本發明屬于家禽育種領域，具體涉及一種利用純合復合基因型提高鴨群產蛋數的方法。
背景技術：
：長期以來，我國蛋鴨養殖以群養為主，選育中多采用家系選擇方式進行。蛋鴨群體中的低產群是影響鴨群產蛋率，影響養殖效率的重要因素，可造成巨大的經濟損失。蛋鴨產蛋數受到遺傳、環境、營養以及飼養管理等多重因素的影響，目前蛋鴨生產中多采用加強飼養管理，輔以營養調控和環境改善的綜合措施。通過上述方法在一定程度上，能夠提高蛋鴨群體的產蛋水平。然而，最根本的方法還是通過遺傳改良的手段進行選擇繁育，逐步培育高產且均勻度好的蛋鴨群體。傳統育種方法主要從性狀的表型上進行選擇，取得了一定的進展，特別是當性狀的遺傳基礎較為簡單或即使較為復雜但表現加性基因效應遺傳時，表型選擇是非常有效的;但產蛋性狀等數量性狀，其表型性狀受微效多基因的控制，此時根據表型提供的對于性狀遺傳潛力的度量多是不準確的，因而選擇往往是低效甚至是無效的；而分子標記輔助選擇能夠通過影響選擇的時間、選擇的強度以及準確性而極大地提高這類低遺傳力性狀的選擇功效。標記輔助選擇就是通過標記對目標性狀實施間接選擇，其前提是標記與目標性狀緊密關聯。分子標記輔助選擇與傳統育種方法相結合已經是目前畜禽遺傳改良工程所采取的主要方法之一，作為分子標記輔助選擇的基礎，尋找蛋鴨產蛋性狀基因座相連鎖的分子標記，為提高分子標記輔助選擇，高產蛋鴨品種的培育提供新途徑和方法。SNP標記指由基因組單核苷酸變異引起的DNA序列多態性，包括堿基轉換、顛換、單堿基插入或缺失等，被公認為是最新的第三代DNA分子標記。根據SNP在基因中的位置可分為基因編碼區SNP(coding-regionSNPcSNP)、基因周邊SNP(perigenicSNP，pSNP)以及基因間SNP(intergenicSNP，iSNP)三類。其中基因編碼區的SNP可能導致基因所編碼的氨基酸序列發生改變，進而改變蛋白的高級形態，影響基因所編碼的蛋白類激素的功能。抗繆勒氏管激素(anti-Mullerianhormone,AMH)是轉化生長因子β超家族(transforminggrowthfactorβsuperfamily,TGF-P)成員之一。AMH是一種對生殖系統的發育及其重要的糖蛋白，也是評價卵巢儲備的指標。在雌性動物中，AMH對顆粒細胞增殖、芳香化酶活性、促黃體激素受體都有抑制作用。它通過減少FSH和增加抑制素間接調節卵原細胞的發育,在卵泡生長發育中，AMH在卵巢卵泡發育的卵泡募集階段發揮最主要作用。在魚類、哺乳動物中，AMH基因多態與其表達密切相關。然而，AMH基因在蛋鴨上的研究還鮮有報道，迄今為止，尚無有關蛋鴨AMH基因做為鴨產蛋性狀的分子標記的研究。技術實現要素：本發明的目的是通過PCR擴增AMH基因外顯子序列的部分片段，尋找突變位點，篩選一種與蛋鴨產蛋數相關的分子標記，并建立批量檢測方法作為蛋鴨的標記輔助選擇的應用。本發明通過以下技術方案實現：申請人通過PCR擴增，從AMH基因中獲得一段特異的DNA片段作為與蛋鴨產蛋性狀相關的分子標記，它的部分基因外顯子序列如序列表SEQIDNO:1和圖1所述。在序列表SEQIDNO:1的892bp的序列內，共有1個多態位點，為第575bp一個G→A的堿基突變，采用直接測序的方法進行上述位點的檢測。申請人制備了檢測上述分子標記堿基突變的引物對，該引物的DNA序列如下所示：P1正向引物5’CAGGGATAGCGGGCAGTT3’（見序列表SEQIDNO:2），P2反向引物5’TCGGCGAGAAGCAAAGC3’（見序列表SEQIDNO:3）。申請人提供了一種制備上述分子標記的方法，按照以下步驟制備：提取樣本群體荊江鴨血液總DNA，將所得的DNA混合構建成DNA池，根據參考序列設計引物（即：P1和P2所示的引物），進行PCR擴增，獲得鴨AMH基因的部分外顯子序列，PCR產物純化后直接測序，通過序列分析獲得如SEQIDNO:1所示和圖1所示的核苷酸序列；其中：所述的蛋鴨AMH基因的外顯子序列如序列表SEQIDNO:1所示。本發明制備的分子標記可應用于蛋鴨產蛋性狀檢測，所述的引物對也可應用于蛋鴨產蛋性狀檢測程序中。本發明與現有技術相比，具有的優點為：本發明實現了對蛋鴨產蛋性狀進行早期選擇，檢測方法快速、準確，且不受養殖環境條件因素影響。附圖說明圖1：本發明克隆的蛋鴨產蛋性狀相關的分子標記的分型結果展示。圖2：PCR擴增獲得的AMH基因外顯子序列的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中泳道：M是DL2000Marker。具體實施方式實施例11、鴨血樣的采集和DNA的提取：被測鴨群的系譜資料及產蛋性能測定完成后，采用一次性注射器從鴨翅下靜脈中抽取約1ml血液，注入經高壓滅菌并裝有200μL無菌ACD抗凝劑的1.5ml離心管中，輕輕搖勻，記錄翅號，-20℃保存備用。基因組DNA的抽提采用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，按照試劑盒說明書操作，具體步驟是取10μL鴨血加入1.5ml離心管中，然后向離心管中加入20μL蛋白酶K和0.5mlbingingbuffer，渦旋振蕩15秒后，室溫靜置10分鐘。將所得溶液加入一個吸附柱中，12,000rpm離心1分鐘，棄廢液。吸附柱放回收集管并加入0.5mlcleanbuffer，12,000rpm離心1分鐘，棄廢液。再次吸附柱放回收集管并加入0.5mlwashbuffer，12,000rpm離心1分鐘，棄廢液，重復1該步驟次。將吸附柱放入一干凈的離心管中，向吸附柱膜中間加入65℃的滅菌高純水，室溫放置2分鐘后，12,000rpm離心1分鐘收集基因組DNA。2、擴增含待測位點的核苷酸片段根據鴨AMH基因組序列，設計包含待測位點序列的引物，利用PCR技術，擴增被測鴨群的DNA，采用SEQIDNO:2和SEQIDNO:3引物對，PCR反應體系為25μL，其中模板DNA為50ng，dNTPs濃度為200μmol/L，每條引物濃度為0.4μmol/L，3U的TaqDNA聚合酶，加去離子水至總體積25μL；PCR反應程序：94℃預變性4min；然后94℃變性30s、64℃退火30s、72℃延伸1min，共40個循環；最后72℃延伸10min。獲得的PCR產物，委托昆泰銳（武漢）生物技術有限公司測序。3、基因型判定及關聯分析根據測序結果判定該位點在檢測群體中的基因型。結果如圖1所示，如果樣本是純合子的話，就只有一個產物峰：G峰或A峰；如果是雜合子，就會出現2個峰：G峰和A峰。實施例2（應用實施例）在由320只荊江鴨組成的群體中，對鴨AMH基因不同基因型與鴨產蛋性狀（包括開產日齡、43周產蛋數、72周產蛋數）進行了關聯分析的檢測應用。基因型檢測結果表明，在檢測的320個個體中，GG基因型個體占多數，有182只個體，GA基因型個體有90只，AA基因型個體最少，有48只個體，不同基因型與性狀的關聯分析結果如表1所示。由表1可以得出該突變位點與蛋鴨43周齡產蛋數、72周齡產蛋數顯著相關(P＜0.05)，上述分析說明該位點的基因突變與上述性狀間存在顯著或極顯著的關聯。表1AMH基因G575A堿基突變與產蛋性狀的關聯分析性狀GG型（182）AA型（48）GA型（90）開產日齡/天126.74±7.03132.98±8.83128.62±9.9343周產蛋數/個155.30±8.34a142.18±6.44b145.99±6.89b72周產蛋數/個327.38±11.75a286.69±22.61c311.74±17.96b注：標有不同上標字母a、b、c表示差異顯著（P<0.05）；（）中內容表示個體數。SEQIDNO:1<110>湖北省農業科學研究院畜牧獸醫研究所<120>一種與鴨產蛋性狀相關的分子遺傳標記及應用<160>3<210>1<211>892<212>DNA<400>1cagggatagcgggcagttcctgggcatgctgacccgcttcatccgccgggtgctgagccc60ctccagtgagccgcccacccagcccagctcccaccactggctggacttccagatgatgga120gacgctccctcaccagctgctcaacctgtctgagacggcagcgctggagcggctggtgca180gtcggaggagccttcggtgctgcttttcccccaggagggcagcgccgggctggagcagca240ttttggggactggcagccagaggggaccgtgctgcagctgctgctgggcaagctgcaggc300agtgatccaggagctgagggacatcccggcgttccaagccaacatggggcttttccagca360cctcctgagcttctgctactacccgccagggccaggcacgggcagcgcgggtgagcggcc420gcctggctctgggaagctgcacgcgctgctgctgctgaaggcgctgcagacggtgcgagt480gcactggcaggagcggaggaaagtcctgcgacaaaaccgcagcgcccggcaccaggccca540ctgccggctgcaggagctgaccatcgacctgcacaaccgcaagttcatcgtcatgcccac600cgtgtacgccgccaacaactgcgagggtccctgcaagctgcccctctccacacgtgtccc660cagctactactcgcacacggtgctgctgctgggcatgcaggagcggggctcgcccctgca720gcgcgctccctgctgcgtgcccgtccgctactcggaccagctcatcatcagcgtgtccag780ccaggggctggaggtgcgcaagttccccaacatggtggcagaggagtgcggctgtcggta840gaggctcctgcccatagccctggagcgcccctgcagctttgcttctcgccga892SEQIDNO:2<210>2<211>18<212>DNA<400>2cagggatagcgggcagtt18SEQIDNO:3<210>3<211>17<212>DNA<400>3tcggcgagaagcaaagc17當前第1頁1 2 3