本發(fā)明屬于梅毒螺旋體試劑盒制備領(lǐng)域，特別涉及一種梅毒螺旋體感染依賴性抗原及其試劑盒和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

梅毒(syphilis)是由梅毒螺旋體蒼白亞種[Treponema pallidum subspecies pallidum(Tp)]引起的一種慢性、系統(tǒng)性的疾病，主要經(jīng)性傳播、輸血傳播以及垂直傳播。梅毒的報(bào)道始于15世紀(jì)末歐洲，曾一度被稱為“大水痘”，其診斷和臨床管理一直困擾著臨床醫(yī)生。有流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明世界范圍內(nèi)有3600萬(wàn)梅毒患者，每年有大于1100萬(wàn)的新發(fā)病例。盡管近年來(lái)這一數(shù)據(jù)有所下降，梅毒依然是引起畸胎、流產(chǎn)、死胎的重要原因，嚴(yán)重影響出生人口質(zhì)量。此外，由于傳播途徑和艾滋病(AIDS)相同，梅毒大大增加了感染艾滋病的風(fēng)險(xiǎn)。因而及時(shí)、準(zhǔn)確、可靠的診斷方法特別是早期梅毒的診斷對(duì)于梅毒的管理來(lái)說(shuō)尤為重要。

由于梅毒螺旋體(Tp)不能進(jìn)行體外培養(yǎng)，很大程度上限制了其致病機(jī)制的闡明和診斷方法的發(fā)展。Tp全基因組序列的解析為Tp的蛋白功能研究提供了新的契機(jī)。梅毒的血清學(xué)診斷始于100多年前,事實(shí)上，梅毒的診斷主要也是依靠血清學(xué)診斷。分為非梅毒螺旋體和梅毒螺旋體為基礎(chǔ)的血清學(xué)試驗(yàn)。前者包括：TRUST、RPR、VDRL等；后者包括：TPPA、TPHA、FTA-ABS、EIA和CIA等。目前主要有2種梅毒的血清學(xué)篩查實(shí)驗(yàn)程序：傳統(tǒng)的程序和與之對(duì)應(yīng)的逆序法。美國(guó)疾病預(yù)防控制中心(CDC)建議使用傳統(tǒng)方法:即梅毒血清學(xué)篩查實(shí)驗(yàn)始于一種非梅毒螺旋體的實(shí)驗(yàn)：RPR、TRUST或者VDRL，進(jìn)而用一種梅毒螺旋體實(shí)驗(yàn)予以確證。實(shí)驗(yàn)室協(xié)會(huì)，英國(guó)健康保護(hù)署,國(guó)際反性傳播疾病聯(lián)盟則鼓勵(lì)采用逆序篩查程序。近年來(lái)學(xué)者們對(duì)逆序篩查的態(tài)度不完全一致。TPPA試驗(yàn)具有極高的敏感性和特異性，是目前公認(rèn)的梅毒確證方法，但是價(jià)格昂貴，數(shù)據(jù)不易保存，難以自動(dòng)化且不能用于療效和再感染的判斷。近年來(lái)，以梅毒螺旋體外膜蛋白和鞭毛蛋白為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫法和化學(xué)發(fā)光法因其獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)(客觀、準(zhǔn)確、耗時(shí)短，易于自動(dòng)化和數(shù)字化等)，在梅毒的血清學(xué)診斷中得到了一定的發(fā)展和應(yīng)用。代表性的診斷抗原包括：TPN15(Tp1071)、TPN17(Tp0435)、TPN47(Tp0574)、TPN44.5(TmpA,Tp0768)、Tp0663、Tp0965和Tp0821等,以及鞭毛蛋白FlaB1,FlaB2,FlaB3。盡管這些抗原在梅毒的血清學(xué)診斷中均有較好的表現(xiàn)，但目前沒(méi)有數(shù)據(jù)確切表明哪一種蛋白或者重組蛋白的診斷價(jià)值最好；另外，基于以上梅毒抗原的ELISA試驗(yàn)等試驗(yàn)方法不能評(píng)價(jià)梅毒的治療效果，而以非梅毒螺旋體為基礎(chǔ)的血清學(xué)試驗(yàn)(RPR、TRUST等)主要原理是基于反應(yīng)素。它們的滴度變化通常與疾病的活躍程度有著密切的關(guān)系，通常用于梅毒療效監(jiān)測(cè)。但是由于反應(yīng)素在其它疾病如SLE、瘧疾、單核細(xì)胞增多癥等也會(huì)存在，所以假陽(yáng)性率較高。

申請(qǐng)者前期在Tp動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中用活的和滅活的TpNichols標(biāo)準(zhǔn)株分組分別進(jìn)行兔背部皮內(nèi)接種觀察免疫應(yīng)答效應(yīng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)：活Tp接種組新西蘭兔誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體總水平與滅活Tp接種組并無(wú)顯著差異，但前者血清中檢測(cè)到有較高滴度的抗Tp0134和抗Tp0760的特異性抗體，這兩種均為非菌體膜蛋白，而后者血清中并無(wú)相關(guān)抗體；活Tp接種組兔脾細(xì)胞受Tp抗原刺激后，INF-γ,TNF-α,IL-1β誘生水平均顯著高于滅活Tp接種組；同時(shí)發(fā)現(xiàn)在早期、二期、晚期及潛伏期梅毒患者血清中均能檢測(cè)到Tp0134和Tp0760的表達(dá)。以上現(xiàn)象我們初步推斷：活的Tp感染和滅活的Tp接種，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原存在一定差異，活的Tp在感染階段可能新合成分泌了一些抗原(如Tp0134和Tp0760等)到菌體內(nèi)外或胞漿，以調(diào)控宿主細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，介導(dǎo)Tp與宿主細(xì)胞間的相互作用，從而在梅毒感染早期的炎癥反應(yīng)以及在宿主體內(nèi)持續(xù)慢性感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。由于這些抗原蛋白是在活的Tp感染階段產(chǎn)生、合成分泌的，并不是Tp菌體膜蛋白，我們稱其為梅毒螺旋體感染依賴性抗原(infection phase_dependent antigens)。

分析和比較活Tp感染后和滅活Tp接種后血清抗體與Tp“高通量融合蛋白微陣列”反應(yīng)譜的差異，將極大促進(jìn)Tp感染依賴性免疫優(yōu)勢(shì)抗原的篩選，由于目前人用Tp滅活疫苗的空白，所以目前無(wú)法獲取Tp死疫苗接種的人類免疫血清；本研究采用新西蘭兔血清進(jìn)行抗原的篩選，理由如下：1.由于Tp的特殊生物學(xué)特性，新西蘭兔是目前唯一較成熟的Tp感染模型構(gòu)建對(duì)象，申請(qǐng)者的課題組也是國(guó)內(nèi)最早成功開(kāi)展新西蘭兔動(dòng)物感染模型構(gòu)建的研究隊(duì)伍，并保存有國(guó)內(nèi)為數(shù)不多幾家機(jī)構(gòu)所有的TpNichols標(biāo)準(zhǔn)株；2.人與外界環(huán)境接觸多，其它病原體接觸誘導(dǎo)機(jī)體所產(chǎn)生的抗體可能與Tp抗原有交叉反應(yīng)，而實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新西蘭兔生活環(huán)境相對(duì)單一，與病原菌接觸少，血清非特異性反應(yīng)背景低；3.人類和新西蘭兔Tp感染的抗原表達(dá)譜可能存在一定差異，如將活Tp感染的人血清與滅活的Tp免疫兔血清直接進(jìn)行比較，由于種屬差異對(duì)抗原表達(dá)的影響，篩選結(jié)果會(huì)出現(xiàn)較高的假陽(yáng)性。

以非梅毒螺旋體為基礎(chǔ)的血清學(xué)試驗(yàn)(RPR、TRUST等)主要原理是基于反應(yīng)素。它們的滴度變化通常與疾病的活躍程度有著密切的關(guān)系，因此可以作為梅毒的判愈實(shí)驗(yàn)。但是由于反應(yīng)素在其它疾病如SLE、瘧疾、單核細(xì)胞增多癥等也會(huì)存在，所以假陽(yáng)性率較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種梅毒螺旋體感染依賴性抗原及其試劑盒和應(yīng)用，本發(fā)明在國(guó)內(nèi)外首次進(jìn)行梅毒感染依賴性診斷抗原的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)Tp0971、Tp0768、Tp0462符合感染依賴性抗原的特點(diǎn)且均具有良好的免疫活性，Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA在與新西蘭兔血清和臨床病人的血清標(biāo)本中均顯示具有良好的診斷性能(較高的敏感性和特異性)。并且我們通過(guò)Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA的A450值與RPR滴度變化進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA和Tp0462-ELISA的A450值與RPR滴度變化均呈正相關(guān)。這就提示我們可以采用一種基于梅毒新類型抗原的ELISA方法來(lái)充實(shí)臨床梅毒診斷方法學(xué)，且同時(shí)能替代傳統(tǒng)的RPR/TRUST，作為梅毒的臨床判愈試驗(yàn)。綜上，Tp0971、Tp0768和Tp0462可以作為梅毒診斷的候選抗原，并且有望為新的梅毒判愈試驗(yàn)方法的研究奠定基礎(chǔ)。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

梅毒螺旋體感染依賴性抗原，其為Tp0971、Tp0768和Tp0462，其氨基酸序列分別為：Tp0971：SEQ ID NO.3、Tp0768：SEQ ID NO.2和Tp0462：SEQ ID NO.1。

所述的梅毒螺旋體感染依賴性抗原，其制備方法包括如下步驟：

步驟一、軟件分析TpNichils標(biāo)準(zhǔn)株全基因組所有ORFs，建立Tp疫苗候選抗原體系；

(1)采用BLAST軟件，對(duì)TpNichils標(biāo)準(zhǔn)株全基因組ORFs的編碼蛋白與人的全部蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源性分析，去掉有高度同源性的抗原；

以人的全部蛋白質(zhì)序列為數(shù)據(jù)庫(kù)，使用BLASTP程序，用Tp全基因組ORFs的編碼蛋白與人的全部蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)，去掉有高度同源性的抗原；

(2)對(duì)以上初篩出的候選抗原采用細(xì)菌亞細(xì)胞定位及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，去掉不適合作為疫苗抗原的蛋白，包括細(xì)菌胞質(zhì)蛋白、跨膜結(jié)構(gòu)超過(guò)4個(gè)的膜蛋白；

步驟二、Tp“高通量融合蛋白微陣列”制備技術(shù)的建立

(1)大規(guī)模抽提pGEX-6p-1和pGEX-6p-2融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒，分別采用不同組合的限制性內(nèi)切酶，進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物切膠回收，純化后分裝保存；

(2)以TpNichils標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA為模板，對(duì)篩選出的有價(jià)值ORFs進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將每個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建ORF/pGEX重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；采用pGEX載體通用引物及每個(gè)ORF的特異性引物對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)的細(xì)菌克隆進(jìn)行篩查和鑒定；

(3)將鑒定陽(yáng)性的單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，離心收集菌體，超聲裂解細(xì)胞收集含有大量可溶性的GST-融合蛋白的上清液，分裝、-80℃保存?zhèn)溆茫蝗?ml上述上清液預(yù)處理后，SDS-PAGE膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，鑒定融合蛋白的表達(dá)情況；

(4)將上述可溶性GST-融合蛋白和采用相同方法制備的GST對(duì)照蛋白，依次點(diǎn)樣固相化于預(yù)先包被有谷胱甘肽的微量反應(yīng)板中，20μL/well，制備高通量的Tp“融合蛋白微陣列”；

步驟三、新西蘭兔TpNichils標(biāo)準(zhǔn)株活Tp感染和滅活Tp免疫血清的制備

(1)常規(guī)方法進(jìn)行Tp的培養(yǎng)與純化；

(2)紫外線滅活Tp的制備；

將純化的Tp菌懸液轉(zhuǎn)入無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿，置G36T5L/C型紫外燈下5cm²處照射45min，每15min晃動(dòng)平皿一次，NS定容至原體積，分裝、-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(3)新西蘭兔Tp感染和免疫血清的制備

選用2.5-3kg成年新西蘭兔40只，隨機(jī)分為兩組：其中一組在背部剃毛處理后皮下接種8個(gè)皮丘，每個(gè)位點(diǎn)接種量為Tp Nichols株菌數(shù)10⁵個(gè)，感染期間喂飼無(wú)抗生素的飼料和飲水；另一組用佐劑聯(lián)合高劑量的滅活Tp，10⁶IFU/每個(gè)位點(diǎn)，同法接種免疫新西蘭兔，共接種3次，0d,14d,28d，第三次免疫后2周，兩組兔均抽血分離血清-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟四、Tp感染依賴性免疫優(yōu)勢(shì)抗原篩選和鑒定：

Tp Nichols株感染組和滅活Tp免疫組的所有兔血清各20份為一抗，分別與Tp“高通量融合蛋白微陣列”中的每一種GST-融合蛋白和采用相同方法制備的GST對(duì)照蛋白反應(yīng)，以HRP標(biāo)記的抗兔抗體為二抗，酶標(biāo)儀讀取405nm波長(zhǎng)OD值。GST-融合蛋白孔OD值大于或等于GST對(duì)照孔2倍以上判斷為陽(yáng)性。比較分析活Tp感染組和滅活Tp免疫組血清與Tp抗原反應(yīng)譜差異，篩選僅被Tp感染組血清抗體特異性識(shí)別的Tp抗原，即感染依賴性抗原。

進(jìn)一步的，其制備方法的步驟一(1)中，確定兩個(gè)蛋白高度同源性的標(biāo)準(zhǔn)為：E-value’值低于1e-10，以及同源序列高于蛋白序列總長(zhǎng)的30％。

進(jìn)一步的，其制備方法的步驟一(2)中Tp胞質(zhì)蛋白選擇標(biāo)準(zhǔn)如下：SignalP3.0軟件預(yù)測(cè)無(wú)信號(hào)肽；TMHMM3.0軟件預(yù)測(cè)無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)；5種細(xì)菌亞細(xì)胞定位軟件至少有3種預(yù)測(cè)該蛋白為胞質(zhì)蛋白；Tp跨膜結(jié)構(gòu)超過(guò)4個(gè)的膜蛋白標(biāo)準(zhǔn)如下：被TMHMM3.0軟件預(yù)測(cè)出至少有4個(gè)或4個(gè)以上的跨膜結(jié)構(gòu)；5種細(xì)菌亞細(xì)胞定位軟件至少有3種預(yù)測(cè)該蛋白為膜蛋白。

基于梅毒螺旋體感染依賴性抗原Tp0971、Tp0768和Tp0462的梅毒診斷及臨床判愈用試劑盒。

進(jìn)一步的，所述試劑盒為酶標(biāo)法試劑盒、膠體金試劑盒、免疫熒光標(biāo)記試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑盒或PCR試劑盒，WB試劑盒等。

所述梅毒螺旋體感染依賴性抗原在梅毒感染檢測(cè)及臨床判愈方面的應(yīng)用。

所述梅毒螺旋體感染依賴性抗原制備的試劑盒在梅毒感染檢測(cè)及臨床判愈方面的應(yīng)用。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明公開(kāi)了基于梅毒螺旋體感染依賴性抗原Tp0971、Tp0768和Tp0462，基于梅毒螺旋體感染依賴性抗原Tp0971、Tp0768和Tp0462篩選建立的ELISA法不僅有良好的臨床診斷效能，還有可能成為特異性高的梅毒臨床判愈試驗(yàn)方法替代目前現(xiàn)有的非特性且具有假陽(yáng)性的RPR、TRUST臨床判愈試驗(yàn)方法，具有廣闊的應(yīng)用前景和臨床價(jià)值。本發(fā)明在國(guó)內(nèi)外首次進(jìn)行梅毒感染依賴性診斷抗原的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)Tp0971、Tp0768、Tp0462符合感染依賴性抗原的特點(diǎn)且均具有良好的免疫活性，Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA在與新西蘭兔血清和臨床病人的血清標(biāo)本中均顯示具有良好的診斷性能(較高的敏感性和特異性)。并且我們通過(guò)Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA的A450值與RPR滴度變化進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA和Tp0462-ELISA的A450值與RPR滴度變化均呈正相關(guān)。這就提示我們或許可以采用一種基于梅毒新類型抗原的ELISA方法來(lái)充實(shí)臨床梅毒診斷方法學(xué)，且同時(shí)能替代傳統(tǒng)的RPR/TRUST，作為梅毒的臨床判愈試驗(yàn)。綜上，Tp0971、Tp0768和Tp0462可以作為梅毒診斷的候選抗原，并且有望為新的梅毒判愈試驗(yàn)方法的研究奠定基礎(chǔ)。同時(shí)鑒于其良好的免疫原性，可在后期考慮作為梅毒疫苗的候選抗原用于梅毒各類型疫苗的研發(fā)應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1A、1B、1C分別為Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA ROC曲線圖。

圖2：Tp0971-ELISA、TP0462-ELISA、Tp768-ELISA與168份梅毒血清的韋恩氏圖

圖3A、3B、3C分別為168份梅毒陽(yáng)性血清標(biāo)本Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462ELISA A450值與RPR滴度散點(diǎn)分布圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)描述：

試驗(yàn)例：一、Tp疫苗感染依賴性免疫優(yōu)勢(shì)抗原的篩選及鑒定

1)軟件分析TpNichils標(biāo)準(zhǔn)株全基因組所有ORFs，建立Tp疫苗候選抗原體系

(1)采用BLAST軟件，對(duì)TpNichils標(biāo)準(zhǔn)株全基因組ORFs的編碼蛋白與人的全部蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源性分析，去掉有高度同源性的抗原

以人的全部蛋白質(zhì)序列為數(shù)據(jù)庫(kù)，使用BLASTP程序，用Tp全基因組ORFs的編碼蛋白與人的全部蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)，去掉有高度同源性的抗原(確定兩個(gè)蛋白高度同源的標(biāo)準(zhǔn)：E-value’值低于1e-10，以及同源序列高于蛋白序列總長(zhǎng)的30％)。

(2)對(duì)以上初篩出的候選抗原采用細(xì)菌亞細(xì)胞定位及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，去掉不適合作為疫苗抗原的蛋白，包括細(xì)菌胞質(zhì)蛋白、跨膜結(jié)構(gòu)超過(guò)4個(gè)的膜蛋白

根據(jù)反向疫苗學(xué)理論，除細(xì)菌胞質(zhì)蛋白外，其他亞細(xì)胞定位的蛋白如膜蛋白、周質(zhì)蛋白和分泌蛋白均可能引起宿主免疫反應(yīng)而成為可能的疫苗候選抗原。而從實(shí)驗(yàn)角度考慮，細(xì)菌膜蛋白跨膜結(jié)構(gòu)超過(guò)4個(gè)，以可溶性形式表達(dá)蛋白將非常困難，不適合大規(guī)模純化和生產(chǎn)疫苗，所以也被排除

Tp胞質(zhì)蛋白標(biāo)準(zhǔn)如下：SignalP3.0軟件預(yù)測(cè)無(wú)信號(hào)肽；TMHMM3.0軟件預(yù)測(cè)無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)；5種細(xì)菌亞細(xì)胞定位軟件至少有3種預(yù)測(cè)該蛋白為胞質(zhì)蛋白。Tp跨膜結(jié)構(gòu)超過(guò)4個(gè)的膜蛋白標(biāo)準(zhǔn)如下：被TMHMM3.0軟件預(yù)測(cè)出至少有4個(gè)或4個(gè)以上的跨膜結(jié)構(gòu)；5種細(xì)菌亞細(xì)胞定位軟件至少有3種預(yù)測(cè)該蛋白為膜蛋白。

2)Tp“高通量融合蛋白微陣列”制備技術(shù)的建立

(1)大規(guī)模抽提pGEX-6p-1和pGEX-6p-2融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒，分別采用不同組合的限制性核酸內(nèi)切酶，進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物切膠回收，純化后分裝保存；

(2)以TpNichils標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA為模板，對(duì)篩選出的有價(jià)值ORFs進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將每個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建ORF/pGEX重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；采用pGEX載體通用引物及每個(gè)ORF的特異性引物對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)的細(xì)菌克隆進(jìn)行篩查和鑒定；

(3)將鑒定陽(yáng)性的單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，離心收集菌體，超聲裂解細(xì)胞收集上清液(即含有大量可溶性的GST-融合蛋白)，分裝、-80℃保存?zhèn)溆茫蝗?ml上述上清液預(yù)處理后，SDS-PAGE膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，鑒定融合蛋白的表達(dá)情況；

(4)將上述可溶性GST-融合蛋白和采用相同方法制備的GST對(duì)照蛋白，依次點(diǎn)樣固相化于預(yù)先包被有谷胱甘肽的微量反應(yīng)板(Pierce,Rockford,IL)中，20μL/well，制備高通量(300待測(cè)抗原以上)的Tp“融合蛋白微陣列”。

3)新西蘭兔TpNichils標(biāo)準(zhǔn)株活Tp感染和滅活Tp免疫血清的制備

(1)Tp的培養(yǎng)與純化：【具體詳細(xì)步驟可參考申請(qǐng)者趙飛駿博士學(xué)位論文《梅毒螺旋體膜蛋白納米核酸疫苗的優(yōu)化及免疫接種策略初步研究》第一章節(jié)】

(2)紫外線滅活Tp的制備

將純化的Tp菌懸液轉(zhuǎn)入無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿，置G36T5L/C型紫外燈下5cm2處照射45min，每15min晃動(dòng)平皿一次，NS定容至原體積，分裝、-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)新西蘭兔Tp感染和免疫血清的制備

選用3kg左右成年新西蘭兔40只，隨機(jī)分為兩組：其中一組在背部剃毛處理后皮下接種8個(gè)皮丘，每個(gè)位點(diǎn)接種量為Tp Nichols株菌數(shù)10⁵個(gè)左右，感染期間喂飼無(wú)抗生素的飼料和飲水。另一組用佐劑聯(lián)合高劑量的滅活Tp(10⁶IFU/每個(gè)位點(diǎn))同法接種免疫新西蘭兔，共接種3次(0d,14d,28d)，第三次免疫后2周，兩組兔均抽血分離血清-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4)Tp感染依賴性免疫優(yōu)勢(shì)抗原篩選和鑒定：

Tp Nichols株感染組和滅活Tp免疫組的所有兔血清各20份(一抗)，分別與Tp“高通量融合蛋白微陣列”中的每一種GST-融合蛋白和采用相同方法制備的GST對(duì)照蛋白反應(yīng)，以HRP標(biāo)記的抗兔抗體為二抗，酶標(biāo)儀讀取405nm波長(zhǎng)OD值。GST-融合蛋白孔OD值大于或等于GST對(duì)照孔2倍以上判斷為陽(yáng)性。比較分析活Tp感染組和滅活Tp免疫組血清與Tp抗原反應(yīng)譜差異，篩選僅被Tp感染組血清抗體特異性識(shí)別的Tp抗原，即感染依賴性抗原。

試驗(yàn)例二、梅毒螺旋體感染依賴性抗原Tp0971，Tp0462,Tp0768在梅毒篩查以及判愈試驗(yàn)中的血清學(xué)評(píng)價(jià)

2.1梅毒螺旋體(Nichols株)全基因組的提取

梅毒螺旋體(Nichols株)由南華大學(xué)病原生物研究所保存。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照國(guó)家的相關(guān)規(guī)定，由南華大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。以Qiagen基因組提取試劑盒(Qiagen，Hilden,Germany)，按說(shuō)明書操作流程提取梅毒螺旋體全基因組DNA模板。

2.2重組蛋白的克隆表達(dá)、純化及鑒定

從GenBank(http://www.ncbi.nlm.nhi.gov/)中分別獲取Tp0768、Tp0971和Tp0462的基因序列，利用Primer 6.0軟件，根據(jù)引物設(shè)計(jì)和酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，結(jié)合PET30a(+)酶切位點(diǎn)圖譜，分別在上下游引物前加入酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基，設(shè)計(jì)引物及引入酶切位點(diǎn)分別如下:

Tp0768：

P1：5’CGCGGATCC ATGAATGCTCATACGCTTGTGT 3’ BamHI

P2：5’CCGGAATTCTCATCGAGAGGCTCCTTCTT 3’EcoR I

Tp0971：

P1：5’CGCGGATCC ATGAAGAGGGTGAGTTTGCTC 3’ BamHI

P2：5’CCGCTCGAGCTACCACTGAGGCCCCTTC 3’ XhoI

Tp0462：

P1：5’CGCGGATCCGTGCGCCGCATAGTCTGT 3’ BamHI

P2：5’CCGCTCGAGTCAGTGTTGCCCGTTTTTGA 3’ XhoI

以提取的Tp Nichols株DNA為模板，分別以Tp0768(P1)、Tp0768(P2)；Tp0971(P1)、Tp0971(P2)；Tp0462(P1)、Tp0462(P2)為引物，PCR分別擴(kuò)增得到相應(yīng)的基因Tp0768、Tp0971和Tp0462，

以Tp Nichols株DNA為模板，分別以Tp0462(P1)、Tp0462(P2)；Tp0768(P1)、Tp0768(P2)；Tp0971(P1)、Tp0971(P2)為引物，PCR分別擴(kuò)增得到相應(yīng)的基因Tp0462、Tp0768和Tp0971。PCR擴(kuò)增的條件分別如下：

以pET30a為載體，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a(﹢)-Tp0462、pET30a(﹢)-Tp0768、pET30a(﹢)-Tp0971，酶切鑒定和PCR鑒定，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序，將經(jīng)測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌E.coli BL21(DE3)中。分別挑選陽(yáng)性單個(gè)菌落，在含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日分別取培養(yǎng)物1：100轉(zhuǎn)種繼續(xù)培養(yǎng)至菌體A₆₀₀＝0.6時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(終濃度分別為0.5mmol/L，1.0mmol/L,0.5mmol/L):Tp0768和Tp0462于20℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)；Tp0971于37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)。同時(shí)設(shè)立未誘導(dǎo)組合陰性對(duì)照組。離心收集菌體，用超聲波破碎菌體后分別收集上清液和沉淀，SDS-PAGE電泳分析表達(dá)結(jié)果。

然后克隆進(jìn)入pET30a中分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a(﹢)-Tp0768、pET30a(﹢)-Tp0971、pET30a(﹢)-Tp0462，酶切鑒定和PCR鑒定，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序，將經(jīng)測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌E.coli BL21(DE3)中。分別挑選陽(yáng)性單個(gè)菌落，在含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日分別取培養(yǎng)物1：100轉(zhuǎn)種繼續(xù)培養(yǎng)至菌體A600＝0.6時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(終濃度分別為1.0mmol/L,0.5mmol/L,0.5mmol/L):Tp0768和Tp0462于20℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)；Tp0971于37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)。同時(shí)設(shè)立未誘導(dǎo)組合陰性對(duì)照組。離心收集菌體，用超聲波破碎菌體后分別收集上清液和沉淀，SDS-PAGE電泳分析表達(dá)結(jié)果。分別大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，Ni-NTA親和層析柱純化表達(dá)產(chǎn)物，Western-blot鑒定重組蛋白的抗原特異性,BCA試劑盒(Pierce,Rockford,USA)測(cè)蛋白濃度，純化后且經(jīng)濃度測(cè)定的重組蛋白用于后續(xù)的ELISA實(shí)驗(yàn)。

2.3 Tp0971-ELISA，Tp0462-ELISA,Tp0768-ELISA的建立及在梅毒篩查以及判愈試驗(yàn)中的血清學(xué)評(píng)價(jià)

分別以Tp0971、Tp0768和Tp0462為抗原包被于ELISA 96孔板(Costar,USA)，經(jīng)反復(fù)摸索、優(yōu)化條件，最終確定Tp0971、Tp0768、Tp0462的包被濃度分別為5μg/ml，3μg/ml，10μg/ml，然后均采用5％脫脂牛奶(5.0g脫脂奶粉溶解于100mLPBS)在4℃條件下封閉24h,PBST(0.05％Tween 20的PBS)洗板3次。336份血清樣本為一抗(1：100，以5％的脫脂牛奶稀釋)，每孔100μL,于37℃孵育1h,PBST(0.05％Tween 20的PBS)洗板5次。HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體(Proteintech)為二抗(1：10000，以5％的脫脂牛奶稀釋)，每孔100μL,37℃孵育30min,PBST(0.05％Tween 20的PBS)洗板5次。37℃TMB顯色20min，加終止液(2mol/L H₂SO₄)終止反應(yīng)，在全自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀(Multiskan MK3)上于450nm下讀數(shù)，記錄結(jié)果。同時(shí)對(duì)這336份血清分別按照試劑盒的操作說(shuō)明書進(jìn)行TPPA試驗(yàn)(日本富士瑞必歐株式會(huì)社)、梅毒初篩ELISA試劑盒(珠海麗珠試劑股份有限公司，IgG/IgM)和RPR(上海科華生物工程股份有限公司)檢測(cè)。所有樣本重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

3、結(jié)果

3.1 Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462ELISA與TPPA比較的評(píng)價(jià):

與TPPA相比，336份血清的診斷陽(yáng)性標(biāo)本數(shù)和靈敏度、特異度等指標(biāo)分別見(jiàn)表1和表2。結(jié)合ROC曲線分析(圖1)，Tp0971、Tp0768、Tp0462均可望成為梅毒螺旋體診斷抗原。圖1Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA ROC曲線圖

注：圖1A、1B、1C分別為Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA ROC曲線圖，橫坐標(biāo)為1-特異度(真陰性率)，縱坐標(biāo)為敏感度(真陽(yáng)性率)。ROC曲線下面積值在0.5～1.0之間。在AUC﹥0.5的情況下，AUC越接近1，說(shuō)明診斷效果越好。AUC在0.7～0.9之間有一定的準(zhǔn)確性，在0.9以上時(shí)具有較高的準(zhǔn)確性。Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA ROC曲線下面積分別為0.983、0.990和0.997。

表1：Tp0971、Tp0768、Tp0462對(duì)336份標(biāo)本的診斷陽(yáng)性數(shù)(率)

表2：Tp0971、Tp0768、Tp0462與TPPA相比的診斷性能評(píng)價(jià)

·注：“+”代表陽(yáng)性結(jié)果，“-”代表陰性結(jié)果.

3.2 Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462ELISA與麗珠梅毒初篩ELISA試劑診斷評(píng)價(jià)：

336份血清標(biāo)本Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462ELISA結(jié)果與麗珠梅毒初篩ELISA試劑盒相比(表3)，一致性極好。

表3：Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA與麗珠梅毒初篩ELISA試劑盒的符合率比較

·注：注：“+”代表陽(yáng)性結(jié)果，“-”代表陰性結(jié)果.

·

與TPPA相比，麗珠梅毒ELISA初篩試劑盒的結(jié)果為：168份梅毒陽(yáng)性標(biāo)本全部檢出陽(yáng)性，168份陰性血清標(biāo)本檢出12例陽(yáng)性，其診斷的靈敏度為100％，特異度為92.8％；一般認(rèn)為，kappa值大于0.75認(rèn)為有極好的一致性，kappa值在0.4和0.75之間為中高度一致，kappa值≤0.4認(rèn)為一致性較差。

3.3 Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462ELISA的韋恩氏圖(交并集關(guān)系)分析：

168份梅毒陽(yáng)性血清中，有148份血清與Tp0971、Tp0768、Tp0462均反應(yīng)，1份血清僅與Tp0971反應(yīng)，0份血清僅與Tp0768反應(yīng)，0份血清僅與Tp0462反應(yīng)，Tp0768和Tp0971的交集為12份，Tp0462和Tp0768，Tp0462和Tp0791的交集均為3份。其中僅有一份標(biāo)本與Tp0971、Tp0768、Tp0462均不反應(yīng)(圖2)。

圖2：Tp0971-ELISA、TP0462-ELISA、Tp768-ELISA與168份梅毒血清的韋恩氏圖

注：圖示Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA和Tp0462-ELISA分別對(duì)168份梅毒陽(yáng)性標(biāo)本測(cè)定的交并集關(guān)系，數(shù)字均代表檢出陽(yáng)性例數(shù)。

3.4 Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462ELISA OD450nm與RPR滴度變化的分析:

經(jīng)SPSS軟件(版本18.0)Spearman秩相關(guān)分析：Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA的A₄₅₀值與RPR滴度變化(圖3)，提示Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA和Tp0462-ELISA的A₄₅₀值與RPR滴度變化均呈正相關(guān)。此外，臨床診斷陽(yáng)性而與Tp0971、Tp0768、Tp0462建立的ELISA-IgG反應(yīng)均呈陰性的個(gè)體中，我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣的現(xiàn)象:即他們的年齡均大于40歲，且這部分樣本的RPR滴度均小于1：4(表4)。

圖3:Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462-ELISA A₄₅₀nm與RPR滴度散點(diǎn)分布

圖3A、3B、3C分別為168份梅毒陽(yáng)性血清標(biāo)本Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462ELISA A₄₅₀值與RPR滴度散點(diǎn)分布圖，利用SPSS軟件包(版本18.0)作Spearman秩相關(guān)分析，得到Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462ELISA A₄₅₀值與RPR滴度相關(guān)系數(shù)分別為0.374，0.432和0.286。如果我們收集梅毒病人從就診到治愈期間的血清標(biāo)本，作同樣的分析，得到的結(jié)果會(huì)更趨向于我們的目的：Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462ELISA法有望為梅毒的療效監(jiān)測(cè)奠定基礎(chǔ)。

表4：TPPA陽(yáng)性而Tp0971、Tp0768、Tp0462ELISA-IgG為陰性的標(biāo)本分析

結(jié)果分析：

Tp0768一般認(rèn)為是梅毒螺旋體的一種質(zhì)膜蛋白，又名TmpA抗原，由345個(gè)氨基酸組成，分子量約37kDa。前已述及，該抗原有較好的免疫活性，可以作為一種梅毒診斷抗原。Tp0971，由204個(gè)氨基酸組成，分子量約為22kDa，相關(guān)初步研究認(rèn)為其為可能為梅毒螺旋體內(nèi)膜脂蛋白，跟梅毒螺旋體的新陳代謝和離子穩(wěn)定有關(guān)，McKevitt M報(bào)道，重組GST-Tp0971融合蛋白與梅毒患者血清可以發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。Tp0462，由392個(gè)氨基酸組成，分子量約40kDa，屬于TP013X家族，是一種目前功能未知的假定蛋白，經(jīng)生物信息學(xué)分析，推測(cè)Tp0462具有信號(hào)肽，有可能是一種具有多個(gè)抗原表位區(qū)的分泌蛋白。

本研究前期在Tp動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中用活的和滅活的Tp Nichols標(biāo)準(zhǔn)株分組分別進(jìn)行兔背部皮內(nèi)接種觀察免疫應(yīng)答效應(yīng),分別分離兔血清大范圍篩選梅毒螺旋體感染依賴性抗原的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)：活Tp接種組新西蘭兔誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體總水平與滅活Tp接種組并無(wú)顯著差異，但前者血清中檢測(cè)到有較高滴度的抗Tp0134和抗Tp0470的特異性抗體，這兩種均為非菌體膜蛋白，而后者血清中并無(wú)相關(guān)抗體。經(jīng)大范圍(約200個(gè)的梅毒螺旋體抗原蛋白)的進(jìn)一步篩選驗(yàn)證，本研究選取的蛋白Tp0971、Tp0768、Tp0462均符合感染依賴性抗原的特性，這一結(jié)果與傳統(tǒng)認(rèn)為的Tp0768可能為質(zhì)膜蛋白，Tp0971為內(nèi)膜脂蛋白的推測(cè)有差異，這有待進(jìn)一步研究。

用336份血清分別與Tp0971、Tp0768、Tp0462這3個(gè)蛋白建立的ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行反應(yīng),Tp0971、Tp0768、Tp0462均具有較高的敏感性和特異性。經(jīng)ROC曲線分析，曲線下面積分別為98.3％,99.0％和99.7％，說(shuō)明這3個(gè)蛋白均可以作為梅毒的診斷抗原使用。而通過(guò)韋恩圖的繪制我們發(fā)現(xiàn)，Tp0971、Tp0768、Tp0462都存在漏檢，這從側(cè)面反映出了單個(gè)抗原診斷效果可能不如多個(gè)重組蛋白聯(lián)合使用好。此外，Tp0971、Tp0768、Tp0462均檢測(cè)不出的這1例梅毒患者可能是因?yàn)閭€(gè)體差異以及ELISA方法本身的局限性決定了其不能作為梅毒診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。而通過(guò)與TPPA試驗(yàn)、麗珠公司生產(chǎn)的梅毒初篩ELISA試劑盒及上海科華生物工程股份有限公司生產(chǎn)的RPR試劑對(duì)比顯示，分別以Tp0971、Tp0768、Tp0462建立的ELISA方法與TPPA和麗珠梅毒初篩ELISA試劑盒具有較高的符合率，而與RPR試劑一致性不理想。本實(shí)驗(yàn)中，TPPA陽(yáng)性而3個(gè)蛋白的ELISA-IgG結(jié)果為陰性的這部分梅毒患者共有21例，年齡均大于40歲，可能是跟這一部分人機(jī)體的抗體水平低下有關(guān)。另外，這部分個(gè)體的樣本RPR的滴度均小于1：4，我們猜測(cè)有可能是a:血清抵抗(血清固定)現(xiàn)象，b：這部分病人可能經(jīng)歷了梅毒感染到梅毒治愈的這一過(guò)程，導(dǎo)致ELISA-IgG結(jié)果從陽(yáng)轉(zhuǎn)陰，提示這幾個(gè)蛋白作為臨床療效監(jiān)測(cè)指標(biāo)的可能性。我們下一步將收集各期梅毒患者從就診到治愈期間的標(biāo)本，來(lái)驗(yàn)證我們的猜測(cè)。

RPR和VDRL的敏感性取決于疾病的進(jìn)程，有報(bào)道稱在一期梅毒中二者的敏感性分別為86％和78％，而在二期梅毒中二者的敏感性可達(dá)到100％。雖然ELISA的敏感性被認(rèn)為很高，但據(jù)報(bào)道有些ELISA試劑在一期梅毒中的敏感性可能不如RPR,另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)眼梅毒患者若RPR滴度很高的話，應(yīng)警惕合并HIV感染。本試驗(yàn)中，RPR與Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA、Tp0462ELISA相比診斷的一致性較差，這反映了2種梅毒血清學(xué)診斷方法在梅毒初篩中的差異性。RPP的主要意義在于評(píng)價(jià)梅毒的治療效果以及用于梅毒再感染的判斷。

如若能將敏感性和特異性較高的ELISA試驗(yàn)和用于梅毒療效監(jiān)測(cè)的RPR實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)結(jié)合，尋找到某種蛋白，既可以用于梅毒的診斷，又能作為梅毒治療效果評(píng)判的ELISA試驗(yàn)，無(wú)論從梅毒診斷還是從降低梅毒治療的成本來(lái)說(shuō)，都將是一種福音。與TPPA相比，麗珠梅毒初篩ELISA試劑盒的靈敏度為100％，而其特異度為92.8％，反映了其作為梅毒初篩試劑盒極高的靈敏度，主要目的在于防止漏檢，但是通過(guò)Spearman秩相關(guān)分析，其OD值與RPR結(jié)果為不相關(guān)。而我們建立的Tp0971-ELISA、Tp0768-ELISA和Tp0462-ELISA的A450值與RPR的滴度相關(guān)系數(shù)分別為0.374，0.432和0.286，具有一定的正相關(guān)，符合本研究三種蛋白建立的ELISA可能作為梅毒療效監(jiān)測(cè)的設(shè)想。如前面所述，單個(gè)蛋白的診斷效果可能比不上多個(gè)重組蛋白聯(lián)合檢測(cè)。本研究準(zhǔn)備下一步通過(guò)生物信息學(xué)分析，篩選出Tp0971、Tp0768、Tp0462的優(yōu)勢(shì)表位肽段，合成多聚肽，并建立ELISA方法，期望合成的多聚肽在梅毒的診斷中具有更高的敏感性和特異性，且能用于梅毒的療效監(jiān)測(cè)。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何不經(jīng)過(guò)創(chuàng)造性勞動(dòng)想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所限定的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。