本申請(qǐng)涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體地，涉及用于血小板發(fā)育研究、血小板減少癥研究及其大規(guī)模備選藥物篩選的斑馬魚(yú)模型。
背景技術(shù)：
：：血小板是血液系統(tǒng)中不可缺少的一部分，它的主要功能是凝血和止血，修補(bǔ)破損的血管。當(dāng)血小板出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，機(jī)體會(huì)呈現(xiàn)疾病狀態(tài)，例如血小板疾病，是由于血小板數(shù)量減少(血小板減少癥)或功能減退(血小板功能不全)導(dǎo)致止血栓形成不良和出血而引起的。血小板減少癥是外周血中血小板減少而導(dǎo)致皮膚粘膜及內(nèi)臟出血的疾病，是臨床常見(jiàn)的以凝血功能障礙、出血為特點(diǎn)的一組疾病。為了更好地研究血小板的發(fā)育和功能，需要尋找到一個(gè)能夠特異標(biāo)記血小板的基因，從而構(gòu)建血小板特異性標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因系，實(shí)時(shí)跟蹤血小板的來(lái)源和分化。MPL(MPLproto-oncogene,thrombopoietinreceptor)是促血小板生成素TPO的受體，是一種造血生長(zhǎng)因子，在人類與小鼠中調(diào)控多種造血祖細(xì)胞和血小板的生成。為了更好地研究MPL的功能以及了解人類血小板減少癥特別是胚胎發(fā)育期的血小板減少癥的相關(guān)機(jī)制，需要構(gòu)建血小板減少癥的突變體，從而建立相應(yīng)的疾病模型。特別地，現(xiàn)有技術(shù)中缺乏作為胚胎發(fā)育期的血小板減少癥的模型以及適合大規(guī)模穩(wěn)定篩選血小板減少癥的備選藥物的動(dòng)物模型。為了更好地研究血小板特別是胚胎發(fā)育期的血小板的相關(guān)機(jī)制，需要構(gòu)建特異性標(biāo)記血小板的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，可以利用其進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察胚胎期血小板的生成以及發(fā)育。對(duì)血小板的研究非常必要。斑馬魚(yú)產(chǎn)卵多，在體外受精，體外發(fā)育且早期胚胎透明，適合在胚胎發(fā)育期進(jìn)行觀察以及用于大規(guī)模高通量的備選藥物篩選。斑馬魚(yú)與人的血液組成以及基因調(diào)控機(jī)制的相似使得斑馬魚(yú)已經(jīng)被用于研究造血發(fā)育1。斑馬魚(yú)已經(jīng)作為疾病模式動(dòng)物用于闡述一些造血疾病的新的分子機(jī)制2和篩選新的藥物3。已有文獻(xiàn)報(bào)道CD41可以作為血小板的一個(gè)標(biāo)記物4，文獻(xiàn)中已經(jīng)構(gòu)建了一種可以標(biāo)記血小板的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，并且細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)證明CD41:GFPhigh的熒光標(biāo)記的細(xì)胞均為血小板。所以可以利用該轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系進(jìn)行血小板減少的突變體篩選，以及藥物治療的實(shí)驗(yàn)證明。白細(xì)胞介素-11(IL-11)為一種造血生長(zhǎng)因子,能促進(jìn)造血干細(xì)胞以及巨噬祖細(xì)胞的增殖,并且誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞成熟,從而升高血小板數(shù)量。此類藥物用于提升血小板數(shù)目在小鼠中已有實(shí)驗(yàn)證明，并且也已經(jīng)成功運(yùn)用于臨床治療人類的血小板減少癥5,6。為了方便對(duì)血小板的研究、監(jiān)測(cè)血小板相關(guān)疾病治療效果等，能夠特異標(biāo)記血小板的斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因系尤為重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：以下是對(duì)本文詳細(xì)描述的主題的概述。本概述并非是為了限制權(quán)利要求的保護(hù)范圍。本申請(qǐng)的第一方面提供了一種突變體斑馬魚(yú)在制備血小板減少癥的動(dòng)物模型中的用途，其中所述突變體斑馬魚(yú)為mplsmu40突變體。在一些實(shí)施方案中，所述血小板減少癥是由mpl基因的敲除引起的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述血小板減少癥可以在通過(guò)造血生長(zhǎng)因子治療后癥狀緩解，所述造血生長(zhǎng)因子優(yōu)選地是白細(xì)胞介素-11(IL-11)。本申請(qǐng)的第一方面還提供了一種突變體斑馬魚(yú)在篩選對(duì)血小板減少癥有效的藥物中的用途，其中所述突變體斑馬魚(yú)為mplsmu40突變體。在一些實(shí)施方案中，所述血小板減少癥是由mpl基因的敲除引起的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述血小板減少癥可以在通過(guò)造血生長(zhǎng)因子治療后癥狀緩 解，所述造血生長(zhǎng)因子優(yōu)選地是白細(xì)胞介素-11(IL-11)。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述篩選可以包括以下步驟：(a)以相同濃度的備選藥物處理受精后1天到2.5天，優(yōu)選2天的所述突變體斑馬魚(yú)和野生型同胞魚(yú)對(duì)照的胚胎；(b)一至兩天后觀察血小板的數(shù)目，以確定所述備選藥物對(duì)所述血小板減少癥的治療效果。本申請(qǐng)的第一方面還提供了一種利用突變體斑馬魚(yú)來(lái)篩選對(duì)血小板減少癥有效的藥物的方法，其中所述突變體斑馬魚(yú)為mplsmu40突變體。在一些實(shí)施方案中，所述血小板減少癥是由mpl基因的敲除引起的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述血小板減少癥可以在通過(guò)造血生長(zhǎng)因子治療后癥狀緩解，所述造血生長(zhǎng)因子優(yōu)選地是白細(xì)胞介素-11(IL-11)。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述篩選可以包括以下步驟：(a)以相同濃度的備選藥物處理受精后1天到2.5天，優(yōu)選2天的所述突變體斑馬魚(yú)和野生型同胞魚(yú)對(duì)照的胚胎；(b)一至兩天后觀察血小板的數(shù)目，以確定所述備選藥物對(duì)所述血小板減少癥的治療效果。本申請(qǐng)的第一方面還提供了一種突變體斑馬魚(yú)在制備凝血功能障礙的動(dòng)物模型中的用途，其中所述突變體斑馬魚(yú)為mplsmu40突變體。在一些實(shí)施方案中，所述凝血功能障礙是由mpl基因的敲除引起的。本申請(qǐng)的第一方面主要涉及但不限于：a.通過(guò)TALEN靶向基因敲除技術(shù)，得到mpl基因序列缺失的突變體斑馬魚(yú)。b.胚胎時(shí)期，利用標(biāo)記不同階段髓系細(xì)胞的探針進(jìn)行WISH實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)詳細(xì)的血小板數(shù)目的改變，用CD41標(biāo)記成熟血小板細(xì)胞，并進(jìn)行凝血實(shí)驗(yàn)檢測(cè)突變體幼魚(yú)的凝血功能。c.作為血小板減少癥的動(dòng)物模型進(jìn)行血小板減少癥的藥物篩選。通過(guò)獲得的Mpl突變體mplsmu40，發(fā)現(xiàn)具有以下表型：①M(fèi)pl突變體mplsmu40斑馬魚(yú)胚胎血小板數(shù)目顯著減少。②同時(shí)在幼魚(yú)期，Mpl突變體mplsmu40顯著影響了機(jī)體內(nèi)的凝血機(jī)制。突變體的凝血時(shí)間顯著延長(zhǎng)，并且出血量顯著增多。③已經(jīng)運(yùn)用白細(xì)胞介素11對(duì)突變體mplsmu40進(jìn)行治療，結(jié)果證明，白細(xì)胞介素11可以有效提高突變體mplsmu40斑馬魚(yú)血小板數(shù)目。本申請(qǐng)的第一方面相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的進(jìn)步：可以利用斑馬魚(yú)進(jìn)行胚胎期血小板疾病的研究；并且由于其具有穩(wěn)定遺傳的特性可進(jìn)行長(zhǎng)期疾病追蹤和高通量藥物篩選。利用本發(fā)明的斑馬魚(yú)Mpl突變體mplsmu40，能夠進(jìn)行血小板減少癥特別是胚胎發(fā)育期的血小板減少癥的研究，以及針對(duì)血小板減少癥的治療的備選藥物的大規(guī)模篩選。在本申請(qǐng)的第一方面中，Mpl突變體mplsmu40具有穩(wěn)定遺傳的血小板減少的表型，能夠進(jìn)行血小板減少癥特別是胚胎發(fā)育期的血小板減少癥的研究。此外，本申請(qǐng)的Mpl突變體mplsmu40還可以用來(lái)擴(kuò)展研究血栓、凝血功能障礙等與血小板相關(guān)的各種疾病機(jī)制。本申請(qǐng)的第二方面提供了一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)在制備血小板及其前體細(xì)胞特異性標(biāo)記的動(dòng)物模型中的用途，其中所述轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)為Tg(mpl:eGFP)。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)中，髓系細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞不被特異性標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)高表達(dá)血小板標(biāo)記基因，低表達(dá)髓系基因和血紅蛋白基因，其中所述血小板標(biāo)記基因包括cd41、lrrc32、gp9、kif1b、nfe2，所述髓系基因包括mpo、lyz、mfap4，所述血紅蛋白基因包括hbbe1、hbae1。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)中，GFP+的細(xì)胞數(shù)目響應(yīng)于促血小板生成素而顯著增多。本申請(qǐng)的第二方面還提供了一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)在制備凝血實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型中的用途，其中所述轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)為Tg(mpl:eGFP)。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)中，髓系細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞不被特異性標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)高表達(dá)血小板標(biāo)記基因，低表達(dá)髓系基因和血紅蛋白基因，其中所述血小板標(biāo)記基因包括cd41、lrrc32、gp9、kif1b、nfe2，所述髓系基因包括mpo、lyz、mfap4，所述血紅蛋白基因包括hbbe1、hbae1。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)中，GFP+的細(xì)胞數(shù)目響應(yīng)于促血小板生成素而顯著增多。本申請(qǐng)的第二方面還提供了一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)在制備用于篩選增加 血小板數(shù)目的藥物的動(dòng)物模型中的用途，其中所述轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)為Tg(mpl:eGFP)。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)中，髓系細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞不被特異性標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)高表達(dá)血小板標(biāo)記基因，低表達(dá)髓系基因和血紅蛋白基因，其中所述血小板標(biāo)記基因包括cd41、lrrc32、gp9、kif1b、nfe2，所述髓系基因包括mpo、lyz、mfap4，所述血紅蛋白基因包括hbbe1、hbae1。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)中，GFP+的細(xì)胞數(shù)目響應(yīng)于促血小板生成素而顯著增多。本申請(qǐng)的第二方面進(jìn)一步提供一種用mpl基因標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，可以特異性標(biāo)記血小板，可以用此轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)實(shí)時(shí)觀察血小板的產(chǎn)生、成熟、分化、以及血栓形成等。所述mpl基因標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)還可以用于各種針對(duì)血小板相關(guān)疾病的治療的藥物效果監(jiān)測(cè)，并可以利用斑馬魚(yú)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察藥物療效。所述mpl基因標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)作為極為方便快捷的動(dòng)物模型，對(duì)于研究血小板的發(fā)育和功能來(lái)說(shuō)更具有優(yōu)勢(shì)。所述轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)為Tg(mpl:eGFP)。本申請(qǐng)的第二方面主要涉及：a.通過(guò)Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)技術(shù)，得到pTol2-mplpromoter–eGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)。b.胚胎時(shí)期，利用不同轉(zhuǎn)基因系斑馬魚(yú)細(xì)胞標(biāo)記進(jìn)行抗體染色共染來(lái)檢測(cè)mpl:eGFP標(biāo)記的細(xì)胞是否為血小板。同時(shí)也利用熒光細(xì)胞分選方法比較不同血細(xì)胞轉(zhuǎn)基因系的細(xì)胞特異標(biāo)記基因的差別。并與已知的Tg(CD41:eGFP)轉(zhuǎn)基因系標(biāo)記的血小板細(xì)胞和造血干細(xì)胞進(jìn)行比較。c.檢驗(yàn)mpl:eGFP是否標(biāo)記為血小板細(xì)胞，進(jìn)行血管損傷實(shí)驗(yàn)，以及Tpo(促血小板生成素)誘導(dǎo)增殖實(shí)驗(yàn)。通過(guò)獲得的Tg(mpl:eGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，發(fā)現(xiàn)具有以下表型：①mpl:eGFP轉(zhuǎn)基因系得到可遺傳的F0代轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)(F0代特指篩選到的第一代可遺傳的轉(zhuǎn)基因母本或父本)，標(biāo)記的細(xì)胞所在位置與mpl探針原位雜交表達(dá)位置相同。②通過(guò)與髓系轉(zhuǎn)基因系和紅系轉(zhuǎn)基因系斑馬魚(yú)比較，細(xì)胞分選結(jié)果 表示，mpl:eGFP+細(xì)胞高表達(dá)血小板表面蛋白基因，低表達(dá)其他譜系的基因。抗體染色結(jié)果表明，mpl:eGFP+不與髓系或者血紅蛋白共同表達(dá)。與已知的CD41:eGFP+細(xì)胞比較，mpl:eGFP+的細(xì)胞更高表達(dá)血小板標(biāo)記基因。③損傷實(shí)驗(yàn)表明，在損傷情況下mpl:eGFP+的細(xì)胞會(huì)到傷口處，作為血小板的功能表現(xiàn)之一。在Tpo的刺激下，mpl:eGFP+的細(xì)胞響應(yīng)Tpo信號(hào)，呈現(xiàn)出顯著增多狀態(tài)。④藥物處理實(shí)驗(yàn)表明，在給予血小板增多藥物白細(xì)胞介素-11處理以后，表現(xiàn)出mpl:eGFP+細(xì)胞增多，證明了血小板增多藥物的有效性。本申請(qǐng)可以很好的展示斑馬魚(yú)實(shí)時(shí)觀察的優(yōu)勢(shì)，將血小板特異性標(biāo)記出來(lái)，對(duì)以后的血小板發(fā)育研究以及相關(guān)疾病研究以及臨床用于增加血小板數(shù)目的藥物篩選提供了很好的動(dòng)物模型。在本申請(qǐng)中，Tg(mpl:eGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系能夠?qū)唏R魚(yú)血小板前體細(xì)胞和血小板特異性標(biāo)記為綠色。該轉(zhuǎn)基因系確實(shí)具有穩(wěn)定遺傳的血小板熒光標(biāo)記，可以被用來(lái)擴(kuò)展研究血小板的產(chǎn)生，分化，成熟，功能(例如血栓的形成)，以及與血小板相關(guān)的各種疾病機(jī)制和進(jìn)行藥物篩選。通過(guò)獲得的Tg(mpl:eGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，發(fā)現(xiàn)具有以下用途：①綠色熒光特異性標(biāo)記了斑馬魚(yú)血小板。②熒光信號(hào)從斑馬魚(yú)胚胎受精后2天開(kāi)始出現(xiàn)，此后逐漸增多。③該轉(zhuǎn)基因系成為一個(gè)目前為止最特異性標(biāo)記血小板的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系。為血小板的發(fā)育以及功能的研究和藥物篩選提供了一個(gè)極為簡(jiǎn)便的工具。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“dpf”指受精后的天數(shù)。舉例來(lái)說(shuō)，“3dpf”指受精后第三天，“8dpf”指受精后第八天。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“hpf”指受精后的小時(shí)數(shù)。舉例來(lái)說(shuō)，“72hpf”指受精后第72小時(shí)。本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)“GFP+”是指具有綠色熒光的細(xì)胞。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“野生型”或者“WT”都是指野生型斑馬魚(yú)。附圖說(shuō)明圖1：TALEN靶向基因敲除技術(shù)獲得斑馬魚(yú)突變體mplsmu40，是一種血小板減少的突變體(A)TALEN靶向基因敲除設(shè)計(jì)方案，選擇斑馬魚(yú)mpl基因轉(zhuǎn)錄本mpl-001(ENSDART00000124917)，1號(hào)外顯子序列作為靶點(diǎn)進(jìn)行基因敲除。(B)經(jīng)測(cè)序得到突變體mplsmu40在靶點(diǎn)位置序列-8bp+48bp的突變，并且突變后Mpl蛋白提前終止，缺失重要功能區(qū)域。(C)免疫化學(xué)染色結(jié)果。尾部信號(hào)點(diǎn)為CD41:eGFPhigh的細(xì)胞，標(biāo)記成熟血小板。突變體mplsmu40中，信號(hào)點(diǎn)明顯減少，說(shuō)明成熟血小板數(shù)目明顯減少。(D)WISH檢測(cè)野生型同胞魚(yú)和突變體mplsmu40的mpl基因表達(dá)，突變體mplsmu40中mpl基因的mRNA表達(dá)量顯著減少。尾部局部放大框?yàn)?00×放大倍數(shù)。(E)血小板相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量結(jié)果，黑色柱子代表野生型同胞魚(yú)，灰色柱子代表突變體mplsmu40。橫坐標(biāo)所示這些基因的mRNA表達(dá)量在突變體mplsmu40中都明顯下調(diào)(每組n＝30)。統(tǒng)計(jì)學(xué)差異由t-檢驗(yàn)得出，ns沒(méi)有顯著差異，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖2：斑馬魚(yú)突變體mplsmu40在凝血實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為凝血功能障礙(A)針刺3dpf的斑馬魚(yú)胚胎尾部血管，圖示為血液停止流出時(shí)的尾部視野野生型同胞魚(yú)(WT，左欄)和突變體(mplsmu40，右欄)，突變體mplsmu40出血量較多，傷口凝血塊較大。(B)凝血實(shí)驗(yàn)處理野生型同胞魚(yú)和突變體mplsmu40各組至少10條，顯微鏡下觀察其從損傷開(kāi)始至流血停止的時(shí)間。分別在3dpf和6dpf時(shí)處理，統(tǒng)計(jì)分析凝血時(shí)長(zhǎng)，突變體mplsmu40尾部血管凝血時(shí)長(zhǎng)顯著多于野生型同胞魚(yú)(每組n≥10)。統(tǒng)計(jì)學(xué)差異由t-檢驗(yàn)得出，ns沒(méi)有顯著差異，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖3：白細(xì)胞介素-11(IL-11)可以有效提高斑馬魚(yú)突變體mplsmu40的血小板數(shù)目(A)上圖為未注射IL-11的突變體mplsmu40對(duì)照組，下圖為注射IL-11后的突變體mplsmu40處理組，圖示信號(hào)點(diǎn)為CD41:eGFPhigh的細(xì)胞，代表血小板的數(shù)目。注射IL-11后的突變體mplsmu40信號(hào)點(diǎn)明顯增多。(B、C)對(duì) 野生型與突變體mplsmu40同時(shí)進(jìn)行IL-11注射，黑色柱子代表對(duì)照組(僅注射蒸餾水)，灰色柱子代表IL-11注射組(注射IL-11)。(B)中結(jié)果顯示注射IL-11使得野生型同胞魚(yú)中cd41基因的mRNA表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組增多約40％(P＝0.016)；(C)中結(jié)果顯示，注射IL-11使得突變體mplsmu40中cd41基因的mRNA表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組增多約97％(P＝0.005)。結(jié)果說(shuō)明，突變體mplsmu40響應(yīng)于IL-11的治療，并且與在野生型同胞魚(yú)中的作用相比，IL-11能夠顯著更多地提升突變體mplsmu40的血小板數(shù)目。圖4：利用Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)技術(shù)，pTol2-mplpromoter-eGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的獲得(A)Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)技術(shù)設(shè)計(jì)方案，選擇斑馬魚(yú)mpl基因轉(zhuǎn)錄本mpl-201(ENSDART00000057297)，二號(hào)外顯子ATG序列為止，向前4641bp作為mpl啟動(dòng)子區(qū)域。(B)上方小圖標(biāo)出了斑馬魚(yú)胚胎期造血部位示意圖。AGM:主動(dòng)脈-性腺-中腎；CHT：尾部血島；下圖左側(cè)為野生型胚胎2.5dpfAGM區(qū)域和2.5dpf及5dpfCHT區(qū)域mpl基因原位雜交的圖示；右側(cè)為Tg(mpl:eGFP)胚胎進(jìn)行GFP抗體染色結(jié)果。兩者表達(dá)部位結(jié)果相同。(C)在Tg(mpl:eGFP)胚胎中進(jìn)行GFP與Lcp1(髓系細(xì)胞表達(dá)基因)抗體共染結(jié)果，上：紅色為L(zhǎng)cp1+細(xì)胞，中：綠色為GFP+細(xì)胞，下：為兩者疊加在一起的圖示，結(jié)果為沒(méi)有任何重疊細(xì)胞。說(shuō)明Lcp1與GFP沒(méi)有共同表達(dá)的細(xì)胞，即GFP不標(biāo)記髓系細(xì)胞。(D)在Tg(mpl:eGFP)胚胎中進(jìn)行GFP與Hbae1(α血紅蛋白，標(biāo)記所有成熟紅細(xì)胞)抗體共染，上：紅色為Hbae1+細(xì)胞，中：綠色為GFP+細(xì)胞，下：為兩者疊加在一起的圖示，結(jié)果為沒(méi)有任何重疊細(xì)胞。說(shuō)明Hbae1與GFP沒(méi)有共同表達(dá)的細(xì)胞，即GFP不標(biāo)記成熟紅細(xì)胞。(E)本申請(qǐng)實(shí)施例5的Tg(mpl:eGFP)與Tg(coronin1a:eGFP)的胚胎分別進(jìn)行GFP流式細(xì)胞分選，其中coronin1a標(biāo)記所有髓系細(xì)胞。兩者GFP+細(xì)胞進(jìn)行qPCR的檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示mpl-GFP+細(xì)胞與coronin1a-GFP+細(xì)胞相比，高表達(dá)血小板基因cd41，而低表達(dá)或不表達(dá)髓系細(xì)胞表達(dá)的基因。(F)Tg(mpl:eGFP)與Tg(gata1:DsRed)的胚胎分別進(jìn)行綠色熒光GFP和紅色熒光DsRed流式細(xì)胞分選，其中g(shù)ata1標(biāo)記所有紅系細(xì)胞。兩者GFP+和DsRed+細(xì)胞進(jìn)行qPCR的檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示 mpl-GFP+細(xì)胞與gata1-DsRed+細(xì)胞相比，高表達(dá)血小板基因cd41和lrrc32，而低表達(dá)血紅蛋白基因(hbbe1、hbae1)(每組n＝30)。統(tǒng)計(jì)學(xué)差異由t-檢驗(yàn)得出，ns沒(méi)有顯著差異，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。(G)Tg(mpl:eGFP)與Tg(CD41:eGFP)的胚胎分別進(jìn)行GFP流式細(xì)胞分選，其中cd41標(biāo)記斑馬魚(yú)造血干細(xì)胞和血小板細(xì)胞。兩者GFP+細(xì)胞進(jìn)行qPCR的檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示mpl-GFP+細(xì)胞與CD41-GFP+細(xì)胞，雖然均高表達(dá)血小板標(biāo)記基因(從左至右依次：gp9、kif1b、lrrc32、nfe2)，但這些血小板標(biāo)記基因在mpl-GFP+細(xì)胞中比在CD41-GFP+細(xì)胞中的表達(dá)顯著更高。圖5：Tg(mpl:eGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)標(biāo)記細(xì)胞為血小板細(xì)胞，可以響應(yīng)于損傷反應(yīng)以及Tpo和白細(xì)胞介素-11。(A)在4dpfTg(mpl:eGFP)的胚胎中進(jìn)行血管損傷實(shí)驗(yàn)，損傷部位為頸部血管，GFP+的細(xì)胞響應(yīng)損傷，并可抵達(dá)損傷部位，這為血小板功能之一。(B)在Tg(mpl:eGFP)的胚胎中顯微注射tpo的mRNA，3dpf的胚胎中，GFP抗體染色的結(jié)果顯示，注射了tpomRNA的胚胎顯著增多了GFP+的細(xì)胞數(shù)目。(C)與已轉(zhuǎn)入Tg(mpl:eGFP)轉(zhuǎn)基因背景的同胞魚(yú)野生型Tg(mpl:eGFP)相比，在血小板減少的mplsmu40；Tg(mpl:eGFP)突變體中mpl-GFP+細(xì)胞顯著減少。(D)白細(xì)胞介素-11可以顯著地提升Tg(mpl:eGFP)中mpl-GFP+細(xì)胞數(shù)目。每組n≥10，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異由t-檢驗(yàn)得出，ns沒(méi)有顯著差異，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。在閱讀并理解了附圖和詳細(xì)描述后，可以明白其他方面。具體實(shí)施方式下面將以實(shí)施例的方式對(duì)本申請(qǐng)作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵺`本申請(qǐng)。應(yīng)當(dāng)理解，可以采用其他實(shí)施方式，并且可以做出適當(dāng)?shù)母淖兌黄x本申請(qǐng)的精神或范圍。為了避免對(duì)于使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵺`本申請(qǐng)來(lái)說(shuō)不必要的細(xì)節(jié)，說(shuō)明書(shū)可能省略了對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)已知的某些信息。因此，以下詳細(xì)描述不應(yīng)以限制性的意義來(lái)理解，且本發(fā)明的范圍僅由所附權(quán)利要求界定。以下的實(shí)施例便于更好地理解本申請(qǐng)，但并不用來(lái)限制本申請(qǐng)的范圍。下述實(shí)施例中所使用的各原料，除特別指出的以外，均可由市售獲得。材料與方法TALEN靶向基因敲除技術(shù)TALEN靶點(diǎn)識(shí)別模塊由北京唯尚立德生物科技有限公司構(gòu)建，將TALEN質(zhì)粒對(duì)通過(guò)顯微注射方法注射到斑馬魚(yú)胚胎單細(xì)胞中可實(shí)現(xiàn)靶基因敲除7。實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)了斑馬魚(yú)mpl基因轉(zhuǎn)錄本mpl-001,一號(hào)外顯子上的一段序列TTTGGGATGCACCT(SEQIDNO:1)作為TALEN間隔區(qū)域，合成左右兩邊的靶點(diǎn)識(shí)別TALEN模塊質(zhì)粒，對(duì)其進(jìn)行定向敲除。Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)技術(shù)啟動(dòng)子序列從NCBI獲取，斑馬魚(yú)mpl基因轉(zhuǎn)錄本mpl-201二號(hào)外顯子ATG序列為止，向前4641bp作為mpl啟動(dòng)子區(qū)域。將啟動(dòng)子序列和eGFP序列與轉(zhuǎn)座子序列連接、克隆、轉(zhuǎn)化，終制備成pTol2-mplpromoter-eGFP質(zhì)粒。斑馬魚(yú)突變體篩選TALEN顯微注射得到的第一代突變體為F0代，將每個(gè)F0代個(gè)體與野生型雜交得到F1代，將F1代成魚(yú)剪尾測(cè)序得到不同序列插入或者缺失的突變體，利用mpl原位雜交信號(hào)是否減少，CD41:GFP熒光信號(hào)是否減少進(jìn)行表型篩選，經(jīng)過(guò)測(cè)序，得到靶點(diǎn)間隔區(qū)域序列突變(-8bp+48bp)(TTTGAAAAGACTTTGAAGACTTGAAAAGACTTTTGCTTTTGAAAAGACTTTGCT)(SEQIDNO:2)的mplsmu40突變體斑馬魚(yú)。斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因系篩選pTol2-mplpromoter-eGFP顯微注射得到的第一代突變體為F0代，F(xiàn)0代于3dpf到4dpf挑出帶有熒光標(biāo)記、并且熒光表達(dá)位置正確的胚胎，將每個(gè)GFP+F0代個(gè)體培養(yǎng)至個(gè)體性成熟，與野生型雜交得到F1代，同時(shí)檢測(cè)F1代3-4dpf胚胎是否穩(wěn)定遺傳熒光標(biāo)記。經(jīng)過(guò)熒光標(biāo)記表型篩選， 得到穩(wěn)定遺傳的標(biāo)記斑馬魚(yú)血小板的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系Tg(mpl:eGFP)。斑馬魚(yú)的飼養(yǎng)與繁殖野生型、突變體mplsmu40斑馬魚(yú)和轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系Tg(mpl:eGFP)的培養(yǎng)方法如現(xiàn)有技術(shù)所述8。對(duì)于本文中提及的所有實(shí)驗(yàn)，斑馬魚(yú)胚胎均被置于含有0.003％苯基硫脲(phenylthiourea,PTU)以及0.002％美蘭的胚胎培養(yǎng)液中，以去除胚胎色素。整體原位雜交(whole-mountinsituhybridization,WISH)地高辛標(biāo)記的反義RNA探針的合成以及WISH操作均按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)操作流程完成9。使用的mpl探針序列為：AACAGCAGGTGACATAGAGTTCAGGTGCCACACTTCTGATCTGATTCAAATCATTTGCAAATGGAGGGGAGACTTATATAAGGACAATACATACAGCTTCTACTATAAACAATTAAACAGAAGTTCATGGAGCAGTTGGAAGTTGTGTCCCAATTGCAATAACTCCATCCATCAGTGTGTCCTGTATGGCCAGAAGTCCAATGTCTTTAAGTTTTACCTCAATACAGGGTTGCAACCATTCAGCCGAACATTTTATGCAGAGACTTTCTATATGAACAGTAAAGTTCAGACAAGGCCTCCAGAAGGTCTGAAGGTACAGATTGGGGAAGAAAGGCTTTGTTTGACATGGGATTCACCATTTCTGATCATTTCTAAGCATCTAATGTACCAGATCCGTTATCAGCATCATGAAGAGAATCAGTGGAAGGGTTTTAAAGCTTCTGGATCCAAGACCAGCACTTGTCTAGATGTGCACAGAGGGGGTCGATACACCATCCAGGTTCGAGCACAACCCAATGGATCTGTGTACAGCGGAAACTGGAGTGACTGGTCAAAACCTGTTACAACCAACCTACCTTTAAGCAAAGAGTGGATTATTTTTGTTTGCATACCAGTGGCTCTGATCATCATTGCAACTGCAGTCATCTCTTTCTTCTCCAGATACTTCCGAAAGGTCAAGAGGTCCCTGTGGCCACCAGTACCAAACCTTAACAAGGTCCTGGAAAACATCCTGACTGATATCAGTGGATCACACTGGGAGCCAACCTTCAACATTAAGCAATGTGATGATGACACTGCTACATCAGTGGTGGAGGTTCTCACTGAGGGGGAATCTGCGGTCAAAACCTGTAAGAACACCTGTCCTCTGCTCTCTGAGCACAGTGAAAAACATGGAGAACATTTCAGAGAGGACTTGGAAATGGCGCAAGATTATGTGATTTTGA ACAACAATATAATCCCCTGCCTTACGGGAAACGACTACGTGTATAAGGATGTTGCTTCAACACATCTGGCCAATGAAAAACAACACTCTTGCTCCAGCACTTCTTACACCTCCCTACCAGATCACACCACAGATATTCTCAACCAATCCTATCTCCTTTTGGCAGAACAATCCGATCTTGGGGCGTATCAAACAACCTGTGGCCAGTACACCAATCTGGAGATCACAGCAGTATCATGTGTAGCAATTGGAGAGTGAGGTTTACTGTCAAAATGAAGCTCATAATCATGTATATATTAAGGGTTCTCTCACAAATGTAAAAAAGACATTCAGTTTCTGTGGAATGAATGAGAAACAAAGGAAAAGCAAAGCTTACGTTAATGGAGCACTTATGAAGGTAATC(SEQIDNO:17)。免疫化學(xué)染色(Immunochemistrystaining)運(yùn)用Anti-GFPantibody(Biotin)(ab6658)一抗(購(gòu)買自abcam公司)，Donkeyanti-GoatIgG(H+L)SecondaryAntibody,Alexa488conjugate二抗(購(gòu)買自invitrogen公司)，donkeyanti-rabbitAlexa-555(購(gòu)買自Invitrogen)，以及Lcp1和Hbae1一抗(由香港科技大學(xué)饋贈(zèng))10，將突變體mplsmu40與轉(zhuǎn)基因品系斑馬魚(yú)Tg(CD41:eGFP)交配4，從而獲得帶有Tg(CD41:eGFP)轉(zhuǎn)基因背景的突變體mplsmu40。對(duì)其進(jìn)行免疫化學(xué)染色，操作方法如本領(lǐng)域已知的11；利用同樣方法對(duì)帶有Tg(mpl:eGFP)轉(zhuǎn)基因背景的斑馬魚(yú)系進(jìn)行免疫化學(xué)染色，熒光顯微鏡下觀察高亮綠色熒光的細(xì)胞，其數(shù)量將代表血小板細(xì)胞的數(shù)量。qRT-PCR使用RocheTripureRNAIsolationReagent(購(gòu)買自Roche公司)來(lái)提取斑馬魚(yú)胚胎的總RNA，其操作步驟按照相關(guān)說(shuō)明執(zhí)行。使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)，來(lái)制備cDNA，其操作步驟按照相關(guān)說(shuō)明執(zhí)行。用斑馬魚(yú)基因β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR，操作方法如本領(lǐng)域已知的12。qRT-PCR引物序列斑馬魚(yú)尾部凝血實(shí)驗(yàn)利用0.03mm直徑的顯微注射用針(borosilicateglasscapillaries1B100F-4，購(gòu)買自WorldPrecisionInstrumentsInc公司)，作為損傷工具，選取受精后72至84小時(shí)的斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行尾部凝血實(shí)驗(yàn)。將斑馬魚(yú)胚胎放在含有0.02％三卡因(tricaine)的胚胎培養(yǎng)液中麻醉，然后置于瓊脂糖平板上。利用顯微注射從尾部?jī)?nèi)側(cè)血管區(qū)域進(jìn)行針刺損傷。數(shù)量為野生型同胞魚(yú)和突變體mplsmu40各110條以上。顯微鏡下觀察計(jì)時(shí)，從損傷開(kāi)始到凝血塊形成，流血停止。藥物實(shí)驗(yàn)選用齊魯制藥有限公司生產(chǎn)的巨和粒注射用重組人白細(xì)胞介素-11，選取受精后48-52hpf的斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行藥物注射。選取頸部或者卵黃囊表面血管注射。濃度為6μg/μL，每個(gè)胚胎用藥約5ng。觀察一天后，對(duì)斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。斑馬魚(yú)頸部凝血實(shí)驗(yàn)利用0.03mm直徑的顯微注射用針(borosilicateglasscapillaries 1B100F-4，購(gòu)買自WorldPrecisionInstrumentsInc公司)，作為損傷工具，選取受精后4dpf的斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行頸部凝血實(shí)驗(yàn)。將斑馬魚(yú)胚胎放在含有0.02％三卡因(tricaine)的胚胎培養(yǎng)液中麻醉，然后置于瓊脂糖平板上。利用顯微注射從頸部卵黃囊上側(cè)血管區(qū)域進(jìn)行針刺損傷。數(shù)量為10條以上。從損傷開(kāi)始到血小板到達(dá)損傷處血栓形成在顯微鏡下觀察計(jì)時(shí)。Tpo實(shí)驗(yàn)選用mMSSAGEmMACHINESP6Kit(AM1340)購(gòu)買自公司，體外合成tpomRNA，選取受精后1個(gè)細(xì)胞時(shí)期的Tg(mpl:eGFP)斑馬魚(yú)胚胎，進(jìn)行單細(xì)胞顯微注射。濃度為800g/μL，每個(gè)胚胎用量約400pg。觀察3天后，對(duì)斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行GFP抗體染色。流式細(xì)胞分選選取各轉(zhuǎn)基因系斑馬魚(yú)即Tg(mpl:eGFP)、Tg(coronin1a:eGFP)10全部髓系細(xì)胞特異性標(biāo)記轉(zhuǎn)基因系、Tg(gata1:DsRed)13全部紅系細(xì)胞特異性標(biāo)記轉(zhuǎn)基因系、Tg(CD41:eGFP)4血小板以及造血干細(xì)胞標(biāo)記轉(zhuǎn)基因系斑馬魚(yú)，于4dpf時(shí)期，各轉(zhuǎn)基因系取200個(gè)以上的斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行綠色熒光或者紅色熒光細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)具體方法參照文獻(xiàn)所述14。實(shí)施例1.mpl基因序列缺失的突變體斑馬魚(yú)的獲得本實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)了斑馬魚(yú)mpl基因轉(zhuǎn)錄本mpl-001ENSDART00000124917,一號(hào)外顯子上的一段序列TTTGGGATGCACCT作為TALEN間隔區(qū)域，合成左右兩邊的靶點(diǎn)識(shí)別TALEN模塊質(zhì)粒，對(duì)其進(jìn)行定向敲除，得到了一個(gè)缺失8bp、插入48bp的Mpl蛋白提前終止的突變體mplsmu40(參見(jiàn)圖1A、圖1B)。mpl基因表達(dá)為了檢測(cè)突變的有效性，以mpl作為標(biāo)記血小板和血小板前體細(xì)胞的標(biāo)記基因。利用原位雜交技術(shù)，檢測(cè)3dpf的野生型同胞魚(yú)和mplsmu40突變體中mpl基因的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果如圖1D中所示，信號(hào)點(diǎn)代表mpl基因的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示，突變體mplsmu40中的mpl基因的mRNA表達(dá)量與野生型同胞魚(yú)相比 有非常明顯的減少。實(shí)施例2.本發(fā)明實(shí)施例1的突變體斑馬魚(yú)可作為血小板減少癥的動(dòng)物模型血小板數(shù)目取5dpf的斑馬魚(yú)胚胎，將突變體mplsmu40與轉(zhuǎn)基因品系斑馬魚(yú)Tg(CD41:eGFP)交配4，獲得帶有Tg(CD41:eGFP)轉(zhuǎn)基因背景的突變體。對(duì)野生型同胞魚(yú)進(jìn)行同樣處理。對(duì)帶有Tg(CD41:eGFP)轉(zhuǎn)基因背景的mplsmu40突變體和野生型同胞魚(yú)進(jìn)行免疫化學(xué)染色，在熒光顯微鏡下觀察血液中流動(dòng)的血小板中高亮熒光的細(xì)胞，信號(hào)點(diǎn)為CD41:eGFPhigh的信號(hào)點(diǎn)，其數(shù)量將代表血小板細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果如圖1C所示，mplsmu40突變體中血小板數(shù)目與野生型同胞魚(yú)相比大幅度減少。多個(gè)與血小板相關(guān)的基因的mRNA表達(dá)選取了mpl、cd41、lrrc32、gp1bb、fog1、nfe2這些已有文獻(xiàn)報(bào)道與血小板相關(guān)的基因15-18，對(duì)5-dpf野生型同胞魚(yú)與突變體mplsmu40斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。這些基因中，Lrrc32、Gp1bb都是血小板膜蛋白；Fog1與Nfe2，是與哺乳動(dòng)物巨核細(xì)胞產(chǎn)生和成熟相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。結(jié)果如圖1E所示，表明，這些基因在突變體mplsmu40中的mRNA水平都顯著低于野生型同胞魚(yú)，說(shuō)明突變體mplsmu40確實(shí)是血小板減少的突變體。總之，以上結(jié)果表明，在突變體mplsmu40中，由于mpl基因的敲除，血小板的數(shù)目顯著減少。由此，本發(fā)明實(shí)施例1的mplsmu40突變體可作為血小板減少癥的動(dòng)物模型。實(shí)施例3.利用本發(fā)明實(shí)施例1的突變體斑馬魚(yú)進(jìn)行由血小板減少癥引起的凝血功能障礙模型構(gòu)建。由于突變體mplsmu40表現(xiàn)為血小板減少，所以可以用該突變體來(lái)研究血小板對(duì)斑馬魚(yú)止凝血的作用，進(jìn)而構(gòu)建斑馬魚(yú)凝血功能障礙實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?9。 首先利用3dpf的斑馬魚(yú)胚胎，每組至少10條，分別對(duì)野生型同胞魚(yú)組和突變體mplsmu40組的斑馬魚(yú)進(jìn)行尾部血管針刺損傷，通過(guò)光學(xué)顯微鏡鏡下20倍觀察血管損傷后傷口血塊大小，并記錄每一條斑馬魚(yú)胚胎從損傷開(kāi)始出血的時(shí)間到出血停止的時(shí)間。圖2A所示為血管損傷后傷口血塊大小，左圖為野生型同胞魚(yú)，右圖為突變體mplsmu40，可以明顯區(qū)別出相比于野生型同胞魚(yú)，mplsmu40突變體損傷后傷口出血量較多，傷口附近形成的血塊較大。凝血時(shí)長(zhǎng)的具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)下表。分別對(duì)3-dpf和6-dpf的斑馬魚(yú)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了兩樣本t檢驗(yàn)，以確定野生型同胞魚(yú)組和突變體mplsmu40組兩組間是否存在顯著性差異。結(jié)果見(jiàn)圖2B，所示為每組凝血時(shí)長(zhǎng)的統(tǒng)計(jì)圖。mplsmu40突變體的凝血時(shí)長(zhǎng)顯著地比野生型同胞魚(yú)更長(zhǎng)。以上結(jié)果表明，mplsmu40突變體可作為血小板減少導(dǎo)致的凝血功能障礙的模型，以利于后續(xù)研究。實(shí)施例4.利用本發(fā)明實(shí)施例1的突變體斑馬魚(yú)進(jìn)行備選藥物篩選由于mplsmu40突變體表現(xiàn)為血小板減少，所以選取了臨床針對(duì)血小板減少癥的常用藥物對(duì)其進(jìn)行藥物治療。選擇了IL-11，其通過(guò)增加血系祖 細(xì)胞的增殖來(lái)得到血小板增加的效果。如圖3A所示，IL-11注射一天后，觀察突變體中血小板的數(shù)目。上圖為對(duì)照組(僅僅注射蒸餾水)，下圖為注射IL-11組，可以明顯看到CD41:eGFPhigh信號(hào)點(diǎn)增多。同時(shí)還使用qPCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖3B-C所示，在野生型同胞魚(yú)和突變體mplsmu40中注射IL-11后均出現(xiàn)cd41基因的mRNA的表達(dá)量上調(diào)，但在突變體mplsmu40中的上調(diào)倍數(shù)顯著更大97％(P＝0.005)，相比于野生型同胞魚(yú)中的40％(P＝0.016)。圖3B-C的結(jié)果說(shuō)明，突變體mplsmu40響應(yīng)于IL-11的治療，并且與在野生型同胞魚(yú)中的作用相比，IL-11能夠顯著更多地提升突變體mplsmu40的血小板數(shù)目。以上結(jié)果表明，可以利用本發(fā)明的mplsmu40突變體作為動(dòng)物模型，對(duì)那些針對(duì)mpl基因缺陷引起的血小板減少癥的備選治療藥物進(jìn)行藥物篩選。實(shí)施例5.Tg(mpl:eGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的獲得本實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)了斑馬魚(yú)mpl基因轉(zhuǎn)錄本mpl-201二號(hào)外顯子ATG序列為止，向前4641bp作為mpl啟動(dòng)子區(qū)域，將此段序列(SEQIDNO:30)插入到pTol2轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒中，合成pTol2-mplpromoter-eGFP，對(duì)野生型斑馬魚(yú)胚胎DNA進(jìn)行基因插入，得到了一個(gè)能夠特異性標(biāo)記血小板的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系Tg(mpl:eGFP)。圖4A示出了Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)技術(shù)設(shè)計(jì)方案。圖4B中，上方小圖標(biāo)出了斑馬魚(yú)胚胎期造血部位示意圖，其中AGM:主動(dòng)脈-性腺-中腎；CHT：尾部血島。下方的圖中，左側(cè)為野生型胚胎2.5-dpfAGM區(qū)域及2.5-dpf和5-dpfCHT區(qū)域mpl基因原位雜交的結(jié)果，右側(cè)為對(duì)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系Tg(mpl:eGFP)胚胎進(jìn)行GFP抗體染色的結(jié)果。兩者表達(dá)部位結(jié)果相同，說(shuō)明GFP的熒光表達(dá)位置確實(shí)是mpl基因表達(dá)的位置。以上結(jié)果表明，獲得了轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系Tg(mpl:eGFP)。實(shí)施例6.本發(fā)明實(shí)施例5的轉(zhuǎn)基因系斑馬魚(yú)的特征的研究mpl不標(biāo)記成熟紅細(xì)胞和髓系細(xì)胞取4dpf的斑馬魚(yú)胚胎Tg(mpl:eGFP)，對(duì)其進(jìn)行免疫化學(xué)染色，在熒 光顯微鏡下觀察Lcp1(髓系細(xì)胞)20與Hbae1(成熟紅細(xì)胞)21染色結(jié)果，信號(hào)點(diǎn)分別為L(zhǎng)cp1、Hbae1與mpl-GFP+的信號(hào)點(diǎn)，其數(shù)量將代表各類細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果如圖4C-D所示，Tg(mpl:eGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎中不存在mpl與lcp1或mpl與hbae1共同表達(dá)的細(xì)胞。說(shuō)明，本發(fā)明的Tg(mpl:eGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系Tg(mpl:eGFP)中，髓系細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞沒(méi)有被特異性標(biāo)記。與已存在的斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因系比較，mpl-GFP+細(xì)胞高表達(dá)血小板標(biāo)記基因，低表達(dá)其他譜系基因。以mpl作為標(biāo)記血小板和血小板前體細(xì)胞的標(biāo)記基因，coronin1a作為標(biāo)記髓系細(xì)胞的標(biāo)記基因，gata1作為標(biāo)記全部紅系細(xì)胞的標(biāo)記基因，利用流式細(xì)胞分選技術(shù)，檢測(cè)4dpf的Tg(coronin1a:eGFP)10，Tg(gata1:DsRed)13，Tg(CD41：eGFP)4和本發(fā)明實(shí)施例5的Tg(mpl:eGFP)中DsRed+細(xì)胞和GFP+中的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果如圖4E-F所示，Tg(mpl:eGFP)中GFP+的細(xì)胞均高表達(dá)血小板基因(cd41，lrrc32)，低表達(dá)或不表達(dá)髓系基因(mpo，lyz，mfap4)22-24和血紅蛋白基因(hbbe1，hbae1)21。結(jié)果顯示，mpl不標(biāo)記成熟紅細(xì)胞和髓系細(xì)胞。進(jìn)一步地，選取了gp9、lrrc32、kif1b、nfe215,17,18,25這些已有文獻(xiàn)報(bào)道與血小板相關(guān)的基因，對(duì)4-dpfTg(CD41:eGFP)4和本發(fā)明實(shí)施例5的Tg(mpl:eGFP)斑馬魚(yú)胚胎分別進(jìn)行綠色熒光蛋白GFP流式分選，將分選得到的細(xì)胞進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖4G所示，表明，這些與血小板相關(guān)的基因在mpl-GFP+的細(xì)胞中比在CD41-GFP+的細(xì)胞中具有顯著更高的表達(dá)，說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例5的Tg(mpl:eGFP)轉(zhuǎn)基因系斑馬魚(yú)確實(shí)是更特異標(biāo)記血小板的轉(zhuǎn)基因系斑馬魚(yú)。實(shí)施例7.利用本發(fā)明實(shí)施例5的轉(zhuǎn)基因系斑馬魚(yú)進(jìn)行凝血模型和Tpo以及白細(xì)胞介素-11增殖血小板響應(yīng)機(jī)制構(gòu)建。由于本轉(zhuǎn)基因系斑馬魚(yú)可以很好地?zé)晒饪梢暬瘶?biāo)記的血小板，所以可 以用此轉(zhuǎn)基因品系來(lái)研究血小板對(duì)斑馬魚(yú)止凝血的作用，從而構(gòu)建斑馬魚(yú)凝血實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?9。首先利用4dpf的斑馬魚(yú)胚胎，每組至少10條，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例5的Tg(mpl:eGFP)轉(zhuǎn)基因系斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行頸部血管針刺損傷，通過(guò)光學(xué)顯微鏡下64倍觀察血管損傷后GFP+細(xì)胞是否到達(dá)損傷處。如圖5A所示，血管損傷后mpl-GFP+的細(xì)胞可到達(dá)損傷處，作為血小板的功能之一，左圖為損傷后1min，右圖為3min，3min血栓面積比1min血栓面積大，說(shuō)明血栓面積隨時(shí)間增大。由于血小板主要生成途徑為Tpo/Mpl，當(dāng)給予Tpo時(shí)，血小板會(huì)響應(yīng)于Tpo而大量增殖26。通過(guò)免疫熒光染色技術(shù)，在Tg(mpl:eGFP)中注射tpomRNA以后，觀察mpl-GFP+的細(xì)胞數(shù)目是否會(huì)明顯增多。如圖5B所示，對(duì)單細(xì)胞時(shí)期Tg(mpl:eGFP)進(jìn)行顯微注射tpomRNA，檢測(cè)3dpfTg(mpl:eGFP)斑馬魚(yú)胚胎GFP+細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，Tpo使得GFP+的細(xì)胞明顯增多。利用本發(fā)明實(shí)施例1的突變體斑馬魚(yú)mplsmu40，我們觀察了在血小板減少癥模型當(dāng)中mpl-GFP+細(xì)胞是否會(huì)減少。如圖5C所示，通過(guò)免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)mplsmu40；Tg(mpl:eGFP)(將實(shí)施例1的mplsmu40純合突變體與實(shí)施例5的Tg(mpl:eGFP)轉(zhuǎn)基因系斑馬魚(yú)雜交，對(duì)其后代篩選得到既有mplsmu40基因突變又具有Tg(mpl:eGFP)轉(zhuǎn)基因背景的斑馬魚(yú)系，將其命名為mplsmu40；Tg(mpl:eGFP))中，4-dpf斑馬魚(yú)胚胎GFP+細(xì)胞與已轉(zhuǎn)入Tg(mpl:eGFP)轉(zhuǎn)基因背景的野生型同胞魚(yú)相比，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示GFP+細(xì)胞數(shù)目顯著減少。我們還研究了白細(xì)胞介素-11作為增加血小板的藥物之一，是否也可以作用于Tg(mpl:eGFP)，使得GFP+的細(xì)胞增多。如圖5D所示，通過(guò)免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)在注射了IL-11的斑馬魚(yú)胚胎Tg(mpl:eGFP)中，相比于對(duì)照組，GFP+細(xì)胞顯著增多，結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明Tg(mpl:eGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)可作為血小板藥物篩選模型。以上結(jié)果表明，Tg(mpl:eGFP)轉(zhuǎn)基因系確實(shí)可作為血小板特異性標(biāo)記的可視化模型，以利于后續(xù)研究。綜上所述，以上僅為本申請(qǐng)的較佳實(shí)施例而已，并非用于限定本申請(qǐng)的保護(hù)范圍，因此，凡在本申請(qǐng)的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。參考文獻(xiàn)1.OrkinSH,ZonLI.Hematopoiesis:anevolvingparadigmforstemcellbiology.Cell.2008；132:631-644.2.StoletovK,KlemkeR.Catchoftheday:zebrafishasahumancancermodel.Oncogene.2008；27:4509-4520.3.SuzanneR,HeatonWL,DeepaJ,etal.Zebrafishscreenidentifiesnovelcompoundwithselectivetoxicityagainstleukemia.Blood.2012；119:5621-5631.4.LinHF.AnalysisofthrombocytedevelopmentinCD41-GFPtransgeniczebrafish.Blood.2005；106:3803-3810.5.PeetersK,StassenJ,CollenD,VanGeetC,FresonK.Emergingtreatmentsforthrombocytopenia:Increasingplateletproduction.DrugDiscovToday.2008；13:798-806.6.Thrombocytopeniainthenewborn.CurrOpinPediatr.1992；88:217-218.7.HuangP,XiaoA,ZhouM,ZhuZ,LinS,ZhangB.HeritablegenetargetinginzebrafishusingcustomizedTALENs.NatBiotechnol.2011；29:699-700.8.WesterfieldM.Thezebrafishbook:aguideforthelaboratoryuseofzebrafish(Daniorerio):M.Westerfield；2007.9.ThisseC,ThisseB.Thisse,C.&Thisse,B.High-resolutioninsituhybridizationtowhole-mountzebrafishembryos.Nat.Protoc.3,59-69.NatureProtocol.2008；3:59-69.10.LiL,YanB,ShiYQ,ZhangWQ,WenZL.LiveImagingRevealsDifferingRolesofMacrophagesandNeutrophilsduringZebrafishTailFinRegeneration.JBiolChem.2012；287:25353-25360.11.JinH,SoodR,XuJ,etal.Definitivehematopoieticstem/progenitorcellsmanifestdistinctdifferentiationoutputinthezebrafishVDAandPBI.Development.2009；136:1397.12.WangK,FangX,MaN,etal.Myeloperoxidase-deficientzebrafishshowanaugmentedinflammatoryresponsetochallengewithCandidaalbicans.FishShellfishImmun.2015；44:109-116.13.YaqoobN,HolottaM,PremC,KoppR,SchwerteT.Ontogeneticdevelopmentoferythropoiesiscanbestudiednon-invasivelyinGATA-1:DsRedtransgeniczebrafish.ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartA:Molecular&IntegrativePhysiology.2009；154:270-278.14.DuL,XuJ,LiX,etal.RumbaandHaus3areessentialfactorsforthemaintenanceofhematopoieticstem/progenitorcellsduringzebrafishhematopoiesis.Development.2011；138:619-629.15.LANGMR,GIHRG,GAWAZMP,MLLERII.HemostasisinDaniorerio:isthezebrafishausefulmodelforplateletresearch？JThrombHaemost.2010；8:1159-1169.16.Timme-LaragyAR,KarchnerSI,FranksDG,etal.Nrf2b,NovelZebrafishParalogofOxidant-responsiveTranscriptionFactorNF-E2-relatedFactor2(NRF2).JBiolChem.2012；287:4609-4627.17.AmigoJD,AckermannGE,CopeJJ,etal.TheroleandregulationoffriendofGATA-1(FOG-1)duringblooddevelopmentinthezebrafish.Blood.2009；114:4654-4663.18.O'ConnorMN,SallesII,CvejicA,etal.Functionalgenomicsinzebrafishpermitsrapidcharacterizationofnovelplateletmembraneproteins.Blood.2009；113:4754-4762.19.JagadeeswaranP,LiuYC.Ahemophiliamodelinzebrafish:analysisofhemostasis.BloodCellsMolDis.1997；23:52-57.20.JinH,SoodR,XuJ,etal.Definitivehematopoieticstem/progenitorcellsmanifestdistinctdifferentiationoutputinthezebrafishVDAandPBI.Development.2009；136:1397.21.AlisonB,CandaceH,OatesAC,etal.Characterizationofembryonicglobingenesofthezebrafish.DevBiol.2003；255:48-61.22.BermanJN,KankiJP,AThomasL.Zebrafishasamodelformyelopoiesisduringembryogenesis.ExpHematol.2005；33:997-1006.23.LieschkeGJ,OatesAC,CrowhurstMO,WardAC,LaytonJE.Macrophagesinembryonicandadultzebrafish:morphologicandfunctionalcharacterization.Blood.2001；98:3087-3096.24.ZakrzewskaA,CuiC,StockhammerOW,BenardEL,SpainkHP,MeijerAH.Macrophage-specificgenefunctionsinSpi1-directedinnateimmunity.Blood.2010；116:e1-e11.25.ShivdasaniRA,RosenblattMF,Zucker-FranklinD,etal.TranscriptionfactorNF-E2isrequiredforplateletformationindependentoftheactionsofthrombopoietin/MGDFinmegakaryocytedevelopment.Cell.1995；81:695-704.26.SvobodaO,StachuraDL,MachoOvaO,etal.Dissectionofvertebratehematopoiesisusingzebrafishthro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