本發明涉及一種醫藥抗體技術領域，具體地說是一種含抗幽門螺旋桿菌IgY的卵黃抗體的制備方法及應用。

背景技術：

幽門螺桿菌(Helicobacter Pylori，以下簡稱HP)是世界上最常見的病原體之一，幽門螺桿菌具有傳染性，它已被世界衛生組織(WHO)列為胃癌的第一類致癌因子。幽門螺桿菌可通過口腔侵入胃和十二指腸粘膜上皮細胞而造成消化道病變，并非所有的幽門螺桿菌菌株感染都會發展為消化道病變。臨床研究結果表明，幽門螺桿菌菌株可分為兩個類型，即一個是含有與細胞毒素表達相關CagA基因的毒力型幽門螺桿菌，(I型幽門螺桿菌，又稱產細胞毒素幽門螺桿菌)，另一個則不含CagA基因的低毒力型幽門螺桿菌(II型幽門螺桿菌，又稱非產細胞毒素幽門螺桿菌)。

產細胞毒素幽門螺桿菌菌株其檢出率約占總幽門螺桿菌的50-60％，這類型的HP幽門螺桿菌是幽門螺桿菌中較具毒性的菌株，在臨床上會造成較嚴重的疾病--胃癌、胃潰瘍、十二指腸潰瘍及并發癥(胃出血、穿孔或阻塞等)。而非產細胞毒素幽門螺桿菌感染僅造成胃部輕微不適癥狀。幽門螺桿菌在正常人群中的高感染率引起世界學者的廣泛關注，據報道在發達國家，30歲以下人群感染率低于20％，60歲以上人群感染率高于50％，在發展中國家20歲以上人群感染率已達到80％。估計幽門螺桿菌的感染率在世界上達到數十億人，中國幽門螺桿菌感染率已達到8億人，而其中約占一半人數以上是感染產細胞毒素幽門螺桿菌。

目前可靠的抗幽門螺桿菌治療主要是聯合療法，但由于聯合療法費用高，且易耐藥，病人難以接受。隨著被動免疫方法的廣泛應用，使特異性抗幽門螺桿菌IgY防治幽門螺桿菌成為一種可行的方法。

因此，有必要利用抗體產生反應高的家禽雞為抗體來源，免疫I型幽門螺桿菌，使雞體內產生抗體，并產生在蛋黃內含有抗體的雞蛋。該產品是雞在反復攝取幽門螺桿菌抗原后，當雞體內產生抗體時產下的蛋。雞蛋中的蛋黃中就存在幽門螺桿菌的抗體IgY。IgY對胃黏膜上吸附幽門螺桿菌有阻止吸附的作用，這樣就可以防止幽門螺桿菌對引發胃癌的可能性。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是，提供一種種安全、成本低、具有高效預防和治療幽門螺桿菌引發的胃癌、胃潰瘍、十二指腸潰瘍及并發癥(胃出血、穿孔或阻塞等)的卵黃抗體的制備方法。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是，該含抗幽門螺旋桿菌IgY的卵黃抗體的制備方法，包括以下步驟：

(1)將含抗幽門螺旋桿菌IgY的卵黃抗體的雞蛋清洗消毒后打破，用蛋黃分離器小心分離卵黃，保證卵黃膜未破裂；

(2)將卵黃在普通濾紙翻滾數次，盡可能將卵白吸除干凈，卵黃破膜收集卵黃；

(3)用2倍卵黃體積的10mM PBS，pH7.4稀釋卵黃，室溫攪拌；按終濃度3.5％PEG6000沉淀稀釋后的卵黃，離心條件為：速度為8000～12000rpm/min，溫度為4℃，離心時間為5～20min；離心后收集上層清液，經普通濾紙過濾去除不溶物；

(4)向步驟(3)中去除不溶物后的上層清液加入終濃度為8.5％PEG6000，室溫攪拌10～30min，再離心棄去上層清液得到沉淀，離心條件為：速度為8000～12000rpm/min，溫度為4℃，離心時間為5～20min；

(5)將步驟(4)離心得到的沉淀用卵黃體積的PBS，pH7.4溶解，再加入終濃度為12％PEG6000沉淀卵黃抗體，室溫攪拌10～30min；再離心棄上層清液得二次沉淀，其離心條件為：速度為10000rpm/min，溫度為4℃，離心時間為10min；

(6)將步驟(5)離心得到的二次沉淀再用6～8ml PBS重懸溶解；在4℃條件下加入33％飽和硫酸銨，攪拌50～70min，再離心棄上層清液得到三次沉淀，其離心條件為：速度為8000～12000rpm/min，溫度為4℃，離心時間為5～20min；

(7)將步驟(6)離心得到的三次沉淀再用1ml PBS重懸溶解；溶解后的沉淀對PBS透析，20小時以上，每6～8小時更換透析液一次；收集經過透析的卵黃抗體。

采用上述技術方案，抗體純化后可制成藥品,用于防治因幽門螺桿菌感染引起的相關疾病；通過多次溶解并離心提純，該方法純化獲得的IgY純度在98％以上，且抗體的得率在63％。該方案采用改良的PEG沉淀法獲得抗體純度更高，經PBS透析可以有效去除純化產物中殘留的聚乙二醇及硫酸銨。

本發明進一步改進在于，所述步驟(1)中的含抗幽門螺旋桿菌IgY的卵黃抗體的雞蛋為用CagA基因陽性的毒力型幽門螺桿菌免疫所產的蛋。

本發明進一步改進在于，所述步驟(1)中的含抗幽門螺旋桿菌IgY的卵黃抗體的雞蛋的制備方法，包括以下步驟：

1)培養CagA基因陽性的毒力型幽門螺桿菌；

2)免疫產蛋母雞：選用40周齡健康產蛋母雞隔離飼養，進行皮下注射，1.0x109cfu/只；每周加強一次免疫1.0x109cfu/只；三次免疫后收集雞蛋。

本發明進一步改進在于，采用間接法ELISA測定血清及含抗幽門螺旋桿菌IgY的卵黃抗體滴度；具體步驟如下：

S1：超聲破碎幽門螺桿菌，Bradford法定量蛋白濃度；

S2：用pH9.6碳酸緩沖溶液稀釋菌體蛋白，按100ug/well包被酶標板，4℃過夜；甩掉包被液，用含有0.05％吐溫20的PBS浸泡沖洗2～5次每次30～70s；

S3：用1％牛血清白蛋白封閉，溫度為37℃，時間為50～70min，洗滌2～5次；加入倍比稀釋血清或卵黃，37℃孵育1.5～3h，洗滌酶標板4～6次；

S4：加入1:10000稀釋的酶標二抗，37℃反應30～60min后，洗滌板條4～6次；TMB顯色，室溫10～30min，2M硫酸終止顯色反應，酶標儀讀取450nm的OD值；抗體滴度判斷：OD值大于陰性對照值的2.1倍為陽性，陽性值的最大稀釋倍數為滴度。所制得的雞蛋中含抗幽門螺旋桿菌卵黃抗體滴度達到1:10000以上。

本發明進一步改進在于，可直接對免疫所產的雞蛋的卵黃進行干燥制得含含抗幽門螺旋桿菌IgY的卵黃抗體的卵黃粉，干燥方法具體包括如下步驟：將用蛋黃分離器小心分離卵黃于-20℃預冷凍1～3h，轉入-80℃凍存過夜；第二天轉入凍干機，主凍干0.1mbar，-56℃，至少24h；終凍干0.02mbar，-56℃，2小時；收獲凍干樣，研磨獲得含抗幽門螺旋桿菌IgY的卵黃粉。應用本發明將含卵黃抗體的蛋黃粉添加于食品或制備成保健食品。

本發明進一步改進在于，所制得的含抗幽門螺旋桿菌IgY的卵黃抗體和所制得的含抗幽門螺旋桿菌IgY的卵黃粉均可應用于食品或食品添加劑或醫藥或保健品或功能性保健食品。

本發明有以下優點和效果：將免疫蛋制成蛋黃粉，對幽門螺旋桿菌陽性患者的治療中證明了顯著療效，有效率達到90％以上。

附圖說明

進一步結合附圖描述本發明的技術方案；

圖1是Yolk純化前及不同批次純化后IgY的還原SDS-PAGE圖譜；

圖2含抗幽門螺桿菌IgY的雞蛋滴度隨免疫進程的變化趨勢；

圖3是含抗幽門螺桿菌IgY的卵黃抗體的活性隨酶切時間延長的變化趨勢圖。

具體實施方式

實施例1：含抗幽門螺旋桿菌IgY的卵黃抗體的雞蛋為用CagA基因陽性的毒力型幽門螺桿菌免疫所產的蛋；含抗幽門螺旋桿菌IgY的卵黃抗體的雞蛋的制備方法：

1)包括培養CagA基因陽性的毒力型幽門螺桿菌：毒力型幽門螺桿菌株37度水浴化凍后，接種于羊血瓊脂平板，將平板置于37度微需氧環境培養48小時。從平板上收獲幽門螺桿菌接種腦心浸液培養基進行擴菌培養。48-72小時離心收獲幽門螺桿菌。

2)免疫產蛋母雞：選用40周齡健康產蛋母雞隔離飼養，進行皮下注射，首次注射免疫1.0x10⁹cfu/只；每周免疫一次，注射三次免疫后收集雞蛋。

實施例2：含抗幽門螺旋桿菌IgY的卵黃抗體的制備方法，具體包括如下步驟：

(1)將含抗幽門螺旋桿菌IgY的卵黃抗體的雞蛋清洗消毒后打破，用蛋黃分離器小心分離卵黃，保證卵黃膜未破裂；

(2)將卵黃在普通濾紙翻滾數次，盡可能將卵白吸除干凈，卵黃破膜收集卵黃；

(3)用2倍卵黃體積的10mM PBS，pH7.4稀釋卵黃，室溫攪拌；按終濃度3.5％PEG6000沉淀稀釋后的卵黃，離心條件為：速度為10000rpm/min，溫度為4℃，離心時間為10min；離心后收集上層清液，經普通濾紙過濾去除不溶物；

(4)向步驟(3)中去除不溶物后的上層清液加入終濃度為8.5％PEG6000，室溫攪拌20min，再離心棄去上層清液得到沉淀，離心條件為：速度為速度為10000rpm/min，溫度為4℃，離心時間為10min；

(5)將步驟(4)離心得到的沉淀用卵黃體積(約12ml)的PBS，pH7.4溶解，再加入終濃度為12％PEG6000沉淀卵黃抗體，室溫攪拌20min；再離心棄上層清液得二次沉淀，其離心條件為：速度為10000rpm/min，溫度為4℃，離心時間為10min；

(6)將步驟(5)離心得到的二次沉淀再用6～8ml PBS重懸溶解；在4℃條件下加入33％飽和硫酸銨，攪拌60min，再離心棄上層清液得到三次沉淀，其離心條件為：速度為10000rpm/min，溫度為4℃，離心時間為10min；

(7)將步驟(6)離心得到的三次沉淀再用1ml PBS重懸溶解；溶解后的沉淀對PBS透析，20小時以上，每6～8小時更換透析液一次；收集經過透析的卵黃抗體。

收集經過透析的卵黃抗體，稀釋20～100倍，測定280nm的吸光度計算IgY含量(抗體濃度按0.75xOD 280nm計算，單位：mg/ml)；最終獲得IgY經還原的SDS-PAGE鑒定純度；該方法純化獲得的IgY純度在98％以上，且抗體的得率在63％。

實施例3：免疫雞蛋及卵黃抗體滴度測定：采用間接法ELISA測定血清及卵黃抗體的滴度；具體步驟包括：

S1：超聲破碎幽門螺桿菌，Bradford法定量蛋白濃度；

S2：用pH9.6碳酸緩沖溶液稀釋菌體蛋白，按100ug/well包被酶標板，4℃過夜；甩掉包被液，用含有0.05％吐溫20的PBS浸泡沖洗3次每次60s；

S3：用1％牛血清白蛋白封閉，溫度為37℃，時間為60min，洗滌2～5次；加入倍比稀釋血清或卵黃，37℃孵育2h，洗滌酶標板5次；

S4：加入1:10000稀釋的酶標二抗，37℃反應30～60min后，洗滌板條4～6次；TMB顯色，室溫15min，2M硫酸終止顯色反應，酶標儀讀取450nm的OD值；抗體滴度判斷：OD值大于陰性對照值的2.1倍為陽性，陽性值的最大稀釋倍數為滴度。

結果表明：含抗幽門螺旋桿菌卵黃抗體滴度達到1:10000以上。

實施例4：可直接對免疫所產的雞蛋的卵黃進行干燥制得含含抗幽門螺旋桿菌IgY的卵黃抗體的卵黃粉，卵黃干燥方法具體包括如下步驟：將用蛋黃分離器小心分離卵黃于-20℃預冷凍2h，轉入-80℃凍存過夜；第二天轉入凍干機，主凍干0.1mbar，-56℃，至少24h；終凍干0.02mbar，-56℃，2h；收獲凍干樣，研磨獲得含抗幽門螺旋桿菌IgY的卵黃粉。

卵黃凍干后為鮮重的53％，此數據與報道的一致；并且試驗數據顯示，凍干后抗體活性不受影響。

實施例5：模擬的胃液環境(胃蛋白酶)對HP抗體活性的影響：

參考藥典2010版人工胃液的配置方法：取稀鹽酸16.4m l，加水約800ml與胃蛋白酶10g，搖勻后，加水稀釋成1000ml，即得；臨用前制備。氫氧化鈉調節溶液的酸堿度，獲得不同pH值的含有10g/L胃蛋白酶胃液；于不同時間點，在胃液中添加卵黃粉或純化的抗體，37℃水浴，同時收集經酶消化過的樣品，立刻稀釋適當倍數經ELISA測定抗體的結合活性，計算分析：活性保留率＝OD_Xmin/OD_0min；其中D_Xmin代表x時間點樣品測定的OD值，x代表時間點，OD_0min為0點樣品ELISA測定的OD值，即為對照組。

通過對比實驗結果表明：免疫所產雞蛋，制成蛋黃粉，參考藥典2010版人工胃液的配置方法，胃酸ph在4.0時，卵黃粉經胃蛋白酶消化后，HP抗體的結合活性有一定損失；蛋白酶作用15分鐘時抗體活性還有88.6％,30分鐘82.5％，60分鐘79.7％，90分鐘抗體活性還有71.6％；

免疫所產雞蛋，制備的卵黃抗體，參考藥典2010版人工胃液的配置方法，胃酸ph在4.0時，卵黃粉經胃蛋白酶消化后，hp抗體的結合活性有一定損失。蛋白酶作用15分鐘時抗體活性還有88.6％,30分鐘78.2.％，60分鐘76.6％，90分鐘抗體活性還有60％。

實施例6：蛋黃粉體內治療對比驗，實驗結果如表1：

免疫雞蛋，制成蛋黃粉，進行體內治療；將制成的卵黃粉口服明確診斷的HP陽性胃病病人16例，每個病人每次1個雞蛋的卵黃粉，經10天服用，有效性在90％以上。

表1服用前后C13檢測值及癥狀變化

以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征及優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。