本發明屬于納米檢測技術領域，具體涉及一種DNA探針通過與摻雜殼聚糖和聯吡啶釕的二氧化硅復合納米粒子自組裝，制備用于檢測micro RNA的DNA納米探針的方法。

背景技術：

DNA納米探針，因其具有可化學合成、性質穩定、識別廣泛且具有信號報告能力等優點，而越來越多的被應用于生物分析。現有的DNA納米探針制備技術多數是將DNA探針通過化學鍵合作用固定于納米材料表面或對其進行信號分子標記，有些還需要酶進行輔助，這會使實驗步驟繁瑣、實驗成本高；另一方面，將DNA探針通過化合鍵合作用固定于納米材料表面會大大降低探針的空間自由度，使其在識別目標分子的過程中由于空間位阻等的影響而使分子識別能力降低。因此，發展新的DNA納米探針的制備方法、克服上述不足之處就具有重要的科學與應用價值。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題在于發展一種制備過程簡單、無需DNA標記的DNA納米探針的制備方法。

解決上述技術問題所采用的技術方案由以下步驟組成：

1、制備摻雜殼聚糖和聯吡啶釕的二氧化硅復合納米粒子

將殼聚糖加入質量分數為0.1％的醋酸水溶液中，配制成質量體積濃度為0.5～5mg/mL的殼聚糖溶液，然后將所得殼聚糖溶液加入到Triton X-100與正己醇、環己烷、超純水的混合液中，再加入0.01mol/L的聯吡啶釕水溶液，用0.1mol/L NaOH水溶液調節體系至中性，室溫攪拌30～60分鐘，加入正硅酸乙酯和氨水，繼續攪拌20～24小時，加入丙酮破乳，離心分離，所得固體依次用無水乙醇和超純水洗滌，得到摻雜殼聚糖和聯吡啶釕的二氧化硅復合納米粒子。

2、制備DNA納米探針

將步驟1得到的摻雜殼聚糖和聯吡啶釕的二氧化硅復合納米粒子分散于超純水中，然后加入與待檢測micro RNA相對應的DNA探針，控制反應體系中摻雜殼聚糖和聯吡啶釕的二氧化硅復合納米粒子的濃度為0.10～0.25mg/mL、DNA探針的濃度為5×10^-10～5×10^-8mol/L，室溫反應30～40分鐘，離心分離，并用1.0mmol/L pH＝6.0的PB緩沖液洗滌1～2次，得到DNA納米探針。

上述步驟1中，優選正硅酸乙酯與殼聚糖溶液、聯吡啶釕水溶液、氨水、超純水的體積比為1:1.5～2.0:0.3～0.8:0.6～0.8:3～3.5，優選Triton X-100與正己醇、環己烷、超純水的體積比為1:1:4.0～4.3:0.1～0.3。

上述步驟2中，優選控制反應體系中摻雜殼聚糖和聯吡啶釕的二氧化硅復合納米粒子的濃度為0.15～0.20mg/mL、DNA探針的濃度為5×10^-9～4.5×10^-8mol/L，其中所述的DNA探針分散于1.0mmol/LpH＝6.0的PB緩沖液中。

本發明通過DNA探針與摻雜殼聚糖和聯吡啶釕的二氧化硅復合納米粒子自組裝，制備成用于檢測micro RNA的DNA納米探針。與現有技術相比，本發明具有如下特點：

1、本發明無需復雜的標記和固定DNA探針分子操作過程，其主要利用DNA探針分子在納米材料表面的自組裝來制備DNA納米探針，只要DNA探針是單鏈DNA且堿基個數為20～35個，對DNA探針的堿基序列沒有要求，因此具有普遍適用性。

2、由于DNA探針在納米粒子表面的特殊組裝形態，使目標micro RNA更易與組裝在納米粒子表面的DNA探針雜交，并釋放出電化學發光納米粒子，因而采用電化學發光分析技術可以快速、高效的識別目標micro RNA，且目標micro RNA的檢出限低，可達0.1pmol/L。

附圖說明

圖1是實施例1制備的DNA納米探針的透射電子顯微鏡圖。

圖2是實施例1制備的DNA納米探針(曲線a)和DNA納米探針與let-7a作用后(曲線b)的電化學發光對比圖。

圖3是實施例1制備的DNA納米探針對let-7a的線性關系圖。

圖4是實施例1制備的DNA納米探針對let-7a的電化學發光疊加圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明的保護范圍不僅限這些實施例。

實施例1

1、制備摻雜殼聚糖和聯吡啶釕的二氧化硅復合納米粒子

將0.2g殼聚糖加入100mL質量分數為0.1％的醋酸水溶液中，配制成質量體積濃度為2mg/mL的殼聚糖溶液，然后將150μL所得殼聚糖溶液加入到1.8mL Triton X-100與1.8mL正己醇、7.5mL環己烷、300μL超純水的混合液中，攪拌30分鐘，再加入50μL 0.01mol/L聯吡啶釕水溶液，并加入0.1mol/L NaOH水溶液調節體系至中性，室溫攪拌60分鐘，依次加入90μL正硅酸乙酯與60μL氨水，室溫繼續攪拌24小時，加入丙酮破乳，離心分離，所得固體依次用無水乙醇和超純水洗滌，得到摻雜殼聚糖和聯吡啶釕的二氧化硅復合納米粒子。

2、制備DNA納米探針

將步驟1得到的摻雜殼聚糖和聯吡啶釕的二氧化硅復合納米粒子分散于超純水中，然后加入與let-7a相對應的DNA探針(堿基序列為AACTATACAACCTACTACCTCA，分散于1.0mmol/L pH＝6.0的PB緩沖液中，濃度為4×10^-8mol/L)，控制反應體系中摻雜殼聚糖和聯吡啶釕的二氧化硅復合納米粒子的濃度為0.15mg/mL、DNA探針的濃度為2×10^-8mol/L，室溫反應30分鐘，離心分離，并用1.0mmol/L pH＝6.0的PB緩沖液洗滌1～2次，得到DNA納米探針，將其分散在1.0mmol/L pH＝6.0的PB緩沖液中冷藏保存。采用JEM-2100型透射電子顯微鏡(日立，日本)對所得DNA納米探針分別進行表征，結果見圖1。由圖可見，制備成的DNA納米探針表面可看到明顯的由于疏水性堿基朝外而形成的水泡，說明DNA探針被成功自組裝在復合納米粒子表面。

為了證明本發明的有益效果，發明人采用實施例1制備的DNA納米探針檢測let-7a，具體試驗如下：

1、電化學發光檢測

(1)DNA納米探針與let-7a的雜交反應

取20μL分散于1.0mmol/L pH＝6.0的PB緩沖液的DNA納米探針，加入20μL退火后的let-7a(用1.0mmol/L pH＝6.0的PB緩沖液配制，濃度為1×10^-8mmol/L)，充分混勻后，室溫雜交40分鐘。

(2)Nafion/MWNT修飾電極的制備

將玻碳電極依次用0.3μm和0.05μm的Al₂O₃拋光粉在拋光布上打磨光亮，然后依次用乙醇和蒸餾水分別超聲清洗5分鐘，取出用超純水沖洗后自然晾干。將1.5mg MWNT超聲分散于3.0mL體積分數為0.05％的Nafion乙醇溶液中，然后取10μL該分散液滴涂在處理好的玻碳電極表面，室溫下靜置使其自然晾干形成Nafion/MWNT修飾電極。

(3)電化學發光信號檢測

將Nafion/MWNT修飾電極先浸入到實施例1得到的DNA納米探針分散液中，室溫靜置60分鐘，用超純水充分沖洗并晾干后，按照常規方法進行電化學發光檢測，得到DNA納米探針組裝到Nafion/MWNT修飾電極上所對應的電化學發光強度I₀；檢測完后將Nafion/MWNT修飾電極再浸入步驟(1)DNA納米探針與let-7a的雜交反應液中，室溫靜置60分鐘后，再采用RFL-1型化學發光分析儀進行電化學發光檢測，得到對應的電化學發光強度I_i，i為1～n之間的正整數。結果見圖2。由圖可見，DNA納米探針與let-7a雜交反應之后電化學發光信號明顯增高，說明let-7a可以使自組裝在納米粒子表面的DNA探針通過雜交從納米粒子表面脫離，從而使納米粒子表面恢復電正性而被吸附在修飾電極表面。

2、線性關系

按照上述步驟(3)的方法，對實施例1得到的DNA納米探針與不同濃度let-7a標準樣品(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9pmol/L)雜交反應后的溶液進行電化學發光信號檢測，分別得到所對應的I_i，繪制I_i隨let-7a濃度變化的標準曲線，結果見圖3和4。由圖可見，不同let-7a濃度下的I_i與let-7a濃度呈現良好的線性關系，其線性相關系數R＝0.985，線性方程為I_i＝-576.85+1500.85c(c為let-7a濃度)。

采用人尿樣復合樣品對所得的線性方程進行了驗證，得到的平均回收率為101％，相對標準偏差為3.4％，表明采用本發明方法制備的DNA納米探針檢測實現實際樣品中的micro RNA，具有高度敏感性、良好的重現性及精確度。因此，本發明方法制備的DNA納米探針可作為用于micro RNA在臨床診斷的檢測材料。