本發(fā)明屬于作物種質(zhì)資源學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于分析大豆種質(zhì)遺傳完整性的方法。

背景技術(shù)：

種質(zhì)(germplasm)是指親代通過有性過程或體細(xì)胞直接傳遞給子代并決定其固有特性的遺傳物質(zhì)。對于植物來說，攜帶種質(zhì)的載體不僅包括種子，還包括植株、根、莖、胚芽、細(xì)胞、原生質(zhì)體等等，甚至是DNA片段。一切具有種質(zhì)或基因的生物類型總稱為種質(zhì)資源(germplasm resources)，也稱遺傳資源(genetic resources)。作物種質(zhì)資源所蘊(yùn)藏的遺傳變異多樣性，是作物育種和生物技術(shù)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

遺傳完整性(genetic integrity)廣義上指種質(zhì)原始遺傳組成狀態(tài)，即在繁殖保存過程中要使其群體的遺傳結(jié)構(gòu)得到完全的保持，包括基因型頻率分布及各位點(diǎn)等位基因頻率分布和其原始群體一致。種質(zhì)遺傳完整性變化有兩方面含義：一是指種質(zhì)貯藏過程中的遺傳變化，如染色體畸變，DNA突變等遺傳變化，以及所產(chǎn)生的遺傳效應(yīng)；二是指種質(zhì)繁殖后，其子代種質(zhì)群體的遺傳組成與親代種質(zhì)群體相比較發(fā)生了變化。因此，維持種質(zhì)遺傳完整性就是在種質(zhì)貯藏過程中要保持其最低程度的遺傳改變(genetic alteration)，在繁種過程中要保持子代與親代具有最大的遺傳相似性。

目前，低溫種質(zhì)庫是大豆種質(zhì)資源保存的主要途徑。我國是世界保存大豆種質(zhì)資源數(shù)量最多的國家，約35000份，這些材料是我國大豆遺傳研究和作物育種的寶貴財(cái)富。然而，大豆種子在低溫種質(zhì)庫中保存并非一勞永逸，隨著保存時間的延長，其生活力會不斷的下降。當(dāng)種質(zhì)庫中的種子發(fā)芽率降到一定程度，或由于生活力監(jiān)測及對外供種的消耗使得貯藏樣品的數(shù)量減少時，需要對庫存大豆進(jìn)行繁殖更新。大豆種子在保存期間和繁殖更新后不可避免受到種子老化及繁殖世代等因素地影響而發(fā)生遺傳完整性變化。因此，針對大豆在保存過程中以及繁殖更新后遺傳完整性發(fā)生變化的實(shí)際情況，制定出一套科學(xué)合理的大豆種質(zhì)遺傳完整性分析方法以及更新發(fā)芽率閾值已是大豆種質(zhì)資源保存研究的當(dāng)務(wù)之急。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于分析大豆種質(zhì)遺傳完整性的方法。采用該方法研究了大豆種質(zhì)資源在保存及繁殖更新過程中其遺傳完整性變化的規(guī)律，并確定出大豆種質(zhì)的繁殖更新發(fā)芽率閾值。

為此，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種用于分析大豆種質(zhì)遺傳完整性的方法，采用形態(tài)標(biāo)記分析與SSR標(biāo)記分析相結(jié)合，對大豆不同生活力群體及其后代群體單株進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查，計(jì)算出形態(tài)多樣性指數(shù)，并進(jìn)行顯著性差異分析；利用SSR核心引物組對各群體單株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增檢測，計(jì)算出不同生活力群體及其后代群體與對照群體之間的各位點(diǎn)等位基因頻率、每位點(diǎn)等位基因數(shù)、遺傳多樣性指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)，并進(jìn)行顯著性差異分析；所述形態(tài)標(biāo)記分析與SSR標(biāo)記分析在同一群體同一單株上進(jìn)行。所述SSR核心引物組由20個引物對組成：序列分別如SEQ ID No.1-SEQ ID No.40所示。

本發(fā)明具體內(nèi)容如下：

1、不同生活力群體的獲得

采用人工倒序老化法：選取播種、田間管理、收獲及成熟度一致的大豆種子，先放入人工氣候箱中進(jìn)行種子含水量平衡，平衡條件是45％RH，25℃，15天，使處理種子的含水量處于同一水平；然后用鋁箔袋真空密封分裝，放置于人工老化箱內(nèi)40℃恒溫老化；放置順序采用倒序法，即人工老化時間最長的處理先放入進(jìn)行老化，人工老化時間最短的最后放入進(jìn)行老化，試驗(yàn)結(jié)束時一起取出；人工老化結(jié)束后在25℃下，將所有處理密封平衡2天。

2、形態(tài)標(biāo)記分析

從不同生活力群體及其子代群體中選出30個單株，每個單株分別調(diào)查形態(tài)性狀，形態(tài)性狀多樣性的計(jì)算采用Shannon-Weaver指數(shù)，將各群體的Shannon-Weaver指數(shù)與對照群體進(jìn)行顯著性t檢驗(yàn)。若差異不顯著則認(rèn)為種質(zhì)遺傳完整性得到有效保持，若差異達(dá)到顯著或極顯著水平，則認(rèn)為種質(zhì)遺傳完整性發(fā)生了改變。

3、SSR標(biāo)記分析

具體步驟是：

(1)采用SDS法從大豆不同生活力群體及其子代群體的每個群體中單株提取葉片基因組DNA，樣本量為96株，所述96個單株中包括形態(tài)性狀調(diào)查的30株；

(2)以每個單株的基因組DNA為模板，用SEQ ID No.1-SEQ ID No.40所示20對SSR核心引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(3)采用6％聚丙烯酰氨凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳結(jié)束后銀染法檢測；

(4)統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增譜帶類型，每個引物視為1個位點(diǎn)，每條帶視為1個等位變異。參照DL1000DNA Marker估計(jì)片段大小。利用POPGENE version 1.31和Powermarker V3.25等軟件對大豆不同生活力群體及其子代群體進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，計(jì)算出各個群體的各位點(diǎn)等位基因頻率、每位點(diǎn)等位基因數(shù)、遺傳多樣性指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)，并利用SAS 9.1對各處理群體與對照群體之間的各位點(diǎn)等位基因頻率進(jìn)行χ²檢驗(yàn)，對每位點(diǎn)等位基因數(shù)、遺傳多樣性指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)進(jìn)行顯著性t檢驗(yàn)，如果差異不顯著則認(rèn)為種質(zhì)遺傳完整性得到有效保持，如果差異達(dá)到顯著或極顯著水平，則認(rèn)為種質(zhì)遺傳完整性發(fā)生了改變。

在上述SSR引物對存在的前提下，任何含有該引物對的產(chǎn)品均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，例如含有上述引物對的試劑或試劑盒。原因在于，其在應(yīng)用時利用的是本發(fā)明所述引物對的特殊性，且得到的結(jié)果取決于本發(fā)明所述引物對的特殊性。因此，本發(fā)明還涉及一種用于分析大豆種質(zhì)遺傳完整性的試劑或試劑盒，其包括所述20對SSR引物對。

本發(fā)明具有如下有益效果：

1、采用形態(tài)標(biāo)記分析與SSR分子標(biāo)記分析相結(jié)合的方法，且形態(tài)標(biāo)記分析單株與SSR標(biāo)記分析單株是一一對應(yīng)的關(guān)系，即每個群體內(nèi)進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查的單株同時也是進(jìn)行SSR核心引物擴(kuò)增的單株，此方法保證了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性，利于更科學(xué)合理地得出大豆繁殖更新發(fā)芽率閾值。

2、每個群體進(jìn)行SSR分析的樣本量為96株，解決了由于樣本量過小，造成群體內(nèi)稀有等位基因的頻率過低，系統(tǒng)誤差過大的問題，同時滿足了在進(jìn)行SSR標(biāo)記分析時，與實(shí)驗(yàn)耗材PCR板孔數(shù)一致，方便進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)的要求。選取大豆繁殖更新時的幼嫩葉片為材料提取基因組DNA，首先明確了所提取DNA的單株是有生命力的個體，而不是生活力未知的種子，只有生命力的個體才能繁殖后代，對于遺傳完整性分析才有意義；其次幼嫩葉片中的多酚、多糖和蛋白質(zhì)等含量較少，易于獲取高質(zhì)量的DNA。該項(xiàng)措施也提高了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。

3、采用人工倒序老化的方法來獲取不同生活力群體，即人工老化時間最長的處理先進(jìn)行老化，人工老化時間最短的最后進(jìn)行老化，試驗(yàn)結(jié)束時一起取出，其優(yōu)點(diǎn)是可以避免系統(tǒng)誤差，從而保證所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

4、本發(fā)明采用20對SSR核心引物進(jìn)行SSR分子標(biāo)記分析，與常規(guī)的大豆SSR分子標(biāo)記分析40～60對引物相比，減少了所用引物對數(shù)量，從而可以節(jié)省大量的工作，提高實(shí)驗(yàn)效率。同時還保證了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

附圖說明

圖1為引物Satt387擴(kuò)增群體G_P-CK的聚丙烯酰胺電泳圖譜。

圖2為引物Satt387擴(kuò)增群體G_P-I的聚丙烯酰胺電泳圖譜。

圖3為引物Satt387擴(kuò)增群體G_P-II的聚丙烯酰胺電泳圖譜。

圖4為引物Satt387擴(kuò)增群體G_P-III的聚丙烯酰胺電泳圖譜。

圖5為引物Satt387擴(kuò)增群體G_F1-CK的聚丙烯酰胺電泳圖譜。

圖6為引物Satt387擴(kuò)增群體G_F1-I的聚丙烯酰胺電泳圖譜。

圖7為引物Satt387擴(kuò)增群體G_F1-II的聚丙烯酰胺電泳圖譜。

圖8為引物Satt387擴(kuò)增群體G_F1-III的聚丙烯酰胺電泳圖譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體試驗(yàn)方法和附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案及其所產(chǎn)生的技術(shù)效果進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明中所使用的方法如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例一 大豆不同生活力群體的獲得

1、試驗(yàn)材料：以大豆地方品種大黃豆種子為試驗(yàn)材料。

2、試驗(yàn)方法：

(1)以播種、田間管理、收獲及成熟度一致的大豆地方品種大黃豆種子為試驗(yàn)材料，至少10000粒種子。

(2)種子人工老化前先放入人工氣候箱中進(jìn)行種子含水量平衡，平衡條件是相對濕度為45％，溫度為25℃，時間為15天，使處理種子的含水量處于7.4％±0.1％，若種子含水量達(dá)不到此標(biāo)準(zhǔn)，相同條件下繼續(xù)平衡。

(3)種子含水量平衡達(dá)到要求后，用鋁箔袋真空密封包裝，平均分成若干份，每份約1000粒種子。

(4)每隔2周進(jìn)行一個處理的人工老化試驗(yàn)，將鋁箔袋放置于人工老化箱內(nèi)恒溫老化，溫度為40℃。采用倒序法進(jìn)行，即人工老化時間最長的處理先進(jìn)行老化，人工老化時間最短的最后進(jìn)行老化，試驗(yàn)結(jié)束時一起取出，避免系統(tǒng)誤差，以未經(jīng)過老化的處理作為對照。人工老化時間視作物品種及所需的發(fā)芽率梯度而定。

(5)人工老化結(jié)束后在25℃下，將所有處理密封平衡2天，獲得的大豆不同生活力的處理群體。

實(shí)施例二 采用形態(tài)標(biāo)記對大豆進(jìn)行遺傳完整性分析

1、分析樣本

實(shí)施例一獲得的大豆不同生活力的處理群體，參考GB/T3543.4農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程中的標(biāo)準(zhǔn)條件，進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，并統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等指標(biāo)(表1)。將不同生活力親代群體的大豆進(jìn)行田間繁殖更新，每個群體定植200株，并進(jìn)行單株編號，得到其子代群體。繁殖更新期間對親代每個群體的30個單株進(jìn)行11個形態(tài)標(biāo)記性狀的調(diào)查。

不同生活力的親代群體收獲后，進(jìn)行單株脫粒后得到子代群體種子，對子代群體的每個群體的單株也進(jìn)行編號，編號與其親代是一一對應(yīng)關(guān)系。對子代群體進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，并統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等指標(biāo)(表1)。將各子代群體進(jìn)行田間繁殖更新，每個群體定植200株，單株編號，與其親代群體保持一致。繁殖更新期間對各個子代群體的30個單株進(jìn)行11個形態(tài)標(biāo)記性狀的調(diào)查，調(diào)查的單株與其親代是一一對應(yīng)關(guān)系。

表1大豆地方品種大黃豆發(fā)芽數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2、Shannon-Weaver指數(shù)t檢驗(yàn)分析

本發(fā)明所統(tǒng)計(jì)形態(tài)性狀標(biāo)記共11個，包括：花色、粒色、粒形、臍色、茸毛色、莢色、結(jié)莢習(xí)性、株高、單株粒數(shù)、單株莢數(shù)和每莢粒數(shù)。從不同生活力群體及其子代群體中選出30個單株，每個單株分別調(diào)查這11個形態(tài)性狀。形態(tài)性狀多樣性的計(jì)算采用Shannon-Weaver信息指數(shù)，即H’＝-∑PilnPi，Pi為某性狀第i個代碼值出現(xiàn)的概率。質(zhì)量性狀如花色、粒色和粒形等予以賦值(表2)。將數(shù)量性狀如株高、單株粒數(shù)、單株莢數(shù)和每莢粒數(shù)進(jìn)行10級分類，1級<X-2δ，10級≥X+2δ，中間每級間差0.5δ，X為平均值，δ為標(biāo)準(zhǔn)差。11個形態(tài)性狀數(shù)據(jù)按不同的變異類型分別轉(zhuǎn)換成AA、BB和CC等字母格式，利用生物統(tǒng)計(jì)軟件Popgene等計(jì)算不同形態(tài)性狀變異的Shannon-Weaver指數(shù)。然后利用SAS V9.1將各群體的Shannon-Weaver指數(shù)與對照群體進(jìn)行顯著性t檢驗(yàn)(表3)。

表2大豆地方品種大黃豆形態(tài)性狀鑒定項(xiàng)目及標(biāo)準(zhǔn)

表3大豆地方品種大黃豆Shannon-Weaver指數(shù)t檢驗(yàn)

注：^*表示5％水平上顯著差異；^**表示1％水平上顯著差異

結(jié)果顯示，親代群體中發(fā)芽率為83.0％的群體G_P-I，其Shannon-Weaver指數(shù)與對照群體G_P-CK相比差異不顯著，發(fā)芽率61.0％的群體G_P-II，其Shannon-Weaver指數(shù)與對照群體相比差異顯著，發(fā)芽率為30.0％的群體G_P-III，其Shannon-Weaver指數(shù)與對照群體相比差異極顯著。這表明，較高生活力的群體(發(fā)芽率≥83.0％)與對照群體相比，其遺傳完整性得到了較好的保持，而較低生活力的群體(發(fā)芽率≤61.0％)與對照群體相比，其遺傳完整性發(fā)生了顯著變化。子代群體中各個群體(包括G_F1-CK、G_F1-I、G_F1-II和G_F1-III)的發(fā)芽率均為90.0％以上，其Shannon-Weaver指數(shù)與對照相比差異均不顯著，表明高生活力的子代群體，與對照群體相比其遺傳完整性得到了較好的保持。這說明形態(tài)多樣性與生活力密切相關(guān)，原因是形態(tài)多樣性主要是數(shù)量性狀造成的，而質(zhì)量形狀的差異很小，高生活力子代群體的數(shù)量性狀與對照群體的差異較小，而低生活力子代群體的數(shù)量性狀與對照群體的差異較大。

實(shí)施例三 采用SSR分子標(biāo)記對大豆進(jìn)行遺傳完整性分析

1、分析樣本

同實(shí)施例二的分析樣本，不同生活力親代群體及其子代群體在田間繁殖更新期間，取96個單株(包括實(shí)施例二中的30個單株)，采集幼嫩葉片，-80℃下保存?zhèn)溆谩Ｗ哟杉~片的單株與其親代也是一一對應(yīng)關(guān)系。

2、基因組DNA提取

采用SDS法單株提取上述親代及子代各個群體的基因組DNA。提取步驟為：

(1)將大豆幼嫩葉片用鑷子放入2.0mL離心管中，每管加入一粒直徑5mm的鋼珠后，進(jìn)行下一步操作或-80℃?zhèn)溆茫?/p>

(2)將離心管迅速放入液氮中冷卻，裝入組織研磨儀中將葉片打碎，時間為30s，頻率為50Hz，注意動作要迅速，之后取出離心管加入1mL的SDS提取液，提取液事先放入65℃水浴中預(yù)熱，抑制DNA酶，加速蛋白質(zhì)變性，促進(jìn)DNA溶解，然后向離心管中加入10μL的巰基乙醇，抑制酚氧化為醌，充分混勻，也可劇烈震蕩；

(3)將離心管放入65℃水浴中保溫1小時，水浴過程中每10分鐘搖動一次；

(4)待樣品冷卻至室溫后，加入1/5體積的5MKAc，冰水混合物中放置30分鐘；

(5)12000g離心10分鐘后，吸取1000μL上清液加入到另一2.0mL離心管中，在每管中加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇溶液，體積比為25：24：1，充分振動15分鐘后，12000g離心15分鐘；

(6)吸取800μL上清液加入到另一2.0mL離心管中，加入10μLRNA酶(10mg/μL)溶液，37℃水浴1小時或-4℃過夜；

(7)每管中加入800μL的氯仿/異戊醇溶液，體積比為24：1，充分振動15分鐘后，12000g離心15分鐘；

(8)吸取600μL上清液加入到另一2.0mL離心管中，每管加入0.6～1.0體積的異丙醇，輕

輕混勻后置于-20℃下30分鐘，12000g離心10分鐘，收集沉淀；

(9)加入1mL75％乙醇沖洗2次后，再用1mL無水乙醇沖洗1次，置于真空離心機(jī)中，將DNA吹干至無酒精味，加入100μL1×TE溶解；

(10)樣品在4℃?zhèn)溆茫嘤鄻悠分糜?20℃下長期保存。

3、20對SSR核心引物的篩選

以大豆地方品種大黃豆對照群體的96個單株基因組DNA為模板，分別用236對SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測、銀染顯色及統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析。根據(jù)每對引物在96個單株中的擴(kuò)增結(jié)果，剔除不具備多態(tài)性或多態(tài)性較低的引物，保留具有較高多態(tài)性的引物，最終篩選獲得20對高多態(tài)性核心引物(表4)，保證大豆每個遺傳連鎖群上有1對引物。

表4大豆地方品種大黃豆遺傳完整性分析SSR核心引物

4、SSR引物擴(kuò)增及聚丙烯酰氨凝膠檢測

采用表4的20對SSR核心引物，對不同生活力的親代群體及其子代群體基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用6％聚丙烯酰氨凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，功率75W，時間為50min，電泳結(jié)束后銀染法檢測。

(1)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：Premix Taq^TM(TaKaRaTaq^TM Version2.0)10.0μL，5.0μmol/L Primer pairs(1.0+1.0)μL，20.0ng/μL DNA5.0μL，ddH₂O3.0μL，總體系為20.0μL。

(2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；95℃變性45s，47℃退火45s，72℃延伸45s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。溫度降至4℃時取出，4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)銀染法檢測步驟為：

①固定：電泳后將平板放入固定液(10％的乙醇和0.5％的冰醋酸)中，輕輕搖動12分鐘至指示劑無色；

②銀染：將平板放入銀染液(0.2％AgNO₃)中，輕輕搖動12分鐘；

③水洗：從銀染液中取出平板，用去離子水洗滌10秒；

④顯影：將水洗后的平板放入顯影液(1.5％NaOH和0.4％甲醛)中，輕輕搖動，顯色至所要的程度；

⑤終止顯影：將平板放入10％的冰醋酸中，輕搖1～2分鐘；

⑥沖洗：將平板放入去離子水中，沖洗1分鐘；

⑦干燥：將沖洗好的平板置于室溫下自然干燥。

結(jié)果如附圖1-8所示：附圖1-8為用引物Satt387擴(kuò)增群體GP-CK、GP-I、GP-II、GP-III、GF1-CK、GF1-I、GF1-II、GF1-III的聚丙烯酰胺電泳圖譜。

5、結(jié)果統(tǒng)計(jì)及分析：根據(jù)檢測結(jié)果，利用POPGENE version 1.31和Powermarker V3.25等軟件對大豆地方品種大黃豆親代及子代各個群體進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，計(jì)算出各個群體的各位點(diǎn)等位基因頻率、每位點(diǎn)等位基因數(shù)、遺傳多樣性指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)，并利用SAS 9.1對各處理群體與對照群體之間的各位點(diǎn)等位基因頻率進(jìn)行χ²檢驗(yàn)，對每位點(diǎn)等位基因數(shù)、遺傳多樣性指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)進(jìn)行顯著性t檢驗(yàn)。

(1)等位基因頻率差異分析

表5大豆地方品種大黃豆群體間等位基因頻率差異分析

從表5可以看出，親代群體中群體G_P-I、G_P-II和G_P-III與對照群體的G_P-CK等位基因頻率顯著差異和極顯著差異的位點(diǎn)個數(shù)以及占總位點(diǎn)個數(shù)百分比，隨著生活力的下降而增加，其中發(fā)芽率為30.0％的群體G_P-III的顯著和極顯著差異位點(diǎn)個數(shù)最多，分別為4個和2個，占總位點(diǎn)的個數(shù)的百分比分別為20.00％和10.00％，發(fā)芽率為61.0％的群體G_P-II次之，分別為3和1個，占總位點(diǎn)的個數(shù)的百分比分別為15.00％和5.00％，發(fā)芽率為83.0％的群體G_P-I最少，分別為1個和0個，占總位點(diǎn)的個數(shù)的百分比分別為5.00％和0，這表明生活力下降顯著地影響了大豆種質(zhì)材料群體內(nèi)的等位基因頻率分布。由群體G_P-CK繁殖的群體G_F1-CK與對照群體G_P-CK相比，無顯著差異位點(diǎn)，由群體G_P-I繁殖的群體G_F1-I與對照群體G_P-CK相比，顯著或極顯著差異的位點(diǎn)個數(shù)與群體G_P-I持平，同為為1個和0個，占總位點(diǎn)的個數(shù)的百分比分別為5.00％和0，這表明發(fā)芽率為93.0％和83.0％的大豆經(jīng)過繁殖更新后，各位點(diǎn)的等位基因頻率與對照群體相比幾乎沒有差異。由群體G_P-II和G_P-III繁殖的群體G_F1-II和G_F1-III，這2個群體與對照群體G_P-CK顯著或極顯著差異的位點(diǎn)個數(shù)較多，分別為3個和2個，5個和3個，占總位點(diǎn)的個數(shù)的百分比分別為15.00％和10.00％，25.00％和15.00％，且子代群體比相應(yīng)親代群體的顯著或極顯著差異位點(diǎn)數(shù)要高，表明發(fā)芽率為61.0％和30.0％的大豆種質(zhì)材料的子代群體各位點(diǎn)的等位基因頻率與對照群體相比差異顯著，且生活力水平愈低差異愈大。以上結(jié)果表明，生活力下降對大豆種質(zhì)材料的等位基因頻率分布影響甚大。

(2)群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

表6大豆地方品種大黃豆群體遺傳結(jié)構(gòu)

注：^*表示5％水平上顯著差異；^**表示1％水平上顯著差異

從表6中可以看出，親代群體中G_P-I、G_P-II、G_P-III及其子代群體G_F1-I、G_F1-II和G_F1-III，其各項(xiàng)遺傳多樣性參數(shù)均低于對照群體G_P-CK，而且隨老化時間的延長，生活力水平愈低，其各項(xiàng)遺傳多樣性參數(shù)也愈低。t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，由對照群體G_P-CK繁殖的群體G_F1-CK，其各項(xiàng)遺傳多樣性參數(shù)與對照群體G_P-CK相比幾乎沒有差異，表明發(fā)芽率為93.0％的群體經(jīng)過繁殖更新后，其群體的遺傳結(jié)構(gòu)得到了較好的保持。群體G_P-I的A、H和I等3項(xiàng)遺傳多樣性參數(shù)與對照群體相比無顯著差異，而其子代群體G_F1-I的各項(xiàng)遺傳多樣性參數(shù)與對照群體相比雖有所下降但沒有達(dá)到顯著差異水平。群體G_P-II和G_P-III的A、H和I等3項(xiàng)遺傳多樣性參數(shù)與對照群體G_P-CK相比差異顯著或極顯著。群體G_P-II和G_P-III的子代群體G_F1-II和G_F1-III的A、H和I等3個遺傳多樣性參數(shù)與對照群體相比差異極顯著，表明更新發(fā)芽率分別為61.0％和30.0％的群體因生活力水平下降，其自身及子代群體內(nèi)的遺傳多樣性低于對照群體遺傳多樣性。以上結(jié)果表明，生活力下降對大豆種質(zhì)材料的群體遺傳結(jié)構(gòu)影響顯著。

綜合大豆地方品種大黃豆形態(tài)標(biāo)記分析和SSR標(biāo)記分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出以下結(jié)論：高生活力的大豆(發(fā)芽率≥83.0％)及其子代在形態(tài)性狀水平及DNA分子水平上，其遺傳完整性都得到了較好的保持；而低生活力的大豆(發(fā)芽率≤61.0％)在形態(tài)水平上遺傳完整性顯著變化，但其子代在形態(tài)水平上有所恢復(fù)，低生活力的大豆(發(fā)芽率≤61.0％)親代及其子代在DNA分子水平上的遺傳完整性明顯改變。因此，大豆的優(yōu)選繁殖更新發(fā)芽率閾值為不低于83.0％，最低不得低于61.0％。

實(shí)施例四用于野生大豆遺傳完整性分析的試劑或試劑盒

所述試劑和試劑盒含有實(shí)施例三所述的引物組合。

所述試劑盒還可包括本領(lǐng)域其他常規(guī)組分。

本發(fā)明綜合采用形態(tài)標(biāo)記與SSR分子標(biāo)記相結(jié)合的方法，且形態(tài)標(biāo)記分析單株與SSR標(biāo)記分析單株是一一對應(yīng)的關(guān)系，即每個群體內(nèi)進(jìn)行形態(tài)性狀調(diào)查的單株同時也是進(jìn)行SSR核心引物擴(kuò)增的單株，此方法保證了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。本發(fā)明提供的方法可以準(zhǔn)確地獲得大豆在保存過程中以及繁殖更新后遺傳完整性發(fā)生變化的實(shí)際情況，從而得出更精準(zhǔn)的大豆繁殖更新的發(fā)芽率閾值。