本發明涉及與脂肪酶靶向結合的肽配基序列及其應用，屬于多肽設計及病毒抗原檢測領域。

背景技術：

基于分子對接的虛擬篩選技術是一種新興的研究多肽與蛋白質之間相互作用的技術手段。這一技術主要是運用計算機快速運算實現多肽與相應靶標蛋白在空間構象上的對接，將虛擬多肽數據庫中的分子逐一與靶標蛋白晶體結構的特定活性位點進行對接，通過計算機快速運算并不斷調整多肽與靶標蛋白結合的位置、構象、分子內部可旋轉鍵的二面角和靶標蛋白的氨基酸殘基側鏈和骨架，尋找多肽分子與靶標蛋白在空間結構上的最佳構象，并預測兩者之間的結合模式與親和力，通過評分值挑選出接近天然構象的與靶標蛋白親和力最佳的多肽配體的一種理論模擬分子間相互作用的方法。

脂肪酶是一種水解長鏈脂肪酸甘油酯的酶，主要來源于胰腺，是胰腺分泌的消化酶之一。正常血液中，僅有少量脂肪酶，血液中的脂肪酶易被腎臟清除。但是，當發生急性胰腺炎時，發病后4-8h內血清中脂肪酶活性升高，24h達峰值，一般持續8-14天。脂肪酶可升至正常參考值上限2-50倍。脂肪酶變化通常與淀粉酶平行，但比淀粉酶升高更早，下降更晚，且升高幅度大，因此比淀粉酶對急性胰腺炎的診斷更敏感，更有診斷意義。

技術實現要素：

本發明借助于分子對接及虛擬篩選技術，在脂肪酶晶體結構的基礎上，通過分子對接技術，搜尋虛擬多肽庫中與靶標蛋白結合模式與親和力最佳的多肽配體，其肽配基序列為RRRDCW，即P19。人工合成P19，利用表達純化的脂肪酶進行表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)與ELISA結合試驗，結果表明，人工合成的P19與脂肪酶有良好的結合能力，由此證明，借助本發明設計而成的肽配基，可用于血清中脂肪酶進行定量和定性的快速檢測。

為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：

與脂肪酶靶向結合的肽配基序列，所述的肽配基序列為RRRDCW。

所述的與脂肪酶靶向結合的肽配基序列，包括以所述的肽配基序列為核心，任何對該肽配基序列所進行的相應調整或修飾；修飾材料包括但不限制在納米材料、熒光材料、酶類、生物素及特定的蛋白質。

將所述的肽配基序列用于血清中脂肪酶的檢測，其中包括但不局限于酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測。

一種所述的肽配基序列在脂肪酶的快速檢測中的應用，其中包括但不限于哺乳動物血清中、人工重組表達或人工純化手段得到的脂肪酶。

一種所述的肽配基序列在脂肪酶定量和定性的快速檢測中的應用。

本發明的有益效果：

1、本發明借助于分子對接及虛擬篩選技術，在脂肪酶晶體結構的基礎上，通過分子對接技術，搜尋虛擬多肽庫中與靶標蛋白結合模式與親和力最佳的肽配基，最終得到可與脂肪酶結合的肽配基，其肽配基序列為RRRDCW，即P19。人工合成P19，并與脂肪酶進行親和力鑒定，P19序列與人工表達的脂肪酶之間相互作用的平衡解離常數KD為3.653×10^-8M，即36.53nM，說明親和力較好。

2、由于人工表達脂肪酶的局限性，針對脂肪酶的抗體的特異性比較差，本發明設計得到的P19序列很好地避免了這一難題，實現快速人工合成與低廉檢測成本。

3、本發明設計而成的P19序列與人工表達蛋白、人工純化蛋白均可以結合，除與脂肪酶反應性較高外，與其它蛋白均不發生交叉性反應，特異性較好。

4、本發明與傳統噬菌體多肽庫篩選相比，具有簡單，快速及成本低的特點；通過計算機輔助實施分子對接，可為實現脂肪酶結構功能解析提供較好的理論指導。

5、本發明與人工表達純化的蛋白進行免疫來獲得針對蛋白抗體的過程相比，具有操作簡單，省時省力，費用低等優點；通過對篩選P19序列進行標記，可實現對脂肪酶進行定性和定量的快速檢測。

附圖說明

圖1為P19序列與脂肪酶的對接結果展示。

圖2為P19序列與人工表達脂肪酶的SPR親和力鑒定結果。其中，縱坐標代表傳感器所檢測到的信號值；橫坐標代表樣品在傳感器中相互作用的時間。圖中，從上到下各曲線對應的P19濃度逐漸降低。

圖3為P19序列與不同樣品的ELISA鑒定結果。

具體實施方式

以下結合實施例對本發明的具體實施方式作進一步詳細說明。

實施例1分子對接及虛擬肽庫的篩選

1、脂肪酶的準備

從PDB數據庫中搜尋哺乳動物脂肪酶的晶體結構(5DMK)，借助計算機程序對晶體結構進行分析，選定其第70到240氨基酸殘基之間的特定氨基酸殘基作為對接設定區域，以進行分子對接。

2、虛擬多肽庫的設計

建立不同氨基酸殘基的空間結構，借助計算機程序，實現對輸入目標多肽進行批量生成，以滿足分子對接計算機程序的自動調用和處理。虛擬多肽庫均以直鏈形式生成，不對任何側鏈、首尾氨基和羧基進行修飾。單一虛擬多肽庫的生成以不超過四位氨基酸殘基為宜。

3、對接結果的評斷

分別計算多肽與蛋白結合的自由能，氫鏈，范得華力等力學參數進行綜合評定，以此來判定篩選結果，并篩選得到P19，其多肽序列為精氨酸-精氨酸-精氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸-色氨酸(Arg-Arg-Arg-Asp-Cys-Trp，簡寫RRRDCW)(SEQ ID NO.1)，其與脂肪酶對接的相互作用位置結果見圖1。

實施例2P19序列與人工表達脂肪酶的親和力鑒定

1、將人工表達純化的脂肪酶采用PBS緩沖液(pH 7.4)稀釋為1μg/ml(蛋白量計)，采用活潑酯法，分別將1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS，1:1)、脂肪酶注入安裝有氨基芯片的SPR檢測儀中，保證EDC/NHS和脂肪酶分別與氨基芯片相互作用5min，實施脂肪酶與氨基芯片的偶聯。偶聯完成后，該傳感器就可以用于測量脂肪酶與P19序列之間的相互作用。

2、向傳感器中注入250μl PBS緩沖液(pH 7.4)，以最大流速(150μl/min)運行緩沖液，達到信號基線，將緩沖液的流速降至20μl/min，以獲得較為穩定的基線。

3、將人工合成并在氨基端生物素化修飾的P19干粉使用PBS緩沖液(pH 7.4)分別稀成濃度為180.01μM、90.07μM、45.03μM、22.51μM，11.25μM、5.63μM、2.81μM、1.41μM的P19溶液，從低濃度開始依次向傳感器中注入250μl的P19溶液，每次注入樣品均采用20μl/min的流速并且與傳感器相互作用5min，最后用PBS緩沖液(pH 7.4)沖洗5min。以得到的不同濃度P19溶液與脂肪酶相互作用的結合與解離曲線為依據，進行P19序列與脂肪酶相結合的親和力分析(見圖2)。

結果表明，P19序列與人工表達的脂肪酶具有較好的親和性結合，兩者之間相互作用的平衡解離常數KD為3.653×10^-8M，即36.53nM。

實施例3P19序列與血清的脂肪酶的ELISA鑒定

1、取哺乳動物血液(陽性)進行離心，去除血細胞，取血清進行酶標板包被；以同樣方式將不同樣品，即脂肪酶標準品、陰性血清、熱休克蛋白(HSP)、牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)進行酶標板包被，作為對照。其中，包被抗原均采用碳酸鹽(CBS)緩沖液進行稀釋，每孔50μl加入96孔酶標板中，置于4℃條件下過夜，用PBST緩沖液洗滌5次后再用質量分數2％的BSA液進行封閉。

2、將人工合成并在氨基端生物素化修飾的P19干粉使用PBS緩沖液(pH 7.4)稀釋成500ng/ml的濃度，以每孔50μl的體積加入到上述酶標板中，混勻后，置于37℃條件下，避光溫育30min。

3、用PBST緩沖液洗滌5次，并甩干酶標板孔中的液體；使用PBST緩沖液稀釋偶聯辣根過氧化物酶的鏈霉親和素(1:1000)，以每孔50μl的體積加入甩干的酶標板中，混勻后，置于37℃條件下，避光溫育30min。

4、根據試驗所需量，將TMB顯色液以每孔100μl的體積加入到上述酶標板中，充分混勻30s之后，室溫條件下，顯色10min。

5、將2M的硫酸終止液以每孔50μl的體積加入上述酶標板中，充分混勻30s之后，在酶標儀器上，讀取各孔在450nm處的吸光值，判定結果。

結果表明，P19序列與哺乳動物血清中的脂肪酶具有較好的親和性與特異性結合，與其它陰性血清均不發生反應(見圖3)。

SEQUENCE LISTING

<110> 鄭州大學第一附屬醫院

<120> 與脂肪酶靶向結合的肽配基序列及其應用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Arg Arg Arg Asp Cys Trp

1 5