本發(fā)明涉及一種離子液體為反應(yīng)介質(zhì)的酶法制備脂溶性茶多酚的方法，屬于食品添加劑生物合成領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

茶多酚作為一種天然食品添加劑，具有使用安全性高，抗氧化能力強，基本無副作用等特點，該類化合物具有高效的抗癌、抗衰老、抗輻射、清除人體自由基、降血糖、降血脂等一系列藥理功能，在油脂、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了愈來愈多的應(yīng)用，其經(jīng)濟效益和應(yīng)用前景十分樂觀。我國具有豐富的茶葉資源，從茶葉中提取茶多酚的工藝成熟，因此，茶多酚作為天然抗氧化劑對食品工業(yè)的發(fā)展和保護人體健康具有非常重要意義。

受自身分子結(jié)構(gòu)限制，茶多酚易溶于水，難溶于油。對油脂性體系，茶多酚的溶解度很小，如果作為精煉食用油或含油食品的抗氧化劑，只能少量溶入，難以加至有效的抗氧化濃度閾值，其優(yōu)異的抗氧化活性難以發(fā)揮作用。

為了解決茶多酚在油脂體系中不能均勻分散的問題，常用一些改性方法增加其脂溶性，這些方法包括溶劑法、乳化法、分子修飾法等。前兩種方法得到的產(chǎn)品脂溶性不穩(wěn)定，一般放置6個月以上會有茶多酚析出。

分子修飾法是將茶多酚中幾種兒茶素分子結(jié)構(gòu)的某些部位酰化或酯化，使得新生成的分子由原先的水溶性改性為脂溶性。目前分子修飾法主要有化學(xué)法和酶法。化學(xué)修飾是是利用有機試劑作為反應(yīng)的催化劑和酰基供體，整個反應(yīng)過程受試劑種類、濃度及反應(yīng)溫度等因素的影響。兒茶素的化學(xué)分子修飾主要是在兒茶素的酚羥基上引入酰基，形成酯鍵。目前常用的酰基供體為酰氯、酸酐、羧酸等，短鏈(C2-C4)一般選擇相應(yīng)的酸酐，而C6以上則使用酰氯。化學(xué)法分子修飾存在其自身固有的缺陷，如酚羥基損失較大，導(dǎo)致其生物活性降低；區(qū)域選擇性差，易產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，目標(biāo)產(chǎn)物分離難度大；采用基團保護等措施，反應(yīng)步驟多，反應(yīng)溫度高，反應(yīng)耗時長；多用堿性催化劑，產(chǎn)生大量含堿廢液，造成環(huán)境污染等。

相對于化學(xué)法，酶法分子修飾具有反應(yīng)條件溫和，區(qū)域選擇性高，副反應(yīng)少，反應(yīng)步驟少、簡單可控、環(huán)境友好等優(yōu)點。然而，目前酶法修飾茶多酚制備脂溶性產(chǎn)品的相關(guān)報道較少。如何以簡單溫和、低毒的方法制備脂溶性茶多酚并保證較高的得率，是目前亟待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種離子液體為反應(yīng)介質(zhì)的酶法制備脂溶性茶多酚的方法。本發(fā)明的方法是將茶多酚與脂肪酸乙烯酯在離子液體體系中經(jīng)脂肪酶促催化反應(yīng)，合成改性脂溶性茶多酚。本發(fā)明將離子液體用于酶法分子修飾的反應(yīng)介質(zhì)，與傳統(tǒng)的有機溶劑相比，離子液體在脂肪酶催化酯類合成過程中具有提高脂肪酶的催化性能、熱穩(wěn)定性及區(qū)域選擇性等優(yōu)越的介質(zhì)特性，且后處理簡單，可重復(fù)利用。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種脂溶性茶多酚的制備方法，所述方法是采用離子液體作為反應(yīng)介質(zhì)，將茶多酚與脂肪酸乙烯酯在脂肪酶催化作用下催化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)萃取、濃縮、真空干燥后得到脂溶性茶多酚。

在本發(fā)明的一種實施方式中，離子液體為酸性離子液體。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述酸性離子液體為以下任意一種或者多種的混合：

[Bmim]HSO₄、[Bmim]H₂PO₄、[Bmim]FeCl₃Br(其中Bmim：1-丁基-3-甲基咪唑)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述萃取、濃縮，是在體系中加入乙酸乙酯萃取，取有機相進行濃縮。

在本發(fā)明的一種實施方式中，茶多酚(原料)為多酚含量95％以上，其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)含量45％以上的茶多酚產(chǎn)品。

在本發(fā)明的一種實施方式中，脂肪酸乙烯酯為以下任意一種或者多種：乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、戊酸乙烯酯、己酸乙烯酯、新壬酸乙烯酯、新癸酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、棕櫚酸乙烯酯。

在本發(fā)明的一種實施方式中，茶多酚與脂肪酸乙烯酯的摩爾比為1:1-3:1。

在本發(fā)明的一種實施方式中，脂肪酶的添加量為0.4-1.2％(w/w底物)(底物即茶多酚)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述催化反應(yīng)，是在60-70℃反應(yīng)12-18小時。

本發(fā)明的第二個目的是提供按照所述方法得到的脂溶性茶多酚的應(yīng)用。

所述應(yīng)用，是應(yīng)用于食品領(lǐng)域、生物領(lǐng)域或者制備藥物。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應(yīng)用，是用作食品添加劑。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應(yīng)用，是用作精煉食用油或含油食品的抗氧化劑。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應(yīng)用，是將本發(fā)明的脂溶性茶多酚添加到食用油中。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述添加的添加量為50-200mg/Kg。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明與傳統(tǒng)的化學(xué)合成法相比具有反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)步驟少，簡單可控，環(huán)境友好，產(chǎn)品分離相對簡單等優(yōu)點，是一種高效、快速、符合綠色化學(xué)和環(huán)境友好發(fā)展方向的茶多酚改性方法。同時酶法分子修飾具有高度選擇性，能更好保持或提高茶多酚的生物活性；本發(fā)明方法得率高。

(2)本發(fā)明采用離子液體作為反應(yīng)介質(zhì)，具有不揮發(fā)性、不易燃性、熱穩(wěn)定性、低毒等優(yōu)點，離子液體中的生物催化過程表現(xiàn)出明顯高于有機溶劑內(nèi)所能達到的反應(yīng)速率、區(qū)域選擇性和轉(zhuǎn)化產(chǎn)量。

(3)本發(fā)明制備的脂溶性茶多酚產(chǎn)物在油脂中溶解性良好，透光率為82％以上，明顯高于未改性茶多酚(透光率21％)。在食用大豆油中，當(dāng)添加量同為200mg/Kg時，油脂的過氧化值試驗結(jié)果表明，本發(fā)明的脂溶性茶多酚的抗氧化性顯著高于迷迭香提取物、BHT和未改性茶多酚。

(4)本發(fā)明的脂溶性茶多酚，脂溶性穩(wěn)定，放置12個月都不會有茶多酚析出。

附圖說明：

圖1：不同抗氧化劑脂溶性能比較；

圖2：脂溶茶多酚與幾種抗氧化劑的抗氧化效果比較；其中BHA丁化羥基茴香醚，BHT2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，TBHQ特丁基對苯二酚，POV過氧化值。

具體實施方案

以下給出實施例，對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1

將100mg含EGCG 55.4％的茶多酚與乙酸乙烯酯按質(zhì)量比2:1置于100mL具塞反應(yīng)瓶中，再加入40mL[Bmim]HSO₄離子液體，上述反應(yīng)體系移入集熱式磁力加熱攪拌器中，待反應(yīng)體系溫度升至60℃時，加入0.5％(w/w底物)Novo Nordisk公司生產(chǎn)的脂肪酶LIPOZYME TL IM開始反應(yīng)16h，反應(yīng)結(jié)束后，在體系中加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相經(jīng)濃縮、真空干燥后得到脂溶性茶多酚產(chǎn)品94.7mg，得率為94.7％。

實施例2

將50mg含EGCG 46.8％的茶多酚與丙酸乙烯酯按質(zhì)量比1:1置于100mL具塞反應(yīng)瓶中，再加入20mL[Bmim]HSO₄離子液體，上述反應(yīng)體系移入集熱式磁力加熱攪拌器中，待反應(yīng)體系溫度升至70℃時，加入0.7％(w/w底物)Novo Nordisk公司生產(chǎn)的脂肪酶LIPOZYME RM IM開始反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后，在體系中加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相經(jīng)濃縮、真空干燥后得到脂溶性茶多酚產(chǎn)品48.2mg，得率為96.4％。

實施例3

將300mg含EGCG 56.7％的茶多酚與戊酸乙烯酯按質(zhì)量比2:1置于250mL具塞反應(yīng)瓶中，再加入60mL[Bmim]FeCl₃Br離子液體，上述反應(yīng)體系移入集熱式磁力加熱攪拌器中，待反應(yīng)體系溫度升至70℃時，加入0.5％(w/w底物)Amano Pharmarceutial公司生產(chǎn)的脂肪酶LipaseAYS“Amano”開始反應(yīng)18h，反應(yīng)結(jié)束后，在體系中加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相經(jīng)濃縮、真空干燥后得到脂溶性茶多酚產(chǎn)品304.8mg，得率為101.6％。

實施例4

將200mg含EGCG 56.8％的茶多酚與乙酸乙烯酯按質(zhì)量比2:1置于250mL具塞反應(yīng)瓶中，再加入60mL[Bmim]H₂PO₄離子液體，上述反應(yīng)體系移入集熱式磁力加熱攪拌器中，待反應(yīng)體系溫度升至70℃時，加入0.5％(w/w底物)Amano Pharmarceutial公司生產(chǎn)的脂肪酶LipaseAYS“Amano”開始反應(yīng)18h，反應(yīng)結(jié)束后，在體系中加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相經(jīng)濃縮、真空干燥后得到脂溶性茶多酚產(chǎn)品171.9mg。

實施例5

將200mg含EGCG 56.8％的茶多酚與乙酸乙烯酯按質(zhì)量比2:1置于250mL具塞反應(yīng)瓶中，再加入60mL[Bmim]FeCl₃Br離子液體，上述反應(yīng)體系移入集熱式磁力加熱攪拌器中，待反應(yīng)體系溫度升至70℃時，加入0.5％(w/w底物)Amano Pharmarceutial公司生產(chǎn)的脂肪酶LipaseAYS“Amano”開始反應(yīng)18h，反應(yīng)結(jié)束后，在體系中加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相經(jīng)濃縮、真空干燥后得到脂溶性茶多酚產(chǎn)品199.9mg。

實施例6

將200mg含EGCG 55％的茶多酚與乙酸乙烯酯按質(zhì)量比3:1置于250mL具塞反應(yīng)瓶中，再加入60mL[Bmim]FeCl₃Br離子液體，上述反應(yīng)體系移入集熱式磁力加熱攪拌器中，待反應(yīng)體系溫度升至68℃時，加入0.4％(w/w底物)Amano Pharmarceutial公司生產(chǎn)的脂肪酶Lipase AYS“Amano”開始反應(yīng)16h，反應(yīng)結(jié)束后，在體系中加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相經(jīng)濃縮、真空干燥后得到脂溶性茶多酚產(chǎn)品201.8mg。

實施例7

將300mg含EGCG 55％的茶多酚與乙酸乙烯酯按質(zhì)量比2:1置于250mL具塞反應(yīng)瓶中，再加入60mL[Bmim]FeCl₃Br離子液體，上述反應(yīng)體系移入集熱式磁力加熱攪拌器中，待反應(yīng)體系溫度升至64℃時，加入1.2％(w/w底物)Amano Pharmarceutial公司生產(chǎn)的脂肪酶Lipase AYS“Amano”開始反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后，在體系中加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相經(jīng)濃縮、真空干燥后得到脂溶性茶多酚產(chǎn)品300.7mg。

實施例8：脂溶性茶多酚的性能及應(yīng)用

如圖1所示，為實施例1-7制備得到的脂溶性茶多酚與其他不同抗氧化劑的脂溶性能比較。分別稱取10mg茶多酚、脂溶性茶多酚、BHT、BHA、TBHQ和迷迭香提取物，分別溶于10mL氯仿中，超聲10min使其溶解，采用紫外可見分光光度計測定所得溶液或懸濁液在800nm下的透光率。

圖1結(jié)果表明，本發(fā)明制備的脂溶性茶多酚產(chǎn)物在油脂中溶解性良好，透光率為82％以上，明顯高于未改性茶多酚(透光率21％)。

將實施例1-7制備得到的脂溶性茶多酚進行應(yīng)用。選擇的油脂為國內(nèi)常用的大豆油，其他抗氧化劑為BHT、TBHQ、茶多酚和迷迭香提取物，當(dāng)添加量同為200mg/kg時，按照《GB/T 5538-2005動植物油脂過氧化值測定》測定POV值。油脂的過氧化值試驗結(jié)果(如圖2)表明，本發(fā)明的脂溶性茶多酚的抗氧化性顯著高于迷迭香提取物、BHT和未改性茶多酚。

實施例9

將實施例1中的離子液體分別替換成酸性離子液體[Bmim]H₂PO₄、堿性離子液體[Bmim]OH、中性離子液體[Bmim]BF₄，其他步驟和參數(shù)與此實施例一致。

結(jié)果顯示，茶多酚在酸性離子液體[Bmim]H₂PO₄、堿性離子液體[Bmim]OH、中性離子液體[Bmim]BF₄反應(yīng)16h后，他們的轉(zhuǎn)化率分別為85.5％，34.8％和52.7％。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。