本發明屬于基因工程領域的基因重組表達
技術領域：
，具體涉及一種通過點突變提高大片段嗜熱脂肪地芽孢桿菌DNA聚合酶(BstDNA聚合酶)活性的方法及應用。
背景技術：
：核酸擴增技術廣泛應用于醫學研究的各個領域，特別是傳染病病原的檢測，近年來以等溫擴增為代表的新方法因檢測簡單、快速以及高特異性高靈敏性，具有更為廣泛的的應用價值。(TsugunoriNotomi,HarumiMasubuchi,ToshhihiroYonekawaetal.,“Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA,”NucleicAcidsResearch,vol,28,No.12,2000)。IsothermalMultiple-Self-Matching-InitiatedAmplification(IMSA)等溫擴增是Loop-mediatedisothermalamplification(LAMP)等溫擴增基礎上發展起來的另一種新型等溫擴增方法，與之相比具有更高的靈敏度，檢測限更低等優點(XiongDing,KaiNie,LeiShi,XuejunMa,“ImprovedDetectionLimitinRapidDetectionofHumanEnterovirus71andCoxsackievirusA16byaNovelReverseTranscription–IsothermalMultiple-Self-Matching-InitiatedAmplificationAssay,”JournalofClinicalMicrobiology,vol.52,no.6,pp.1862–1870,2014)，因此本發明所涉及的等溫擴增方法均選擇IMSA。等溫擴增依賴于BstDNA聚合酶，其屬于I型DNA聚合酶，來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌屬，完整序列包含三種活性(i):5′-3′外切酶活性(ii)5′-3′聚合酶活性(iii)3′-5′外切酶活性，與其他DNA聚合酶相比，BstDNA聚合酶有著較強的熱穩定性、鏈置換活性及聚合酶活性，因此吸引了越來越多的人的研究興趣(Seng-MengPhang,Chai-YawTeo,VictorWongThiWong,etal.,“CloningandcompletesequenceoftheDNApolymerase-encodinggene(BstpolⅠ)andcharacterisationoftheKleow-likefragmentfromBacillusstearothermophilus,”Gene,vol.163,pp.65-68,1995)。技術實現要素：為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種通過點突變提高大片段嗜熱脂肪地芽孢桿菌DNA聚合酶活性的方法。酶的基因來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)GIM1.543(購自中國工業微生物菌種保藏中心)。通過基因重組獲得大片段BstDNA聚合酶質粒。將大片段BstDNA聚合酶的第310位氨基酸G突變為L或A，或將510位氨基酸D突變為E，突變位點氨基酸均為保守氨基酸。結果顯示與野生型BstDNA聚合酶相比，突變體G310L、G310A和D540E的聚合效率均有顯著提高，且都高于商業化BstDNA聚合酶，具有較大的應用價值。本發明的另一目的在于提供一種定量檢測BstDNA聚合酶聚合效率的方法。本發明的目的通過下述技術方案實現：一種通過點突變提高大片段嗜熱脂肪地芽孢桿菌DNA聚合酶活性的方法，是通過酶切連接將野生型BstDNA聚合酶基因克隆到原核表達載體上，并通過RF克隆技術對氨基酸G310或D540進行點突變構建突變體，并轉入原核表達載體進行表達，純化，并進行酶活檢測；所述的野生型BstDNA聚合酶的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。編碼野生型BstDNA聚合酶的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。所述的突變體為G310L、G310A或D540E。所述的突變體G310L的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。所述的突變體G310L的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。所述的突變體G310A的氨基酸序列如SEQIDNO：5所示。所述的突變體G310A的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。所述的突變體D540E的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示。所述的突變體D540E的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示。所述的原核表達載體優選為pET28a；所述的突變體的具體獲得步驟如下：以野生型pET28a-Bst質粒為模板，設計突變引物，通過RF克隆，經核酸擴增及DpnⅠ酶消化后，轉化。所述的純化是鎳柱親和層析方法進行純化。一種定量檢測BstDNA聚合酶聚合效率的方法，是用HPLC方法檢測等溫擴增反應前后dCTP的減少量，繼而計算酶或突變體的Kcat。Kcat值越大，表明聚合效率越高，其酶活性越高。在本發明的一種實施方案中，IMSA等溫擴增方法用到的模板為手足口病EV71病毒的VP1基因。所述的通過點突變提高大片段嗜熱脂肪地芽孢桿菌DNA聚合酶活性的方法在提高大片段嗜熱脂肪地芽孢桿菌DNA聚合酶活性中的應用。所述的定量檢測BstDNA聚合酶聚合效率的方法在定量檢測BstDNA聚合酶聚合效率中的應用。本發明的機理是：本研究從嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)GIM1.543中獲得BstDNA聚合酶基因組，并對BstDNA聚合酶進行克隆，表達，純化及定向改造，以滿足不斷增長的市場需要。大片段BstDNA聚合酶具有5′-3′聚合酶活性，無5′-3′外切酶活性，熱穩定性高，鏈置換活性好等優點。本發明相對于現有技術，具有如下的優點及效果：(1)由于專利保護制度嚴謹，BstDNA聚合酶目前僅有NEWENGLANDBioLabs公司有售，且價格比普通的聚合酶都要昂貴，國內卻鮮少有公司出售。因此我們在實驗室自主研發大片段BsDNA聚合酶。(2)在大片段BstDNA聚合酶基礎上對G310L(A)和D540E兩個位點進行點突變，與野生型BstDNA聚合酶相比，G310L和G310A的突變體聚合效率都有所提高，且都高于商業化BstDNA聚合酶，而D540E與野生型聚合效率略有改變。說明G310L，G310A和D540E的突變體聚合效率顯著高于野生型BstDNA聚合酶，遠高于商業化BstDNA聚合酶。本發明通過點突變提高BstDNA聚合酶活性，為科研及實際檢測提供更高效率的BstDNA聚合酶，應用價值明顯。(3)本發明運用高效液相(HPLC)方法定量檢測IMSA等溫擴增方法消耗的dCTP。(4)本發明提供一種快捷簡便的方法表達BstDNA聚合酶，并使其與商業化的BstDNA聚合酶有更快的聚合速率，為BstDNA聚合酶國產化提供便利。附圖說明圖1是大片段pET28a-Bst重組質粒構建圖；其中，(a)泳道M：DNAMarker，泳道1：基因組PCR圖；(b)泳道M：DNAMarker，泳道1：重組質粒雙酶切。圖2是WT大片段BstDNA聚合酶表達的SDS-PAGE鑒定；其中，泳道M：proteinMarker，泳道1：未誘導全菌，泳道2：未誘導上清，泳道3：未誘導沉淀，泳道4：誘導全菌，泳道5：誘導上清，泳道6：誘導沉淀。圖3是IMSA顏色判定法定性檢測酶活；其中，每個反應管對應加入的蛋白為1：商業化，2：野生型，3：D540E，4：G310A，5：G310L，6：陰性對照。圖4是恒溫熒光擴增儀DEAOU-3080C檢測聚合效率；其中，1：商業化，2：野生型，3：D540E，4：G310A，5：G310L，6：陰性對照。圖5是高效液相檢測定量檢測聚合效率；其中，(a)陰性對照，dCTP保留時間為16.583min，對應峰面積為2459.42；(b)G310L，dCTP保留時間為17.447min，對應峰面積為1781.62；(c)野生型(WT)，dCTP保留時間為17.059min，對應峰面積為1840.69；(d)商業化，dCTP保留時間為17.454min，對應峰面積為1941.52。具體實施方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。如無特別說明，均認為常規方法。實施例1：野生型pET28a-Bst重組蛋白工程菌構建1、嗜熱脂肪地芽孢桿菌基因組的獲得(1)取少量甘油凍存菌種嗜熱脂肪地芽孢桿菌劃線至無抗LB平板中，55℃恒溫培養箱靜置培養48h。(2)挑取單菌落至無抗液體LB培養基中55℃，220rpm搖床培養過夜。(3)用細菌基因組提取試劑盒(天根DP302)對嗜熱脂肪地芽孢桿菌進行基因組提取。2、以提取的基因組為模板對BstDNA聚合酶基因進行擴增。(1)擴增引物序列的設計引物名稱序列Bst-F5′-CTGTTCCATATG(NdeI)GAAGGCGAAAAGCCGCTC-3′Bst-R5′-CCGCTCGAG(XhoI)TTTGGCGTCGTACCACGTC-3′(2)PCR反應體系(50μL)：反應組分含量GenomeDNA1μLPrimeSTARHS(Premix)25μLBst-F(10μM)1μLBst-R(10μM)1μLddH2OUpto50μL(3)PCR擴增反應程序：(4)PCR反應結束后，進行1％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。(5)PCR產物37℃雙酶切2h，體系如下：反應組分體積Bst基因2μgNdeI2μLXhoI2μL10×FastDigestbuffer5μLddH2OUpto50μL(6)載體37℃雙酶切2h，體系如下：反應組分體積pET28a2μgNdeI2μLXhoI2μL10×FastDigestbuffer5μLddH2OUpto50μL(7)16℃連接過夜，連接體系如下：反應組分體積pET28a雙酶切產物80μgBst雙酶切產物40μgT4DNALigase0.5μL10×T4DNALigaseBuffer1μLddH2OUpto10μL結果見圖1，測序結果與理論結果一致，并與預期核苷酸序列完全一致。結論：pET28a-Bst重組質粒構建成功。3、pET28a-Bst重組蛋白的表達(1)上述步驟2中的陽性克隆質粒轉化大腸桿菌表達菌株感受態細胞BL21(DE3)中，挑取單克隆接種至5mL含有50μg/mLKanLB液體培養基中37℃擴大培養。(2)于OD600為0.5時加入1mMIPTG，37℃誘導6h后離心收集菌體。(3)超聲裂解，上清和沉淀分別加入上樣緩沖液沸水煮10min。(4)濃縮膠80V，分離膠120V進行SDS-PAGE電泳。(5)電泳完畢用考馬斯亮藍染色液染色，脫色液脫色。結果：如圖2所示，重組pET28a-Bst蛋白得到成功誘導表達。蛋白主要分布于上清中。結論：pET28a-Bst重組蛋白成功表達。4、pET28a-Bst重組蛋白的純化(1)pET28a-Bst在37℃，180rpm的情況下誘導表達6h。(2)收集菌體，用純化BindingBuffer重懸，鎳柱親和層析方法純化。(3)收集純化前后的樣品，SDS-PAGE檢測，并將上樣樣品進行WesternBlot檢測。(4)將純化后的蛋白4℃透析過夜，BCA試劑盒測定蛋白濃度。結果：如圖2所示，200mM咪唑洗脫下來的蛋白條帶大小為61kDa與重組蛋白理論大小一致。結論：成功純化獲得野生型重組蛋白。實施例2：突變體蛋白工程菌構建1、RF克隆法構建各突變體(1)擴增引物序列的設計(2)PCR反應體系(20μL)：反應組分含量野生型pET28a-Bst0.3μLPrimeSTARHS(Premix)10μLF(10μM)0.4μLR(10μM)0.4μLddH2OUpto20μL(3)PCR擴增反應程序：DpnⅠ消化反應組分含量PCRF反應液17μL10×FastDigestBuffer2μLDpnⅠ1μL條件：37℃反應2h。(4)取消化后的產物10μL轉化E.CoilDH5a。2、各個突變體的表達與純化：方法參照實施例1中pET28a-Bst重組蛋白的表達及純化。結果：各突變體蛋白得到成功誘導表達且主要分布于上清中。200mM咪唑洗脫下來的蛋白條帶大小為61kDa與理論大小一致，與商業化BstDNA聚合酶67kDa相比，重組蛋白分子量小于商業化蛋白。結論：成功純化獲得G310L(A)，D540E突變體蛋白。實施例3：IMSA法酶活驗證1、HNB染色法定性檢測酶活(1)以EV71病毒C4亞型VP1基因的2978～3248nt序列依據PrimerExplorerV4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/)在線軟件設計引物，引物序列如下：PrimernameSequence(5′-3′)DsF-EV715′-ACCATTGATAAGCACTCGCAGGGTCAAGCTGTCAGACCCTCC-3′DsR-EV715′-GAACACAAACAGGAGAAAGATCTTGTGAGAACGTGCCCATCA-3′FIT-EV715′-TCCGAATGTGGGATATCCGTCATAAGTTTCAGTGCCATTCATGTC-3′RIT-EV715′-TTATGACGGATATCCCACATTCGGAAGGACATGCCCCGTATT-3′SteF-EV715′-GAACACAAACAGGAGAAAGATCTTG-3′SteR-EV715′-ACCATTGATAAGCACTCGCAGG-3′(2)IMSA等溫擴增反應體系反應組分含量模板0.3μLBstDNApol(NEB)1μLDsF-EV71(5.0mM)1μLDsR-EV71(5.0mM)1μLFIT-EV71(20.0mM)1μLRIT-EV71(20.0mM)1μLSteF-EV71(40.0mM)1μLSteR-EV71(40.0mM)1μL2×RM12.5μLHNB1μLddH2OUpto25μL以上反應體系是商業化BstDNA聚合酶作為陽性對照，在本發明中參照陽性對照設置了5個反應體系，1中加入的商業化BstDNA聚合酶，2～5分別加入與商業化BstDNA聚合酶等量的各種蛋白，順序依次為：商業化，野生型，D540E，G310L，G310A；6為陰性對照。(3)IMSA等溫擴增反應程序63℃60min85℃2min結果：如圖3所示，1～5為陽性，顯示天藍色；6為陰性對照，顯示紫色。其中，每個數字標記對應的蛋白如下表所示：NO.123456sampleNEBWTD540EG310AG310L陰-/++++++－Tt(min)18:3015:0016:0013:3012:00結論：野生型及突變體D540E，G310A，G310L均有活性。2、熒光法檢測酶活方法參照上述1、HNB染色法定性檢測酶活，各反應體系中不加HNB，均改為加入1μL熒光染料，所用熒光染料為稀釋1000倍的syto9。實驗所需儀器為廣州迪奧生物科技有限公司的恒溫熒光擴增儀，反應時間為60min。以反應時間檢測酶反應的效率。結果：如圖4所示，1～5為陽性，有S型曲線；6為陰性，無S型曲線。其中1代表NEB商業化BstDNA聚合酶，2代表WT，3代表D540E，4代表G310A，5代表G310L。其中，G310L反應時間最短為12min，野生型為15min，商業化為18:30min。結論：與野生型BstDNA聚合酶相比，G310L和G310A的突變體聚合效率都有所提高，且都高于商業化BstDNA聚合酶，而D540E比野生型聚合效率略有提高。3、HPLC法定量檢測酶活并對Kcat值進行研究(1)HPLC條件采用WaterssymmetryC18色譜柱(3.5μm，4.6×150mm)，流動相緩沖液A：10mM氫氧化四丁基銨作為離子對試劑，10mM磷酸二氫鈉及0.25％甲醇。緩沖液B：5.6mM氫氧化四丁基銨作為離子對試劑，50mM磷酸二氫鈉及30％甲醇。采用梯度洗脫方法：0～30min為60％A及40％B，30～60min為40％A及60％B。流速：1.0mL/min。柱溫：27℃。(2)以不同濃度的dCTP(sigmaHPLC級)作標準曲線，2倍梯度稀釋，最終為5個濃度梯度：0，3mM，0.15mM，0.075mM，0.0375mM，0.0187mM。0.22μm的膜進行過濾。繪制標準曲線。按照上述IMSA反應體系及程序進行反應，其中不含HNB和熒光染料，且反應體系為75μL。IMSA反應完成后的反應液10稀釋，HPLC檢測，并進行數據分析。結果：dCTP標準曲線線性關系良好，線性方程為y＝－174.22+26309.69x(R2＝0.997)a：陰性對照：保留時間為16.583min峰面積為2459.42；見圖5(a)。b：G310L：突變體保留時間為17.447min，峰面積為1781.62；見圖5(b)。c：WT：保留時間為17.059min，峰面積為1840.69；見圖5(c)。d：NEB：商業化BstDNA聚合酶為17.454min，峰面積為1941.52；見圖5(d)。結論：以表格形式呈現dCTP的Kcat其中IMSA反應體系為75μL。從表中可以看出G310L突變體聚合反應效率最高，野生型其次，商業化最慢，與熒光法檢測酶活結論一致。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3