本發(fā)明涉及一株魯氏不動桿菌及其在降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

氯氰菊酯(Cypermethrin，CY)是擬除蟲菊酯類農(nóng)藥中最常用品種之一，其廣泛應(yīng)用于茶樹、果蔬、人畜等蟲害的防治。由于其具有疏水性強(qiáng)、對光熱穩(wěn)定等特性，因此自然降解速率慢，在環(huán)境中半衰期長達(dá)94.2d-1103d，易導(dǎo)致其在環(huán)境中殘留蓄積，因此其在土壤、水體、農(nóng)畜產(chǎn)品中常出現(xiàn)較高的檢出率和超標(biāo)率。氯氰菊酯對魚類及其他水生動物有高毒性，其還能在動植物體內(nèi)蓄積，對神經(jīng)系統(tǒng)有急性毒性，并能損傷男性生殖系統(tǒng)發(fā)育，長期接觸還可能引發(fā)多種慢性疾病，美國環(huán)境保護(hù)局已將其認(rèn)定為一種致癌劑。在我國廣泛應(yīng)用于茶樹、果蔬、人畜等蟲害的防治，氯氰菊酯類農(nóng)藥的過量使用不僅造成了環(huán)境污染，同時由于食物鏈的傳遞，在動物性來源食品中也存在嚴(yán)重的殘留現(xiàn)象，從而嚴(yán)重危害人體健康，隨著人們生活質(zhì)量的不斷提高和環(huán)保意識的逐漸增強(qiáng)，該類農(nóng)藥的殘留問題已越來越引起人們的關(guān)注。如何消除氯氰菊酯類農(nóng)藥對環(huán)境的危害，已經(jīng)成為關(guān)系人類健康和國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大科學(xué)問題。以微生物降解為基礎(chǔ)的生物修復(fù)是一種環(huán)境友好型污染物去除方法。

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥作為目前最有發(fā)展前景的殺蟲劑，在尚未找到新型替代化合物之前，未來幾十年內(nèi)仍將被廣泛使用，因而迫切需要研究殘留農(nóng)藥的降解。微生物降解是各種農(nóng)藥降解方法中較為綠色和高效的一種。

然而，現(xiàn)有細(xì)菌對氯氰菊酯的降解速度慢、降解率低，如，公開號為CN101139559A的專利申請以及肖紅利，擬除蟲菊酯降解菌株分離及生化分子基礎(chǔ)研究，中國優(yōu)秀碩士論文全文數(shù)據(jù)庫工程科技Ⅰ輯2005/07公開了一種不動桿菌，其在培養(yǎng)基條件下，降解200mg/L的氯氰菊酯時，在48h的降解率僅52.1％，而且最高也僅能達(dá)到75％；胡桂萍，氟氯氰菊酯降解菌FLQ-11-1分離鑒定、降解特性及降解機(jī)理，中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫工程科技Ⅰ輯2016年第08期中公開了一種細(xì)菌，其在作用5天后對100mg/L的甲氰菊酯的降解率也僅90.23％。

急需提供一種可以快速、高效降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的新的菌株。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種新的魯氏不動桿菌(Acinetobacter lwoffii)及其在降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種魯氏不動桿菌，它是由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏的保藏號：CGMCC No.13144的魯氏不動桿菌Acinetobacter lwoffii JX-2。

本發(fā)明魯氏不動桿菌Acinetobacter lwoffii，于2016年10月24日保藏在于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地點(diǎn)為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏號為CGMCC No.13144。

本發(fā)明還提供了魯氏不動桿菌在降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥中的用途。

其中，所述魯氏不動桿菌是保藏號為CGMCC No.13144的魯氏不動桿菌Acinetobacter lwoffii JX-2。

其中，所述擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是氰戊菊酯、溴氰菊酯或氟氯氰菊酯。

本發(fā)明還提供了一種降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的方法，包括如下步驟：

(1)取魯氏不動桿菌，復(fù)蘇制備種子液；

(2)將種子液加入待處理的樣品中，混勻，即可。

步驟(1)中，所述魯氏不動桿菌是保藏號CGMCC No.13144的魯氏不動桿菌Acinetobacter lwoffii JX-2。

步驟(1)中，所述種子液的濃度不低于10⁶cfu/mL。

優(yōu)選地，所述種子液的濃度為10⁶～10⁹cfu/mL。

所述種子液的按照如下方法制備：取魯氏不動桿菌，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，調(diào)整濃度，即可。

本發(fā)明魯氏不動桿菌Acinetobacter lwoffii JX-2，在培養(yǎng)基條件下降解200mg/L的氯氰菊酯，在48h的降解率達(dá)到80％，在96h時可達(dá)88％，降解效率顯著優(yōu)于現(xiàn)有文獻(xiàn)報道的不動桿菌，可以高效、快速降解氯氰菊酯等擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，用于污染土壤、水體的生物修復(fù)或生物凈化，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，具有極好的應(yīng)用前景。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1為本發(fā)明菌株JX-2培養(yǎng)48h的菌落培養(yǎng)特征。

圖2為本發(fā)明菌株JX-2的細(xì)胞形態(tài)圖。

圖3本發(fā)明菌株JX-2對氯氰菊酯的降解情況。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明培養(yǎng)基：

Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)：酵母浸膏(Yeast extract)5.0g；胰蛋白胨(Casein tryptone)10g；氯化鈉(Sodium chloride)10g；蒸餾水(H₂O)1000mL；調(diào)pH至7.0，此固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中再加20g/L瓊脂(Agar)制成的。培養(yǎng)基于121℃，滅菌20min備用。

實(shí)施例1本發(fā)明魯氏不動桿菌的分離鑒定

1、分離

取醋賠樣品4份，分別拌勻，各取5g，置于裝有30mL LB培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于80℃下加熱10min，冷至室溫再加入氯氰菊酯使其質(zhì)量濃度為50mg/L，于30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后按5％接種量再依次進(jìn)行3次富集培養(yǎng)，每次培養(yǎng)48h，并逐步提高培養(yǎng)基中氯氰菊酯濃度，使之分別達(dá)到100mg/L、200mg/L、400mg/L。將最后一級梯度馴化后的培養(yǎng)液按5％(v/v)接種量轉(zhuǎn)接于30mL含100mg/L氯氰菊酯的LB培養(yǎng)基中，并用無菌生理鹽水作空白對照，于30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)120h。

最終從醋醅中富集分離得到一株可以降解氯氰菊酯的菌株，編號為JX-2。

2、鑒定

(1)形態(tài)、生理生化特征

形態(tài)：挑取菌株JX-2至LB固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)，記錄其菌落形態(tài)特征，挑取單菌落進(jìn)行涂片、革蘭氏染色，于10×100倍油鏡下觀察記錄顏色、大小、形狀、排列等。

生理生化鑒定參見《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》第八版。

菌株JX-2的形態(tài)鑒定(如圖1、圖2所示)：革蘭氏染色陰性，桿菌，菌落近圓形，扁平，不透明，微黃色，不反光，表面皺褶，邊緣不整齊。

表1菌株JX-2生理生化鑒定結(jié)果

(2)16S rDNA鑒定

對菌株16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增，PCR條件：94℃預(yù)變性5min；然后94℃、45s，56℃、45s，72℃、90s，循環(huán)30次；最后72℃延伸10min；PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序，菌株JX-2的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示：

TGGTAGCGTCTCCTTACGGTTAGACTACCTACTTCTGGTGCACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGATCGGCTTTTTGAGATTAGCATCCTCTCGCGAGGTAGCAACCCTTTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCGTCCCCGCCTTCCTCCAGTTTGTCACTGGCAGTATCCTTAAAGTTCCCGGCTTAACCCGCTGGCAAATAAGGAAAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTATGTAAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTTACTATGTCAAGACCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCTACTTATCGCGTTAGCTGCGCCACTAAAGCCTCAAAGGCCCCAACGGCTAGTAGACATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCATGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGTATTAGGCCAGATGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCATCCTCTCCCATACTCTAGCCAACCAGTATCGAATGCAATTCCCAAGTTAAGCTCGGGGATTTCACATTTGACTTAATTGGCCACCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAAATCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGCGAGTAACGTCCACTATCCAAGAGTATTAATCTCGGTAGCCTCCTCCTCGCTTAAAGTGCTTTACAACCAAAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGGTTCCCCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCGGATCATCCTCTCAGACCCGCTACAGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCCGACTTAGGCTCATCTATTAGCGCAAGGTCCGAAGATCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCGTCCCTTTCGGAACGTTGTCCCCCACTAATAGGCAGATTCCTAAGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTAGGTCCAGTAGCAAGCTACCTTCCCCGCTCGACTGCAGGT。

測定，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行Blast同源性對比，該菌株序列與Acinetobacter lwoffii菌株基因序列高度同源。

綜上，結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特征、16S rDNA鑒定結(jié)果，將本發(fā)明分離株JX-2鑒定為魯氏不動桿菌(Acinetobacter lwoffii)，并將其命名為魯氏不動桿菌cinetobacter lwoffii JX-2，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.13144。

實(shí)施例2采用本發(fā)明魯氏不動桿菌降解土壤中的氯氰菊酯

取本發(fā)明魯氏不動桿菌Acinetobacter lwoffii JX-2，保藏號為CGMCC No.13144，簡稱菌株JX-2。菌種活化：挑取菌株JX-2至LB液體培養(yǎng)基中，30℃，180r/min振蕩培養(yǎng)24h；然后連續(xù)劃線、挑取單菌落培養(yǎng)兩次(30℃)，挑取單菌落接種至LB斜面30℃培養(yǎng)2d備用。用無菌生理鹽水洗下斜面上菌體并調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁶cfu/mL，制成種子液。

將種子液加入待處理土壤中，混勻，即可。

實(shí)施例3采用本發(fā)明魯氏不動桿菌降解水中的氯氰菊酯

取本發(fā)明魯氏不動桿菌Acinetobacter lwoffii JX-2，保藏號為CGMCC No.13144，簡稱菌株JX-2。菌種活化：挑取菌株JX-2至LB液體培養(yǎng)基中，30℃，180r/min振蕩培養(yǎng)24h；然后連續(xù)劃線、挑取單菌落培養(yǎng)兩次(30℃)，挑取單菌落接種至LB斜面30℃培養(yǎng)2d備用。用無菌生理鹽水洗下斜面上菌體并調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁷cfu/mL，制成種子液。

將種子液加入待處理水中，混勻，即可。

實(shí)施例4采用本發(fā)明魯氏不動桿菌降解土壤中的氯氰菊酯

取本發(fā)明魯氏不動桿菌Acinetobacter lwoffii JX-2，保藏號為CGMCC No.13144，簡稱菌株JX-2。菌種活化：挑取菌株JX-2至LB液體培養(yǎng)基中，30℃，180r/min振蕩培養(yǎng)24h；然后連續(xù)劃線、挑取單菌落培養(yǎng)兩次(30℃)，挑取單菌落接種至LB斜面30℃培養(yǎng)2d備用。用無菌生理鹽水洗下斜面上菌體并調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁹cfu/mL，制成種子液。

將種子液加入待處理土壤中，混勻，即可。

以下用實(shí)驗(yàn)例的方式來證明本發(fā)明的有益效果：

實(shí)驗(yàn)例1采用本發(fā)明魯氏不動桿菌降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的方法

1材料與儀器

1.1材料

菌種：本發(fā)明魯氏不動桿菌Acinetobacter lwoffii JX-2，保藏號為CGMCC No.13144，簡稱菌株JX-2。

氯氰菊酯：購自中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.2主要儀器

WondaSil C18柱，購自島津技邇(上海)商貿(mào)有限公司。

2試驗(yàn)方法

菌種活化：挑取菌株JX-2至LB液體培養(yǎng)基中，30℃，180r/min振蕩培養(yǎng)24h；然后連續(xù)劃線、挑取單菌落培養(yǎng)兩次(30℃)，挑取單菌落接種至LB斜面30℃培養(yǎng)2d備用。

用無菌生理鹽水洗下斜面上菌體并調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁶cfu/mL，制成種子液。

將降解菌株JX-2的種子液按5％接種量接種于含有100mg/L、200mg/L、400mg/L氯氰菊酯的LB液體培養(yǎng)基中,分裝30mL/250mL錐形瓶，設(shè)接種5％無菌水為空白對照，30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)，取樣時間為0h-96h期間每12h取樣1瓶，作為樣品進(jìn)行檢測。

樣品前處理及檢測條件：從錐形瓶中取均勻培養(yǎng)液1mL至刻度試管，用乙腈定容至10mL，混勻后于10000r/min離心10min，取上清液供液相色譜(HPLC)分析用。測定條件：色譜柱為WondaSil C18柱(150mm×4.60mm，5.0μm)；流動相為乙腈:水(85:15，V/V)，流速1.0mL/min；紫外檢測器，其波長為210nm；進(jìn)樣量10μL。

3結(jié)果與分析

結(jié)果如圖3和表2所示：

表2菌株JX-2降解LB培養(yǎng)基中的農(nóng)藥

如圖3和表2所示，本發(fā)明菌株魯氏不動桿菌JX-2，降解100mg/L的氯氰菊酯時，降解率可達(dá)98％；降解200mg/L的氯氰菊酯時，在48h的降解率達(dá)到80％，而且在96h時還可達(dá)88％；降解400mg/L的氯氰菊酯時，降解率可達(dá)67％。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明魯氏不動桿菌JX-2可以有效降解氯氰菊酯，且降解速度快，降解率高。

實(shí)驗(yàn)例2采用本發(fā)明魯氏不動桿菌降解土壤中的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥

1材料與儀器

1.1材料

菌種：本發(fā)明魯氏不動桿菌Acinetobacter lwoffii JX-2，保藏號為CGMCC No.13144，簡稱菌株JX-2。

氯氰菊酯：購自中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.2主要儀器

WondaSil C18柱，購自島津技邇(上海)商貿(mào)有限公司。

2試驗(yàn)方法

菌種活化：挑取菌株JX-2至LB液體培養(yǎng)基中，30℃，180r/min振蕩培養(yǎng)24h；然后連續(xù)劃線、挑取單菌落培養(yǎng)兩次(30℃)，挑取單菌落接種至LB斜面30℃培養(yǎng)2d備用。

用無菌生理鹽水洗下斜面上菌體并調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁶cfu/mL，制成種子液。

從四川省某蔬菜基地取土壤樣品，添加氯氰菊酯使其質(zhì)量濃度分別為50mg/L、30mg/L、20mg/L、10mg/L，將降解菌株的種子液按5％接種量接種(實(shí)驗(yàn)組)，設(shè)接種5％無菌水為空白對照，30℃培養(yǎng)，每24h取樣，用實(shí)驗(yàn)例1所述方法測定樣品中氯氰菊酯的殘留量。

通過HPLC檢測樣品中氯氰菊酯的殘留量，空白土壤樣品中氯氰菊酯含量變化較小，實(shí)驗(yàn)組的土壤樣品中氯氰菊酯降解率如表3所示。

表3菌株JX-2降解土壤中的農(nóng)藥

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明魯氏不動桿菌JX-2可以有效降解氯氰菊酯，且降解速度快，降解率高。

綜上，本發(fā)明分離得到了一株新的魯氏不動桿菌Acinetobacter lwoffii JX-2，其可以高效、快速降解氯氰菊酯等擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，對環(huán)境修復(fù)的作用佳，具有極好的應(yīng)用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都醫(yī)學(xué)院

<120> 一種魯氏不動桿菌及其在降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥中的應(yīng)用

<130> GY044-16P1498

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1407

<212> DNA

<213> 16S rDNA

<400> 1

tggtagcgtc tccttacggt tagactacct acttctggtg cacaaactcc catggtgtga 60

cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg cattctgatc cgcgattact 120

agcgattccg acttcatgga gtcgagttgc agactccaat ccggactacg atcggctttt 180

tgagattagc atcctctcgc gaggtagcaa ccctttgtac cgaccattgt agcacgtgtg 240

tagccctggt cgtaagggcc atgatgactt gacgtcgtcc ccgccttcct ccagtttgtc 300

actggcagta tccttaaagt tcccggctta acccgctggc aaataaggaa aagggttgcg 360

ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacagcc atgcagcacc 420

tgtatgtaag ttcccgaagg caccaatcca tctctggaaa gttcttacta tgtcaagacc 480

aggtaaggtt cttcgcgttg catcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540

ccgtcaattc atttgagttt tagtcttgcg accgtactcc ccaggcggtc tacttatcgc 600

gttagctgcg ccactaaagc ctcaaaggcc ccaacggcta gtagacatcg tttacggcat 660

ggactaccag ggtatctaat cctgtttgct ccccatgctt tcgcacctca gtgtcagtat 720

taggccagat ggctgccttc gccatcggta ttcctccaga tctctacgca tttcaccgct 780

acacctggaa ttctaccatc ctctcccata ctctagccaa ccagtatcga atgcaattcc 840

caagttaagc tcggggattt cacatttgac ttaattggcc acctacgcgc gctttacgcc 900

cagtaaatcc gattaacgct tgcaccctct gtattaccgc ggctgctggc acagagttag 960

ccggtgctta ttctgcgagt aacgtccact atccaagagt attaatctcg gtagcctcct 1020

cctcgcttaa agtgctttac aaccaaaagg ccttcttcac acacgcggca tggctggatc 1080

agggttcccc ccattgtcca atattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg 1140

tctcagtccc agtgtggcgg atcatcctct cagacccgct acagatcgtc gccttggtag 1200

gcctttaccc caccaactag ctaatccgac ttaggctcat ctattagcgc aaggtccgaa 1260

gatcccctgc tttctcccgt aggacgtatg cggtattagc gtccctttcg gaacgttgtc 1320

ccccactaat aggcagattc ctaagcatta ctcacccgtc cgccgctagg tccagtagca 1380

agctaccttc cccgctcgac tgcaggt 1407