在55℃下洗滌15分鐘，進行三次。

對于具有15個核苷酸至100個核苷酸的長度的核苷酸序列，中等嚴緊條件被定義為在由0.9mnaci、0.09mtris-hclph＝7.6、6mmedta、0.5％np-40、1×denhardt溶液、1mm焦磷酸鈉、1mm磷酸二氫鈉、0.1mmatp和0.2mg/ml酵母rna組成的緩沖液中的預雜交和雜交，其中在比計算出的解鏈溫度(tm)低5℃至10℃的溫度下進行預雜交和雜交，其中tm通過按照bolton和mccarthy(1962，proceedingsofthenationalacademyofsciencesusa，48：1390)進行的計算來確定。隨后，該試驗在標準southern印跡條件下繼續(xù)進行(j.sambrook，e.f.fritsch和t.maniatis，1989，molecularcloning，alaboratorymanual，第二版，coldspringharbor，newyork)。最后，將載體材料用包含0.1％sds的6×scc緩沖液洗滌15分鐘，進行一次；和在各自處于比計算出的tm低5℃至10℃的溫度下用6×ssc緩沖液洗滌15分鐘，進行兩次。

本發(fā)明的另一個目標是提供用于制備使玉米赤霉烯酮解毒的單加氧酶的轉(zhuǎn)基因宿主細胞以供使用。

為了解決該任務，本發(fā)明的特征主要在于，所述宿主細胞表達具有這樣的核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列編碼至少一種作為轉(zhuǎn)變在玉米赤霉烯酮的位置7處的酮基團的單加氧酶的多肽，和/或與至少一個選自seqidno.4、5和6的核苷酸序列具有至少60％的序列同一性程度，其中所述多核苷酸整合在染色體中或存在于染色體外并且所述宿主細胞為原核或真核細胞，特別是酵母細胞或植物細胞，并且所述宿主細胞任選地另外還過表達使對于加氧酶來說所需要的輔因子再循環(huán)的酶，特別是將nadp⁺或nad⁺轉(zhuǎn)變成nadph或nadh的酶。

將nadp⁺或nad⁺轉(zhuǎn)變成nadph或nadh的酶以及為此所需要的輔因子可以從現(xiàn)有技術(shù)中獲知，例如在torrespazmino等人，2008(angew.chem.47(12)，2275-8)中獲知。優(yōu)選地，對所述將nadp⁺或nad⁺轉(zhuǎn)變成nadph或nadh的酶進行選擇，從而使得其可以在食物和/或飼料工業(yè)中無問題地進行使用，特別地其與相應的食物和/或飼料法律的規(guī)定相容。例如，作為將nadp⁺轉(zhuǎn)變成nadph的酶，可以使用依賴于nadph的木糖還原酶(特別是來自樹干畢赤酵母(pichiastipitis)的)，其使用允許作為飼料添加劑的木糖醇作為底物。作為備選地，還可以使用來自乳桿菌屬物種(lactobacillussp.)的轉(zhuǎn)化nad(p)h的甘露醇脫氫酶，其中可以使用允許作為飼料添加劑的甘露醇作為底物。

優(yōu)選地，可能的是，以融合蛋白形式來制備或表達用于使zen解毒的多肽和能夠使輔因子再循環(huán)的酶。由此，可以在一個共同過程(特別是生物技術(shù)上游和下游過程)中制備這兩種酶活性。此外，在使用此類融合蛋白的情況下，確保在這兩個氧化步驟之間循環(huán)的輔因子保持與用于使zen解毒的多肽在空間上接近。

最后，本發(fā)明旨在提供這樣的添加劑以供使用，用所述添加劑可成功實現(xiàn)在確定的或復雜的基質(zhì)中，例如在飼料或食物中，快速地且可靠地使zen解毒，所述解毒被定義為雌激素活性的降低。

為了解決該任務，提供了使玉米赤霉烯酮解毒的添加劑以供使用，其中所述添加劑包含至少一種作為將在玉米赤霉烯酮的位置7處的酮基團轉(zhuǎn)變成酯基團的單加氧酶的多肽，所述單加氧酶優(yōu)選地包含選自seqidno.1、2和3的氨基酸序列或者其功能性變體，其中在所述功能性變體與至少一個所述氨基酸序列之間的序列同一性為至少60％；以及任選地，包含至少一種助劑。用這樣的添加劑，可直接地在食物或飼料中成功實現(xiàn)zen向玉米赤霉烯酮衍生物(即izom，其毒性比玉米赤霉烯酮的毒性低大約100倍)的一步的生物化學轉(zhuǎn)變。

根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的進一步方案，如此地產(chǎn)生所述添加劑，從而所述至少一種助劑選自惰性載體、維生素、礦物質(zhì)、酶、其他用于使真菌毒素解毒的組分、和輔因子，特別是nadph和/或nadh。通過使用這樣的添加劑，可以確保例如在食物或飼料中所包含的zen的量的大多數(shù)部分被安全可靠地氧化為izom，由此保證對于攝入這些飼料或食物的受試者的機體沒有有害效應。

在此，除了根據(jù)本發(fā)明的多肽外，所述添加劑還可以包含例如酶制劑作為助劑，在所述酶制劑中進一步包含至少一種這樣的酶，所述酶例如參與蛋白質(zhì)的降解，例如蛋白酶，或者所述酶參與淀粉或纖維或脂肪或糖原的代謝，例如淀粉酶、纖維素酶或葡聚糖酶，以及例如水解酶、脂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化還原酶、植酸酶、木聚糖酶和/或其組合。

其他可能的、根據(jù)本發(fā)明可使用的助劑為這樣的酶制劑，其除了包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽外，還包含至少一種用于使與玉米赤霉烯酮不同的真菌毒素解毒的組分，例如使真菌毒素解毒的酶，例如黃曲霉毒素氧化酶、麥角胺水解酶、麥角胺酰胺酶、赭曲毒素酰胺酶、串珠鐮孢菌素羧酸酯酶、串珠鐮孢菌素氨基轉(zhuǎn)移酶、氨基多元醇氨基氧化酶、脫氧瓜萎鐮菌醇環(huán)氧化物水解酶；和/或至少一種使真菌毒素解毒的微生物；和/或至少一種結(jié)合真菌毒素的組分，例如微生物細胞壁或無機材料例如膨潤土。

根據(jù)本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的進一步方案，所述多肽以這樣的濃度包含在所述添加劑中，以該濃度可成功實現(xiàn)將zen快速地和特別地在其由消耗了被污染的飼料或食物的受試者(特別是哺乳動物)的身體吸收之前已經(jīng)轉(zhuǎn)變成無毒或毒性明顯更低的代謝物izom。

在此，所述多肽可以以經(jīng)包囊或經(jīng)包衣的形式存在于所述組合物中，其中對于所述包囊或包衣過程，可以考慮標準方法，例如在wo92/12645中所描述的那些。通過所述包囊或包衣過程，可成功實現(xiàn)將所述多肽運輸至其使用位點，而沒有改變，特別是沒有降解或損害，從而在保護殼溶解(例如在動物的消化道中)之后，所述多肽才開始起作用，由此在酸性的、富含蛋白酶的和缺氧的環(huán)境中也可以達到zen的更加有針對性的、更快速的和更完全的轉(zhuǎn)化。此外，通過所述包囊或包衣過程，還可成功提高在所述添加劑中所述多肽的溫度穩(wěn)定性。

可以用在飼料工業(yè)中常用的助劑將所述經(jīng)包囊或經(jīng)包衣的多肽進一步加工為預混合物。

此外，本發(fā)明還旨在所述添加劑用于使在飼料(其特別地用于豬、家禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖)中、在食物中或在干酒糟中的玉米赤霉烯酮解毒的用途。通過所述添加劑的根據(jù)本發(fā)明的用途，可成功實現(xiàn)通過將在位置7處的酮基團轉(zhuǎn)變成酯基團而將在食物或飼料中或者在干酒糟中所包含的zen氧化為izom并由此使其解毒，其中在被污染的飼料或食物中低的多肽濃度的情況下已經(jīng)成功實現(xiàn)這樣的解毒。

在此，優(yōu)選地，在每噸飼料或食物或干酒糟中，所述多肽在大約1g至大約500g的范圍內(nèi)，所述經(jīng)包囊或經(jīng)包衣的多肽在大約20g至大約3000g的范圍內(nèi)，所述預混合物在大約200g至大約10kg的范圍內(nèi)，或者所述添加劑在大約5mg至大約10kg的范圍內(nèi)存在。由此使得可能將在飼料或食物中存在的zen(其可以以直至10,000μg/kg的濃度存在于其中)大多數(shù)地轉(zhuǎn)變成izom。

如果在淀粉的液化過程中、在糖化過程中、在沼氣過程中或在發(fā)酵過程中(例如在生物乙醇制備的制漿過程或發(fā)酵過程中)使用所述添加劑，那么可以確保將在用于所述過程的或由其產(chǎn)生的產(chǎn)物(例如干酒糟或淀粉)中的zen轉(zhuǎn)變成izom，由此沒有有損于健康的量的zen保持完整。

此外，本發(fā)明還旨在提供這樣的方法以供使用，用所述方法使得可能將zen快速地且可靠地轉(zhuǎn)變成無毒的衍生物即izom。

為了解決該任務，如此地進行所述方法，從而在一步酶促氧化反應中，通過添加多肽，特別是單加氧酶，來將玉米赤霉烯酮轉(zhuǎn)變成izom并由此使其解毒，其中在玉米赤霉烯酮的位置7處的酮基團被轉(zhuǎn)變成酯基團；并且任選地，借助于另一種酶將在該反應中被氧化的輔因子，特別是nadp+或nad+，還原成nadph或nadh。通過該一步酶促反應，不僅保證了快速地摻入氧原子(其與在位置7處的酮基團一起形成酯基團)，而且尤其確保了該反應完全進行并且玉米赤霉烯酮完全轉(zhuǎn)變成毒性低大約100倍的izom。與此同時，nadp⁺或nad⁺可以通過已經(jīng)描述的酶系統(tǒng)轉(zhuǎn)變或再循環(huán)成nadph或nadh。

根據(jù)本發(fā)明的一個進一步方案，如此地進行所述方法，從而使用具有選自seqidno.1、2和3的氨基酸序列或者其功能性變體的多肽作為用于以酶促方式使玉米赤霉烯酮解毒的多肽，其中在所述功能性變體與至少一個所述氨基酸序列之間的序列同一性為至少60％。在使用具有選自seqidno.1、2和3的氨基酸序列的多肽的情況下，觀察到玉米赤霉烯酮的特別完全的解毒。

正如這相應于本發(fā)明的一個進一步方案一樣，根據(jù)本發(fā)明的方法在此可以不僅在添加劑本身中而且在轉(zhuǎn)基因宿主細胞中、在轉(zhuǎn)基因植物中或在種子中進行使用，并且不依賴于使用位點地導致始終如一地良好的結(jié)果和特別是將玉米赤霉烯酮完全轉(zhuǎn)化為izom。

在此，可以如此地進行所述方法，從而將所述多肽或所述添加劑與被玉米赤霉烯酮污染的飼料或食物相混合，使所獲得的混合物與濕氣相接觸，并且所述多肽或所述添加劑使在所述被污染的飼料或食物中所包含的玉米赤霉烯酮解毒。在濕潤的飼料或食物例如麥芽漿或糊漿的情況下，玉米赤霉烯酮向izom的轉(zhuǎn)變在經(jīng)口攝入之前在所述飼料或食物中發(fā)生，由此可以確保，最大程度地消除玉米赤霉烯酮對于人和動物的有害效應。在此，濕氣是指水或含水液體的存在，其中例如唾液或其他在消化道中存在的液體也屬于該范疇。

還可以如此地進行本發(fā)明的方法，從而將所述飼料或食物在經(jīng)口攝入之前進行粒化。

根據(jù)本發(fā)明的一個進一步方案，如此地進行所述方法，從而在一步反應過程中，所述玉米赤霉烯酮以至少70％，優(yōu)選地至少80％，特別地至少90％的程度被解毒，如特別地也在實施例3中所顯示的那樣。由此可以預防在動物或人中的亞急性和/或亞慢性的毒性效應，例如致畸形的、致癌的、動情的和免疫抑制的效應。

下面將依據(jù)實施例以及附圖更詳細地闡明本發(fā)明。其中：

圖1：通過釀酒酵母(s.cerevisiae)，在陰性對照中zen的部分轉(zhuǎn)變。

圖2：通過表達具有seqidno.1的多肽的釀酒酵母，在試驗批料中zen的轉(zhuǎn)變。

圖3：izom的化學結(jié)構(gòu)。

圖4：zen(圖4a)以及izom(圖4b)的雌激素活性。

如果沒有更確切地指明，那么所有分子生物學或微生物學工作都通過使用標準方法來進行(methodsinenzymology，第194卷，第3-933頁(1991)；guidetoyeastgeneticsandmolecularbiology.由christineguthrie，geraldr.fink編輯.isbn：978-0-12-182095-4；j.sambrook等人，2012，molecularcloning，alaboratorymanual，第4版，coldspringharbor)。

實施例1：在一步反應中從zen形成izom

借助于標準方法，用質(zhì)粒pcs57轉(zhuǎn)化酵母菌株yzga515(釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)，其通過使abc轉(zhuǎn)運蛋白基因pdr5失活而進行了修飾(poppenberger等人，2003，j.biol.chem.，278(48)47905-14)，以為了經(jīng)改善的玉米赤霉烯酮(zen)的攝取)。pcs57是來源于酵母表達質(zhì)粒padh-fw(mitterbauer等人，2002，appl.environ.microbiol.，68(3)，1336-1346)的質(zhì)粒，其具有作為選擇標記的leu2和adh1啟動子。

在試驗批料中，用pcs57載體轉(zhuǎn)化酵母菌株yzga515，所述pcs57載體另外還在強組成型adh1啟動子(醇脫氫酶1)之后包含作為bamhi-xhoi片段的具有seqidno.4的多核苷酸。由此使得具有seqidno.1的多肽的形成成為可能。

作為陰性對照，用空載體(沒有具有seqidno.4的多核苷酸的padh-fw)轉(zhuǎn)化酵母菌株yzga515。

將轉(zhuǎn)基因酵母(試驗批料和陰性對照)在sc-leu培養(yǎng)基(sherman1991，methodsenzymol.，194，3-21)中進行培養(yǎng)，離心，并且以2mg/lzen的濃度重懸浮在新鮮的sc-leu培養(yǎng)基中，其中在所述兩種情況下都調(diào)節(jié)od600＝4的細胞密度。在不同的溫育時間后，抽取樣品，給樣品摻入1個體積的甲醇，并由此終止細胞內(nèi)過程。通過離心使細胞懸浮液澄清，并將所得的上清液用于借助于hplc-ms進行的測量。如先前所描述的，測量起始物質(zhì)玉米赤霉烯酮(zen)，以及由噬真菌毒素絲孢酵母所形成的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物zom-1(vekuri等人，2010，appl.environ.microbiol.76(7)，2353-9)。

在用空載體進行轉(zhuǎn)化的陰性對照中，沒有形成zom-1，和特別地沒有形成izom。相應的hplc分析數(shù)據(jù)顯示在圖1中，其中y-軸指明了納克/毫升(ng/ml)和x-軸指明了以小時(h)表示的時間。

與此相反，在試驗批料中，玉米赤霉烯酮明顯更快地被轉(zhuǎn)化，并且鑒定出一種新的代謝物，其具有由vekiru等人(2010)所假定的中間體的預期質(zhì)量(在下面稱為izom)。此外，還可檢測到zom-1，這是一個清楚的暗示，即從izom至zom的水解以很小的程度發(fā)生。相應的hplc分析數(shù)據(jù)顯示在圖2中。相比于陰性對照而言，測量到少得多的量的zen，其中y-軸指明了納克/毫升(ng/ml)和x-軸指明了以小時(h)表示的時間。

在另一個試驗批料中，另外還定量地測量了代謝物izom。在表1中顯示了zen的代謝的摩爾平衡表。從中清楚地看出，在6小時后，大部分所使用的玉米赤霉烯酮(zen)已經(jīng)被轉(zhuǎn)變成izom。在該平衡表中的少量虧空可用其他代謝物的形成以及由方法決定的分析的不精確來解釋。這些結(jié)果清楚地顯示，具有seqidno.1的多肽能夠?qū)en轉(zhuǎn)變成代謝物izom。

表1：在試驗批料中zen的代謝的摩爾平衡表

實施例2：izom的化學結(jié)構(gòu)的鑒定

代謝物izom的化學結(jié)構(gòu)(圖3)可以借助于經(jīng)分離和經(jīng)純化的代謝物的nmr測量來進行測定。為了nmr譜的測量，從幾升的酵母培養(yǎng)物(sc-leu，如在實施例1中所描述的)的培養(yǎng)物過濾物制備足夠量的izom。借助于固相萃取和隨后的制備型hplc來純化izom。

借助于經(jīng)分離的關(guān)于izom的參考物質(zhì)，可以一方面追蹤zen向izom的轉(zhuǎn)變(參見實施例1)和另一方面經(jīng)由nmr來查明化學結(jié)構(gòu)。

采用brukeravancedrx-400ft-nmr波譜儀，在室溫(20℃)下在cd3od溶液中用5mm的反向?qū)掝l帶z-梯度探頭來獲得用于鑒定izom的nmr譜。化學位移建立在殘留溶劑共振(關(guān)于¹hnmr，3.31ppm；關(guān)于¹³cnmr，49.15ppm)的基礎上。所有脈沖程序獲自bruker軟件庫。借助于topspin1.3(brukerbiospingmbh)來評價nmr數(shù)據(jù)。完整的結(jié)構(gòu)確定和信號分配基于¹h、¹³c-apt、¹h¹h關(guān)聯(lián)波譜學(cosy)，¹h¹³c異核單量子關(guān)聯(lián)波譜(hsqc)，和¹h¹³c異核多頻帶關(guān)聯(lián)波譜(hmbc)來進行。

與zen相比，izom的nmr波譜學數(shù)據(jù)顯示出兩個主要差別。這證實了酮基團被轉(zhuǎn)化為酯基團。所述差別主要是羰基碳原子的從在zen中的212ppm(對于酮來說特征性的)至175ppm(對于羧酸衍生物來說特征性的)的位移，和鄰近的ch2基團的從36ppm和2.90/2.30ppm(在zen中的位置8)至65ppm和4.20/4.05(在izom中的位置9)的位移(分別關(guān)于¹³c和¹h)，其由鄰接的氧原子引起。與zom1的開環(huán)相反，在izom中大環(huán)仍然是完整的，如通過在c7和h9之間的遠程關(guān)聯(lián)可明顯看出的。nmr數(shù)據(jù)在表2中給出。izom的化學結(jié)構(gòu)顯示在圖3中。

表2：用于鑒定izom的¹h和¹³cnmr數(shù)據(jù)

實施例3：相比于zen而言izom的大大降低的雌激素活性

為此，使用經(jīng)純化的代謝物izom(如在實施例2中所描述的)來測定以雌激素活性表示的其毒性并與玉米赤霉烯酮的毒性進行比較。

為了測量雌激素活性，使用特別為此制備的報道酵母菌株，yzhb817(bachmann，h.：phenotypicdetectionofzearalenoneinsaccharomycescerevisiae.masterthesisbokuvienna，2003)。該菌株來源于酵母雙雜交菌株pj69-4a(matatrp1-901leu2-3，112ura3-52his3-200gal4-(缺失的)gal80(缺失的)lys2：：gal1-his3gal2-ade2met2：：gal7-lacz)(james等人，1996，genetics，144(4)，1425-1436)。通過破壞abc轉(zhuǎn)運蛋白pdr5和snq2來對pj69-4a進行進一步開發(fā)。具有該雙突變pdr5和snq2的菌株顯示出特別高的zen-攝取(mitterbauer等人，2003，appl.environ.microbiol.，69(2)，805-811)。隨后，用表達載體(ptk103)轉(zhuǎn)化該菌株從而獲得菌株yzhb817，所述表達載體觸發(fā)包含人雌激素受體α的激素依賴性激活結(jié)構(gòu)域和酵母gal4蛋白的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的產(chǎn)生。

在雌激素類物質(zhì)存在下，酵母菌株yzhb817誘導gal7lacz報道基因的表達，所述報道基因的產(chǎn)物，β-半乳糖苷酶，可以容易地通過生色底物onpg(鄰硝基苯基-β-半乳糖苷)的水解在420nm處來測量(currentprotocolsinmolecularbiology，第13章，yeast(編輯lundbladv，struhl，k.))。

將100μl的雌激素測試溶液(zen或izom)溶解在50％乙醇中，與1.9ml的細胞密度為od600＝0.1的在sc-trp培養(yǎng)基中的菌株yzga817的酵母培養(yǎng)物相混合，并且在30℃和180rpm下溫育18小時。此后，測定培養(yǎng)物的od600，并且將1ml的細胞粒狀沉淀(10分鐘，13krpm)重懸浮在500mlz-緩沖液中并用25μl氯仿進行滲透化。通過添加100μlonpg溶液(4mg/ml)來啟動酶反應，并在通過添加250μl的1mna2co3溶液而出現(xiàn)黃色著色后終止酶反應。在420nm處對上清液進行測量，并如下來計算“相對單位”(相關(guān)于所使用的細胞量而言)：

ru＝(od420×1000)/(od600×以分鐘表示的溫育時間)。

如在圖4中所顯示的，zen在低的ppb范圍內(nèi)誘導gal7-lacz報道基因的表達，因此為了表達7.5個相對單位的β-半乳糖苷酶，需要大約45ppbzen(圖4a)。與此相反，izom顯示出低得多的動情性能。相比較而言，為了達到大致相同的效應，需要大約500ppb(圖4b)。由此得出，izom相比于zen而言以幾乎低100倍的程度發(fā)揮雌激素作用。

實施例4：序列同一性的測定

具有有著seqidno.1、2和3的氨基酸序列的多肽相互之間的序列同一性百分比的測定通過借助于程序blast(basiclocalalignmentsearchtool)，特別地用blastp(其可以在“nationalcenterforbiotechnologyinformation”的主頁(ncbi；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進行利用)的兩個序列的相互匹配來進行。因此，可能的是，根據(jù)altschul等人，1997(nucleicacidsres.(1997)25：3389-3402)的算法，將兩個或更多個序列互相進行比較。作為程序設置，考慮基本設置，但是特別地：“最大靶序列”＝100；“期望閾值”＝10；“字長”＝3；“矩陣”＝blosom62；“缺口成本”＝“存在：11；延伸：1”；“計算調(diào)整”＝“條件式組成得分矩陣調(diào)整”。在具有seqidno.1的序列和具有seqidno.3的序列之間的序列同一性為73％。