本發明涉及一種抗真菌的2-氮唑硫色酮類化合物，這種化合物的合成方法及其在制備抗真菌藥物中的應用。
背景技術：
真菌在自然界大量存在，很多真菌可引起動植物的多種病害，不僅危害動植物的生長，更主要的是影響人類健康，威脅人類生命安全。
近年來，由于免疫受損人群，包括惡性腫瘤、惡性血液病、艾滋病、sars、糖尿病、嚴重燒傷等發病快速增多，以及廣譜抗生素和免疫抑制劑的廣泛使用，導管、插管和器官移植等新技術的開展，使機會性深部臟器的真菌感染發病率越來越高，也越來越嚴重。資料顯示，上述人群中深部真菌感染發生率約為11％～40％，病死率為40％。據文獻報道，通過對上世紀80年代至90年代醫院內細菌和真菌感染導致敗血癥的統計結果分析顯示，其中真菌感染導致敗血癥的發病率明顯漸增，并且真菌性敗血癥的病死率最高，高達71.43％。通過對149例真菌感染的分析顯示，真菌感染呈逐年上升趨勢。因此，抗真菌藥物的研究和開發越來越受到重視。
而現在臨床上應用的抗真菌藥物按結構可以分為抗真菌抗生素、唑類抗真菌藥及其他抗真菌藥。抗真菌抗生素，主要為多烯類抗生素，是作用于真菌膜上麥角甾醇的藥物，近年來雖然各國報道的新抗真菌抗生素種類繁多，但是其中有一部分抗生素?？怪参镎婢蠖鄶悼箘游镎婢目股乜拐婢V過窄，或體內活性微弱，或細胞毒性較強等，具有開發前景者不多。唑類抗真菌藥為麥角甾醇生物合成抑制劑，是臨床上應用最廣泛的藥物，包括咪唑和三氮唑類，現有的唑類抗真菌藥物一般都有相對較寬的抗真菌譜，但是每個藥物之間仍有差異，同時也存在一定的毒副作用和耐藥性。而其他抗真菌藥物也同樣伴隨這抗真菌廣譜窄，一定抗藥性和毒性等問題。
色酮類化合物是一類廣泛存在且具有生物活性的物質，早在十九世紀末，人們便已經從廣泛分布于地中海東部國家的傘形科阿米芹的果實中提取出了khellin，并被作為第一個色酮類藥物臨床應用?；钚匝芯勘砻?，無論是天然存在的還是合成得到的色酮類化合物，具有抗過敏、抗菌、抗癌、抗病毒、降血壓血脂等廣泛生理活性，尤其作為抗真菌藥物，目前研究較為活躍，已成為抗真菌藥物研發的熱點之一。而硫色酮結構在藥物合成中是一種重要的結 構基序，比相應的色酮，其表現出較高的生物活性。硫色酮類化合物主要通過合成的方式獲得，它相對于色酮的生理活性都有較大的增強，更是在抗真菌藥物研究領域有著廣泛的研究。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種硫色酮類抗真菌化合物，該化合物對常見治病真菌以及深部真菌感染都具有較強的抑菌活性，而且具有毒性低，穩定性好、抗真菌譜廣，安全性好等特點。本發明還提高該硫色酮類抗真菌化合物的制備方法及其在制備治療系統性真菌感染的藥物中的應用。
一種2-氮唑硫色酮類化合物，化學結構如式(i)
式(i)中，r1選自如式(ii)五元氮唑環中的一種：
其中：j、k、l分別獨立地選自氫、c1-c3的烴基；
r2選自羥基、c1-c6的烴氧基、c1-c6的烴氨基、c1-c6的烴基、苯基、被1個或多個c1-c6烴基或烴氧基取代的苯基、苯氧基、被1個或多個c1-c6烴基或烴氧基取代的苯氧基；
r3、r4、r6分別獨立地選自氫、氟、氯、溴或碘；
r5選自氫、氟、氯、溴、碘、c1-c6的烴氧基、c1-c6的烴氨基、c1-c6的烴基、苯氧基、被1個或多個c1-c6烴氧基取代的苯氧基。
本發明2-氮唑硫色酮類化合物合成方法，按下步驟：
用化合物(v)與cs2在堿性化合物作用下縮合、環合形成2-巰基硫色酮衍生物的鹽即化合物(vi)，然后與碘乙烷或溴乙烷反應得式(iiia)化合物。所述的堿性化合物選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀、碳酸銫或三乙胺。其反應式如下：
其中：r2選自羥基、c1-c6的烴氧基、c1-c6的烴氨基、c1-c6的烴基、苯基、被1個或多個c1-c6烴基或烴氧基取代的苯基、苯氧基、被1個或多個c1-c6烴基或烴氧基取代的苯氧基；
r3、r4、r6分別獨立地選自氫、氟、氯、溴或碘；
r5選自氫、氟、氯、溴、碘、c1-c6的烴氧基、c1-c6的烴氨基、c1-c6的烴基、苯氧基、被1個或多個c1-c6烴氧基取代的苯氧基；
m表示無機鹽金屬離子；
x表示f或cl。
將式(iiia)化合物溶于有機溶劑中，在1-1.3當量的氧化劑存在下進行氧化反應而得式(iiib)化合物。所述有機溶劑選自乙腈、乙酸、二氯甲烷、二氯乙烷中的至少一種；所述氧化劑選自二氧化錳、過氧化氫、過氧苯甲酸、間氯過氧苯甲酸、單過氧鄰苯二甲酸鎂或過氧乙酸。其反應式如下：
其中：r2選自羥基、c1-c6的烴氧基、c1-c6的烴氨基、c1-c6的烴基、苯基、被1個或多個c1-c6烴基或烴氧基取代的苯基、苯氧基、被1個或多個c1-c6烴基或烴氧基取代的苯氧基；
r3、r4、r6分別獨立地選自氫、氟、氯、溴或碘；
r5選自氫、氟、氯、溴、碘、c1-c6的烴氧基、c1-c6的烴氨基、c1-c6的烴基、苯氧基、被1個或多個c1-c6烴氧基取代的苯氧基。
將式(iiia)化合物溶于有機溶劑中，在2-3當量的氧化劑存在下進行氧化反應而得式(iiic)化合物。所述有機溶劑選自乙腈、乙酸、二氯甲烷、二氯乙烷中的至少一種；所述氧化劑選自二氧化錳、過氧化氫、過氧苯甲酸、間氯過氧苯甲酸、單過氧鄰苯二甲酸鎂或過氧乙酸。其反應式如下：
其中：r2選自羥基、c1-c6的烴氧基、c1-c6的烴氨基、c1-c6的烴基、苯基、被1個或多個c1-c6烴基或烴氧基取代的苯基、苯氧基、被1個或多個c1-c6烴基或烴氧基取代的苯氧基；
r3、r4、r6分別獨立地選自氫、氟、氯、溴或碘；
r5選自氫、氟、氯、溴、碘、c1-c6的烴氧基、c1-c6的烴氨基、c1-c6的烴基、苯氧基、被1個或多個c1-c6烴氧基取代的苯氧基。
以式(iii)化合物為原料，在有機溶劑中，在堿性化合物存在條件下，與式(iv)化合物反應而得2-氮唑硫色酮類化合物。所述的有機溶劑選自n，n-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、二氧六環、乙腈、四氫呋喃、丙酮、乙酸乙酯中的至少一種；所述的堿性化合物選自氫化鈉、氫化鉀、碳酸鐘或碳酸銫。所述式(iii)化合物結構如下：
所述式(iv)化合物選自以下結構化合物中的一種，
其中：z選自硫(s)、亞硫?；?imgfile="bsa0000127272710000044.gif"wi="194"he="129"img-content="drawing"img-format="gif"orientation="portrait"inline="no"/>磺?；?imgfile="bsa0000127272710000045.gif"wi="207"he="173"img-content="drawing"img-format="gif"orientation="portrait"inline="no"/>
j、k、l分別獨立地選自氫、c1-c3的烴基；
r2選自羥基、c1-c6的烴氧基、c1-c6的烴氨基、c1-c6的烴基、苯基、被1個或多個c1-c6烴基或烴氧基取代的苯基、苯氧基、被1個或多個c1-c6烴基或烴氧基取代的苯氧基；
r3、r4、r6分別獨立地選自氫、氟、氯、溴或碘；
r5選自氫、氟、氯、溴、碘、c1-c6的烴氧基、c1-c6的烴氨基、c1-c6的烴基、苯氧基、被1個或多個c1-c6烴氧基取代的苯氧基。
本發明式(i)化合物還包括其在藥物制劑學上所容許的鹽。
本發明提供所述2-氮唑硫色酮類化合物在制備治療真菌感染疾病的人用藥物或動物用藥物中的應用。
所述藥物中除含有活性成分2-氮唑硫色酮類化合物外，還含有與藥物上可接受的載體、助劑和/或稀釋劑，組成組合物。
所述藥物的劑型是溶液、霜劑、栓劑、膏劑或溶液劑。
本發明還提供所述2-氮唑硫色酮類化合物作為農業和園藝殺菌劑的應用。
所述殺菌劑中除含有活性成分2-氮唑硫色酮類化合物外，還含有與藥物上可接受的載體、助劑和/或稀釋劑，組成組合物。
通過測定最低抑菌濃度mic(即化合物能抑制試驗微生物生長的濃度)，對本發明2-氮唑硫色酮類化合物的抗真菌活性進行了體外評價。試驗證實，本發明2-氮唑硫色酮類化合物具有廣譜抗真菌活性，在人體及動物(特別是哺乳動物)體內具有藥理學活性，可與普通化療可接受的稀釋劑或載體相混合，或用其他的賦形劑，制成溶液、霜劑、栓劑、軟膏、溶液等劑型，以藥物的形式進行局部涂抹使用，對于真菌感染病具有明顯的療效。除了用于制備抗真菌的人用或動物用抗真菌藥物外，本發明2-氮唑硫色酮類化合物還可以用于農業和園藝的植物殺菌劑，對各種植物病原體疾病如稻瘟病、大麥和小麥的粉霉病及其他各種寄主植物(如黃瓜、蘋果、葡萄)的粉霉病、小麥的銹病、燕麥的冠銹和其他各種寄主的銹病，西紅柿的晚疫病及其他寄主植物的病原性腐爛等的防治非常有效。
具體實施方式
下面通過實施例對本發明的上述內容進一步進行詳細說明。需要說明的是，本發明的范圍不受實施例限制，而以權利要求為準。
實施例1，式iii1的合成制備反應式如下：
按下步驟制備：
單口燒瓶中加入2，4-二氯-5氟苯甲酰乙酸甲酯22.4mmol，dmso30ml、naoh45mmol，攪拌下升溫至40℃，在此溫度下滴加cs226.3mmol的5mldmso的溶液。滴畢，控溫40℃攪拌反應。反應畢，冷卻至室溫，滴加碘乙烷26.3mmol的10mldmso溶液，滴畢，室溫反應至反應畢，將反應液攪拌下倒入50ml冰水中，有大量固體析出，過濾收集固體，乙醇中重結晶，得式(iii1)產物2-乙硫基-6-氟-7氯硫色酮-3-甲酸甲酯16.8mmol，收率75％。
1hnmr(dmso-d6)：1.36(t，3h)，3.16(q，2h)，4.81(s，3h)，8.22(d，1h)，8.55(d，1h)。
實施例2-實施例20：式(iii)硫色酮類化合物的制備
以(iv)化合物為原料，制備產物式(iii)化合物(目標產物為表1中的式(iii2)～(iii15)各化合物)，制備步驟同實施例1，反應式如下：
實施例2～實施例15中，產物式(iii)硫色酮類化合物各基團選擇及制備用試劑和檢測數據均列于表1。
表1
實施例16：式iii16的合成制備反應式如下：
按下面步驟制備：
向100ml單口燒瓶中，依次加入2-乙硫基-6-氟-7氯硫色酮-3-甲酸甲酯10mmol，乙酸20ml，加熱至65℃，滴加30％的h2o212mmol攪拌反應6小時，加入亞硫酸鈉萃滅，減壓蒸餾除去溶劑乙酸，然后50ml二氯甲烷和50ml水萃取，取二氯甲烷層，用水洗滌兩次(50ml×2)，回收有機層，減壓蒸餾得式(iii16)產物2-乙亞硫?；?6-氟-7氯硫色酮-3-甲酸甲酯9.5mmol，收率95％。
1hnmr(dmso-d6)：1.28(t，3h)，3.06-3.18(m，1h)，3.31-3.43(m，1h)，3.87(s，3h)，8.16(d，1h)，8.60(d，1h)。
實施例17：式iii17的合成制備反應式如下
按下面步驟制備：
向100ml單口燒瓶中，依次加入2-乙硫基-6-氟-7氯硫色酮-3-甲酸甲酯10mmol，二氯甲烷20ml，加熱至回流，滴加間氯過氧苯乙酸mcpba22mmol，攪拌反應畢，加入亞硫酸鈉萃滅，減壓蒸餾除去溶劑乙酸，然后50ml二氯甲烷和50ml水萃取，取二氯甲烷層，用水洗滌兩次(50ml×2)，回收有機層，減壓蒸餾得式(iii17)產物2-乙磺基-6-氟-7氯硫色酮-3-甲酸甲酯9.7mmol，收率97％。
1hnmr(dmso-d6)：1.38(t，3h)，3.20(q，2h)，4.83(s，3h)，7.54(d，1h)，8.15(d，1h)。
實施例18～實施例31：式(iii)硫色酮類化合物的制備
分別以(iii2-iii15)化合物為原料，制備產物式(iii18-iii31)化合物(目標產物為表1中的式(iii18)～(iii31)各化合物)，制備步驟同實施例16或17，反應式如下：
實施例18～實施例31中，產物式(iii18-iii31)硫色酮類化合物各基團選擇及制備用試劑和檢測數據均列于表2。
表2
實施例32：式(i1)的合成制備反應如下：
按下面步驟制備：
向100ml單口燒瓶中，依次加入2-乙硫基-6-氟-7-氯硫色酮-3-甲酸甲酯1mmol，nah2.5mmol和5ml的dmf，然后稱取1.5mmol的咪唑溶于2-3ml的dmf中，室溫下緩慢滴加，攪拌反應。待反應畢，用20ml二氯甲烷和20ml水萃取，取二氯甲烷層，用水洗滌兩次(20ml×2)，回收有機層減壓蒸餾，得式(i1)產物2-(1h-咪唑-1-基)-6-氟-7-氯硫色酮-3-甲酸甲酯0.51mmol，收率51％。
1hnmr(dmso-d6)：3.71(s，3h)，7.28(s，1h)，7.62(s，1h)，8.16(s，1h)，8.23(d，1h)，8.58(d，1h)。
實施例33：式(i2)的合成制備反應如下：
按下面步驟制備：
向100ml單口燒瓶中，依次加入2-乙亞硫酰基-6-氟-7-氯硫色酮-3-甲酸甲酯1mmol，nah2.5mmol和5ml的dmf，然后稱取1.5mmol的1h-1，2，4-三唑溶于2-3ml的dmf中，室溫下緩慢滴加，攪拌反應。待反應畢，用20ml二氯甲烷和20ml水萃取，取二氯甲烷層，用水洗滌兩次(20ml×2)，回收有機層減壓蒸餾，得式(i2)產物2-(1h-1，2，4-三唑-1-基)-6-氟-7-氯硫色酮-3-甲酸甲酯0.62mmol，收率62％。
1hnmr(dmso-d6)：3.7(s，3h)，8.22(d，1h)，8.49(s，1h)，8.58(d，1h)，9.12(s，1h)。
實施例34：式(i3)的合成制備反應如下：
按下面步驟制備：
向100ml單口燒瓶中，依次加入2-乙磺?；?6-氟-7-氯硫色酮-3-甲酸甲酯1mmol，碳酸鉀2.5mmol和5ml的乙腈，然后稱取1.5mmol的1h-1，2，3-三唑溶于2-3ml的乙腈中，緩慢滴加，攪拌反應，hplc跟蹤反應。待反應結束后，用20ml二氯甲烷和20ml水萃取，取二氯甲烷層，用水洗滌兩次(20ml×2)，回收有機層減壓蒸餾，得式(i3)產物2-(1h-1，2，3-三唑-1-基)-6-氟-7-氯硫色酮-3-甲酸甲酯0.85mmol，收率85％。
1hnmr(dmso-d6)：3.85(s，3h)，8.15(d，1h)，8.44(s，2h)，8.55(d，1h)。
實施例35～實施例51：式(i)硫色酮類化合物的制備
分別以(iii)化合物為原料，制備產物式(i)化合物(目標產物為表1中的式(i2)～(i20)各化合物)，制備步驟同實施例31，32或33，反應式如下：
實施例35～實施例51中，產物式(i)硫色酮類化合物各基團選擇及制備用試劑和檢測數據均列于表3。
表3
實施例61：體外抗真菌活性實驗
1、實驗用菌株
近平滑念珠菌、孢子絲菌、啤酒酵母菌曲霉菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、紅色毛癬菌、青霉菌、疣狀毛癬菌、紫色毛癬菌、新生隱球菌、克柔氏念珠菌、絮狀表皮癬菌、石膏樣毛癬菌。
2、試藥及材料
試驗用材料：
改良馬丁培養基、96孔培養板、dmso
對照藥物：氟康唑
3、實驗方法
(1)抗菌藥液的制備
將受試藥物分別用dmso溶解，配成25.6g/l的溶液，于-20℃以下保存備用。試驗前將低溫冷藏的受試藥液取出，在35℃恒溫箱中融化，用rpmi1640稀釋10倍，備用。
(2)接種液的制備
哥受試念珠菌株(近平滑念珠菌，白色念珠菌，光滑念珠菌，熱帶念珠菌)在改良馬丁培養基上轉種，將其用質量分數為0.85％的無菌鹽水制成懸液。用血細胞計數板計數孢子，調整含菌量，使集落形成單位為1×106～5×106cfu/ml。接種時用rpmi-1640培養液將其稀釋200倍后，再稀釋10倍，cfu值調至0.5×103～6.0×103cfu/ml，備用。
(3)mic板制備
無菌操作下，在滅菌的96孔聚乙烯板的第1號孔加rpmi-1640培養液100μl，作為空白對照。第2號孔加菌液190μl，第3-12號孔加配置好的菌液100μl。然后在2號孔中加入10μl受試藥液，按10級倍比稀釋2-11號孔的濃度，使各孔的最終濃度為128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25mg/l，第12號孔不加受試藥液作為生長對照。各mic板密閉后置于35℃普通空氣孵箱中，孵育滿24h判斷結果。
(4)結果判斷
用酶標分析儀于620nm測各孔的od值，以od值下降80％以上的最低濃度作為mic值。當mic值高于128mg/l時計為＞128mg/l；當mic值低于0.25mg/l時計為≤0.25mg/l。
(5)重復觀察與統計
上述試驗需要至少重復三次，當出現mic值單一跳孔時，則記錄為最大的抑制細菌濃度，當mic值出現兩個或兩個以上跳孔時，則重新進行試驗。
4、抗真菌敏感性試驗結果
通過初步的mic測定發現，受試化合物具有廣譜抗真菌活性，其中實施例(32)～實施例(51)的硫色滿類化合物抑制真菌活性更為顯著，對以上受試菌株的mic值均小于10mg/l。