本發(fā)明涉及啟動(dòng)子領(lǐng)域，具體地指一種荔枝葉片特異表達(dá)基因LcGRX啟動(dòng)子及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

荔枝是華南一種重要的果樹，在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。然而，采前果實(shí)易受蛀蒂蟲等危害導(dǎo)致落果嚴(yán)重,從而降低荔枝產(chǎn)量；采后荔枝果實(shí)不耐貯藏，果皮褐變、病害嚴(yán)重和失水變干易裂等，嚴(yán)重縮短了荔枝貨架期，降低了荔枝的商品價(jià)值，限制了荔枝產(chǎn)業(yè)發(fā)展。培育多抗優(yōu)質(zhì)耐貯的新品種是解決這些問題的根本途徑。但由于荔枝遺傳基礎(chǔ)狹窄，缺乏抗性資源，使抗性育種進(jìn)展緩慢。

歷史上，雜交育種與實(shí)生選種是荔枝品種改良的主要途徑。但是，荔枝童期長(zhǎng)，雜交育種周期長(zhǎng),而且不同親本之間可能存在生殖隔離而致雜交不親和，或因花期不遇難以雜交，使雜交存在技術(shù)困難。從實(shí)生的半野生群體中篩選優(yōu)株，進(jìn)而培育為優(yōu)良品種是一種行之有效的辦法，但選擇效率低。目前，隨土地開發(fā)利用的加速，荔枝實(shí)生群體規(guī)模快速縮小，加上歷史上已經(jīng)過多次篩選，從實(shí)生群體中選擇優(yōu)株的難度越來越大，效率更低。

現(xiàn)代植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的興起與發(fā)展為荔枝育種提供了新的方向。轉(zhuǎn)基因技術(shù)既可以在受體中表達(dá)受體的同源基因(同源轉(zhuǎn)基因)，也可以打破物種的限制，在受體中表達(dá)來自于不同于受體的外源基因(異源轉(zhuǎn)基因)，從而不受資源匱乏的影響達(dá)到定向改良某一或某些性狀的目的。

轉(zhuǎn)基因育種一般都是通過基因工程來完成的，供體、受體和載體是基因工程的三大要素。其中，啟動(dòng)子調(diào)控外源基因的表達(dá)，而成為基因工程表達(dá)載體的重要組成元件。啟動(dòng)子按作用方式可以分為三類：組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。組織特異性啟動(dòng)子常具有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的特征。在轉(zhuǎn)基因育種中，組織特異性啟動(dòng)子比組成型啟動(dòng)子具有更廣泛的用途。因?yàn)榻M成型啟動(dòng)子可以調(diào)節(jié)基因在植物各組織中均有不同程度的表達(dá)，從而使得植株各器官中的異源蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物大量積累，打破植物原有的代謝平衡，甚至?xí)a(chǎn)生毒素，進(jìn)而影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育，甚至?xí)?dǎo)致植物死亡，另外，也會(huì)給人類帶來食用安全等相關(guān)問題。而通過利用組織特異性啟動(dòng)子，定向調(diào)節(jié)目的基因在特定器官或組織中表達(dá)，定向改良作物性狀，是可行的轉(zhuǎn)基因作物育種策略之一。研究荔枝啟動(dòng)子特別是組織特異表達(dá)基因啟動(dòng)子，有助于對(duì)荔枝性狀進(jìn)行定性改良，從而為荔枝轉(zhuǎn)基因育種提供方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供了一種荔枝葉片特異表達(dá)基因LcGRX啟動(dòng)子及其應(yīng)用，本發(fā)明為荔枝基因工程育種提供基礎(chǔ)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種荔枝葉片特異表達(dá)基因LcGRX啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。其來源于無患子科荔枝(L.chinensis Sonn)妃子笑品種。

本發(fā)明提供了用于獲得上述荔枝葉片特異表達(dá)基因LcGRX啟動(dòng)子的引物對(duì)，所述引物對(duì)為：

正向引物P1：5'-GTGCCCCATGACTTATTTTAT-3'；

反向引物P2：5'-TCTTTCACCAACCTTGCTATT-3'。

本發(fā)明提供了一種荔枝葉片特異表達(dá)基因LcGRX啟動(dòng)子的獲得方法，以具有荔枝葉片特異表達(dá)基因LcGRX的荔枝基因組DNA為模板，采用以下引物對(duì)：

正向引物P1：5'-GTGCCCCATGACTTATTTTAT-3'；

反向引物P2：5'-TCTTTCACCAACCTTGCTATT-3'。

進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其所獲得的荔枝葉片特異表達(dá)基因LcGRX啟動(dòng)子序列為SEQ IDNO.1所示。

作為優(yōu)選方案，所述PCR反應(yīng)體系：

所述PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s；61℃退火30s；72℃延伸2min，循環(huán)35次后；72℃延伸8min。

本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)載體，它含有上述荔枝葉片特異表達(dá)基因LcGRX啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體。作為優(yōu)選方案，植物表達(dá)載體為pCAMBIA1304。含有本發(fā)明啟動(dòng)子的重組載體、含有載體的宿主菌株、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或者轉(zhuǎn)基因植株均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明提供了一種上述重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)以荔枝葉片特異表達(dá)基因LcGRX啟動(dòng)子序列如SEQ IDNO.1所示為模板設(shè)計(jì)引物對(duì)，如下：

LcGRX-F：AACTGCAGGTGCCCCATGACTTATTTTAT(下劃線為Pst I酶切位點(diǎn))，

LcGRX-R：CGGAATTCTCTTTCACCAACCTTGCTATT(下劃線為EcoR I酶切位點(diǎn))；

2)以荔枝葉片特異表達(dá)基因LcGRX序列為模板進(jìn)行PCR，PCR擴(kuò)增條件如下：

反應(yīng)體系：

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；94℃變性30s；61℃退火30s；72℃延伸2min，循環(huán)35次后；72℃延伸8min；獲得PCR產(chǎn)物1；

3)以荔枝類甜蛋白LcTLP基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物對(duì)，如下：

正向引物P3：5'-CG(GAATTC)TCATGAAGCTCTTCAAAATCC-3'，

反向引物P4：5'-GG(ACTAGT)GGGGCAAAAGACAACCTT-3'；

4)以荔枝類甜蛋白LcTLP基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR，PCR擴(kuò)增條件如下：

94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s；61℃退火30s；72℃延伸2min，循環(huán)35次后；72℃延伸8min；獲得PCR產(chǎn)物2；

5)用Pst I、EcoRI對(duì)PCR產(chǎn)物1進(jìn)行酶切，純化回收得到回收產(chǎn)物1，用EcoRI、SpeI對(duì)PCR產(chǎn)物1進(jìn)行酶切，純化回收得到回收產(chǎn)物2，同時(shí)，用PstI、SpeI將pCAMBIA1304載體進(jìn)行雙酶切，去除CaMV35S啟動(dòng)子，酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收大片段；

6)在10μL體系中，將回收的pCAMBIA1304載體大片段、回收產(chǎn)物1和回收產(chǎn)物2用T4連接酶4℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將篩選得到的陽(yáng)性克隆用PstI、SpeI進(jìn)行酶切驗(yàn)證，獲得得到表達(dá)Gus基因的植物重組表達(dá)載體pCAMBIA1304-GRX-TLP。

本發(fā)明提供了一種下述各項(xiàng)之一在啟動(dòng)目的基因表達(dá)和培育植物新品種中的應(yīng)用，

(1)上述的啟動(dòng)子；

(2)上述的重組表達(dá)載體；

進(jìn)一步地，所述植物為雙子葉植物。

再進(jìn)一步地，所述植物為荔枝、番茄或擬南芥。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明的啟動(dòng)子具有葉片特異性高表達(dá)，果肉低表達(dá)的特性，可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因育種領(lǐng)域。通過構(gòu)建含有該啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到植物，例如雙子葉植物荔枝等的基因組中，驅(qū)動(dòng)目的基因在植物葉片中特異性高表達(dá)，可用于培育新的育種材料，為進(jìn)一步的荔枝轉(zhuǎn)基因育種提供基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為L(zhǎng)cGRX基因在荔枝不同組織中的定量PCR表達(dá)圖；

圖2為L(zhǎng)cGRX基因啟動(dòng)子表達(dá)載體構(gòu)建圖；

圖3為pCAMBIA1304-GRX-TPL表達(dá)載體在荔枝不同組織的表達(dá)活性圖。

具體實(shí)施方式

為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1荔枝葉片特異性表達(dá)基因LcGRX啟動(dòng)子序列的獲得

摘取結(jié)果母枝中部無病蟲害的成熟功能葉片和剛剛開放的花朵，3h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，無菌水清洗干凈，吸干多余水分，液氮速凍，-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩２烧顺墒臁板有Α惫麑?shí)且3h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，挑選無病蟲害的健康果實(shí)，滅菌水沖洗數(shù)次，吸干多余水分，剝?nèi)」ぁ⒎N子和果肉，液氮速凍，-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩！板有Α背墒旆N子在育苗塞中培育出健康幼苗，3個(gè)月后，取根，無菌水沖洗干凈,吸干多余水分，液氮速凍，-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ陨喜牧嫌萌A越洋多糖多酚植物RNA提取試劑盒提取總RNA。

取1.6μg總RNA，用Invirtrogen的SuperScriptT"I III Reverse Transcriptase合成cDNA第一鏈。具體操作如下：

體系輕輕混勻，瞬時(shí)離心，25℃孵育10min；42℃孵育30min；85℃加熱5s；-20℃冰箱保存。

從前期荔枝各個(gè)組織(根、葉、花、果皮、果肉、果核)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明，荔枝LcGRX基因在葉中有很強(qiáng)的表達(dá)活性，而在果肉中表達(dá)量很低。根據(jù)荔枝轉(zhuǎn)錄組拼接的序列和基因組的序列設(shè)計(jì)針對(duì)LcGRX基因啟動(dòng)子的特異引物(P1、P2)。其序列為

正向引物P1：GTGCCCCATGACTTATTTTAT；

反向引物P2：TCTTTCACCAACCTTGCTATT。

以荔枝品種妃子笑葉片為材料，采用艾德萊公司的DNA小量提取試劑盒提取基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度。以其DNA為模板，P1、P2為引物進(jìn)行PCR。

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；94℃變性30s；61℃退火30s；72℃延伸2min，循環(huán)35次后；72℃延伸8min。

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后切膠回收目的條帶。PCR回收產(chǎn)物連接PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)。藍(lán)白斑篩選后，挑取陽(yáng)性克隆單菌落用于搖菌，提取質(zhì)粒。篩選具有擴(kuò)增目的片段的單克隆，后送北京華大基因工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)序獲得LcGRX基因編碼區(qū)及上游序列，將所獲目的片段序列與前期所獲序列比對(duì)分析，兩條序列堿基組成一致。選取翻譯起始位點(diǎn)上游1996bp作為啟動(dòng)子序列進(jìn)行研究，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

實(shí)施例2荔枝LcGRX基因在不同組織的表達(dá)模式調(diào)查

由于荔枝actin(肌動(dòng)蛋白)基因在荔枝各個(gè)組織的表達(dá)量基本一致，所以檢測(cè)荔枝基因的相對(duì)表達(dá)量一般使用actin作為內(nèi)參基因。

設(shè)計(jì)如下特異性的RT-PCR引物：

Act-F：CAACTGGTATTGTCTTGGATTCTG；

Act-R：TCATCAAGGCATCGGTTAGA。

LcGRX-RT-F：AAGACCTCTTGTTGCATCAGCT；

LcGRX-RT-R:CACCTCCTACGAGTTCTTGACC。

RT-PCR反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s；60℃退火34s；循環(huán)40次，72℃延伸8min。

定量PCR分析結(jié)果表明，LcGRX基因在荔枝葉片高表達(dá)，在其余5個(gè)組織中表達(dá)量較低，尤其是在果肉中表達(dá)量最低。證實(shí)LcGRX基因的啟動(dòng)子為荔枝葉片特異性表達(dá)啟動(dòng)子。

實(shí)施例3植物L(fēng)cGRX基因啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建

1)以荔枝葉片特異表達(dá)基因LcGRX啟動(dòng)子序列如SEQ IDNO.1所示為模板設(shè)計(jì)引物對(duì)，且引物對(duì)分別上加Pst I、EcoR I酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，如下：

正向引物P1：5'-GTGCCCCATGACTTATTTTAT-3'；

反向引物P2：5'-TCTTTCACCAACCTTGCTATT-3'。

以荔枝葉片特異表達(dá)基因LcGRX啟動(dòng)子序列為模板進(jìn)行PCR，PCR擴(kuò)增條件如下：

反應(yīng)體系：

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；94℃變性30s；61℃退火30s；72℃延伸2min，循環(huán)35次后；72℃延伸8min；獲得PCR產(chǎn)物1；

3)以如SEQ IDNO.2所示的荔枝類甜蛋白LcTLP基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物對(duì)，且引物對(duì)分別上加EcoR I、Spe I保護(hù)堿基，如下：

正向引物P3：

5'-CG(GAATTC)TCATGAAGCTCTTCAAAATCC-3'，

反向引物P4：5'-GG(ACTAGT)GGGGCAAAAGACAACCTT-3'；

4)以荔枝類甜蛋白LcTLP基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR，PCR擴(kuò)增條件如下：

94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s；61℃退火30s；72℃延伸2min，循環(huán)35次后；72℃延伸8min；獲得PCR產(chǎn)物2；

5)用Pst I、EcoR I對(duì)PCR產(chǎn)物1進(jìn)行酶切，純化回收得到回收產(chǎn)物1，用EcoR I、Spe I對(duì)PCR產(chǎn)物2進(jìn)行酶切，純化回收得到回收產(chǎn)物2，同時(shí)，用Pst I、Spe I將pCAMBIA1304載體進(jìn)行雙酶切，去除CaMV35S啟動(dòng)子，酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收大片段；

6)在10μL體系中，將回收的pCAMBIA1304載體大片段、回收產(chǎn)物1和回收產(chǎn)物2用T4連接酶4℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將篩選得到的陽(yáng)性克隆用Pst I、Spe I進(jìn)行酶切驗(yàn)證，獲得得到表達(dá)Gus基因的植物重組表達(dá)載體pCAMBIA1304-GRX-TLP。

7)挑取陽(yáng)性克隆單菌落用于搖菌，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR檢測(cè)和酶切鑒定后送北京華大基因工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果確認(rèn)不同片段的插入順序，且插入LcGRX基因啟動(dòng)子與SEQ IDNO.1所示的序列一致，構(gòu)建的植物表達(dá)載體為pCAMBIA1304-GRX-TLP，載體如附圖2所示。

實(shí)施例4基因槍轉(zhuǎn)化與GUS基因瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證啟動(dòng)子功能

摘取結(jié)果母枝中部無病蟲害的成熟功能葉片和剛剛開放的花朵，3h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，無菌水清洗干凈，吸干多余水分。采摘八成熟“妃子笑”果實(shí)且3h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，挑選無病蟲害的健康果實(shí)，0.1％HgCl₂消毒1min后，滅菌水沖洗數(shù)次，晾干后，剝?nèi)」ぁ⒎N子和果肉。“妃子笑”成熟種子在育苗塞中培育出健康幼苗，3個(gè)月后，取根組織的伸長(zhǎng)區(qū)、分生區(qū)以及根冠，無菌水沖洗干凈,吸干多余水分。以上材料立即用于基因槍轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

微彈載體制備

①稱取10mg鎢粉，置于2.0ml的無菌離心管中。

②向管中加入1ml 70％的乙醇，充分渦旋混勻3min，然后室溫靜置15min，3000rpm離心5min。

③棄上清液，加入1ml無菌水，充分渦旋3min，室溫靜置15min，3000rpm離心5min；用無菌水重復(fù)洗滌三次。

④棄上清液，加入50％的甘油(高壓滅菌)，使鎢粉的終濃度為60mg/ml。

⑤將上述制備的鎢粉充分渦旋混勻后取50μL轉(zhuǎn)入另一無菌的1.5mL離心管中。

⑥依次加入5μl質(zhì)粒(1mg/ml)、50μl的CaCl2(2.5M，高壓滅菌)溶液和20μL亞精胺(0.1M，過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用)。

⑦將混合物充分渦旋8min，室溫靜置15min，12000rpm離心5min。

⑧棄上清液，加入150μl的70％的乙醇，渦旋混勻1min，12000rpm離心1min。

⑨棄上清液，加入150μl的無水乙醇，渦旋混勻1min，12000rpm離心1min。

⑩棄上清液，加入50μl的無水乙醇，重懸顆粒，然后將離心管浸入超聲波清洗器中10sec，分散顆粒，每個(gè)彈孔上樣10μl，每次上樣可轟擊2-3次。

轉(zhuǎn)化受體材料

①超凈工作臺(tái)滅菌后吹風(fēng)。

②用75％的乙醇擦洗基因槍進(jìn)行消毒，阻擋網(wǎng)和可破圓片是提前高壓滅菌準(zhǔn)備好。

③連接高壓氦氣瓶和基因槍(型號(hào)：SJ-500)，用滅菌鑷子夾取可裂圓片和阻擋網(wǎng)，并旋緊安裝好。

④每次取10μl制作好的微彈，均勻涂布于每個(gè)彈孔中。

⑤將裝好微彈的彈夾裝入基因槍中。

⑥把氦氣壓力調(diào)到3.5MPa，按基因槍使用說明按下扳機(jī)轟擊受體材料。

⑦每次轟擊完，更換彈夾，更換可列圓片和阻擋網(wǎng)，重復(fù)4～6步驟，然后轟擊轉(zhuǎn)化受體材料。

⑧分別以pCAMBIA1304質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，鎢粉為陰性對(duì)照，pCAMBIA1304-GRX-TLP質(zhì)粒轟擊上述荔枝不同組織材料。轟擊完的荔枝實(shí)驗(yàn)材料置于28℃暗培養(yǎng)24～36h。

GUS組織化學(xué)染色

①將轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后的受體材料，用無菌水清洗樣品數(shù)次，用濾紙將樣品表面水吸干；

②將荔枝果皮剝出，并用無菌手術(shù)刀將基因槍轟擊的果皮、種子和葉片，切成小塊；

③將切好的樣品轉(zhuǎn)至10mL的無菌離心管中，每管中加入5mL的固定液(組份：1％(體積百分濃度)甲醛，0.05M磷酸鈉緩沖液，0.05％(質(zhì)量百分濃度)Triton-100)，放到搖床上200rpm溫和搖動(dòng)30min；

④將固定液去除，用0.05M磷酸鈉緩沖液洗滌樣品三次，每次于200rpm溫和搖動(dòng)10min；去除用過的緩沖液；

⑤每管中加入600μL的現(xiàn)配制的GUS染色液(配方：50mM磷酸鈉緩沖液pH7.0，0.1M鐵氰化鉀，0.1M亞鐵氰化鉀，10mM EDTA，0.1％Triton-100，20％甲醛，0.5mMX-gluc)浸沒轉(zhuǎn)化材料，于37℃水浴保溫1h；

⑥取出材料，用75％的乙醇漂洗20min；

⑦先后用20％乙醇、50％乙醇各浸泡20min；

⑧在顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)化材料的GUS的染色結(jié)果并拍照。

分析染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pCAMBIA1304質(zhì)粒(陽(yáng)性對(duì)照)在所有組織中均出現(xiàn)了藍(lán)色斑點(diǎn)，表明CaMV35S啟動(dòng)子能調(diào)控pCAMBIA1304質(zhì)粒中的GUS基因表達(dá)。鎢粉(陰性對(duì)照)轟擊在所有材料中均未出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，表明鎢粉轟擊不會(huì)導(dǎo)致荔枝組織出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性。構(gòu)建的植物表達(dá)載體pCAMBIA1304-GRX-TLP在葉片中表達(dá)強(qiáng)烈，同時(shí)在根、花、果皮和種子中均有微弱表達(dá)，但在果肉中沒有出現(xiàn)，說明構(gòu)建的植物表達(dá)載體pCAMBIA1304-GRX-TLP能調(diào)控GUS基因在荔枝的葉片中特異性高表達(dá)，但不能調(diào)控其在果肉中表達(dá)。

其它未詳細(xì)說明的部分均為現(xiàn)有技術(shù)。盡管上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做出了詳盡的描述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，人們還可以根據(jù)本實(shí)施例在不經(jīng)創(chuàng)造性前提下獲得其他實(shí)施例，這些實(shí)施例都屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。

<110> 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所

<120> 荔枝葉片特異表達(dá)基因LcGRX啟動(dòng)子及其應(yīng)用

<211> 1996bp

<212> DNA

<213> 荔枝葉片特異表達(dá)基因LcGRX啟動(dòng)子

<400>

GTGCCCCATGACTTATTTTATGCTTTAGAAATTTATTTTATACATGCAGTTATTGAGATGTGATCTATTGACTTGATAATGACTACTAATATGAAATAATAACTTTTTTTCCAACGTGGCAACAAAATGCTAGGAAGATTTTTTATAAAATCAGAAAAAAGGGCTATTTTAAAAACTTTTTCCTAAACGGTAAACATGAAAGGAGTTACAATATTATTAAAGGGTCGTTTATTTTTTCCACTTAAAATTTAATTGTATCAAATTATATCTATTAAGTTATTTTTGTTTGTATTTTTAAGTGATCAAACCACTTAAAACTATCAAAGAACAATTGAAAAAAATAAGTAAGAATTTTTAATATTTACTTTTTTTCTCCTGATACTTACAAAAAATATATTTGAAAAGTAAAAAATGAATGTTTAAATTGTAAATTATAATATATTAGTTTAATTTTAAGATAGCTTTTCACTTAATTGTAAATCATTTAATGATATTTAAAAGTTTTTATTTCAAATCTATCCTCCCAAAAATAACATAATTTTAAAGTTATCCTAATTTTACATTACTCAAATTTTCTTTTTTTTTTTCCCCTTGATACTTACAAAAAATATATTTACAAAGTAAAATCTAAATACATCGCATCTCAAATTATCTTAGAATTAAACTAATATATTTTAATTTATAATTTGAATATTCATTTTTAATTGTTTTCTTAAATATATTTAAATATATAAATATGGTTAATATTACTATATTTTTTAATCGTATTTTAACTATAGATAAAAAATTATTAATATGTACATAAAAAATGTTTTAGATTTTATTAAATTATTTATTTTCAGATGTTTGTAGTAAATTAATTAAAATTATATAACAGCAAATAAAAAATATATATAAATGTCAACTTATTAGTTTTCAGACAATTTTAAATTTAAAAAACAAACAAGTTTACAATATAATCAGAGGTAAAGAAAAAAAAATATTATTCGGATTTCAAATTTCAGTCATCATTCAGTCTTCAGTAGCACTGTTCAGTCTTCAGACAAAAAAAATAAACAACCTCTTGGACTATCAATATTTAGGGTGCAAATAATCCACACTATATTGTTATAAACAATGTGAGATGGTTTGTCACACAGTTTATTCAAACAAAATAATAAATGAATTGTCTACACTCAAAACAAATTAATATTACATTAAGACTTTAAACATATATAAATACCTTAAAAGGACAACAATTCTTCTAATACCATGCAAATCTCTCCCTCTCTTTTTTCTTTAAAATGTACCACAAATTTGAAATATCAAGTTACTCTTGTTATGGTATATATACATAATTTTCTTATTTTTAGTCCCGGTTATCAATGGGTAAAGAAAATTCTGGAAAATTTCAAGTTGAATATGTGCATATACTATAAAGAAATAGAATTATAGAACTGATTTAAGCTTTGATTGAACAGTATTATTTAGTATGCTTACTATTATTATAGGCGGTTGCTCTTTGCTCTGAATTTTTCTAATGGCAATGACAACGCTAATGTCGTACAGATCTCAGCGATCAAGGACGAATATGCTGAATTGAGATGGACGTTGCCAATTATATCATAAGCACTCTAGATAATATCATATTTGTTGGGCATCATCTACATAGTATCACTTCAACACATTATTTTAGTCACATTTTTCTTGTCTATAGACTATTTAGCTTGATATTGCAAGTTACCATCAAGGGTAGTCTGGGAATCAAAGAAAACATCCTCTTTGGAACATTTTATTCCCTTCCTGTACTGATTCCATCTGGAAACAAATTAGATATGAAATCCCAATCCCACCACCATAATAAAAAAATTCTTGTTATAAATAGACCTCCATGGTTGTTCAAGTCTCCTCACAGCAAAACTTCATCAACTCTCTCAATAACAAGCTTAGTAACATTCAAGACTCCCATTTTTATTTGATTTGCGGCCATGGACACAATAGCAAGGTTGGTGAAAGA

<210> 2

<211> 671bp

<212> DNA

<213> 荔枝類甜蛋白LcTLP基因

<400> 2

TCATGAAGCTCTTCAAAATCCTCCTTTCCTTTTTTGCCATTGCACTCTCCACCACCTTGGTTTATGCAGCCAAATTTGACATCACCAACAACTGTCCTGAGACTATTTGGGCAGCTGCCGTGCCTGGTGGTGGCAAGAAACTAGACAAAGGCGAAACATGGACCATAACTGCCGCCCCAGGTACCAAAGAAGCCAGAATTTGGGGACGTACCAAGTGCAATTTCGATGCCAGCGGGAAAGGCAAGTGTGAGACAGGTGACTGCAACGGCGTCCTCGAGTGCCAAGGCTATGGATCCCCTCCCAATACCTTGGCTGAGTACGCGTTGCAGCAGTTCAACAACATGGACTTCATTGACATGTCCAACATTGATGGTTTTAATGTCCCAATGGAGTTCAGCTCCACCTCTCCTGGATGCAACCGTGTGATCAAATGCACGGGTGACTTGGTAGGGCAGTGCCCTAATGAGCTCAAAGTACCAGGAGGATGTCAAGGGCCATGCTGGGTGTTCAAGACCAACGAGCACTGTTGCAATTCTGGTAGTTGTGGACCTACAGATTTCTCCAGGTTTTTCAAAGATAGGTGCCCGGATGTTTATAGTTATCCAAAAGATGATGCAACAAGTGTTTTTACTTGCCCTAGTGGAACAGACTATAAGGTTGTCTTTTGC