本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種快速回補鴨疫里默氏桿菌缺失基因的方法。

背景技術：

目前主要通過敲除鴨疫里默氏桿菌的基因來研究該基因的功能，進而研究鴨疫里默氏桿菌的致病機理。將細菌某個基因敲除后通常會引起它的表型發生改變，但有些表型變化可能是由于被敲除的基因影響了其它基因的轉錄表達所導致。因此，我們在敲除某個基因時，還需要對這個基因進行回補，來確定該基因的功能。對于像大腸桿菌等細菌可以通過氯化鈣轉化法直接將重組質粒導入細菌細胞內。但鴨疫里默氏桿菌要求比較嚴格，目前主要通過結合轉移的方法導入重組質粒。這種方法需要利用大腸桿菌作為供體菌，且步驟繁瑣、耗時過長等給鴨疫里默氏桿菌研究帶來諸多不便。基于此技術背景，因此急需一種快速回補鴨疫里默氏桿菌缺失基因的方法。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種快速回補鴨疫里默氏桿菌缺失基因的方法，該方法簡單，周期短。

為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種快速回補鴨疫里默氏桿菌缺失基因的方法，構建含有目的基因的重組穿梭質粒，然后加入含有MgCl₂的活化的鴨疫里默氏桿菌菌液中，37℃孵育30分鐘，然后加入含MgCl₂的GCB培養基孵育7小時，然后涂布在含對應抗性固體GCB培養基上，37℃培養箱培養18-24h至單克隆長出，即獲得鴨疫里默氏桿菌回補菌株；所述穿梭質粒為能夠在鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌中穩定存在的質粒。

本發明中，所述穿梭質粒為含有鴨疫里默氏桿菌復制起始基因的質粒。

進一步，所述穿梭質粒為pLMF03，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本發明中，所述MgCl₂的濃度為5mM。

本發明中，活化鴨疫里默氏桿菌的方法如下：從-80℃取出鴨疫里默氏桿菌在血平板上復蘇至菌落長出，用接種環挑取單克隆菌落接種至GCB液體培養基中培養過夜；調整OD600＝1，得活化鴨疫里默氏桿菌。

本發明中，所述目的基因為鴨疫里默氏桿菌RA0C_1193基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本發明中，所述重組穿梭質粒由以下方法制備：將SEQ ID NO.4所示序列經NcoI和XbaI酶切位點連入pLMF03質粒NcoI和XbaI酶切位點制得。

本發明的有益效果在于：本發明提供了一種快速回補鴨疫里默氏桿菌缺失基因的方法，該方法載體重組后不需要轉入供體菌，直接可以進入宿主菌并發揮相關基因功能；并且培養周期短，一般情況下18小時就能分離到回補候選株克隆；所需成本較低，為研究鴨疫里默氏桿菌基因功能提供了有力的工具。

附圖說明

為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖進行說明：

圖1為穿梭質粒pLMF03圖譜。

圖2為PCR鑒定穿梭質粒pLMF03轉入ATCC11845后長出來的轉化子的電泳圖(第1-9泳道為隨機選取的9個轉化子，質粒pLMF03為陽性對照，ATCC11845野生株為陰性對照；)

圖3為PCR擴增出的RA0C-1193基因片段的電泳圖(第1泳道DNA marker；第二泳道RA0C-1193基因片段)。

圖4為用限制性內切酶NcoI和XbaI酶切質粒pLMF03和RA0C-1193基因片段，回收酶切產物的電泳圖(第1泳道為酶切后的質粒pLMF03，第2泳道為酶切后的RA0C-1193基因片段)。

圖5為載體pLMF03與目的基因RA0C-1193連接后轉入DH5α長出來的轉化子的鑒定電泳圖(第1-6泳道為隨機挑取的6個轉化子，7泳道為陽性對照；ATCC11845野生株為陽性對照)。

圖6為重組質粒酶切后的電泳圖。

圖7為自然轉移長出來的轉化子鑒定的電泳圖(1-5為轉化子為模板；6為質粒pLMF03為模板；7為鴨疫里默氏桿菌ATCC11845為模板)。

具體實施方式

下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。

實施例1

穿梭質粒的準備：首先從-80℃取出帶有穿梭質粒pLMF03(圖1，SEQ ID NO.7)的宿主菌DH5α(本實驗室保存)在LB平板上，待其生長起來后，用接種環挑取單克隆菌落接種至4ml液體LB培養基中培養過夜；然后用質粒小提試劑盒(購自天根)對過夜培養的菌液進行質粒的提取，并測濃度。

受體菌的制備：首先從-80℃取出鴨疫里默氏桿菌ATCC11845野生株(本實驗室保存)在血平板上復蘇，待其生長起來后，用接種環挑取單克隆菌落接種至10ml液體GCB培養基培養過夜；將其調整為OD600＝1，并加入5mMMgCl₂混勻備用。

自然轉移：取兩個1.5ml無菌離心管，一個作為實驗組，一個作為對照組，分別加入300μl(含5mM MgCl₂)上述菌液，其中實驗組分別加入1μg的穿梭質粒pLMF03，對照組不加。封口膠密封并置于37℃培養箱孵育30分鐘；取出孵育30分鐘的實驗組和對照組，分別向其中加入700μl含有5mM MgCl₂的GCB培養基，即定容至1ml，封口膠密封，37℃培養箱孵育7小時。

培養基的制備：4個含頭孢西丁(1μg/ml)(Cefoxitin，CFX)抗性的GCB固體培養基。

從實驗組和對照組分別取出100μl菌液，分別用一次性涂布棒涂在含頭孢西丁(1μg/ml)(Cefoxitin，CFX)的GCB固體培養基上，將培養基置于37℃培養箱培養18h至單克隆長出。

陽性結合子的篩選及鑒定：經觀察發現，在含頭孢西丁抗性的培養基上，實驗組長出了明顯的單克隆菌落，而對照組沒有，挑取9個單克隆分離在新的含頭孢西丁抗性的GCB固體培養基上，37℃培養箱培養過夜。

將挑取的單克隆進行PCR擴增cfxA部分片段(SEQ ID NO.1)，PCR鑒定引物如下：

cfx p1：5’-ggtgctgcaatgttgatg-3’(SEQ ID NO.2)；

cfx p2：5’-ccgctaaggtataactg-3’(SEQ ID NO.3)；

PCR擴增程序如下：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循環30次；再72℃后延伸8min；16℃保存；同時以質粒pLMF03為陽性對照，ATCC11845野生株為陰性對照，將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖2所示。結果顯示，穿梭質粒pLMF03能夠成功導入鴨疫里默氏桿菌ATCC11845野生株。

實施例2、回補鴨疫里默氏桿菌RA ATCCΔRA0C-1193

構建重組質粒：在NCBI上查找RA ATCC11845株的RA0C-1193基因(約861bp)，序列如SEQ ID NO.4所示：然后設計擴增目的基因的引物，具體引物如下：

p1：5’-catgccatggatgagccaaaccataaatac-3’(SEQ ID NO.5)，下劃線表示NcoI；

p2：5’-ctagtctagattagaaagtgattttgtaagtgcctg-3’(SEQ ID NO.6)下劃線表示XbaI；

然后以鴨疫里默氏桿菌ATCC11845基因組為模板，p1和p2為引物擴增目的基因片段，PCR擴增程序如下：98℃預變性30s；98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循環30次；再72℃后延伸10min；最后16℃保存；擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖3所示。結果顯示，擴增獲得約861bp大小條帶，PCR產物大小與預期大小相符。

用限制性內切酶NcoI和XbaI酶切質粒pLMF03和目的基因片段，回收酶切產物，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖4所示。結果顯示，酶切產物成功回收。

用T4連接酶連接載體片段pLMF03與目的基因片段，然后將連接產物轉化至DH5α，從轉化長出來的單克隆菌落隨機挑取6個進行PCR鑒定。以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6為特異性引物，ATCC11845野生株為陽性對照進行PCR擴增；PCR擴增程序如下：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循環30次；再72℃后延伸10min，最后16℃保存。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖5所示。結果顯示，隨機選取的6個轉化子均擴增出了目的基因。使用質粒提取試劑盒(購自天根)提取陽性克隆質粒，然后用限制性內切酶NcoI和XbaI鑒定，結果圖6所示。

受體菌的制備：首先從-80℃取出鴨疫里默氏桿菌RA ATCCΔRA0C-1193(RA ATCC ΔRA0C-1193菌株參見Liao H B,Cheng X J,Zhu D K,et al.TonB energy transduction systems of Riemerella anatipestifer are required for iron and hemin utilization[J].PloS one,2015,10(5):e0127506)，在血平板上復蘇，待其生長起來后，用接種環挑取單克隆菌落接種至10ml液體GCB培養基培養過夜；將其調整為OD600＝1，并加入5mM MgCl₂混勻備用。

自然轉移：準備兩個1.5ml無菌離心管，一個作為實驗組，一個作為對照組，分別加入300μl(含5mM MgCl₂)上述菌液，其中實驗組加入1μg的重組質粒，對照組不加。封口膠密封并置于37℃培養箱孵育30分鐘；取出孵育30分鐘的實驗組和對照組，分別向其中加入700μl含有5mM MgCl₂的GCB培養基，即定容至1ml，封口膠密封，37℃培養箱孵育7小時。

從實驗組和對照組分別取出100μl菌液，分別用一次性涂布棒涂在含頭孢西丁(1μg/ml)(Cefoxitin，CFX)和壯觀霉素(80μg/ml)(Spectinomycin，SPC)的GCB固體培養基上；將培養基置于37℃培養箱培養18h至單克隆長出。

陽性結合子的篩選及鑒定：培養后發現在含頭孢西丁抗性和壯觀霉素抗性的培養基上實驗組均長出了明顯的單克隆菌落，而對照組沒有，隨機挑取5個單克隆分離在新的抗性的GCB固體培養基上，37℃培養箱培養過夜；以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3為模板PCR擴增目的基因cfxA，并以質粒pMM47為陽性對照，ATCC11845野生株為陰性對照。

PCR擴增程序如下：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循環30次；再72℃后延伸8min；最后16℃保存。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖7所示。結果顯示，5個轉化子均能擴增出cfxA，表明重組質粒能夠成功導入鴨疫里默氏桿菌ATCC11845。

最后說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的范圍。

<110> 四川農業大學

<120> 一種快速回補鴨疫里默氏桿菌缺失基因的方法

<160> 7

<210> 1

<211> 253

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cfxA部分序列

<400> 1

ggtgctgcaa tgttgatgaa tcgtttgttt actgaaggtc ttatcgatga tgagaaacaa 60

agtttcatta agaatacgtt aaaagaatgc aaaacaggtg tagataggat agcagctcca 120

cttcttgata aagaaggggt tgttatagcg cataagacag gttcaggtta tgttaatgaa 180

aatggtgttc ttgcagctca caatgatgtt gcctatatat gtctgcctaa taatatcagt 240

tataccttag cgg 253

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物cfx p1

<400> 2

ggtgctgcaa tgttgatg 18

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物cfx p2

<400> 3

ccgctaaggt ataactg 17

<210> 4

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RA0C_1193基因序列

<400> 4

atgagccaaa ccataaatac atcggaaaga aaagaccaaa tcaaaagtgc catcatcaca 60

tttttgatta gccttttggt attcttagct ttgtattttt attcgtttac tagagaactt 120

ccaaaggagg aagtcgtaag cacgatgctc atcaattttg gagaccaaaa cgagggtaac 180

ctgcctgaag aaccccaaaa ccaagagggc agtctatccg ccaccgaagc acctacacca 240

atacaagaaa tacaacctac acctgtagaa cctcagccca aaaaagaagt ggtaaaggag 300

aaaattatca cagggcaaaa taccaaaaca agtgctgaaa aggtggaaaa agtaacctct 360

aaacctacaa aagaaagcac agcaaacacc caaaagaaag aaaccacgac acctaaaaaa 420

agcagtacca ctacacaaaa taaaaccgtg accaaccaag gtgatggcag aggtaacgag 480

gctattggca acctcatcag agggcgaggt gccaacaaag gagctcaagg aaactcccaa 540

aacacttccg gcaattcagg agacccacta ggtggcgata gcaatggcga tagtaaaatc 600

ggcatagacc gaaagttaat cggatttata cctggaacta tggggcgtgg tggttcacag 660

ccgacccacc agtgttctgc ctcaggcacc attagcatct cttatgtggt agataaagcg 720

ggcaatgtaa tttcggctag acgaagtggc ggtattacag acccttgtgc cgtaaacaca 780

accatagagt gggtaaagaa atatgtaaaa gcagaaagag ctagcacttc ttctacaggc 840

acttacaaaa tcactttcta a 861

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物p1

<400> 5

catgccatgg atgagccaaa ccataaatac 30

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物p2

<400> 6

ctagtctaga ttagaaagtg attttgtaag tgcctg 36

<210> 7

<211> 6733

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLMF03質粒序列

<400> 7

aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca 60

tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag 120

ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg 180

aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct 240

ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt 300

agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg 360

gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc 420

ttgggctatt taggcattag ccctcttttt aacctgactt aaaaaataat taaatcataa 480

gatattaaat atcaagtgat tatgatttac tatgctatac ataatatcac ccagtgttag 540

aaaattcttg ctatgctttt tgtttgtttt ttttcattcg tgaactttta gaatactttt 600

aaaataaact caaatttata aactattgat tttcaatatt atacaaaacc aaacttatta 660

acattaaact tatttctatt acctttaaaa taaactacta aaagacaaat ctaccaatcc 720

tcggaactat ttaataaata ggaagttata taaaaataat gaacttttag aatactttat 780

tagtcttttt agctccaaaa atgaactttt agaatacttt ttttgaactt ttagaatact 840

tttttaaact tgctttttag taagttcatt ttttatatat ttgtattcta aaagtgcatt 900

ttatattcat aactctctat atatggcaaa agtagataat aaactaatgt ttcagtccta 960

tatttttact acggctaaat atgatttttc agtctatgaa aagcgtatac tatataggca 1020

aatagaaata gaacaggcat tgctaaataa tgaggcgttg aaagattgta tcaaaataga 1080

tactaaccta tggggggata aaaaatatac aattccaatt tctatgctgt tagctaatga 1140

tgaagataaa aattattata aaattaaaaa agcattcaaa gacctaaaat caaagaacat 1200

tgagtacgaa gatgaaaaag aatacgcttg ctttggtgtt attgataagt tttggattga 1260

taaatatgga agaaatgtta cttggcaatc tgacaaaaga attgttgaag cggtaatgga 1320

ttttacaaga ggatggagaa aatatgaatt gaagattgct atgcagtttg agactattta 1380

tgcaatgcgt ttttacgaac tgatagctaa taaaaccaaa ccaataacat atgaagtgtc 1440

atttcttgaa aaaatgtttc aattggaaaa taagtacagg aaccctcagg gtaatcttaa 1500

tatcagtatg tttaaacgcc gtgtattaga ccccgctaaa aacgagttag ataaatgttc 1560

tccatacact tttgattata ctctttcaaa ggataaaaaa attatttctc taattcctat 1620

tttccaagaa caatttgcag atgaaagtat gaagatgatc aaaatagaag aggaaaaaga 1680

tatacactct gtattaactc aaagagaaat tgatgttttt acaaacgaat ttggttttac 1740

acaacaaggt ttattaaaca actatgccct attcaaagat tgtaaggcta cacttccatc 1800

aaactattct ttcttccttt ttcaagagat aagaaaaagt cggactaaga aaggaaaaat 1860

atctcctgct tatgtgattg ggattataag aaatatgctt aaagatttca aaaaagaaca 1920

acaataggct tatgaaaaaa tatacaacaa aagaaatcgc agagcttttt ggcgtcagcg 1980

aacggacaat ccagcgacac ataacgacac taagcgacaa catatcaaat accgacagaa 2040

agggcttttc aataccagaa gacattgttt tctttcttgc cgagcgacac cattacgaca 2100

ttttagcgac aacgaacgac aacgaacgac aggataaaaa tgaagaattt cctcatattg 2160

aatacttcac agaagaggaa taccaagagt ttaaaaaaag gatcacagag tacccttttt 2220

tgaaagagca aattaaactg tctaatgaac atttggatac tctaaaaaca caaatagaat 2280

atttcagact atcttacaat aagcaattgg atattcacga aaaattaatc ggagcgttcc 2340

gagaaagaaa ctttattgaa gctaaagaaa aggggatgga taaatagctc ctaataatta 2400

aagaagtatt agaaaaaaaa tgctatataa aaacttaatc gagctctata cgagatctgt 2460

tccaatgcat tggctgcagg tcgacatttc aaaaatttaa cttaaaccac tgatttacaa 2520

aaatgtttat ttgcaaaact attttacaaa gatattacaa taatttttct agcacaaatt 2580

tatttctcac catatctttg ccttgttcaa gtgagtgaac agagtaacaa acaaaaaaag 2640

aaacaaattt aaaaaaatta tttaaaattc catggctcta gaactcgagc atcatcatca 2700

tcatcattga actagtggag ttgcttctct tttcgggagt ggaaaactga aagaactgga 2760

acgtgccaac gaaaaactgc aagacgaggt ttcaaaacgg aacaccaata ttgaaaaatt 2820

gcagagccaa gtacagcaga tgcagaaaca gcatgatacg caaatccaca atctcagaga 2880

aatgcacagg caggaacttg acatgaaaga aaaagaactg tcacggctcg ccagaatcat 2940

agacaaggct ttcaggtggt ttccgatgtt cagggaaatg ctgcgcatgg aaaagttttg 3000

tgccatgctg ggattctcta aagaaatgac tgaaagtctt atagtcaaaa aagaagccct 3060

gaaatgtagc ggtaaaatct attccgagca acacaggcgg aactttgata taaaggatga 3120

tattttaagg gtggaaaatg accctgacga tgaaagcagg ctgaacctga caataaacag 3180

gaagccgatt gccgactggt tcagggagca atggcacagg cttagatatg gagcaagagt 3240

gccgcaacag gaagaaagaa aaagtagagg attcaaatta taatagaagc aatttgatta 3300

gtaatctaaa agcactccga taacgattag agtgctttta gattgtttat cattaattat 3360

caaagcaagt gcagtttaag attttactga agtttgcatt aataaagaat atactacagc 3420

tgatatatgc gcaacatatt gtgacgcttg tgatttattt cccttgaaat ccttaacaaa 3480

taccgctaag gtataactga tattattagg cagacatata taggcaacat cattgtgagc 3540

tgcaagaaca ccattttcat taacataacc tgaacctgtc ttatgcgcta taacaacccc 3600

ttctttatca agaagtggag ctgctatcct atctacacct gttttgcatt cttttaacgt 3660

attcttaatg aaactttgtt tctcatcatc gataagacct tcagtaaaca aacgattcat 3720

caacattgca gcaccaagag gagatgtata gttagagtaa gccttgttat ggtcagccga 3780

catttcctct tccgtataag ctatctgaaa acttgaacga ggaatgagtg tggctataaa 3840

actatctgtt tgagcgacat taaccatatc cttaaacata aggttgcttg cattgttgtc 3900

actctgagta agagtataac gcagcaaatc tctcactgtc aatgatatga ctggccctga 3960

ataatctttc agcataggac tccaagtctt tgggtcaagt ttatccctat ttatatttac 4020

taaggtatca agtgaaattc ctttattgtc aaagtcatta caaagagcta atgcctgatg 4080

aaccttaaac acactcatca taggataaac actcttatta ttgaccttaa ccgtatctct 4140

gttattaaca ataaccgcca caccaatttc gccaggacaa gctgagacaa tttgagaaat 4200

gctatcagtc aaaacatttg ttaaaggagg atttgcgcta tcttttgtcg ctgatttatg 4260

gaacaatgaa aataccaaga tgaaaatgca aactaaagct atactcaaaa ctacgatttg 4320

tttttttctg tttttttcca tgttttatat tatttatatt tgtttgacga gaatatcttt 4380

atttgccgac aaaggtacat aactaaagtt tcccacccaa ataaatagat agaaaaataa 4440

cagtttgtcg aattttcttt gtaaattagt aatcgctaaa gaactgattt tggggatccc 4500

cgggtaccga gctcgaattc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct 4560

ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc 4620

gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc 4680

ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact 4740

ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc 4800

gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc 4860

gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga 4920

aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag 4980

acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 5040

atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 5100

tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg 5160

gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa 5220

gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt 5280

gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt 5340

ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat 5400

tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg 5460

acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta 5520

cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat 5580

catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag 5640

cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa 5700

ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca 5760

ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc 5820

ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt 5880

atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc 5940

gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat 6000

atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt 6060

tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 6120

cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 6180

ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 6240

actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta 6300

gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 6360

ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 6420

gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 6480

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gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 6660

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cggagcctat gga 6733